«Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет имени академика И. П. Павлова» icon

«Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет имени академика И. П. Павлова»





Скачать 316.48 Kb.
Название«Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет имени академика И. П. Павлова»
Бурова Л.А
Дата14.03.2013
Размер316.48 Kb.
ТипАвтореферат
На правах рукописи


БЕЛЬТЮКОВА
Анна Станиславовна



СОДЕРЖАНИЕ И СИНТЕЗ ЦИТОКИНОВ
ПРИ ПСОРИАЗЕ



14.00.36 – аллергология и иммунология

14.00.11 – кожные и венерические болезни


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук


Санкт-Петербург

2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет имени академика И.П. Павлова» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ.


^ Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Тотолян Арег Артемович

Доктор медицинских наук, профессор Монахов Константин Николаевич


^ Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Сельков Сергей Алексеевич

Доктор медицинских наук, профессор Горланов Игорь Александрович


^ Ведущее учреждение:

ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России


Защита состоится «______» ________________2009 года в _____ часов

на заседании диссертационного совета ДМ 001. 022. 01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН (197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., д. 69/71).


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН,
по адресу: 197376, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12.


Автореферат разослан «______» ________________________2009 года


Ученый секретарь

Диссертационного совета,

доктор медицинских наук Бурова Л.А.

^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Псориаз – хронический дерматоз мультифакториальной природы с доминирующим значением в развитии генетических факторов, характеризующийся гиперпролиферацией эпидермальных клеток, нарушением кератинизации, воспалением в дерме (Соколовский Е.В. и соавт., 1999).

Эпидемиологические исследования последних лет показали, что псориаз встречается практически во всех климатогеографических зонах земного шара, однако отмечаются расовые отличия в частоте заболевания. Распространенность псориаза варьирует в разных странах, и, по данным различных авторов, составляет от 0,1% до 2% (Lomholt G., 1963; Brandrup F., Green A., 1981; Christophers E., 2001). В Европейских странах псориаз поражает 1,5-2% популяции, в Канаде заболевание встречается с частотой до 4,7%, в Азиатских странах встречается реже (0,4% в Китае). У 14–47% больных псориазом наблюдается артрит и/или спондилит (Gladman D.D., 1998). В настоящее время число больных псориазом в России составляет приблизительно 3 млн. человек; отмечается тенденция к росту заболеваемости среди лиц трудоспособного возраста, увеличению числа тяжелых, непрерывно рецидивирующих форм заболевания (Беляев Г.М. и соавт., 2005). К настоящему времени доля больных псориазом среди всех больных дерматозами составляет 12-15% (Соколовский Е.В. и соавт., 1999). Установлено, что у 60-70% больных псориаз предшествует артриту, у 10-20% – псориаз развивается одновременно с артритом и примерно у 20% кожные проявления псориаза могут развиться после возникновения поражения суставов (Логинова Е.Ю. и соавт., 2008). Артрит предшествует развитию псориаза чаще у детей, имеющих отягощенный семейный анамнез по псориазу (Насонов Е.Л., 2008). В формировании и реализации клинических проявлений псориаза участвуют многочисленные факторы. Многие зарубежные и отечественные исследователи отмечают ведущую роль иммунных механизмов в патогенезе псориаза (Шегай М.М., и соавт., 1998; Gottlieb A.B., 2003; Pietrzak A.T., 2008).

В связи с распространенностью данного заболевания и не выясненным первичным патогенетическим механизмом, представляется актуальным исследование хемокинов, хемокиновых рецепторов, основных цитокинов, участвующих в патогенезе псориаза, и транскрипционного маркера Т-регуляторных клеток – FOXP3. Данное исследование позволит уточнить патогенез заболевания, охарактеризовать длительность и течение хронического повреждения в коже.

^ Цель работы. Оценить закономерности системной продукции и местного синтеза цитокинов при псориазе с целью изучения иммунопатогенеза и поиска новых биомаркеров заболевания.

^ Задачи работы

  1. Определить нормальные значения уровня цитокинов в сыворотке крови и в моче, а также экспрессию мРНК СС- и СXC-хемокинов в биоптатах кожи практически здоровых лиц.

  2. Определить в сыворотке крови больных псориазом содержание следующих цитокинов:

  • провоспалительных цитокинов (IL-1α, IL-1β, IL-9, IL-12 (p40), IL-12(p70), IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, TNF-α, TRAIL, MIF, LIF; IL-2Rα, IFN-α2);

  • противовоспалительных цитокинов (IL-10, IL-1RA);

  • Th1-цитокинов (IFN-γ, TNF-β, IL-2,);

  • Th2-цитокинов (IL-4, IL-5, IL-6);

  • факторов иммуногемопоэза, ростовых факторов и адгезионных молекул (FGFbasic, SCF, SCGF, PDGF-BB, β-NGF, VEGF, HGF, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-3, IL-7, ICAM-1, VCAM-1);

  • хемокинов (CCL27/CTACK, CXCL1/GROα, CXCL9/MIG, CXCL12/SDF-1α, CCL5/RANTES, CXCL8/IL-8, CCL11/eotaxin, CXCL10/IP-10, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α и CCL4/MIP-1β).

  1. Оценить содержание цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-γ, GM-CSF, TNF-α) в сыворотке крови и моче у больных псориазом и у больных атопическим дерматитом и склеродермией, и в зависимости от клинической активности процесса.

  2. Исследовать экспрессию мРНК FOXP3 в визуально здоровой и пораженной коже при псориазе.

5. Определить экспрессию мРНК некоторых СС- и СXC-хемокинов и их рецепторов в визуально здоровой и в пораженной коже больных псориазом по сравнению с атопическим дерматитом и склеродермией.

^ Научная новизна

Впервые определена экспрессия хемокинов и хемокиновых рецепторов в коже практически здоровых лиц. Выявлено, что в коже практически здоровых лиц экспрессируются гены хемокинов (CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CXCL8/IL-8) и гены рецепторов для СС-хемокинов (ССR1, CCR3 и ССR5), однако отсутствует экспрессия СС-хемокинов (CCL3/MIP-1α, CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2) и рецепторов для семейства СXС-хемокинов. Показано, что у больных псориазом с индексом PASI менее 10 и с индексом PASI более 20 значительно повышено содержание в сыворотке крови: CCL4/MIP-1β, CCL7/MCP-3, CCL11/eotaxin, CCL27/CTACK, CXCL1/GROα, CXCL9/MIG, CXCL12/SDF-1α по сравнению с практически здоровыми лицами, а также повышено содержание CXCL10/IP-10 в сыворотке крови у пациентов с индексом PASI < 10. Установлены особенности экспрессии генов хемокинов и их рецепторов в коже больных псориазом по сравнению с атопическим дерматитом и склеродермией. Установлена зависимость экспрессии генов хемокинов и их рецепторов в коже от распространенности и тяжести течения псориаза и псориатического артрита, а также определена их корреляция с индексами прогрессии данной патологии, индексами VAS и PASI.

Впервые определены лабораторные маркеры активности псориаза в моче: выявлена прямая корреляционная зависимость между индексом PASI и концентрациями IL-6 и IL-8 в моче при псориазе и взаимосвязь между уровнем IL-6 и содержанием белка в моче, что может указывать на диагностическую значимость этого цитокина как маркера «активности поражения почек» при псориазе. Установлена повышенная экспрессия гена FOXP3 в коже больных псориазом по сравнению с практически здоровыми лицами. Изучен уровень экспрессии гена FOXP3 в визуально здоровой и пораженной коже у больных псориазом, также установлены закономерности экспрессии этого гена по мере прогрессирования заболевания. Выявлена прямая корреляционная зависимость между уровнем экспрессии гена FOXP3 в визуально здоровой коже больных псориазом и индексом тяжести и распространенности заболевания (PASI).

^ Теоретическая значимость работы

В данной работе освещены три аспекта иммунопатогенеза псориаза: участие цитокинов, Т-регуляторных клеток, а также хемокинов и их рецепторов в формировании и поддержании псориатического воспаления. С помощью мультиплексного анализа цитокинов показано вовлечение в патогенез псориаза «цитокинового каскада», включающего активацию провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, Th1- и Th2-цитокинов, хемокинов, а также факторов иммуногемопоэза, ростовых факторов и адгезионных молекул. На уровне регуляторных Т-клеток было выявлено нарастающее повышение экспрессии гена FOXP3 по мере прогрессирования заболевания. Выявлена прямая корреляционная зависимость между индексом тяжести и распространенности псориаза и концентрациями IL-6 и IL-8 в моче.

Третий аспект относится к определению закономерностей повышенного местного синтеза СС- и СХС-хемокинов и хемокиновых рецепторов в кожных биоптатах больных псориазом, участвующих в формировании и поддержании воспаления в коже. Высказана гипотеза о наличии в визуально непораженной коже больных псориазом повышенного содержания мРНК хемокинов (CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2) и двух рецепторов для CXCL8/IL-8 (СXCR1 и СXCR2) как потенциальных биомаркеров заболевания, что наиболее значимо в дебюте псориаза, особенно при суставных его проявлениях.

^ Практическая значимость работы

Определение показателей повышенной экспрессии мРНК хемокинов (CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2) и рецепторов (СXCR1 и СXCR2) в сочетании с повышенной экспрессией мРНК FOXP3 в коже предполагается рекомендовать к использованию в клинической практике для дифференциальной диагностики псориаза, что наиболее значимо в дебюте заболевания, особенно при суставных его проявлениях. Для определения активности заболевания рекомендуется определять IL-6 и IL-8 в моче, предлагаемые «маркеры» активности псориаза, которые определяются с помощью неинвазивных методов и доступны для клинического применения. Для уточнения поражения почек при псориазе возможно определение IL-6, который коррелирует с содержанием белка в моче.

^ Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. В сыворотке крови больных псориазом значительно увеличено по сравнению с практически здоровыми лицами содержание провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-9, IL-12 (p40), IL-13, IL-16, IL-18, TNF-α, IL-2Rα, IFN-α2 и LIF), Th1-цитокинов (IFN-γ); Th2-цитокинов (IL-5), хемокинов (CCL11/eotaxin, CCL4/MIP-1β, CCL7/MCP-3, CCL27/CTACK, CXCL1/GRO-α, CXCL9/MIG, CXCL12/SDF-1α), а также факторов иммуногемопоэза, ростовых факторов и адгезионных молекул (GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-3, SCGF, β-NGF, HGF и ICAM-1).

2. У пациентов с псориазом по сравнению с больными атопическим дерматитом и склеродермией повышенная экспрессия мРНК хемокинов (CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2), хемокиновых рецепторов (СXCR1 и СXCR2) и FOXP3 в визуально здоровой и пораженной коже сочетается с повышенным содержанием IL-6, GM-CSF, IFN-γ и TNF-α в сыворотке крови и повышенным содержанием IL-4, IL-10, GM-CSF, IFN-γ и TNF-α в моче.

3. Рост клинической активности псориаза сопровождается повышенным содержанием IL-2, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFN-γ и TNF-α в периферической крови и повышенным содержанием IL-8, IL-10, GM-CSF, IFN-γ в моче в сочетании с повышенной экспрессией мРНК FOXP3, хемокинов (CCL11/ eotaxin, CCL24/eotaxin-2, CCL3/MIP-1α и CCL4/MIP-1β) и рецепторов для CXCL8/IL-8 (CXCR1, CXCR2) в биоптатах визуально здоровой и пораженной кожи.

^ Личный вклад автора

Автором лично выполнено проведение punch-биопсий у больных псориазом, групп сравнения и практически здоровых лиц. Автором проводилась оценка тяжести заболевания, подсчет интегральных индексов – PASI и VAS, проведение ПЦР диагностики (выделение мРНК из биоптатов кожи, проведение обратной транскрипции, амплификация, проведение электрофореза и детекция продуктов амплификации). Вклад соавторов состоял в помощи при отборе, клиническом обследовании больных псориазом и псориатическим артритом и групп сравнения (Ильина Т.Н., Шемеровская Т.Г., Хобейш М.М.), а также в освоении и постановке новых методов исследования (Сысоев К.А.). Доля участия автора в накоплении, обобщении, анализе материала составляет 100%.

^ Апробация работы

Основные положения диссертационного исследования были доложены на конференциях: Общества Молодых Ученых СПбГМУ имени акад. И.П. Павлова «Санкт-Петербургские научные чтения - 2007» (Санкт-Петербург, 2007), II Международный молодежный медицинский конгресс (Санкт-Петербург, 2007), на конференции 8-th JOHN HUMPHREY (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов» (Санкт-Петербург, 2008), Объединенный иммунологический форум – 2008 (Санкт-Петербург, 2008), XIII Всероссийском научном форуме с международным участием имени акад. В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009). Работа поддержана грантами Правительства Санкт-Петербурга № 4/04-05/19 в 2008 и № 4/30.04/021 в 2009 году.

^ Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, включает список сокращений, введение, обзор литературы, описание материалов и методов, содержит три главы собственных наблюдений, обсуждение результатов исследования, заключение, выводы, практические рекомендации, приложение, содержит список литературы, включающий 243 источника (20 отечественных и 223 зарубежных). Работа содержит 20 таблиц и 17 рисунков.

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликовано 6 печатных работ, в том числе 1 публикация в научном журнале рекомендованном ВАК.


^ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Всего обследовано 108 человек, из них 70 человек принадлежали к основной группе (пациенты с псориазом и псориатическим артритом, средний возраст 46,6±9,5 года), 20 человек составили группу сравнения (атопический дерматит, средний возраст 30,8±5,9 лет и склеродермия, средний возраст 46,1±11,8 лет) и 18 группу контроля (практически здоровые лица, средний возраст 30,9±15,3 лет). У всех больных псориазом были собраны анамнестические данные о течении заболевания. Постановка диагноза осуществлялась на основании клинической картины, рентгенологического исследования суставов, анамнестических данных и выявления в большинстве случаев антигенов HLA B27, а также на основании новых диагностических критериев, разработанных в 2006 году международной группой исследователей CASPAR (Classification Criteria for Psoriatic Arthritis).

Для определения тяжести заболевания, наряду с оценкой клинической активности, были использованы индексы оценки кожных и суставных псориатических поражений - индексы PASI (Psoriasis Area and Severity Index) и VAS (Visual Analog Scale). Оценка PASI проводилась из расчетных данных: легкая степень до 10 баллов PASI включительно, средняя степень – от 10 до 20 баллов, тяжелая – 20 баллов и более. В группе пациентов с псориазом было 20 человек с индексом PASI менее 10 (средний возраст 45,1±10,3 лет), 30 пациентов с индексом PASI от 10 до 20 (средний возраст 42,2±7,5 лет) и 20 пациентов с псориазом с индексом PASI более 20 (средний возраст 47,1±11,8 лет).

Иммунологическое исследование биоптатов и образцов сыворотки крови и мочи больных проводилось в лабораториях Научно-методического центра по молекулярной медицине на базе СПбГМУ.

Материалом для исследования служили образцы кожных биоптатов, полученных методом punch-биопсии от пациентов, страдающих псориазом, из участков визуально неповрежденной кожи и из бляшечных элементов. Punch-биопсия производилась с помощью одноразового стерильного пробойника диаметром 3мм (Stumpp Medizintechnik GmbH, Германия). Всем пациентам проводилось определение экспрессии мРНК хемокинов CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2, CXCL8/IL-8 и их рецепторов CCR1, CCR3, CCR5, CXCR1, CXCR2 и мРНК FOXP3 с помощью постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) с предварительной обратной транскрипцией. Реакционная смесь для ПЦР содержала следующие компоненты: 5x ПЦР-буфер (Амплисенс, Москва), деионизированная вода – до 20 мкл, праймеры (от 0,05 до 0,3 µM) производства «Синтол» (Москва), ДНК-Taq полимеразу («ДНК-Технология, Москва», 1,0 ферм.ед. в пробе) и мРНК (7,5 мкл в пробе), в общем объеме 10 мкл. ПЦР проводили в амплификаторе ICycler (Bio-Rad, США). Режим ПЦР: денатурация ДНК при 95С – 4 мин., 30 циклов амплификации (95С – 30 с., 60С – 30 с., 72С – 30 с.), элонгация 72С – 7 мин. Визуализацию полученных ПЦР-продуктов осуществляли в 1,5 % агарозном геле, окрашенным бромистым этидием, при УФ освещении на трансиллюминаторе «Волна» (Россия). Полуколичественную оценку проводили с помощью программы Gel-Pro, принимая за 100 % интенсивность флюоресценции β-актина. Мультиплексное определение панели цитокинов IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-γ, GM-CSF, TNF-α (проводилось в сыворотке и моче 52 больных псориазом), а у 10 пациентов в сыворотке крови определялись: IL-1α, IL-1β, IL-12 (p40), IL-12(p70), IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, TNF-α, TNF-β, TRAIL, MIF, IL-10, IL-1RA, IL-2, IL-2Rα, IFN-α2, IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-13, LIF, FGFbasic, SCGF, PDGF-BB, β-NGF, VEGF, HGF, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-3, IL-7, ICAM-1, VCAM-1, SCF, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CCL7/MCP-3, CCL11/eotaxin, CCL27/CTACK, CXCL1/GROα, CXCL8/IL-8, CXCL9/MIG, CXCL10/IP-10, CXCL12/SDF-1α с использованием коммерческих наборов и прибора BIO-Plex («BIO-RAD», США).

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программы «Statistica 6.0» (StatSoft, США). Две группы независимых переменных сравнивались U-тестом Вилкоксона-Манна-Уитни. При отсутствии нормального распределения переменных использовалась ранговая корреляция по Спирмену. Достоверными считались различия между группами при р < 0,05, что является стандартным уровнем для медико-биологических исследований.


^ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Содержание цитокинов в сыворотке крови и в моче больных псориазом

Первоначально у 10 пациентов было определено содержание 50 цитокинов. Эти цитокины, в зависимости от функциональной активности, были разделены на провоспалительные, противо-воспалительные, цитокины, продуцируемые Th1- и Th2-клетками, ростовые и иммуногемопоэтические факторы, адгезионные молекулы.

Было показано, что в сыворотке крови больных псориазом повышены значения провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-12 (p40), IL-16, IL-18, IL-2Rα, IFN-α2, IL-9, IL-13 и LIF в группах с индексом PASI до 10 и более 20 по сравнению с практически здоровыми лицами (p < 0,01). Выявленный уровень IL-18 и IL-2Rα в сыворотке крови у больных псориазом с индексом PASI более 20 был достоверно повышен по сравнению с больными с индексом PASI менее 10, напротив, уровни IL-1α и IL-16 были повышены у пациентов с индексом PASI менее 10 по сравнению с пациентами с индексом PASI более 20 (p < 0,005). Среди противовоспалительных цитокинов не были выявлены достоверные различия между больными псориазом и практически здоровыми лицами, а также различия между группами. Среди цитокинов, продуцируемых клетками Th1-типа, было выявлено повышенное значение IFN-γ в группе с индексом PASI менее 10 по сравнению с группой с индексом PASI более 20 (p < 0,05). По содержанию цитокинов, продуцируемых клетками Th2-типа, было выявлено повышенное значение IL-5 в группе с индексом PASI менее 10 и более 20 по сравнению с практически здоровыми лицами (p < 0,01). Не было выявлено различий по концентрации цитокинов, продуцируемых клетками Th2-типа, между группами с индексом PASI менее 10 и более 20. Было выявлено, что в сыворотке крови больных псориазом достоверно увеличены значения: CCL4/MIP-1β, CCL7/MCP-3, CCL11/eotaxin, CCL27/CTACK, CXCL9/MIG и CXCL12/SDF-1α, как в группе с индексом PASI менее 10, так и в группе с индексом PASI более 20 по сравнению с практически здоровыми лицами (p < 0,01). Также было показано, что в сыворотке крови больных псориазом с индексом PASI менее 10 достоверно повышено содержание CXCL10/IP-10 по сравнению с практически здоровыми лицами (p < 0,01). Выявленный уровень CCL7/MCP-3 и CCL27/CTACK в сыворотке крови у больных псориазом с индексом PASI более 20 был достоверно повышен по сравнению с больными с индексом PASI менее 10, а уровень CXCL1/GROα был повышен у пациентов с индексом PASI менее 10 по сравнению с индексом PASI более 20 (p < 0,005). В ходе настоящей работы было установлено, что у пациентов с псориазом по сравнению с практически здоровыми лицами достоверно повышено значение цитокинов, относящихся к ростовым факторам: SCGF, beta-NGF (p < 0,01). Были выявлены повышенные значения факторов иммуногемопоэза (G-CSF, M-CSF и IL-3) и повышенные значения ICAM-1 в сыворотке крови больных псориазом с индексом PASI до 10 и более 20 по сравнению с практически здоровыми лицами (p < 0,01). Уровни IL-3 и ICAM-1 в сыворотке крови у больных псориазом с индексом PASI более 20 были достоверно повышены по сравнению с больными с индексом PASI менее 10, а уровень HGF был повышен у пациентов с индексом PASI менее 10 по сравнению с индексом PASI более 20 (p < 0,005).

Скрининговое исследование уровня продукции 50 цитокинов в сыворотке крови больных псориазом выявило разноплановые изменения цитокинового профиля. В связи с этим были выбраны 8 основных цитокинов (IL-2, IL-6, TNF-α, IL-10, IFN-γ, IL-4, GM-CSF и IL-8), участвующих в патогенезе псориаза, и были исследованы их концентрации у 52 пациентов. При оценке уровня цитокинов было отмечено статистически значимое увеличение содержания провоспалительных цитокинов: IL-2, IL-6, GM-CSF, IFN-γ и TNF-α в сыворотке крови у больных псориазом по сравнению с практически здоровыми лицами (р < 0,01). Было установлено, что у больных псориазом повышено содержание цитокинов (GM-CSF и IFN-γ) в сыворотке крови по сравнению с атопическим дерматитом (p < 0,01). Было выявлено, что содержание GM-CSF в сыворотке крови больных псориазом без поражения суставов повышено, а IL-8 снижено по сравнению с сывороткой, полученной от пациентов с атопическим дерматитом (р < 0,01). В настоящей работе было показано, что у пациентов с атопическим дерматитом в сыворотке крови повышены значения IL-6, IFN-γ и TNF-α по сравнению с практически здоровыми лицами (p < 0,01).

При исследовании уровня цитокинов в моче больных псориазом выявлена повышенная концентрация противовоспалительного цитокина – IL-10, а также выявлено увеличение провоспалительных цитокинов (GM-CSF, IFN-γ и TNF-α) по сравнению с практически здоровыми лицами (p < 0,05). Выявлено повышенное содержание цитокинов IL-2, IL-4 и IL-8 в моче больных псориазом по сравнению с больными со склеродермией (р < 0,01). Было установлено, что у больных псориазом в моче повышено содержание GM-CSF и IFN-γ по сравнению с пациентами с атопическим дерматитом. Были выявлены повышенные значения в моче IL-10 и GM-CSF у больных псориазом (без поражения суставов) и сниженные значения IL-8 по сравнению с пациентами с атопическим дерматитом; и у пациентов с поражением суставов выявлены повышенные значения IL-10 и GM-CSF по сравнению с пациентами со склеродермией (р < 0,01).

Было выявлено, что у больных псориазом без поражения суставов повышена концентрация IL-2 и IL-8 и у больных псориазом с поражением суставов повышены значения IL-2 и IL-4 в моче по сравнению с пациентами со склеродермией (р < 0,01).

В группе с максимальной активностью псориатического воспаления (индекс PASI более 20) выявлено увеличение провоспалительного цитокина – IL-2 в сыворотке крови по сравнению с практически здоровыми лицами (p < 0,001). В двух группах с индексом PASI менее 10 и индексом PASI более 20 выявлено увеличение GM-CSF в сыворотке крови по сравнению с практически здоровыми лицами (p < 0,001). Показано, что у пациентов с индексом PASI более 20 в сыворотке крови повышены значения IL-2, IL-6, IL-8, IL-10 и GM-CSF по сравнению с пациентами с индексом PASI менее 10 (p < 0,01). Также выявлено повышенное содержание IL-2 в сыворотке крови в группе с индексом PASI более 20 по сравнению с индексом PASI от 10 до 20 (p < 0,01). Определение уровня цитокинов в моче в зависимости от тяжести и распространенности кожного поражения показало повышенные значения IL-10, GM-CSF, IFN-γ во всех трех группах по сравнению с практически здоровыми лицами (p < 0,001). В группе пациентов с индексом PASI менее 10 выявлено достоверно повышение TNF-α по сравнению с практически здоровыми лицами (p < 0,007). Было выявлено повышенное значение IL-8 в группе с индексом PASI более 20 по сравнению с индексом PASI менее 10 (p < 0,05).

Таблица 1. Концентрация цитокинов в сыворотке крови больных псориазом, пациентов со склеродермией,

атопическим дерматитом и практически здоровых лиц


^ Концентрация цитокинов в сыворотке крови (пг/мл), Me (min-max):

TNF-α

1,4

(0-11,3)*

0,4

(0-21,1)

0,6

(0-11,3)

0,3

(0,2-8,2)

0,4

(0,4-1,9)*

0,1

(0-1,2)

*-достоверность различий показателя по сравнению с практически здоровыми лицами, (p < 0,05)

۞-достоверность различий показателя по сравнению с пациентами с атопическим дерматитом, (p < 0,01) (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).


IFN-γ

7,3

(0-75,3)* ۞

1,9

(0-12,2)

4,7

(0-75,3)

2,3

(1,4-8,3)

3,5

(0,3-5,3)*

0

(0-1,1)

GM-CSF

7,3

(0-25,0)* ۞

4,1

(0-10,7)¤

0,8

(0-25,0)

1,4

(0,2-9,7)*

0,4

(0-0,8)

0

(0-3,7)

IL-10

0,1

(0-355,3)

0

(0-4,3)

0,9

(0-7,0)

0

(0-3,6)

0,1

(0-1,8)

0

(0-0,9)

IL-8

0,5

(0-200,7)

0,37

(0-21,5) ۞

0,8

(0-51,5)

0,9

(0,4-7,1)

1,3

(0,5-26,2)

1,0

(0-2,4)

IL-6

2,4

(0-86,5)*

0,4

(0-15,4)

5,9

(0-86,5)

3,0

(0,3-25,5)*

1,3

(0,4-6,5)*

0

(0-0,1)

IL-4

0

(0-159,8)

0

(0-18,9)

0

(0-111,8)

0

(0-19,3)

1,1

(0-4,5)

0

(0-1,6)

IL-2

0,1

(0-106,2)*

0

(0-5,5)

0,5

(0-106,2)

0,1

(0,-15,8)*

0,2

(0-1,3)

0

(0-0)

Группа обследованных

Псориаз (группа в целом) (n = 52)

- псориаз без поражения суставов (n = 18)

-псориаз с поражением суставов (n = 34)

Склеродермия (n = 10)

Атопический дерматит (n = 10)

Практически здоровые лица (n = 10)

Анализ взаимосвязи уровней цитокинов и клинических показателей позволил выявить прямую корреляционную взаимосвязь индекса PASI и уровня IL-8 (r = 0,5, p < 0,00001) в моче и обратную в сыворотке крови IFN-γ и ЦИК (r = -0,51, p < 0,008). Была выявлена умеренная корреляционная зависимость между содержанием белка в моче пациентов и уровнем IL-6 (r = 0,4, p < 0,006).


Экспрессия FOXP3 в коже больных псориазом

В настоящей работе было показано, что в коже практически здоровых лиц не экспрессируется FOXP3, а в коже больных псориазом была выявлена достоверно увеличенная экспрессия гена FOXP3 как в пораженной коже, так и в визуально здоровой больных псориазом. Были выявлены достоверно повышенные значения экспрессии гена FOXP3 в визуально здоровой и пораженной коже больных псориазом по сравнению с практически здоровыми лицами, как в группе пациентов с поражением суставов, так и без поражения суставов (p < 0,005) (таблица 3). Достоверных различий между экспрессией FOXP3 в коже больных псориазом без поражения и с поражением суставов выявлено не было. При оценке результатов экспрессии мРНК FOXP3 в коже пациентов со склеродермией была выявлена повышенная экспрессия гена FOXP3 в визуально здоровой и в пораженной коже пациентов по сравнению с практически здоровыми лицами (p < 0,00001). Также была установлена повышенная экспрессия гена FOXP3 в визуально здоровой коже пациентов со склеродермией по сравнению с визуально здоровой кожей при псориазе (как в группе с поражением суставов, так и без поражения суставов) (p < 0,001), а в пораженной коже при псориазе выявлена повышенная экспрессия гена FOXP3 по сравнению со склеродермией (p < 0,005).

При оценке результатов экспрессии мРНК FOXP3 в коже пациентов с атопическим дерматитом была обнаружена повышенная экспрессия гена FOXP3 в визуально здоровой и в пораженной коже по сравнению с практически здоровыми лицами (p < 0,00001). Была установлена повышенная экспрессией гена FOXP3 в пораженной коже пациентов с атопическим дерматитом по сравнению с визуально здоровой кожей (p < 0,005). Во всех группах пациентов по индексу PASI была выявлена достоверная разница между визуально здоровой и пораженной кожей больных псориазом и кожей практически здоровых лиц (p < 0,00001). Корреляционный анализ индекса PASI и экспрессии мРНК FOXP3 в визуально здоровой коже больных псориазом выявил прямую корреляционную зависимость (r = 0,35, p = 0,0001).

Таблица 2. Концентрация цитокинов в моче больных псориазом, пациентов со склеродермией, атопическим дерматитом и практически здоровых лиц
и практически здоровых лиц

^ Концентрация цитокинов в моче (пг/мл), Me (min-max):

TNF-α

0,3

(0-39,7)*

0,7

(0-12,7)*

0,3

(0-39,7)*

0,3

(0,2-8,2)*

0,2

(0,1-0,4)*

0

(0-0,1)

*-достоверность различий показателя по сравнению с практически здоровыми лицами, (p < 0,05)

**- достоверность различий показателя по сравнению с пациентами со склеродермией, (p < 0,01)

۞-достоверность различий показателя по сравнению с пациентами с атопическим дерматитом, (p < 0,01) (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).



IFN-γ

3,9

(0-179,7)* ۞

5,0

(0-75,3) *

3,3

(0-179,7)*

2,3

(1,4-8,3)*

0,8

(0-5,3)

0

(0-0)

GM-CSF

5,8

(0-36,4)* ۞

7,9

(0-11,8) * ۞

3,8

(0-36,4)* ۞

1,4

(0,2-9,7)*

0

(0-0,8)

0

(0-0)

IL-10

1,2

(0-16,1)*

0,3

(0-11,6)* ۞

1,8

(0-16,1)* ۞

0

(0-3,6)

0

(0-0,2)

0

(0-0)

IL-8

0,8

(0-78,9)**

0

(0-34,0) ** ۞

1,9

(0-78,9)

0,9

(0,4-7,1)

4,5

(0,5-26,2)

0,7

(0,1-4,7)

IL-6

0,3

(0-625,3)

0,1

(0-15,2)

0,4

(0-625,3)

3,0

(0,3-25,5)

1,2

(0,4-2,2)

1,3

(0-11,9)

IL-4

0,2

(0-18,8)**

1,2

(0-6,5)

0,2

(0-18,8)**

0

(0-19,3)

0

(0-4,5)

0

(0-0,1)

IL-2

0,1

(0-10,8)**

0,1

(0-10,8)**

0

(0-8,2)**

0,1

(0-15,8)

0

(0-0,4)

0,1

(0-0,7)

Группа обследованных

Псориаз (группа в целом) (n = 52)

- псориаз без поражения суставов (n = 18)

-псориаз с поражением суставов (n = 34)

Склеродермия

(n = 10)

Атопический дерматит (n = 10)

Практически здоровые лица (n = 10)


Таблица 3. Показатели уровня экспрессии мРНК FOXP3 в кожных
биоптатах больных псориазом, атопическим дерматитом, склеродермией и практически здоровых лиц



Группы обследованных

Экспрессия мРНК FOXP3 в биоптатах:

визуально здоровой кожи

пораженной кожи

Me (min-max)

Me (min-max)

Псориаз (группа в целом) (n = 60)

5,4 (0-60,1) * ۞

21,9 (4,5-90,1) * ۞ "

псориаз без поражения суставов (n = 20)

6,5 (1,2-18,7) * ۞

18,9 (7,4-77,6) * ۞"

псориаз с поражением суставов (n = 40)

5,1 (0-60,1) * ۞

36,0 (4,5-90,1) * ۞ "

Склеродермия (n = 10)

23,0 (0-89,0) *

8,1 (4,3-10,7) *"

Атопический дерматит
(n = 10)

9,2 (0-20,5) *

33,5 (0-43,5) *"

Практически здоровые лица (n = 18)

0 (0-0)

* - достоверность различий по сравнению с практически здоровыми лицами, (p < 0,00001);

۞ - достоверность различий показателя по сравнению с пациентами со склеродермией, (p < 0,001);

"- достоверность различий значений показателя пораженной кожи по сравнению с визуально здоровой кожей, (p < 0,005) (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).


Синтез хемокинов и хемокиновых рецепторов
в коже больных псориазом


В ходе исследования было показано, что в коже практически здоровых лиц экспрессируются гены хемокинов CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CXCL8/IL-8 и гены рецепторов ССR1, CCR3 и ССR5 для СС семейства хемокинов, однако рецепторы для СXС семейства хемокинов не экспрессируются.

При сравнении результатов экспрессии хемокинов и их рецепторов в коже практически здоровых лиц в зависимости от возраста, было выявлено, что в группе 16-20 лет повышена экспрессия CXCL8/IL-8, по сравнению с группой 31-60 лет, также выявлено, что повышено значение CCL4/MIP-1β в группе 31-60 лет по сравнению с группой 16-20 лет (p < 0,05). При анализе экспрессии хемокинов и их рецепторов в коже больных псориазом и здоровых лиц была выявлена достоверно повышенная экспрессия CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β и рецепторов CXCR1 и CXCR2 как в визуально здоровой, так и в пораженной коже больных псориазом по сравнению с практически здоровыми лицами (p < 0,05). При оценке результатов экспрессии хемокинов и их рецепторов в визуально здоровой коже больных псориазом и пациентов с бляшечной склеродермией и атопическим дерматитом (группы сравнения) была выявлена повышенная экспрессия CCL11/eotaxin (p = 0,01), CCL24/eotaxin-2 (p = 0,02), CCL4/MIP-1β (р = 0,02) как в визуально здоровой, так и в пораженной коже больных псориазом (рис. 2, А и Б).

По распространенности псориаза пациенты были разделены на три группы с PASI меньше 10, с PASI от 10 до 20 и с PASI более 20. В первой группе пациентов была выявлена достоверно повышенная экспрессия генов CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2, CCL5/RANTES и рецепто­ров CXCR1, CXCR2 в биоптатах визуально здоровой кожи. Экспрессия генов CCL11/eotaxin и CXCR1, CXCR2 в биоптатах пораженной кожи пациентов также была достоверно повышена (p < 0,05) (рис. 1, А и Б).
Во второй группе была выявлена достоверно повышенная экспрессия генов CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2, CCL5/RANTES, CXCR1, CXCR2, CXCL8/IL-8 в биоптатах визуально здоровой кожи.



*-достоверность различий по сравнению с практически здоровыми лицами (p < 0,05)


Рис. 1. Экспрессия мРНК хемокинов и их рецепторов в визуально здоровой коже (А) и пораженной коже (Б) больных псориазом, склеродермией и атопическим дерматитом (p < 0,05).

В третьей группе была выявлена достоверно повышенная экспрессия генов CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2, CCL3/MIP-1α, CXCR1, CXCR2, в биоптатах визуально здоровой кожи пациентов. Выявлена достоверно повышенная экспрессия генов CCL11/eotaxin, CCL24/ eotaxin-2, CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CXCR1, CXCR2, в биоптатах пораженной кожи пациентов (p < 0,05) (рис. 1, А и Б). Выявлена обратная корреляционная зависимость между экспрессией хемокинов: CCL24/eotaxin-2 (r = –0,94, p = 0,005), CCL3/MIP-1α (r = –0,94, p = 0,005), CCL4/MIP-1β (r = –0,85, p = 0,03) и рецепторов: ССR5 (r = –0,79, p = 0,005) и CXCR2 (r = –0,94, p = 0,005), в визуально здоровой коже пациентов с псориазом и индексом PASI меньше 10. Выявлена прямая корреляционная зависимость между экспрессией мРНК CCL11/eotaxin (r = 0,69, p = 0,04) в визуально здоровой коже пациентов с псориазом и индексом PASI при его значениях от 10 до 20. Выявлена прямая корреляционная зависимость между уровнем экспрессии ССR1 (r = 0,82, p = 0,02), CCR3 (r = 0,74, p = 0,02) и ССR5 (r = 0,82, p = 0,006) в пораженной коже пациентов с псориазом и значениями PASI при его значениях от 10 до 20. В группе больных с индексом PASI более 20 корреляционных зависимостей выявлено не было.

Таким образом, полученные в работе данные характеризуют некоторые этапы патогенеза псориаза и показывают сложную многоступенчатую структуру формирования и поддержания воспаления при псориазе.


Выводы

1. В сыворотке крови больных псориазом достоверно повышено содержание провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-9, IL-12 (p40), IL-13, IL-16, IL-18, TNF-α, IL-2Rα, IFN-α2 и LIF), Th1-цитокинов (IFN-γ); Th2-цитокинов (IL-5), хемокинов (CCL11/eotaxin, CCL4/MIP-1β, CCL7/MCP-3, CCL27/CTACK, CXCL1/GRO-α, CXCL9/MIG, CXCL12/SDF-1α), а также факторов иммуногемопоэза, ростовых факторов и адгезионных молекул (GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-3, SCGF, β-NGF, HGF и ICAM-1) по сравнению с практически здоровыми лицами.

2. Повышенное содержание провоспалительных цитокинов (IL-6, GM-CSF, IFN-γ и TNF-α) в сыворотке крови больных псориазом по сравнению с пациентами с атопическим дерматитом и склеродермией достоверно коррелирует с клиническими (PASI) и общелабораторными показателями (ЦИК).

3. У больных псориазом содержание IL-4, IL-10, GM-CSF, IFN-γ и TNF-α в моче повышено по сравнению с атопическим дерматитом и склеродермией.

4. Повышенная экспрессия мРНК FOXP3 в пораженной и визуально здоровой коже при псориазе коррелирует с клинической активностью заболевания и отражает отличие псориаза от атопического дерматита и склеродермии.

5. В коже практически здоровых лиц экспрессируются гены хемокинов (CCL4/MIP-1β, CCL5/RANTES, CXCL8/IL-8) и гены рецепторов для СС-семейства хемокинов (ССR1, CCR3 и ССR5), однако отсутствует экспрессия рецепторов для семейства СXС-хемокинов, а также СС-хемокинов (CCL3/MIP-1, CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2).

6. Повышенный синтез хемокинов (CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL11/ eotaxin, CCL24/eotaxin-2) и двух рецепторов для CXCL8/IL-8 (СXCR1 и СXCR2) в визуально здоровой коже больных псориазом позволяет рассматривать эти показатели как потенциальные биомаркеры заболевания, что наиболее значимо в дебюте псориаза, особенно при суставных его проявлениях.


^ Практические рекомендации


1. Выявление повышенной экспрессии мРНК хемокинов (CCL3/MIP-1α, CCL4/MIP-1β, CCL11/eotaxin, CCL24/eotaxin-2) и рецепторов (СXCR1 и СXCR2) в сочетании с повышенной экспрессией мРНК FOXP3 в коже рекомендуется использовать для дифференциальной диагностики псориаза, что наиболее значимо в дебюте заболевания, особенно при суставных его проявлениях.

2. Определение концентрации IL-6 и IL-8 в моче при псориазе рекомендуется использовать для определения активности заболевания.

3. Для определения тяжести поражения почек при псориазе рекомендуется проводить определение уровня IL-6 в моче.


^ Список работ, опубликованных по материалам диссертации


  1. Бельтюкова А.С., Сысоев К.А., Тотолян Арег А. Экспрессия некоторых хемокинов и их рецепторов при псориазе // Тез. науч. работ II Международного молодежного медицинского конгресса «Санкт-Петербургские научные чтения-2007». – СПб, 2007. – С. 25.

  2. Beltyukova A.S., Sysoev K.A., Totolyan Areg A. Expression of genes of chemokines and their receptors in patients with psoriasis // Сб. науч. тр. 8th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology. – Moscow, 2007. – P. 8.

  3. Бельтюкова А.С., Сысоев К.А., Ильина Т.Н., Шемеровская Т.Г.,

    Хобейш М.М., Монахов К.Н., Тотолян Арег А. Экспрессия мРНК хемокинов и хемокиновых рецепторов в коже больных с псориазом // Медицинская иммунология. – 2008. – Т. 10, № 4-5. – C.337-346.



  4. Бельтюкова А.С., Сысоев К.А., Ильина Т.Н., Шемеровская Т.Г.,

    Хобейш М.М., Монахов К.Н., Тотолян Арег А. Экспрессия мРНК хемокинов и хемокиновых рецепторов в коже больных с псориазом // Российский иммунологический журнал. – 2008. – Т. 2 (11), № 2-3. – С.130.

  5. Бельтюкова А.С. Хемокины и хемокиновые рецепторы кожи как потенциальные биомаркеры псориаза // Аннотации научных работ победителей конкурса грантов Санкт-Петербурга 2008 года для студентов, аспирантов молодых ученых и молодых кандидатов наук. – СПб.: Фонд «ГАУДЕАМУС». – С.100.

  6. Бельтюкова А.С., Сысоев К.А., Ильина Т.Н., Шемеровская Т.Г.,

    Хобейш М.М., Монахов К.Н., Тотолян Арег А. Продукция цитокинов в сыворотке крови и моче пациентов псориазом // Медицинская иммунология. – 2009. – Т. 11, № 4. – С.364-365.


Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:

Похожие:

«Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет имени академика И. П. Павлова» icon«Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им акад. И. П. Павлова»
Работа выполнена на кафедре стоматологии детского возраста с курсом челюстно-лицевой хирургии гоу...
«Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет имени академика И. П. Павлова» icon«Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им акад. И. П. Павлова»
Работа выполнена на кафедре терапевтической стоматологии гоу впо «Санкт-Петербургский государственный...
«Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет имени академика И. П. Павлова» iconН. А. Тотолян Санкт-Петербургский Государственный медицинский университет им акад. И. П. Павлова

«Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет имени академика И. П. Павлова» iconС. Ф. Багненко доктор медицинских наук, профессор, академик рамн, ректор гоу впо «Санкт-Петербургский

«Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет имени академика И. П. Павлова» iconВ. В. Дунаевский Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им акад. И. П. Павлова,

«Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет имени академика И. П. Павлова» iconОбезболивания современными анестетиками при лечении пульпита 14. 00. 21 Стоматология
Работа выполнена на кафедре терапевтической стоматологии гоу впо «Санкт-Петербургский государственный...
«Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет имени академика И. П. Павлова» iconСанкт-Петербургский государственный медицинский

«Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет имени академика И. П. Павлова» iconСанкт-Петербургский государственный медицинский

«Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет имени академика И. П. Павлова» iconТ. В. Черниговская Санкт-Петербургский Государственный Университет

«Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет имени академика И. П. Павлова» iconА. Л. Калинкин закончил Первый московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова

Разместите кнопку на своём сайте:
Медицина


База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
Документы