14. 00. 36 – аллергология и иммунология автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Санкт-Петербург
|
|
Скачать 0.68 Mb.
|
|
На правах рукописи БАЛДУЕВА Ирина Александровна РАЗРАБОТКА, ОБОСНОВАНИЕ И ОЦЕНКА СОВРЕМЕННОЙ БИОТЕРАПИИ У БОЛЬНЫХ СОЛИДНЫМИ ОПУХОЛЯМИ специальность – 14.00.14 – онкология – 14.00.36 – аллергология и иммунология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Санкт-Петербург 2008 г. Работа выполнена в ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Росмедтехнологий» Научный консультант доктор медицинских наук, профессор Моисеенко В.М. ^ доктор медицинских наук, профессор Барышников А.Ю. доктор медицинских наук, профессор Гершанович М.Л. доктор медицинских наук, профессор Максимов С.Я. Ведущая организация: Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет им. акад. И.П. Павлова. Защита состоится «____»_________________ 2008 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.052.01 ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Росмедтехнологий» (197758, г. Санкт-Петербург, Песочный-2, ул.Ленинградская, д.68). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова Росмедтехнологий». Автореферат разослан «____»_____________________ 2008 г. Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н. Орлова Р.В. ^ Актуальность проблемы В последнее десятилетие достигнуты несомненные успехи в лечении злокачественных опухолей, в первую очередь, вследствие прогресса лекарственной терапии. Одновременно достижения молекулярной биологии, иммунологии, углубленное понимание механизмов прогрессии опухоли и взаимоотношений иммунной системы и опухоли, а также развитие биотехнологии обусловили реальные перспективы улучшения результатов лечения опухолей с помощью методов биотерапии. Разработка методов биотерапии у больных солидными опухолями, основанных на иммунопатологических особенностях заболевания является актуальным направлением в современной клинической онкологии (Cемиглазов В.Ф. и соавт., 1996; Барышников А.Ю. и соавт., 1998; Якубовская Р.И. и соавт., 2004; Georgiev G.P. et al., 1998). Кроме того, понимание механизмов иммунной защиты, исследование причин их несостоятельности и разработка методов коррекции представляет также несомненный научный интерес (Кадагидзе З.Г. и соавт., 2004). Это связано с тем, что злокачественная опухоль в организме является своего рода моделью реакции “трансплантат против хозяина”. Неуклонный рост частоты онкологических заболеваний, низкий уровень выживаемости у больных с IV стадией, недостаточная эффективность традиционных методов лечения у этой категории больных обуславливают социальную значимость данной проблемы (Чиссов В.И. и соавт., 1998; Давыдов М.И. и соавт., 2002). Большой научный интерес представляет изучение механизмов формирования иммунодепрессии у больных злокачественными опухолями. Способность опухоли индуцировать анергию и апоптоз иммунокомпетентных клеток свидетельствует о том, что иммунодепрессия при опухолевом росте может являться следствием негативного исхода клеточной активации (Хансон К.П. и соавт., 1996). Происходит ли это на самом деле у больных солидными опухолями, насколько подвержены нарушения иммунитета биотерапевтической коррекции, как изменение баланса цитокинов сказывается на течении заболевания, и, в том числе, на выраженности специфического противоопухолевого иммунного ответа – все это составляет тот спектр вопросов, который в настоящее время остается во многом не выясненным (Моисеенко В.М. и соавт., 1998). Кроме того, в доступной литературе отсутствует обоснование режимов вакцинотерапии больных злокачественными опухолями, что связано с недостаточным пониманием механизмов индукции оптимального иммунного ответа на каждый опухолеассоциированный антиген. Между тем, очевидно, что эффективность этого метода во многом зависит от рационального его применения. Таким образом, из всего вышесказанного следует, что, несмотря на колоссальные достижения фундаментальной и прогресс клинической онкологии, остается много неясного во взаимоотношении опухоли и иммунной системы организма практически на всех этапах опухолевой прогрессии. Кроме того, появляется целый спектр вопросов, связанных с воздействием различных методов современной биотерапии на это взаимоотношение, что определило цель и задачи настоящего исследования. ^ Повышение эффективности лечения больных солидными опухолями на основе современных высокотехнологичных методов биотерапии. ^
^ В диссертационной работе впервые:
Практическая значимость
Основные положения, выносимые на защиту
^ Основные результаты работы обсуждались на научных конференциях ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Росмедтехнологий» совместно с Кафедрой онкологии с курсом клинической радиологии и на Кафедре клинической лабораторной диагностики Cанкт-Петербургской Медицинской Академии последипломного образования. Результаты работы были представлены на II съезде иммунологов России (г. Сочи, 1999), Европейской школе по онкологии (г. Москва, 1999), III—XI научных конференциях с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург, 1999—2007) III, V и IX (г. Москва, 1999, 2001 и 2006) Ежегодных Российских онкологических конференциях, I Международном конгрессе «Новые медицинские технологии» (г. Санкт-Петербург, 2001), I Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия рака» (г. Москва, 2002), Международной научно-практической конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (г. Санкт-Петербург, 2002), I Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия рака» (г. Москва, 2002), конференции «Проблемы онкоиммунологии: научные и прикладные аспекты» (г. Киев, 2003), 14th Inter. Congress on anti-CancerTreatment (Paris, 2003), III съезда ВОГиС «Генетика в ХХI веке: современное состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2004), межрегиональной научно-практической конференции «Комбинированные и комплексные методы лечения в онкологии» (г. Барнаул, 2004), научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (г. Томск, 2004), конференции «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (г. Санкт-Петербург, 2004), III и V съезде онкологов и радиологов СНГ (г. Минск, 2004; г. Ташкент, 2008), IV—VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (г. Москва, 2005—2008), научно-практической конференции онкологов СЗФО «Меланома кожи. Современное состояние диагностики и лечения» (г. Великий Новгород, 2005), I Российско-американской конференции «Биотехнология и онкология» (г. Санкт-Петербург, 2005), Российской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии в онкологической практике» (г. Барнаул, 2005), 6th World Congress on Melanoma (Vancouver, 2005), Congress «Мediated diseases from theory to therapy» (Moscow, 2005), научно-практической конференции онкологов СЗФО «Меланова кожи. Современное состояние диагностики и лечения» (г. Санкт-Петербург, 2005), XXXIII Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (Rhodes, 2005), 8th International Symposium Biological Therapy of cancer from disease to targeted therapy (Dresden, 2005), Объединенном иммунологическом форуме (г. Санкт-Петербург, 2008). Внедрение результатов работы в практику Результаты работы внедрены и используются в практической и научно-исследовательской работе ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Росмедтехнологий», Институте биологии гена РАН (г. Москва), Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (г. Санкт-Петербург), в учебном процессе кафедры онкологии с курсом клинической радиологии и кафедры клинической лабораторной диагностики Cанкт-Петербургской Медицинской Академии последипломного образования. Структура и объем диссертации Работа состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и 9 приложений. Текст изложен на 263 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 133 рисунка. Список литературы включает 433 источника. ^ Материалы и методы исследования Работа выполнена в ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Росмедтехнологий». Исследование проводилось в период с ноября 1998 по февраль 2008 года. В работе использовались клинические, стандартные лабораторные, биохимические, иммунологические и иммуногистохимические методы исследования больных, позволяющие оценить функциональное состояние организма, инструментальные методы, применяемые при диагностике злокачественных опухолей и метастатических образований. Все экспериментальные исследования выполнены по решению Ученого Совета ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Росмедтехнологий». В исследование включено 322 пациента. Клиническая оценка произведена у 214 пациентов: 121 больной меланомой кожи, 78 больных раком почки, 8 больных раком предстательной железы, 5 больных колоректальным раком, 1 больной злокачественной шванномой, 1 больной немелкоклеточным раком легкого (рис. 1). 102 больных после радикального хирургического лечения или полных циторедуктивных операций и 112 пациентов после частичных циторедуктивных операций.  Рис. 1. Характеристика больных, получавших противоопухолевую вакцинотерапию. Во всех случаях диагноз заболевания был подтвержден гистологическим исследованием, а удаленные опухоли были использованы для приготовления аутологичных культур опухолевых клеток с целью дальнейшей противоопухолевой вакцинотерапии. В исследование включено 108 женщин и 106 мужчин. Средний возраст пациентов составил 53,7 года (от 21 года до 79 лет). Все больные подвергались предварительному обследованию для оценки степени распространенности опухоли. В результате у 112 больных была подтверждена диссеминированная стадия заболевания. Частота поражения различных органов и систем представлена на рис. 2.  Рис. 2. Частота поражения различных органов и систем у больных, получавших вакцинотерапию с лечебной целью. Для отбора больных использовали общепринятые в клинической практике критерии включения и исключения. Критерии включения:
Критерии исключения:
Точкой отсчета наблюдения за больными принималась дата хирургического лечения, в том числе с целью забора образца опухоли для приготовления вакцины. Объективная оценка клинического эффекта (стандартные клинические, лабораторные, рентгенологические и ультразвуковые методы исследования) проводилась после 3-й и 6-й вакцинаций, а также каждые последующие 3 мес. Во время исследования проведен анализ факторов, которые могли бы оказывать влияние на эффективность лечения – тип опухоли, состояние иммунной системы, цель вакцинации, количество вакцинаций. При оценке лечебного действия вакцинотерапии использованы единые критерии объективного эффекта. Критериями объективного эффекта при лечении солидных опухолей является полный или частичный регресс размеров опухоли и метастазов, а также время безрецидивной выживаемости. Статус больного на момент решения вопроса о возможности проведения паллиативной вакцинотерапии оценивался по системе ВОЗ. Степень токсичности вакцин определялась по шкале СТС NCIC (расширенная шкала ВОЗ). При оценке показателей выживаемости период наблюдения исчислялся от даты хирургического лечения первичной опухоли или метастазов, совпадающей с забором опухолевого материала для приготовления вакцины, до даты смерти или последнего контакта с больным или родственниками. Изучение косвенного влияния вакцинотерапии на выживаемость проводили путем сопоставления выживаемости больных, получавших вакцинотерапию с паллиативной и адъювантной целью, прошедших полный (6 вакцинаций) или частичный курс лечения. В табл. 1 указаны вакцины, режимы и способы введения, разработанные и оптимизированные в ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова Росмедтехнологий» с 1998 по 2008 гг. Источником информации о больных были истории болезни и амбулаторные карты ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Росмедтехнологий», заполняемые в процессе лечения и наблюдения. Оценка иммунного статуса пациентов проводилась в лаборатории иммунологии СПб ГУЗ «Городская больница №31». После получения данных из первичной документации и текущие сведения о больных кодировались и фиксировались в специально разработанных бумажных формах и в программе Microsoft Excel персонального компьютера, представляя базу данных для каждой группы больных. Таблица 1 Аутологичные вакцины, режимы и способы введения
Для оценки сроков жизни в различных группах больных использовалась медиана выживаемости, определяемая как период времени, за который погибает половина больных исследуемой группы (Березкин Д.П., 1982), и средняя продолжительность выживания (М) с ее стандартной ошибкой (m). Для вычисления указанных критериев использовалась компьютерная программа Statistica 6.0. Графическая демонстрация осуществлена с помощью кривых Каплана-Мейера. Методы 1. Приготовление вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток. Приготовление вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток состоит из четырех основных этапов: 1-й этап – дезагрегация образца резецированной аутологичной опухоли; 2-й этап – наращивание культуры аутологичной опухоли в условиях, соответствующих требованиям Good Laboratory Practice (GLP); 3-й этап – характеристика клеточного состава (цитологическая, иммуноцитохимическая, клоногенная и др.); 4-й этап – программное замораживание и хранение в условиях -196оС криобанка клеточных культур человека в ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Росмедтехнологий». ^ Для получения суспензии опухолевых клеток используют механический и ферментативный способы диссоциации опухолевой массы. Традиционно предпочтение отдают ферментативной обработке тканей, которая считается наименее травматичной для клеток. В то же время использование этого метода приводит к трудно обнаруживаемым метаболическим нарушениям, в частности, к изменению проницаемости мембран и потере ими части белков, что не вызывает немедленной гибели клеток, но приводит к торможению роста культуры in vitro (Slocum H.K. et al., 1981; Engelholm S.A. et al., 1985). Ряд специалистов применяют механический способ дезагрегации тканевых фрагментов с помощью различных ручных приемов, в том числе с использованием стеклянных гомогенизаторов. Достоинством этого подхода является его дешевизна, а ограничением – низкая жизнеспособность клеток механически травмированной солидной опухоли. В настоящей работе мы использовали автоматизированный механический способ дезагрегации опухолевой ткани с помощью Медимашины (DAKO, Дания) (Ottosen G.L. et al., 1996) в нашей модификации. Для этого опухолевую ткань разделяли на фрагменты 2-3 мм3, помещали в культуральную среду и Медиконы (стерильные ножи) (DAKO, Дания) и дезагрегировали в течение 10 - 60 сек. Время дезагрегации определяли для каждого случая эмпирически в связи с различиями в структурно-морфологической организации опухоли. Далее клеточную суспензию фильтровали с помощью Филконов 70 мкм и 50 мкм (DAKO, Дания), которые позволяют максимально избавиться от стромальных и клеточных конгломератов и отмывали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Количество и жизнеспособность клеток определяли в камере Горяева с помощью трипанового синего. Далее клетки вводили в фиксированный объем полной питательной среды и переносили в индивидуальные культуральные флаконы. ^ Наращивание индивидуальных клеточных культур требует пристального внимания и непрерывного совершенствования технологии культивирования. Для изучения оптимального соотношения компонентов питательной среды использовали три типа сред: DMEM (Invitrogen, США), DMEM/F12 (Биолот, РФ), RPMI-1640 (Serva, ФРГ). При этом добавляли разное количество сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (СЭКРС): 5, 10, 20% (Биолот, РФ). Также исследовали влияние на рост опухолевых клеток кондиционированной среды культур фибробластов легких эмбриона человека, препарата трансферрин-инсулин-селен (Invitrogen, США) (конечная концентрация в среде: 5 мкг/мл, 5 мкг/мл и 5 нг/мл, соответственно). В качестве селективного агента, предотвращающего рост фибробластов, применяли 100 мкг/мл генетицина (Invitrogen, США). С целью предотвращения контаминации клеточных культур использовали 100 ед./мл пенициллина, 50 ед./мл стрептомицина или 50 мкг/мл гентамицина, 2,5 мкг/мл фунгизона (Invitrogen, США). При наращивании первичной клеточной массы получали монослойные, суспензионные или полусуспензионные культуры, у которых в дальнейшем можно изменить адгезионные свойства, используя подложку из коллагена. При необходимости использовали культуральные флаконы, предварительно покрытые матриксом, состоящим из бычьего коллагена I типа (Sigma, США). Эффективность добавок определяли по скорости прироста клеток. Для этого высаживали выделенные клетки по 5 х 103 на лунку в 96-луночной планшете в исследуемой питательной среде. На 3-ьи сутки производили подсчет клеток в камере Горяева. ^ Проводили цитологическую и морфологическую верификацию, изучали тип роста, у части культур исследовали скорость пролиферации. Стабильно пролиферирующие культуры меланомы и рака почки в последующем тестировали на присутствие опухолеассоциированных антигенов. Для этого опухолевые клетки: 1) выращивали на стеклах; 2) фиксировали с помощью абсолютного метанола; 3) окрашивали моноклональными антителам к белкам S100, gp100, tyrosinase, MITF, MAGE1, MART/MelanA, CD63, (Novocastra, Великобритания) с помощью непрямого иммуноцитохимического метода и системы визуализации Novostain Detection Kit NCL-RTU-D (Novocastra, Великобритания). Для выявления антигенов клеток рака почки применяли моноклональные антитела NCL-RCC (Novocastra, Великобритания), специфичные к гликопротеину 200 kD, локализующегося в клетках проксимального отдела почечных канальцев и экспрессирующегося в 93% первичных опухолях почки и 84% метастатических образований, а также к CK18, CK8, Ki-67, EMA, PanCK. ^ Опухолевые клетки каждого пациента подсчитывали в камере Горяева и криоконсервировали в дозе 106 клеток/мл в полипропиленовых стерильных криопробирках (Sarstedt, ФРГ) и криосреде, содержащей 50% питательной среды, 40% СКРС, 10% диметилсульфоксида (ДМСО) (Sigma, США). Для криоконсервации использовали метод программного замораживания клеток на приборе Computer Freezer Ice Cube 1810 SY Lab (Италия) с контролируемой скоростью охлаждения, которая составляла –1оС/мин в диапазоне от +4 оС до –40оС, и –5оС/мин в диапазоне от –40 до –120оС. Затем клетки переносили в индивидуальные контейнеры с жидким азотом (-196оС) и хранили до использования. Для размораживания клеток пробирки помещали на 3 мин. в воду с температурой +42оС, затем разводили полной питательной средой 1:10, центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин, заменяли криосреду на полную питательную среду и рассеивали для культивирования в концентрации 2-3 х 106/мл. ^ Для блокады пролиферации культуру опухолевых клеток в день вакцинации помещали в стерильные полипропиленовые пробирки в полной питательной среде и облучали в суммарной дозе 2000 сГр на терапевтическом аппарате «Рокус-γ» Со60 1,25 mev (мощность дозы 0,99 сГр/с). Такой режим облучения полностью блокирует пролиферативную активность опухолевых клеток при сохранении синтеза белковых молекул, в том числе, специфических антигенов (Soiffer R. et al., 1998). Контроль пролиферативной активности клеток проводили по методике оценки включения Н3 тимидина в ДНК пролиферирующих клеток. Результаты анализа проб не превышали отрицательный контроль (лизат аутологичных опухолевых клеток). После облучения опухолевые клетки троекратно отмывали от компонентов культуральной среды в 10 мл 0,9% раствора хлорида натрия центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин каждая и приводили к концентрации 106/мл. ^ В подавляющем большинстве протоколов, апробированных в зарубежных клиниках, минимальное количество аутологичных опухолевых клеток, вводимых с целью вакцинации при каждой инъекции, составляет 2 х 103 клеток, а максимальной – 109 клеток. Глубоких обоснований именно такого количества антигенного материала в специальной литературе нет, очевидно, этот эмпирически найденный диапазон соответствует тому содержанию антигенного материала в опухолевых клетках (5-15 мкг), которое необходимо для индукции полноценного иммунного ответа при внутрикожном введении. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям