Клинико-биохимические и иммунологические особенности развития легочной гипертензии при врожденных пороках сердца у детей раннего возраста 14. 01. 08 Педиатрия
|
|
Скачать 378.38 Kb.
|
|
На правах рукописи Артеменко Ольга Игоревна Клинико-биохимические и иммунологические особенности развития легочной гипертензии при врожденных пороках сердца у детей раннего возраста 14.01.08 – Педиатрия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2010 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». ^ Профессор, доктор медицинских наук Н.П. Котлукова Научный консультант: Кандидат биологических наук М.П. Давыдова ^ Профессор, доктор медицинских наук И.В. Леонтьева Профессор, доктор медицинских наук М.И. Баканов Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Защита диссертации состоится «1» февраля 2010 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.02 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1). Автореферат разослан «30» декабря 2009 года. Ученый секретарь диссертационного совета, профессор, доктор медицинских наук Н.П. Котлукова ^ Актуальность проблемы Врожденные пороки сердца (ВПС) занимают первое место среди причин развития легочной гипертензии (ЛГ) у детей. Перестройка, а затем склерозирование легочного сосудистого русла приводит к формированию комплекса Эйзенменгера, продолжительность жизни при котором не превышает 25-30 лет (Бураковский В.И., 1975, Белозеров Ю.М., 2004). У детей первого года жизни при врожденных пороках сердца с лево-правым шунтом развивается гиперволемическая легочная гипертензия. При своевременной хирургической коррекции ВПС давление в легочной артерии снижается до нормальных значений, т.е. возможен полный регресс заболевания. Однако, у части пациентов по не совсем понятным причинам уже в раннем возрасте развиваются необратимые изменения легочных сосудов и даже радикальная коррекция порока оказывается бесперспективной (Бокерия Л.А., 1999). В группу риска входят дети с синдромом Дауна и ВПС, у которых легочная гипертензия прогрессирует значительно быстрее. Необходимо отметить, что высокое легочное сопротивление и высокое давление в легочной артерии, определяемые при помощи допплер-ЭхоКГ, не позволяют однозначно судить о степени перестройки легочного сосудистого русла (Levy M., 2007). Наиболее достоверным методом для определения прогноза заболевания в настоящее время является катетеризация полостей сердца и инвазивное измерение давления в легочной артерии с использованием функциональных проб (ингаляции оксида азота, кислорода, введение блокаторов кальциевых каналов, простаноидов и др.) (Горбачевский С.В., 2006). Однако понятно, что такое исследование обладает высоким риском, проводится только в высокоспециализированных кардиохирургических стационарах и не может быть скрининговым. Изучение патогенеза ЛГ при ВПС в конечном итоге направлено на: 1) поиск биохимического маркера степени ЛГ для решения вопроса о целесообразности и сроках хирургического лечения ВПС; 2) определение мишеней для фармакологической коррекции этого заболевания. Нарастание легочного сосудистого сопротивления является следствием дисбаланса вазоконстрикторных и вазорелаксирующих стимулов. Поэтому неоднократно предпринимались попытки по содержанию вазоактивных субстанций (эндотелина-1, тромбоксана А2, продуктов окисления оксида азота и др.) в крови предсказать течение ЛГ (Granton G.T., 2002, Горбачевский С.В., 2006). Тем не менее, ключевым моментом все- таки является соотношение разных медиаторов, а не их абсолютная концентрация в крови. Сведения о механизмах, лежащих в основе развития ЛГ, за относительно короткий срок (последнее десятилетие) позволили создать лекарства, к примеру, препараты простациклина, антагонисты эндотелиновых рецепторов и ингибиторы фосфодиэстеразы, значительно улучшающие качество жизни пациентов с этим заболеванием (Белозеров Ю.М., 2004). Новым направлением в изучении патогенеза многих заболеваний сердца и сосудов (артериальной гипертензии, сахарного диабета, атеросклероза) стало определение роли свободных радикалов. Ткань легких вследствие ее анатомических особенностей и высокого напряжения кислорода наиболее подвержена окислительному стрессу и в норме характеризуется высокой активностью антиоксидантной системы. При патологических изменениях во время развития ЛГ происходит нарастание активных форм кислорода (Cracowski J.L., 2001, Black S.M., 2006), а по данным исследований последних лет они играют одну из ключевых ролей в процессах пролиферации и гипертрофии гладкомышечных клеток и фибробластов. Показано участие некоторых цитокинов в формировании ЛГ (Dorfmüller P., 2003, Levi, M., 2007). Однако данные преимущественно зарубежной литературы по этому вопросу немногочисленны и касаются взрослых групп пациентов с комплексом Эйзенменгера. Это определило актуальность изучения новых аспектов патогенеза гиперволемической легочной гипертензии у детей первого года жизни с ВПС. ^ оценка роли иммунных механизмов и антиоксидантной системы в патогенезе легочной гипертензии при врожденных пороках сердца с учетом особенностей легочной гемодинамики, а также обоснование целесообразности их коррекции у детей раннего возраста. ^
^ В работе установлено участие провоспалительных иммунных механизмов (IL-1, TNF-α) в развитии легочной гипертензии при ВПС и впервые показано, что их активация происходит на ранних стадиях заболевания у детей грудного возраста. Впервые проведена комплексная оценка антиоксидантных параметров у здоровых детей в данной возрастной группе. Изучена реакция антиоксидантной системы у грудных детей в ответ на изменения легочной гемодинамики при различных ВПС, а также у детей с наследственной предрасположенностью к окислительному стрессу при синдроме Дауна. Обнаружена взаимосвязь между активностью каталазы сыворотки и степенью тяжести легочной гипертензии у пациентов с несиндромальной формой ВПС. Выявлены особенности патогенеза ЛГ у детей с синдромом Дауна, как то отсутствие ответа антиоксидантной системы на усиление окислительного стресса и низкий уровень экспрессии провоспалительных цитокинов при развитии ЛГ. ^ В работе изучены новые аспекты формирования легочной гипертензии у детей раннего возраста с ВПС, что пополняет знания о физиологии данного заболевания, в особенности - гиперволемической стадии ЛГ. Результаты работы могут быть использованы для дальнейшего изучения процессов патогенеза легочной гипертензии и поисков новых методов лечения. Обоснована целесообразность исследования эффективности антиоксидантных препаратов, как одного из направлений в терапии ЛГ и гипоксемии при ВПС, в том числе при синдроме Дауна. Определены параметры антиоксидантной системы (каталазная и общая антиоксидантная активность неферментативных соединений сыворотки, концентрация общего глутатиона в плазме) у здоровых детей 1-го года жизни, которые могут быть использованы как нормативы для последующих исследований. ^ Результаты, полученные в ходе исследования, внедрены в практическую деятельность отделений новорожденных и грудного возраста Перинатального кардиологического центра ГКБ № 67 г. Москвы и используются в методической и практической работе для занятий со студентами, ординаторами и аспирантами на кафедре детских болезней № 2 ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. ^ . Материалы диссертационной работы обсуждены на заседании кафедры детских болезней № 2 ГОУ ВПО РГМУ. Основные результаты работы доложены на V Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии 2006» и V Всероссийском конгрессе «Детская кардиология 2008». Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ. ^ Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав, посвященных результатам собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов, заключения, практических рекомендаций и выводов. Библиография включает источника отечественной и - зарубежной литературы. Диссертация иллюстрирована таблицами, графиками и рисунками. ^ Объект исследования. Работа проводилась на базе Перинатального кардиологического центра ГКБ № 67 (главный врач – А.С. Шкода) и ДКБ № 13 им. Н.Ф. Филатова (главный врач – В.В. Попов) г. Москвы. Для решения поставленных задач было обследовано 80 детей в возрасте от 1 до 34 месяцев. Основную группу составили пациенты с ВПС и повышением давления в легочной артерии (26 детей), не имеющие синдромальной патологии. Критериями исключения являлись острые и хронические инфекционные заболевания, пороки развития легких, другие возможные (помимо ВПС, гиперволемии) причины развития ЛГ, анемия III ст., декомпенсированные соматические заболевания и аллергодерматозы в стадии обострения. В исследование не включали детей, перенесших кардиохирургическую коррекцию ВПС. В отдельную группу были выделены дети с ВПС и ЛГ в сочетании с синдромом Дауна (13 пациентов), т.к. известно, что эта категория детей наиболее рано развивает высокую необратимую ЛГ. Особенностью пациентов с синдромом Дауна является их генетическая предрасположенность к окислительному стрессу, обусловленная высокой активностью супероксиддисмутазы 1 типа, ген которой расположен в 21 хромосоме, вследствие чего повышается содержание перекиси водорода в крови. Для анализа данных были набраны 3 группы сравнения пациентов аналогичного возраста: 1) практически здоровые дети (23 ребенка); 2) дети с синдромом Дауна без кардиологической патологии (9 пациентов); 3) дети с ВПС и гиповолемией МКК (9 пациентов). Для уточнения диагноза всем пациентам было проведено общеклиническое (выяснение анамнеза, осмотр, общие анализы крови и мочи) и кардиологическое обследование, которое включало ЭКГ, допплер-ЭхоКГ, рентгенографию грудной клетки, измерение сатурации. Характеристика групп представлена в табл.1. ^
Примечание. Данные по возрасту пациентов представлены в виде среднего. B скобках даны минимальное и максимальное значения. ООАВК – общий открытый атриовентрикулярный канал, ДМЖП - дефект межжелудочковой перегородки, ДМПП - дефект межпредсердной перегородки, ДОС - двойное отхождение сосудов, МАРС - малая аномалия развития сердца, МКК – малый круг кровообращения, ОАП - открытый артериальный проток, ООО - открытое овальное окно, ПЖ - правый желудочек сердца, СД – синдром Дауна, СЛА – стеноз легочной артерии, ТФ – тетрада Фалло. Выделенные группы пациентов были сравнимы по возрасту и распределению по полу. Пациенты с ВПС и признаками недостаточности кровообращения получали кардиологическую терапию в зависимости от тяжести НК – сердечные гликозиды (дигоксин), диуретики (верошпирон, фуросемид), ингибиторы АПФ (капотен), метаболические препараты (панангин, рибоксин, элькар). Методы. Лабораторная часть исследования проводилась на кафедре нормальной и патологической физиологии факультета фундаментальной медицины ГУНУ МГУ им. М.В. Ломоносова (зав. кафедрой - д.б.н., профессор В.Б. Кошелев) под руководством к.б.н. М.П. Давыдовой. Для решения поставленных задач нами были изучены: 1. ^ : - экспрессия мРНК IL-1, IL-6, TNF-α в лимфоцитарно-моноцитарной фракции крови; 2. Параметры антиоксидантной системы: - активность каталазы сыворотки, - общая антиоксидантная активность низкомолекулярных водорастворимых соединений сыворотки (АОА), - концентрация общего глутатиона в плазме крови; 3. ^ : - экспрессия мРНК индуцибельной NOS в лимфоцитарно-моноцитарной фракции крови, - содержание нитритов и нитратов в сыворотке. Анализ экспрессии мРНК цитокинов IL-1, IL-6, TNF-α и индуцибельной NO-синтазы в лимфоцитарно-моноцитарной фракции крови методом обратной транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР)Для анализа экспрессии проводили забор 1 мл венозной крови. Мононуклеарные клетки и лимфоциты периферической крови выделяли непосредственно после ее забора центрифугированием (при 24ºС и 1500 g в течение 15 мин) в градиенте плотности Ficoll-Paque (1,077 г/см3), в качестве антикоагулянта использовали ЭДТА. Отбирали обогащенную лимфоцитами и моноцитами интерфазу, добавляли эквиобъем тканевой среды RPMI и осаждали клетки центрифугированием в течение 15 минут при температуре 24ºС и 400 g. Выделение РНК. Выделение РНК проводили с помощью фенольно-хлороформного метода с использованием TRI-реагента (Sigma). После гомогенизации при добавлении 500 мкл TRI-реагента, образцы перемешивали с 150 мкл хлороформа и проводили разделение фаз центрифугированием (12000 g в течение 20 минут при 4С). РНК из водной фазы осаждали добавлением эквиобъема изопропилового спирта и последующим центрифугированием при 14000 g в течение 30 минут при 4С. Осадок РНК промывали дважды 75%-ным этанолом и растворяли в 25 мкл деионизованной воды, обработанной диэтилпирокарбонатом и содержащей 2 ед. активности ингибитора РНКаз (Sintol). Относительную концентрацию РНК оценивали электрофоретически. Проведение ДНК-азной обработки РНК. Для удаления примеси ДНК образцы, содержащие 1-2 мкг РНК и 1 единицу активности ингибитора РНКазы, инкубировали в течение 40 минут при 37С с 2 единицами активности ДНКазы I, не обладающей РНКазной активностью (Fermentas). После инкубации инактивировали ДНКазу стоп-реагентом (Fermentas). Качество ДНК-азной обработки отслеживали по результатам ПЦР для -актина. Проведение обратной транскрипции (ОТ) мРНК. Обратную транскрипцию проводили в течение 1,5 часов при 38С в образцах, содержащих на 0,5-1 мкг обработанной ДНКазой РНК 100 единиц активности обратной транскриптазы MMuLV (Fermentas), 1 единицу активности ингибитора РНКазы, 0,1 мкг олиго(18)-dТ праймеров (Sintol), 60 моль гексарандом праймеров (Sintol), 400 мкМ дезоксинуклеотидилтрифосфатов (Sigma). Проведение полимеразной цепной реакции. В пробирки с кДНК вносили 0,13 мМ дезоксинуклеотидилтрифосфатов, 4 pмоль специфичных праймеров и 0,5 единицы активности Taq-полимеразы (Fermentas) в 1-кратном буфере для ПЦР. Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием амплификатора “Терцик” (“ДНК-технология”, Россия) в течение 39 (для -актина) или 42 циклов (IL-1, IL-6, TNF-) при параметрах: 95С – 15 секунд, 60С (для -актина, IL-1, TNF-) или 62С (для IL-6) – 20 секунд, 72С – 30 секунд. Были использованы следующие пары праймеров: для -актина - 5’-AGGCCAACCGCGAGAAGATGAC, 5’-TCGGCCGTGGTGGTGAAGC, для IL-1 - 5'-CTCCTCACCCACACCATCAGCCGC, 5'-GAAGGTTGGATGTTCGTCCTCCACT, для TNF- - 5'-CAGAGAGTCCTGTGCTGAATGTGGA, 5'-AGAGGAGGGTTTCTTAGAACCAA, для IL-6 - 5'-GATTCCAAAGATGTAGCCGCCCCACA, 5'-CATTTGTGGTTGGGTCAGGGGTGGT, для iNOS - 5'-GGCTCCTTCAAAGAGGCAAAAATAGA, 5'-AGTAATGGCCGACCTGATGTTGC. Результаты ПЦР анализировали электрофоретически, используя 2%-ный агарозный гель. Производилась фотосъемка геля в ультрафиолете на цифровую камеру «Kodak DC 290 Zoom», с обработкой полученного изображения программой «KODAK 1D Image Analysis Software» («Kodak», США). Результатом явилась относительная яркость полос ампликонов, выраженная в условных единицах, сравниваемая с яркостью продуктов ПЦР положительного контроля (кДНК стимулированных лимфоцитов). Количественный анализ проводили на основании калибровочных кривых, полученных по результатам амплификации растворов контрольной кДНК после последовательных 10-ти кратных разведений. Определение активности антиоксидантной системы Измерение каталазной активности сыворотки крови проводили при помощи спектрофотометрии. При длине волны 240 нм регистрировали истощение Н2О2 в пробе, содержащей 50 мкл сыворотки на 2 мл инкубационной смеси (50 мМ РВS, рН=7,4, Н2О2 10 мМ) за 1 мин., из чего рассчитывали максимальную активность каталазы на мл сыворотки. Измерение содержания общего глутатиона в плазме крови проводили спектрофотометрически при длине волны 412 нм. К 1 мл 50 мМ калий-фосфатного буфера, рН=7,5, добавляли 150 мкл депротеинизированной плазмы. Реакцию начинали добавлением DTNB (до концентрации 200 мкМ). Для восстановления окисленного глутатиона использовали глутатион-редуктазу в концентрации 0,5 Ед/мл, что требовало внесения NADPH (до 100 мкМ). Концентрацию глутатиона определяли после 1 мин. инкубации по калибровочной шкале. Измерение АОА сыворотки крови осуществлялось методом фотохемилюминесценции (ФХЛ). К раствору, содержащему 1500 мкл бидистиллята, 1000 мкл карбонатного буфера (0.1 М, рН=10,4) и 10 мкл люминола (1мМ, pH=7,83), добавляли по 10 мкл сыворотки. Число измерений каждого образца было равно трем. Результаты измерения АОА водорастворимых антиоксидантов представлялись в эквивалентных единицах концентрации аскорбиновой кислоты путем сравнения полученных данных АОА с экспериментальными данными градуировочной кривой для аскорбиновой кислоты в диапазоне концентраций от 10 до 400 мкМ. Для определения содержания нитритов и нитратов в сыворотке крови производили депротеинизацию сыворотки путем добавления в пробу этанола в соотношении 1:2. С целью восстановления нитратов до нитритов использовали раствор VCl3. Для определения концентрации нитритов использовали реакцию Грисса. После инкубации в течение 60 мин. при t=37 C измеряли оптическую плотность при длине волны 492 нм. Содержание нитратов/нитритов вычисляли по калибровочной шкале. Статистическая обработка данных Полученные результаты обрабатывались с помощью пакета программ SPSS 15.0. Данные представлены в виде медианы с указанием минимального и максимального значений либо среднего (M) ± стандартная ошибка среднего (SD). Оценка различий между группами проводилась при помощи непараметрических методов. Степень связи между признаками оценивали, вычисляя коэффициент ранговой корреляции Спирмена (k). Значения р<0,05 считали значимыми. ^ В нашей работе было обследовано 39 пациентов с ВПС и лево-правым шунтом, следствием чего является развитие гиперволемической легочной гипертензии. 13 пациентов с синдромом Дауна и ВПС были выделены в отдельную группу т.к. известно, что у них легочная гипертензия прогрессирует быстрее. В группах детей с ВПС родители предъявляли жалобы на одышку, утомляемость при кормлении и другой физической нагрузке, недостаточную прибавку массы тела, задержку психомоторного развития. При антропометрии была обнаружена гипотрофия у 13 из 26 детей (50%) в основной группе, из них у 9 пациентов - гипотрофия II-III степени. Особенностью пациентов с синдромом Дауна было наличие дефицита массы тела у всех 13 пациентов с ВПС, 10 из которых имели гипотрофию II-III степени. Пациенты контрольной группы поступали в стационар для обследования по поводу шума в сердце. У них были диагностированы анатомические особенности, не влияющие на системную и легочную гемодинамику - дополнительные трабекулы или хорды левого желудочка, ООО, пролапс митрального клапана с минимальной регургитацией. Симптомов сердечной недостаточности у детей контрольной группы обнаружено не было. Систолическое давление в ПЖ составило не более 30 мм рт. ст.. Среди сопутствующей патологии у детей как основной, так и групп сравнения встречались следующие заболевания: функциональные нарушения желудочно-кишечного тракта, дисбиоз кишечника, анемия, рахит, атопический дерматит, пахово-мошоночная грыжа, дисплазия тазобедренных суставов, последствия перинатального поражение ЦНС гипоксически-ишемического генеза в виде гидроцефального синдрома, синдрома повышенной нервно-рефлекторной возбудимости, синдрома мышечной дистонии, гипотонии, задержки психомоторного развития. Кардиологическое обследование включало допплер-ЭхоКГ, рентгенографию грудной клетки, ЭКГ и определение сатурации крови кислородом. Врожденные пороки сердца, давление в ПЖ и возраст пациентов в каждой группе представлены в табл. 1. Среди ВПС в основной группе доминировал ДМЖП – у 19 из 26 пациентов, который по частоте встречаемости в популяции в целом занимает 1-е место. У детей с синдромом Дауна наиболее часто встречался ООАВК (у 5 из 13 пациентов) – «типичный» ВПС для этого синдрома. Наличие порока сердца с лево-правым шунтом крови приводило к развитию клинических признаков недостаточности кровообращения (НК). Степень НК определяли по классификации Н.А. Белоконь (1987). Некоторые показатели инструментального обследования в образовавшихся группах приведены в табл. 2. ^
Примечание. Данные представлены в виде среднего (M) ± стандартная ошибка среднего (SD). В скобках указаны минимальное и максимальное значения в каждой группе. СД – синдром Дауна, КТИ – кардиоторакальный индекс, SaO2 - сатурация крови О2. Основным эхокардиографичеким критерием, характеризующим степень легочной гипертензии, было систолическое давление в правом желудочке (ПЖ), которое определяли по градиенту регургитации на трикуспидальном клапане или по градиенту давления ЛЖ-ПЖ при наличии ДМЖП. У всех пациентов основной группы и группы «СД + ВПС» отмечался лево-правый сброс крови. При этом признаки легочной гипертензии (повышение систолического давления в ПЖ, расширение ЛА, увеличение правых отделов сердца) были обнаружены у 33 из 39 пациентов. Систолическое давление в ПЖ составило 17-130 мм рт.ст.. На рентгенограмме у пациентов с ВПС и лево-правым шунтом обнаруживали усиление сосудистого рисунка по артериальному типу, расширение и утрату структурности корней легких, признаки эмфиземы легких, кардиомегалию, выбухание дуги легочной артерии. В табл.2 продемонстрировано нарастание кардиоторакального индекса (КТИ) одновременно с нарастанием давления в ПЖ по мере утяжеления клинических симптомов сердечной недостаточности. Основными особенностями ЭКГ являлись признаки гипертрофии правого и/или левого желудочков, нагрузка на предсердия, нарушения проводимости в виде блокады правой ножки пучка Гиса, метаболические изменения миокарда желудочков. Нарушения сердечного ритма в виде редкой желудочковой экстрасистолии были зарегистрированы лишь у одного ребенка с ДМЖП и начальной ЛГ. Статистически значимые отличия в насыщении крови кислородом были обнаружены между пациентами с «ВПС и гиповолемией МКК» и контрольной группой - 85±8 и 96±2 % соответственно (p<0,05). Снижение сатурации у данных пациентов обусловлено наличием классических «синих» ВПС – ТФ, ДОС со СЛА - в этой группе. Статистические различия между другими группами по сравнению с контролем не найдены. Безусловно, все вышеперечисленные клинико-инструментальные особенности хорошо описаны и составляют «классический» симптомокомплекс легочной гипертензии при ВПС у детей раннего возраста. Основное внимание в нашей работе было уделено изучению роли антиоксидантных механизмов, системы оксида азота и иммунных провоспалительных факторов при данной патологии. 1. Провоспалительные факторы: экспрессия мРНК провоспалительных цитокинов в лимфоцитарно-моноцитарной фракции крови. В нашем исследовании планировалось определить, насколько рано при ВПС с обогащением МКК и формированием ЛГ в процесс вовлекаются провоспалительные цитокины (IL-1, IL-6, TNF-α), и сопоставить их уровень со степенью гемодинамических нарушений. Острые и хронические инфекционные заболевания были критерием исключения для всех групп. Их отсутствие было подтверждено по данным осмотра, клинических анализов крови и мочи, рентгенографии органов грудной клетки, отсутствия патогенной флоры в посеве из носа и зева, отрицательных результатов посева кала на микробы кишечной группы. У пациентов с ВПС и лево-правым шунтом было обнаружено увеличение экспрессии IL-1 и TNF-α в лимфоцитах по сравнению с контролем (табл.3, рис.1), и их уровни коррелировали между собой (k = 0,77, p<0,05). Примечательно, что у здоровых детей зависимость уровней экспрессии этих цитокинов между собой отсутствовала.  ^ СД – синдром Дауна, МКК – малый круг кровообращения. * р<0,05. Наши данные совпадают с литературными, в которых продемонстрирована активация провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, TNF-α, хемокинов) при ЛГ в более старших возрастных группах (Dorfmüller P., 2003, G.P., 2008). Провоспалительные цитокины синтезируются иммунными клетками в периферической крови и лимфоцитарно-моноцитарными бронховаскулярными инфильтратами в легких, а также эндотелиальными клетками. Предполагаются различные пути влияния провоспалительных факторов на легочное сосудистое русло. В культуре легочных артериальных гладкомышечных клеток показано увеличение экспрессии циклооксигеназы 2 типа под воздействием IL-1β, IL-6, TGF- β1, что приводит к гиперпродукции PgE2 – одного из основных легочных вазоконстрикторов – и угнетение синтеза простациклина (Bradbury 2002, Itoh A., 2003). Провоспалительные цитокины стимулируют образование свободных радикалов. Обнаружено негативное влияние IL-6 и TNF-α на количество и функции предшественников эндотелиальных клеток, которые мобилизуются из костного мозга и участвуют в постнатальном васкулогенезе (Diller P., 2008). Известно, что провоспалительные цитокины оказывают неблагоприятное влияние на функциональное состояние миокарда (Kelly R.A., 1997). Нами изучена динамика экспрессии IL-1 и TNF-α в зависимости от степени НК. Полученные данные неоднозначны (табл.3). Наибольший уровень экспрессии обоих цитокинов получен у детей с НК IIA, а при утяжелении НК наблюдается снижение их экспрессии в лимфоцитах, хотя она по-прежнему остается выше, чем в группе сравнения. Объяснением этого явления, возможно, служит тот факт, что 3 из 8 детей в группе НК IIБ получали глюкокортикоиды (преднизолон), обладающие мощным противовоспалительным действием. ^
Примечание. Данные представлены в виде медианы в условных единицах, в скобках указаны минимальное и максимальное значение в каждой группе. НК – недостаточность кровообращения. * р<0,05 по сравнению с контрольной группой. ** p<0,05 по сравнению с группой «ВПС+ЛГ» У пациентов с ВПС и гиповолемией МКК не обнаружено усиления экспрессии провоспалительных цитокинов в мононуклеарах крови, что, по нашему мнению, связано с «сохранностью» легочного сосудистого русла при данной патологии. Следует отметить, что нами не выявлено экспрессии IL-6 в лимфоцитарно-моноцитарной фракции крови во всех группах. Однако по литературным данным при ЛГ и синдроме Эйзенменгера имеет место нарастание этого цитокина в крови и легких в более старших возрастных группах (Dorfmüller P., 2003, Diller G.P., 2008). Возможно, что экспрессия IL-6 увеличивается на более поздних стадиях заболевания и ее отсутствие является особенностью детей первого года жизни. Низкая экспрессия провоспалительных цитокинов при ЛГ у детей с ВПС и синдромом Дауна, вероятно, связана с относительным иммунодефицитным состоянием, что свойственно пациентам с этой патологией (Kola 1997, Goldacre M.J., 2004). 2. Параметры антиоксидантной системы. В нашем исследовании впервые была проведена комплексная оценка антиоксидантных показателей у здоровых детей первого года жизни и пациентов с ЛГ (табл.4). ^
Данные представлены в виде среднего (M) ± стандартная ошибка среднего (SD). GSH – глутатион, NOx – нитриты/нитраты. * р<0,05 по сравнению с контрольной группой. - Возрастная динамика обсуждаемых показателей в контрольной группе. Анализируя полученные данные, мы столкнулись с тем обстоятельством, что стандартных тестов и возрастных норм антиоксидантных показателей у детей 1-го года жизни до настоящего времени не разработано. В результате проведенного исследования было установлено, что в группе контроля концентрация глутатиона в плазме обратно коррелировала (k = -0,69, p<0,05) с возрастом ребенка (рис.2). Для каталазной и общей антиоксидантной активности сыворотки зависимости от возраста обнаружено не было.  ^ По литературным данным известно о высоком уровне окислительного стресса у новорожденных и постепенном снижении различных маркеров окислительного стресса у детей с 1 года до 16 лет (Kauffman L.D., 2003, Tsukahara H., 2007). Наши данные по падению концентрации общего глутатиона в плазме в течение 1-го года жизни у здоровых детей согласуются с общей тенденцией, отмеченной в литературе. Объяснением этого явления может служить более высокий уровень метаболизма и митохондриального дыхания у детей. - Каталазная активность сыворотки. Каталазная активность сыворотки на первый взгляд не отличалась между здоровыми детьми и детьми с ВПС (табл.4, рис.3). Она составила 37,4±14,8, 39,3±29,7 и 33,5±13,1 Ед/мл в группах «ВПС с ЛГ», «ВПС с гиповолемия МКК» и контрольной соответственно. Однако мы обратили внимание на зависимость между величиной давления в правом желудочке при пороках с лево-правым сбросом крови (ДМЖП, ДМПП, АВК) и активностью каталазы. У пациентов с наиболее высоким давлением (систолическое давление в ПЖ 80±25 мм Hg) в правом желудочке была обнаружена более высокая каталазная активность сыворотки. Коэффициент корреляции 0,68 (p<0,05). Разделив пациентов с ВПС «бледного» типа на клинические группы по выраженности недостаточности кровообращения (НК), были получены достоверные отличия между группой сравнения и пациентами, страдающими НК IIБ ст. и высокой ЛГ, а также между группами с начальной и высокой ЛГ (табл. 4, рис.3).  ^ . НК – недостаточность кровообращения, ЛГ - легочная гипертензия, ВПС – врожденный порок сердца. Вероятно, только значительное повышение давления в ЛА влияет на активность каталазы в отличие от прооксидантных ферментов, экспрессия и активность которых зависят даже от небольшого изменения напряжения сдвига (Grobe A.C., 2006). С другой стороны, нарастание каталазной активности в миокарде показано при формировании «легочного сердца» (Farahmand F., 2004). Вовлечение в процесс провоспалительных и тромбогенных факторов (IL-1, IL-6, TNF-α, TxA2, серотонина) по литературным данным приводит к усилению окислительного стресса (Liu J.Q., 2004). Однако взаимосвязи между повышенным уровнем экспрессии IL-1 и TNF-α и определявшимися параметрами антиоксидантной системы у наших пациентов с ЛГ не выявлено. Пациенты с ВПС и гиповолемией в легких были распределены на 2 группы в зависимости от степени насыщения крови кислородом. В первую группу вошли пациенты без признаков артериальной гипоксемии в покое, во вторую – пациенты со сниженной сатурацией (81±2 по сравнению с 96±2 % в контроле), диффузным цианозом, повышенным уровнем гемоглобина (149±35 и 109±15 г/л соотв.) и эритроцитозом (4,7±0,7 и 3,6±0,5х109/мл соотв.) в крови (табл. 4, рис.3). Эти дети отличались высокой активностью каталазы, в то время как у пациентов с обедненным легочным потоком, но без существенных признаков гипоксемии, каталазная активность сыворотки, напротив, была ниже, чем в контроле. Такое разделение пациентов с ВПС «синего» типа с клинической точки зрения не выглядит удивительным и обусловлено, во-первых, разной степенью стеноза ЛА, и, во-вторых, разной степенью смешения артериальной и венозной крови, т.е. величиной право-левого шунта. Недаром клинически выделяют «бледную» форму тетрады Фалло. Пациенты с синдромом Дауна вне зависимости от степени ЛГ по активности каталазы не отличались от группы сравнения. ^ Учитывая выявленную зависимость (вероятно, нелинейную) уровня общего глутатиона в плазме крови от возраста у здоровых детей 1-го года жизни, дальнейшее сравнение групп по этому показателю представляло значительные сложности. Небольшая численность каждой группы не позволила разделить их на еще более мелкие возрастные отрезки. О достоверных отличиях можно говорить только между здоровыми детьми и пациентами с синдромом Дауна без ВПС, у которых наблюдалось снижение уровня глутатиона в плазме крови. Также в группе пациентов с синдромом Дауна без ВПС найдена обратная корреляция средней силы (k = -0,72) между активностью каталазы и концентрацией глутатиона в плазме. ^ АОА низкомолекулярных соединений сыворотки у пациентов с синдромом Дауна была выше, чем в группе сравнения (10,5±2,6 Ед и 6,9±2,9 Ед в образце соответственно, р<0,05). В других группах различий обнаружено не было. 3. Система оксида азота: уровень нитритов/нитратов (NOx) в сыворотке и экспрессия мРНК iNOS в мононуклеарах крови. В нашей работе были измерены уровень нитритов/нитратов в сыворотке крови методом спектрофотометрии и экспрессия индуцибельной NO-синтазы в лимфоцитарно-моноцитарной фракции крови при помощи ПЦР. Нитриты и нитраты – основной продукт окисления оксида азота. Неоднократно предпринимались попытки по их концентрации в крови судить о количестве «эндотелиального фактора расслабления сосудов» и активности NOS (Hampl V., 2000). С другой стороны известно, что в условиях окислительного стресса эндотелиальная NO-синтаза «переключается» на синтез активных форм кислорода. При этом увеличивается концентрация стабильных продуктов окисления NO – нитритов и нитратов. При анализе собственных данных корреляции продуктов окисления NO в сыворотке и гемодинамических показателей при ЛГ обнаружено не было (табл. 4), что отмечено и большинством других авторов. Соответственно, этот показатель не может характеризовать тяжесть ЛГ. Высокий уровень нитритов/нитратов у детей с синдромом Дауна, вероятно, объясняется повышением содержания перекиси водорода в крови, окисляющей оксид азота. Экспрессия мРНК iNOS в лимфоцитах обнаружена у 6 пациентов: у 4 – из группы с гиперволемией МКК (n=17), у 1 – из группы с гиповолемией МКК (n=6), и у 1 – из группы сравнения (n=17). Причины экспрессии iNOS именно у этих детей и связи с другими параметрами, в частности, с уровнем NOx, найти не удалось. Особенности антиоксидантной защиты при синдроме Дауна. Антиоксидантная активность сыворотки, измеренная при помощи ФХЛ, характеризует суммарный антиоксидантный потенциал неферментативных водорастворимых соединений, содержащихся в крови. К ним относятся аскорбиновая кислота, глутатион, билирубин, мочевая кислота. Результаты для пациентов с синдромом Дауна, полученные в нашей работе, обобщены на рис. 4. У пациентов с синдромом Дауна АОА была выше, чем в группе сравнения (10,5±2,6 Ед и 6,9±2,9 Ед в образце соответственно, р<0,05), а уровень глутатиона в плазме ниже по сравнению со здоровыми детьми (1,8±1,0 и 4,0±2,3 мкмоль/мл, р<0,05). Разнонаправленность этих изменений свидетельствует, что повышение АОА при синдроме Дауна не связано с тиосульфидной системой, а зависит от количества других низкомолекулярных антиоксидантов, содержащихся в крови. По литературным данным известно, что у пациентов с синдромом Дауна повышена концентрация мочевой кислоты в плазме вследствие высокой интенсивности пуринового обмена (несколько генов ферментов, участвующих в метаболизме пуринов локализованы в 21 хромосоме). Также отмечен более высокий уровень аскорбиновой кислоты у детей с синдромом Дауна по сравнению с возрастным контролем (Brodsky G., 1997, Pallardo F.V., 2006). Вероятно, эти особенности отвечают за относительно более высокую АОА сыворотки при болезни Дауна. У пациентов с синдромом Дауна в сочетании с ВПС и гиперволемией в легких сохраняется тенденция по двум выше указанным параметрам, но разброс значений слишком большой для обнаружения достоверных различий (АОА 9,5±7,4 Ед, глутатион 3,0±3,7 мкмоль/мл). Эта группа детей была разнородна и по возрасту, и по тяжести кардиологической патологии, степени НК. Ранее мы отметили, что у детей с ЛГ при несиндромальной форме ВПС каталазная активность сыворотки зависит от степени ЛГ, в частности, была выявлена прямая корреляция между активностью каталазы и давлением в правом желудочке. Тем не менее, у детей с синдромом Дауна подобной закономерности ни по одному из исследуемых параметров не обнаружено. Каталазная активность сыворотки в трех группах не отличалась (ДК 39,3±21,2 , Д-ЛГ 34,4±17,1, К 36,6±17,9 Ед/мл сыворотки). В большинстве исследований других авторов также активность каталазы была сравнима с контролем. ^ Уровень нитритов и оксидантная активность, нитратов сыворотки, мкМ Ед/мл сыворотки  * * *  В Активность каталазы, Г Концентрация глутатиона Ед/мл сыворотки в плазме, мкМ  *  Рис.4 Особенности антиоксидантной системы у детей с с-мом Дауна А – неферментативная антиоксидантная активность сыворотки, Б - уровень нитритов и нитратов в сыворотке, В - активность каталазы, Г - концентрация глутатиона в плазме. К – контрольная группа, Д-К – синдром Дауна без ВПС, Д-ЛГ – синдром Дауна + ЛГ. В группе пациентов с синдромом Дауна без ВПС найдена обратная корреляция средней силы (k = - 0,72, p<0,05) между активностью каталазы и концентрацией глутатиона в плазме. И каталаза, и глутатионпероксидаза отвечают за детоксикацию перекиси водорода, концентрация которой в крови при болезни Дауна повышена. Эта зависимость, вероятно, обусловлена отрицательной обратной связью между двумя антиоксидантными ферментными системами, контроль которых может осуществляться как на уровне экспрессии генов ферментов так и регуляцией синтеза глутатиона. Наше исследование показало, что в ответ на усиление окислительного стресса у детей с болезнью Дауна не происходит адекватной активации антиоксидантных ферментных систем (каталазы и глутатиона). Увеличение АОА низкомолекулярных соединений сыворотки на 20-30 % вряд ли носит компенсаторный характер, а скорее связано с измененным пуриновым метаболизмом и повышением активности ксантиноксидазы. Нарушения окислительного статуса при синдроме Дауна во многом генетически обусловлены. С одной стороны, повышенная экспрессия супероксиддисмутазы 1 при неизменной активности каталазы и сниженном уровне глутатиона приводит к избытку перекисных радикалов и окислительному стрессу. С другой стороны, высокая интенсивность пуринового обмена, способствующая накоплению эндогенного антиоксиданта - мочевой кислоты, также связана с трисомией по 21 хромосоме. Однако в равновесии между про- и антиоксидантными факторами первые имеют значительный перевес. Анализ наших данных показывает, что на работу антиоксидантной системы у детей влияют множество параметров. Существуют генетические и возрастные особенности, например, падение концентрации глутатиона в плазме крови в течение 1-го года жизни у здоровых детей и изначально низкий его уровень при синдроме Дауна. Нарушение гемодинамики при ВПС влияет на другой компонент антиоксидантной защиты – каталазную активность сыворотки, при этом прослеживается тенденция от минимальных значений при снижении легочного потока до повышения активности фермента при гиперволемии и ЛГ. Переменная гипоксия известна как один из прооксидантных факторов и выраженная артериальная гипоксемия, возникающая вследствие смешения артериальной и венозной крови при «синих» пороках, очевидно, вызывает компенсаторное повышение каталазной активности крови. Использование антиоксидантов у детей с ВПС и ЛГ и при синдроме Дауна, вероятно, имеет хорошие перспективы, действуя сразу на несколько звеньев патогенеза. Заключение В работе исследованы новые аспекты формирования легочной гипертензии в первые годы жизни у детей с ВПС, что пополняет знания о физиологии данного заболевания. Доказано участие провоспалительных цитокинов и активация антиоксидантной системы при гиперволемической ЛГ. Существенными особенностями пациентов с синдромом Дауна является отсутствие ответа антиоксидантной системы и провоспалительных факторов иммунной системы на ухудшение легочной гемодинамики. Полученные данные указывают на целесообразность исследования эффективности антиоксидантов, как одного из направлений в терапии ЛГ и гипоксемии при ВПС, в том числе при синдроме Дауна. ВЫВОДЫ
^
^
^
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям