Специфические терапия и профилактика кожного кандидоза плотоядных животных 06. 02. 02 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
|
|
Скачать 305.75 Kb.
|
|
На правах рукописи АПАНАСЕНКО Наталья Александровна СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ТЕРАПИЯ И ПРОФИЛАКТИКА КОЖНОГО КАНДИДОЗА ПЛОТОЯДНЫХ ЖИВОТНЫХ 06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Москва - 2010 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии) Научный руководитель: доктор ветеринарных наук ^ Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук Скворцов Владимир Николаевич доктор медицинских наук, профессор ^ Ведущая организация: Государственное научное учреждение Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства им. В.А. Афанасьева Российской академии сельскохозяйственных наук Защита диссертации состоится «___» _________ 2010 года в «___» часов на заседании диссертационного совета Д 006.033.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии по адресу: 109428, г. Москва, Рязанский проспект, д. 24/1, ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии Автореферат разослан «___» _________ 2010 года Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук И. Ю. Ездакова ^ Актуальность проблемы. В последние годы, как в медицинской, так и в ветеринарной микологической практике возрастающее значение приобретают микозы кожи, вызываемые условно-патогенными грибами (Р.С. Овчинников, М.Г. Маноян, Е.Ю. Макарова, А.Г. Гайннулина, А.Н. Панин, 2007; А.А. Широких, А.Н. Огородников 2007). К указанной группе инфекций относится и кандидоз – одна из современных болезней цивилизации (Н.А. Фролова, 2007). Ветеринарным специалистам болезнь известна очень давно, однако некоторые вопросы до сих пор остаются открытыми и требуют своего разрешения. Несмотря на то, что происходит ежегодное увеличение числа заболеваемости этим микозом представителей всех видов животных, многие аспекты кандидоза плотоядных до настоящего времени изучены недостаточно. Число антимикотических средств, стоящих сегодня на вооружении медицины, постоянно пополняется – насчитывают около 10 препаратов системного и около сотни местного действия (К.М. Ломоносов, 2007). Ветеринария также использует эти лекарственные средства. Препараты системного действия токсичны и могут вызывать серьезные побочные эффекты. Лекарственные формы для местного применения у животных неудобны из-за наличия обильного волосяного покрова. Таким образом, разработка новых, удобных в применении, эффективных лекарственных средств для ликвидации и профилактики кандидозов у животных является актуальной. Из анализа данных литературы и собственных исследований следует, что одним из лучших способов лечения и профилактики дерматомикозов животных является применение специфических иммунологических средств. Мы также направили свои усилия на разработку вакцины против кожного кандидоза плотоядных животных, которая стала составной частью более сложного препарата – ассоциированной инактивированной вакцины против дерматомикозов и кандидозов плотоядных. Интерес к данному вопросу обусловлен тем, что в ветеринарной практике ассоциативная инфекция, вызванная грибами родов Trichophyton, Microsporum и Candida приобретает все большее значение (А.М. Литвинов с соавт., 2008; Н.А. Апанасенко, 2008; С.А. Лисовская, 2010). Создание такой вакцины значительно сократит финансовые затраты животноводческих предприятий на приобретение дорогостоящих фармакологических препаратов, облегчит труд ветспециалистов, снизит экономические потери от порчи шкурковой продукции в пушном звероводстве, предотвратит моральный и физический социальный ущерб владельцев животных. ^ Основная цель настоящей работы состояла в описании поражений кожи серебристо-черных лисиц, собак и кошек, вызванных грибами рода Candida, и разработке специфического средства терапии и профилактики кожного кандидоза плотоядных животных. В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи: - изучить клинические проявления поверхностного кандидоза у серебристо-черных лисиц, собак и кошек; - изучить лабораторную диагностику, видовой состав и патогенность возбудителей болезни; - изготовить комбинированные микросерии вакцины из биомассы нескольких видов кандид, испытать их на лабораторных животных и выбрать оптимальный по предъявляемым требованиям вариант; - провести испытания оптимального варианта вакцины на серебристо-черных лисицах, собаках и кошках. ^ . Впервые изучен симптомокомплекс и видовой состав возбудителей болезни при поверхностных формах кандидоза серебристо-черных лисиц, собак, кошек. На основании этого создана эффективная ассоциированная инактивированная вакцина КАНДИДЕРМ-К против кожного кандидоза плотоядных животных. Впервые разработаны «Методические наставления по лабораторной диагностике поверхностных кандидозов животных». ^ . Ветеринарной практике предложены, разработанные в соавторстве с д.в.н. А.М. Литвиновым: 1) «Методические наставления по лабораторной диагностике поверхностных кандидозов животных», утвержденные Российской академией сельскохозяйственных наук 03 сентября 2010 г.; 2) «Лабораторный регламент по изготовлению и контролю КАНДИДЕРМ-К – вакцины против кожного кандидоза плотоядных ассоциированной инактивированной», утвержденный руководством ВИЭВ 17 сентября 2010 г.; 3) «Инструкция по применению КАНДИДЕРМ-К – вакцины против кожного кандидоза плотоядных ассоциированной инактивированной», утвержденная руководством ВИЭВ 17 сентября 2010 г.. Материалы по специфическим терапии и профилактике поверхностного кандидоза плотоядных животных включены в следующие документы, разработанные в соавторстве с д.в.н. А.М. Литвиновым, к.в.н. Л.А. Красотой, утвержденные директором ВИЭВ 26 октября 2009 г.: 1) «Инструкция по изготовлению и контролю КАНДИДЕРМ – вакцины против дерматомикозов (трихофитии, микроспории) и кандидозов плотоядных ассоциированной инактивированной»; 2) «Стандарт организации КАНДИДЕРМ»; 3) «Инструкция по применению КАНДИДЕРМ – вакцины против дерматомикозов (трихофитии, микроспории) и кандидозов плотоядных ассоциированной инактивированной». ^ Основные положения диссертации доложены и обсуждены на лабораторных совещаниях, Ученых советах, методических комиссиях ГНУ ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии (г. Москва, 2007 – 2010 гг.); Международной научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел» (г. Москва, 2008 г.); межрайонной научно-практической конференции по проблемам лабораторной диагностики болезней животных (Ленинская районная СББЖ, г. Видное, Московская область, 2008 г.); междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2009 г.); Международной научно-практической конференции «Современные средства и методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойных и микотических болезней сельскохозяйственных животных, рыб и пчел» (г. Москва, 2009 г.); курсах повышения квалификации директоров ветеринарных лабораторий субъектов РФ (ФГУ «Российская академия кадрового обеспечения агропромышленного комплекса, Косино, 2009 – 2010 гг.). ^ : - результаты изучения симптомокомплекса поверхностного кандидоза серебристо-черных лисиц, собак, кошек; - лабораторная диагностика поверхностного кандидоза серебристо-черных лисиц, собак, кошек; видовой состав возбудителей болезни и результаты изучения их патогенности для лабораторных животных; - краткая технология изготовления ассоциированной инактивированной вакцины против кожного кандидоза плотоядных животных; - оценка безопасности и иммуногенных свойств разработанной вакцины; - эффективная схема применения вакцины при кожных кандидозах серебристо-черных лисиц, собак, кошек; - результаты изучения терапевтической и профилактической эффективности созданной вакцины. ^ Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи д.в.н. А.М. Литвинову, д.б.н., профессору О.Ф. Гробову, сотрудникам ГНУ ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко; главному ветеринарному врачу ОАО «Агрофирма Прозоровская» С.В. Питеримовой и директору ООО «Валента» В.В. Соковой за помощь в организации научных исследований. ^ . Диссертация изложена на 196 страницах, иллюстрирована 40 таблицами, 17 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы, включающего 267 источников, и приложений. Публикация материалов исследований. По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей, в том числе 3 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. ^ Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии). Научно-клинические исследования проведены в период с 2006 по 2010 гг. в лаборатории микологии и антибиотиков им. А. Х. Саркисова (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии) г. Москвы, ОАО «Племенном зверосовхозе Салтыковский» Балашихинского района, Московской области, ОАО «Агрофирме Прозоровская» Калининградской области, фирме ООО «Валента» г. Владимира, фелинологическом клубе «Жемчужина» г. Зеленограда, Московской области и в ветеринарной клинике при Люберецкой СББЖ. ^ Клинические проявления кандидоза у плотоядных животных изучали в указанных выше хозяйствах, питомниках, клиниках по общепринятым методам. Распространенность возбудителей кандидоза изучали путем исследований проб патологического материала от животных с клиническими признаками дерматитов. Для обнаружения, селективного выделения, дифференциации и предварительной идентификации грибов рода Candida использовали агар Никерсона. Получения чистых культур грибов достигали также путем посева патологического материала на сусло агар с добавлением гентамицина (0,5 мкг/мл), декстрозный агар Сабуро с добавлением хлорамфеникола (50,0 мг/л) и циклогексимида (500,0 мг/л). Культурально-морфологические признаки грибов изучали на плотных и жидких питательных средах. В качестве жидких сред использовали пивное сусло, бульон Сабуро, кукурузную и картофельную среды с добавлением 1 % глюкозы; плотных – сусло агар, агар Сабуро, картофельный, морковно-картофельный, кукурузный, рисовый агары и др. Для изучения биохимических свойств грибов использовали синтетическую среду Лоддер, модифицированную Ланжероном и Гера, пептонную воду с мясным экстрактом и индикатором Андреде, агаровую среду без углеводов. С использованием микологических методов исследований всего проведено 203 экспертизы. Из патологического материала от серебристо-черных лисиц, собак, кошек, рептилий выделено и идентифицировано 137 штаммов грибов рода Candida: 89 C. albicans, 38 – C. tropicalis, 4 – C. parapsilosis, 3 – C. glabrata, 3 – C. krusei. Патогенность выделенных штаммов C. albicans и C. tropicalis определяли путем дозированного внутрибрюшинного заражения белых мышей. Для определения ЛД50 пользовались формулой Кербера. Вакцинные и вирулентные штаммы грибов C. albicans и C. tropicalis создавали в лабораторных условиях путем их направленной селекции на получение требуемых свойств: высокой энергии роста, обильного бластоспороношения, устойчивой вирулентности, низкой степени диссоциации. Для изготовления вакцины использовали штаммы грибов C. albicans «Лисица» и C. tropicalis «Змея», депонированные в Музее грибных культур лаборатории микологии и антибиотиков ГНУ ВИЭВ имени Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии г. Москва под № 95 и № 87 соответственно. Изготовление инактивированных моноантигенов и ассоциированной вакцины с разным содержанием бластоспор грибов C. albicans «Лисица» и C. tropicalis «Змея» проводили общепринятыми в микологии и биологии методами, которые более подробно изложены в соответствующих разделах диссертации. Испытания, позволившие выбрать оптимальный вариант вакцины, проводили на белых мышах. Безвредность моноантигенов и микросерий ассоциированной вакцины определяли путем их подкожного и внутримышечного введения с последующей оценкой местной и общей реакции организма животных. Иммуногенность испытуемых препаратов проверяли путем дозированного заражения иммунизированных животных вирулентными штаммами через 1 и 3 мес. после иммунизации. Экспериментальные испытания оптимального варианта вакцины осуществляли на серебристо-черных лисицах, домашних собаках и кошках. Безвредность вакцины изучали путем однократного подкожного и внутримышечного введения в 3-х и 5-ти кратных дозах. Изучение иммунологической зрелости организма проводили путем экспериментального накожного заражения иммунизированных животных разных возрастов. Для изучения сроков формирования и длительности поствакцинального иммунитета иммунизированных животных заражали в разные сроки после ревакцинации. Терапевтическую эффективность вакцины изучали путем сравнения длительности болезни у иммунизированных с лечебной целью и контрольных животных. Статистическую обработку данных проводили с использованием непараметрических методов. Для анализа количественных данных использовали критерий Манна-Уитни. Для сравнения качественных признаков друг с другом были построены таблицы сопряженности, которые анализировались при помощи одностороннего точного критерия Фишера. Расчет выполнен на персональном компьютере с использованием приложения Microsoft Excel 2003 и пакета статистического анализа данных Statistica 8.0 for Windows (StatSoft Inc., USA). С целью изучения симптомокомплекса и видового состава возбудителей болезни было обследовано: серебристо-черных лисиц – 51, собак – 72, кошек – 78, анаконд – 2. В экспериментах и клинических испытаниях использовано 1359 белых мышей, 166 серебристо-черных лисиц, 197 собак, 202 кошки в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утв. Минсельхозом СССР 31.07.1978 г. ^ 2.2.1. Кандидозы плотоядных животных Симптомокомплекс. Среди обследованных нами животных с поражениями кожи, видимых слизистых оболочек и кожно-слизистых соединений грибы рода Candida были выделены от 42 из 72 собак, 38 из 51 серебристо-черных лисиц, 10 из 78 кошек. Изучение кандидозов рептилий не входило в планы наших исследований, однако от 2-х анаконд, содержащихся на передержке в питомнике «Валента», где мы проводили работы, выделили штаммы C. tropicalis, обладающие типичными для данного вида признаками. У плотоядных животных кандидозные поражения мы обнаруживали в кожных складках (28,3 %), на коже вне складок (25 %), в области наружных половых органов (19,6 %), в ротовой полости, в углах и вокруг рта (11,9 %), вокруг глаз (5,4 %), в наружном слуховом проходе (5,4 %), вокруг сосков у кормящих самок (2,2 %). Кандидоз кожных складок (в том числе и между пальцами конечностей) регистрировали у серебристо-черных лисиц и собак. На соприкасающихся поверхностях гиперемированной кожи появлялись мелкие пузырьки, после вскрытия которых, формировались эрозии. Эрозии впоследствии сливались, образуя обширные участки поражения, которые представляли собой блестящие очаги вишневого цвета. По периферии очага отслаивался эпидермис (в виде белой бахромы), а вокруг образовывались свежие мелкие пузырьки, пустулы или эритематозно-сквамозные высыпания. Встречались очаги поражения в виде утолщенных участков мацерированного эпидермиса белого цвета. При иной локализации поражения были сходны с вышеописанными. При этом мы отмечали и другие признаки болезни. Так, например, при локализации патологического процесса в области наружных половых органов выявляли точечные эрозии, покрытые серовато-белым налетом или с наслоением творожистых или пленчатых налетов белого цвета. При поражении влагалища регистрировали сливкообразные или творожистые выделения. Вокруг пораженных сосков наблюдали очаги гиперемии с четкими границами, похожие на тепловой ожог. Стоматит проявлялся образованием на слизистой оболочке ротовой полости налетов из пленок в виде свернувшегося молока или сероватые слизистые наложения. Налеты легко снимались, под ними обнажались эрозии. Иногда образовывались изъязвленные участки неправильной формы с неприятным запахом, покрытые беловатыми бляшками плотной консистенции. Неприятный запах также был характерен и для кандидозного отита. При локализации поражений в углах рта отмечалось покраснение, мацерация, серо-белый налет, трещины с утолщенными краями. При поражении губ, отек и шелушение были незначительными. На фоне шелушения образовывались серые пленки с приподнятыми краями, после снятия которых, обнаруживали эрозии. Следует отметить, что описанные выше симптомы регистрировали преимущественно у собак, а также у серебристо-черных лисиц. У кошек отмечено лишь 3 случая поражения кожи вокруг глаз (покраснение, отечность, облысение и характерное шелушение кожи) и 7 случаев – кожи туловища вне складок. Поражения кожи вне складок отличались наибольшим разнообразием. У серебристо-черных лисиц, собак, кошек регистрировали от незначительных изменений в виде покраснения, повышенного шелушения и разрежения волосяного покрова до плохо заживающих язв, покрытых беловатым или серым налетом и окруженных красной каймой. В тяжелых случаях, после вскрытия пустул очаги поражения инфильтрировались и покрывались толстыми серозно-кровянистыми корками. После разрешения процесса на месте поражений длительно оставались толстые складки. Клинические симптомы болезни у змей характеризовались угнетением, малой подвижностью, длительным отсутствием аппетита, отказом от водяных ванн. Вокруг носовых отверстий образовывались коричневые корочки и ободок из густой, серо-коричневой слизи, затрудняющих дыхание. На кожном покрове в области спины и брюшка и на хвосте были заметны очаговые поражения диаметром до 5 мм, имеющие серо-коричневый цвет. Под отделяющимися щитками иногда встречались кровоточащие эрозии. ^ Изучение и идентификацию грибов рода Candida проводили в соответствии с рекомендациями, приводимых в руководствах П.Н. Кашкина (1958), Н.П. Елинова (1964), А.М. Ариевича (1965), А.Ю. Сергеева (2000), Д. Саттона (2001) и др. Сложности, связанные с отсутствием описания кандидоза у плотоядных, определили необходимость совершенствования диагностики этого микоза. По результатам исследований мы разработали «Методические наставления по лабораторной диагностике поверхностного кандидоза животных», представляющие научный и практический интерес. Кандидоз диагностировали с учетом симптомокомплекса, результатов микроскопии, с последующим высевом на питательные среды. Видовое определение грибов включало изучение внешнего вида колоний, характера роста в жидкой питательной среде, обнаружения хламидоспор, определение типа филаментации, ферментативной активности и ассимиляционной способности штаммов. При видовой идентификации выделенных штаммов установлено, что практически во всех случаях поверхностных кандидозов плотоядных животных возбудителями болезни являлись грибы вида C. albicans. Вторым по частоте выделения был вид C. tropicalis, который встречался, как правило, в ассоциации с C. albicans. В единичных случаях (в основном, на видимых слизистых оболочках) обнаруживали C. parapsilosis, C. glabrata и C. krusei также в ассоциации с C. albicans или с C. albicans и C. tropicalis (табл. 1). Таблица 1 Ассоциации грибов рода Candida, выделенных от серебристо-черных лисиц, собак, кошек и рептилий
На долю C. albicans пришлось 65 %, C. tropicalis – 27,7 %, C. parapsilosis – 2,9 %, C. glabrata – 2,2 %, C. krusei – 2,2 % всех идентифицированных штаммов. Указанные штаммы были изолированы от 92 животных – 42 собак, 38 серебристо-черных лисиц, 10 кошек и 2 анаконд. Почти у половины больных животных выделены монокультуры C. albicans, от 3 животных (из них 2 змеи) – монокультуры C. tropicalis, от остальных же – C. albicans в ассоциации с другими видами, преимущественно с C. tropicalis. Наибольшее количество штаммов Candida spp. получено от обследованных нами собак. Второе место по частоте выявления грибов рода Candida занимали серебристо-черные лисицы. От кошек с кожными болезнями удалось изолировать лишь 10 штаммов Candida spp. (табл. 2). Таблица 2 Частота встречаемости грибов рода Candida у разных видов животных
^ Поскольку в результате исследований было установлено, что у плотоядных животных в 98,9 % случаев кандидозных поражений выделялись грибы вида C. albicans, при этом часто в ассоциации с C. tropicalis, дальнейшие работы мы проводили с грибами этих видов. Опыт по изучению патогенности выделенных штаммов C. albicans и C. tropicalis проводили на здоровых белых мышах 2-х месячного возраста массой по 18 – 22 г, содержащихся в одинаковых условиях на стандартном пищевом рационе. Подопытным животным внутрибрюшинно вводили по 0,3 см3 взвеси двухсуточной сусло-агаровой культуры в физиологическом растворе хлорида натрия, содержащей разное количество живых дрожжевых клеток C. albicans, C. tropicalis. Выживаемость наблюдали в течение 14 суток. Для определения ЛД50 пользовались формулой Кербера: ЛД50 = ЛД100 – S (z х d) / m, где ЛД100 – доза, вызывающая смертельный исход у всех животных данной группы; z – средняя арифметическая величина, полученная от деления количества погибших животных от двух смежных групп; d – интервал между рядом стоящими дозами; m – число животных в каждой группе; S – сумма величин (z х d). Средняя летальная доза (ЛД50) при внутрибрюшинном заражении белых мышей для различных штаммов грибов C. albicans составила 50,0 – 280,0 млн., C. tropicalis – 77,5 – 325,0 млн. бластоспор грибов. ^ Из выделенных и идентифицированных 137 эпизоотических изолятов отобрано по 2 штамма C. albicans и C. tropicalis, показавших стабильность в сохранении культурально-морфологических и биологических признаков. Отбор и поддерживание перспективных для работы штаммов грибов проводили общепринятыми в микологии методами. В результате проведенной работы из вышеуказанных штаммов были изолированы клоны, обладающие высокой энергией роста, низкой степенью диссоциации и обильным спороношением. При создании иммунологического средства для терапии и профилактики кандидоза плотоядных животных мы использовали штаммы C. albicans «Лисица» и C. tropicalis «Змея», обладающие наиболее низкой степенью диссоциации. С целью изучения иммуногенности указанных штаммов, из них мы изготовили инактивированные моноантигены, основные этапы производства которых включали: 1) выращивание вакцинного штамма на сусло-агаре; 2) съем выращенной культуры с питательной среды; 3) гомогенизацию биомассы грибов; 4) определение содержания бластоспор в гомогенате грибов; 5) контроль грибных гомогенатов на чистоту; 6) стандар-тизацию грибных гомогенатов по количеству бластоспор кандид в единице объема препарата; 7) ступенчатую инактивацию бластоспор в гомогенате высокой температурой; 8) контроль гомогената на стерильность; 9) доведение рН гомогената до 7,0 - 7,2. Изготовлено по 5 микросерий моноантигенов C. albicans и C. tropicalis с различным содержанием бластоспор грибов в 1 см3 (1, 2, 3, 4, 5 млн.). Моноантигены испытали вначале на безвредность. Для этого белым мышам подкожно и внутримышечно вводили препараты в объемах по 0,2 см3, после чего оценивали местную и общую реакции организма. Результаты проведенных исследований показали, что моноантигены безвредны для лабораторных животных. Иммуногенность моноантигенов C. albicans и C. tropicalis определяли путем их внутримышечного и подкожного введения белым мышам в объеме 0,2 см3 с последующим внутрибрюшинным заражением иммунизированных животных спустя 1 и 3 мес. после иммунизации. В качестве контрольных использовали патогенные штаммы C. albicans «Собака» и C. tropicalis «Котенок», минимальные заражающие дозы которых составили 18,6 и 54,9 млн. бластоспор соответственно. В результате проведенных исследований установлено, что 100 %-ная иммунизирующая доза штаммов грибов C. albicans «Лисица» для белых мышей содержит 4 млн. бластоспор в 1 см3. Моноантиген, содержащий в 1 см3 3 млн. бластоспор грибов, через 1 мес. после ревакцинации защищал от заражения 66,7 % белых мышей, через 3 мес. – 66,7 % при внутримышечном введении и 33,3 % при подкожном. При этом у заболевших в результате экспериментального заражения животных отмечали лишь незначительное угнетение, затем самопроизвольное выздоровление, тогда как невакцинированные животные тяжело заболевали. Легкое течение болезни отмечено также у мышей иммунизированных в дозе 2 млн. бластоспор, однако в этой группе процент животных, которых вовсе не удалось заразить, был низок. 100 %-ная иммунизирующая доза штаммов грибов C. tropicalis «Змея» для белых мышей составила 5 млн. бластоспор. Иммунизация моноантигеном, содержащим 4 млн. бластоспор в 1 см3, через 1 мес. после ревакцинации защищала от заражения 100 % животных, через 3 мес. 100 % мышей при внутримышечном введении моноантигена и 66,7 % при подкожном. У заболевших, в результате экспериментального заражения иммунизированных животных болезнь протекала в легкой степени. Этапы производства микросерий ассоциированной вакцины. Вакцину готовили следующим образом: 1) раздельно выращивали вакцинные штаммы на сусло-агаре (на матрасах) при 28 0 С в течение 2-3 суток; 2) добавляли официнальный физ. раствор NaCl (по 200-300 см3 на каждый матрас); 4) полученные суспензии пересевали с помощью пипетки Мора на новые матрасы с сусло-агаром (из расчета 5 – 7 см 3 суспензии на 1 матрас); 5) посевы инкубировали при 28 0 С в течение 3-5 суток; 6) выращен-ные культуры снимали с питательной среды с помощью стерильного металлического скребка; 7) биомассы грибов раздельно гомогенизировали со стерильным раствором 0,9 %-го серноватистокислого натрия в гомогенизаторах с вертикальными стаканами и нижним приводом; 8) концентрированные гомогенаты выдерживали в течение 10 дней при 2-6 0 С; 9) определяли содержание бластоспор грибов в гомогенатах путем подсчета в камере Горяева; 10) определяли контаминацию грибного гомогената посторонней микрофлорой; 11) стандартизировали грибные гомогенаты по определенным количествам грибных клеток в единице объема разбавителя (0,9 % серноватистокислый натрий); 12) стандартные грибные гомогенаты смешивали в соотношении 1:1; 13) клетки грибов в вакцинном гомогенате ступенчато инактивали температурой 45-55 0 С; 14) гомогенат контролировали на стерильность; 15) стандартизировали соединенный гомогенат по количеству бластоспор; 16) рН вакцинного гомогената доводили до 7,0 – 7,2; 17) разливали и укупоривали препарат; 18) повторно инактивировали температурой 45-55 0 С; 19) этикетировали; 20) контролировали препарат согласно лабораторному регламенту. ^ Изготовлено 7 микросерий (вариантов) вакцины с различным содержанием бластоспор C. albicans и C. tropicalis (2,5 + 2,5 млн. в 1 см3, 5 + 5 млн. в 1 см3, 10 + 10 млн. в 1 см3, 15 + 15 млн. в 1 см3, 20 + 20 млн. в 1 см3, 25 + 25 млн. в 1 см3, 30 + 30 млн. в 1 см3). Испытания, позволившие выбрать оптимальный вариант вакцины, проводили на белых мышах. Для изучения безвредности микросерий вакцины животным подкожно и внутримышечно вводили 3-х и 5-кратные профилактические дозы препарата и оценивали местную и общую реакции организма. Наблюдения за испытуемыми животными проводили в течение 10 дней. В результате испытаний на безвредность из дальнейших опытов исключены 6-й и 7-й варианты вакцины, введение больших доз которых оказалось реактогенным для белых мышей. Остальные микросерии были испытаны на иммуногенность. Изучение длительности поствакцинального иммунитета показало, что мыши, привитые 1 вариантом вакцины уже через 3 мес. после повторной вакцинации в результате экспериментального заражения проявляют клиническую картину кандидоза. Мыши, привитые 2, 3, 4 и 5 вариантами вакцины, спустя 1 и 3 мес. после иммунизации не реагировали на экспериментальное заражение. Однако через 6 мес. после иммунизации в зависимости от варианта вакцины заболевало кандидозом от 17 до 34 % экспериментально зараженных животных. Наименее иммуногенными оказались 1 и 2-й варианты вакцины. Статистически значимых различий в эффективности 3, 4, 5-го вариантов не было выявлено. Ввиду того, что в 3-м варианте содержится наименьшее количество бластоспор грибов (20 млн.), более целесообразным для дальнейших исследований мы сочли именно этот вариант вакцины. Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что наиболее оптимальным вариантом вакцины оказался третий, т.е. вакцина, содержащая в 1 см3 20 млн. бластоспор грибов C. albicans и C. tropicalis, получившая название КАНДИДЕРМ-К. Оптимальный способ введения вакцины – двукратный, внутримышечный с интервалом между инъекциями 14 суток. Стабильность вакцины определяли через 1, 3, 6, 9 и 12 и 24 мес. хранения при комнатной температуре. При проведении контроля учитывали внешний вид препарата, отсутствие в нем посторонних примесей, плесени, герметичность укупорки флаконов и отсутствие в них трещин, стерильность, безвредность и иммуногенность. Ни в одном случае после проведения контроля биопрепарата по всем параметрам не было установлено отклонений качества вакцины от требований технических условий. На основании полученных данных срок годности препарата мы установили 24 мес. (срок наблюдения), а температуру хранения от 2 до 250 С. ^ Опыты, проведенные по изучению свойств вакцины на серебристо-черных лисицах, собаках и кошках, т.е. непосредственно на том виде животных, для которого она предназначается, в целом повторили общие закономерности, полученные в экспериментах на белых мышах. Испытания показали, что испытуемый препарат безвреден для указанных выше животных. Результаты дальнейших экспериментов позволили сделать вывод о возможности иммунизации щенков серебристо-черных лисиц, начиная с 30-ти дневного возраста, а собак и кошек старше 45-ти суточного возраста. Сроки формирования поствакцинального иммунитета и его длительность у плотоядных животных определены методом экспериментального накожного заражения вакцинированных животных. Эксперименты показали, что напряженный иммунитет у иммунизированных животных формируется к 21-м суткам после повторного введения вакцины. Терапевтический эффект от иммунизации животных начинал проявляться спустя 2-5 сут. после первого введения вакцины, а через 3-5 сут. после повторного применения препарата наступало полное выздоровление. Терапевтический эффект клинически характеризовался вначале незначительным обострением воспалительного процесса, а затем быстрым его угасанием. Животные, которых не подвергали иммунизации, болели в течение 2 - 3-х мес. (срок наблюдения). Как видно из табл. 3, различия в продолжительности болезни между группами иммунизированных и неиммунизированных животных статистически высоко значимы. Лечебная эффективность препарата составила 100%. Таблица 3 Терапевтическая эффективность вакцины КАНДИДЕРМ-К
Примечание: ** - Статистически значимое отличие по сравнению с контролем при p < 0,01. Профилактическая эффективность вакцины в ответ на экспериментальное заражение спустя 1 и 3 мес. составила 100 %, через 6 мес. – 86,7 % (при этом заболевшие животные перенесли болезнь в легкой форме), а через 9 мес. – только 56,7 %. На основании полученных результатов исследований была разработана эффективная схема иммунизации животных (табл. 4). Таблица 4 Рекомендуемые дозы для серебристо-черных лисиц, собак и кошек
^ Ограниченные клинические испытания экспериментальной вакцины КАНДИДЕРМ-К проводили на собаках и кошках в ООО «Валента» г. Владимира и на серебристо-черных лисицах ОАО «Агрофирме Прозоровская» Калининградской области. В питомнике ООО «Валента» г. Владимира кандидозом, вызванным C. albicans, заболело 12 собак и 17 кошек отъемного возраста. Для их терапии была применена вакцина КАНДИДЕРМ-К. Больных животных иммунизировали двукратно с интервалом между инъекциями 14 дней. Клинические проявления кожного кандидоза начали угасать уже через 2-5 дней после первой инъекции препарата, а спустя 3-4 дня после повторной инъекции животные выздоравливали. Терапевтическая эффективность препарата составила 100 %. По нашим рекомендациям, в соответствии с инструкцией по применению вакцины КАНДИДЕРМ-К, в ОАО «Агрофирме Прозоровская» в порядке ограниченного производственного эксперимента подкожно было привито 10 самок серебристо-черных лисиц за 1 мес. до гона (спаривания). К положенному сроку от этих самок родилось 45 щенков. В подсосный и послеотъемный периоды ни один из полученных лисят кандидозом не заболел, хотя общая заболеваемость кандидозом молодняка на отделении фермы составила 3,2 %. Это демонстрирует то, что профилактическая эффективность вакцины, опосредованно, через колостральный (пассивный) иммунитет, составила также 100 %. Профилактическая эффективность вакцины у 20 иммунизированных лисят в возрасте 30 дней тоже составила 100 %, по сравнению с общим контролем (заболеваемость контрольных животных – 3,2 %). 3. ВЫВОДЫ 1. Среди изучаемых животных заболеванию поверхностными формами кандидоза наиболее подвержены собаки (46,7 %) и серебристо-черные лисицы (42,2 %). Значительно реже микоз встречается у кошек (11,1 %). 2. Основными возбудителями поверхностного кандидоза серебристо-черных лисиц, собак и кошек являются грибы вида C. albicans, которые часто встречаются в ассоциации с C. tropicalis. 3. Симптомокомплекс поверхностного кандидоза плотоядных животных разнообразен. Регистрируют незначительные (гиперемия, шелушение, разрежение волосяного покрова) и более интенсивные поражения тканей в форме язв, гиперкератоза и локальных алопеций. 4. Из эпизоотических культур C. albicans и C. tropicalis отобраны перспективные для создания иммуногенных препаратов штаммы, показавшие стабильность в сохранении культурально-морфологических признаков и биологических свойств. 5. Разработана эффективная ассоциированная инактивированная вакцина против кожного кандидоза плотоядных животных. 6. Вакцина безвредна и иммуногенна. Двукратное (с интервалом 14 дней) внутримышечное введение вакцины в дозе 0,5 – 1,5 см3 с содержанием в 1 см3 20 млн. бластоспор грибов C. albicans и C. tropicalis создает у животных напряженный иммунитет длительностью 6 месяцев. 7. Терапевтическая эффективность вакцины составляет 100 %, профилактическая – 85 - 100 %. ^ Для диагностики, терапии и профилактики кандидоза плотоядных животных ветеринарной практике предложены: - «Методические наставления по лабораторной диагностике поверхностных кандидозов животных» (соавтор д.в.н. А.М. Литвинов), утвержденные Российской академией сельскохозяйственных наук 03 сентября 2010 г.; - «Лабораторный регламент по изготовлению и контролю КАНДИДЕРМ-К – вакцины против кожного кандидоза плотоядных ассоциированной инактивированной» (соавтор д.в.н. А.М. Литвинов), утвержденный руководством ВИЭВ 17 сентября 2010 г.; - «Инструкция по применению КАНДИДЕРМ-К – вакцины против кожного кандидоза плотоядных ассоциированной инактивированной» (соавтор д.в.н. А.М. Литвинов), утвержденная руководством ВИЭВ 17 сентября 2010 г. Материалы по специфическим терапии и профилактике поверхностного кандидоза плотоядных животных включены в следующие документы, разработанные в соавторстве с д.в.н. А.М. Литвиновым и к.в.н. Л.А. Красотой, утвержденные директором ВИЭВ 26 октября 2009 г.: - «Инструкция по изготовлению и контролю КАНДИДЕРМ – вакцины против дерматомикозов (трихофитии, микроспории) и кандидозов плотоядных ассоциированной инактивированной»; - «Стандарт организации КАНДИДЕРМ»; - «Инструкция по применению КАНДИДЕРМ – вакцины против дерматомикозов (трихофитии, микроспории) и кандидозов плотоядных ассоциированной инактивированной». ^ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Дерматофитозы плотоядных и грызунов клеточного содержания / А.М. Литвинов, В.Ю. Соловьева, О.В. Ивченко, Н.А. Апанасенко, А.И. Касьянов, О.В. Чебаков // Кролиководство и звероводство. – 2008. – № 4. – С. 29-31; № 5. – С. 26-27. 2. Апанасенко Н. А. Специфическая профилактика кожного кандидоза плотоядных животных / Н. А. Апанасенко // Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел: Материалы международной научно-практической конференции – М., 2008. – С. 312-314. 3. Апанасенко Н.А. Специфические терапия и профилактика дерматомикозов и кандидозов плотоядных животных / Н. А. Апанасенко // Труды ВИЭВ: Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.Х. Саркисова: Современные средства и методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойных и микотических болезней сельскохозяйст-0венных животных, рыб и пчел. – М., 2009. – Т. 75. – С. 62-64. 4. Апанасенко Н.А. Видовой состав возбудителей поверхностного кандидоза плотоядных животных / Н.А. Апанасенко, А.М. Литвинов // Иммунопатология, аллергология, инфектология. – М., 2010. – № 1. – С. 146. 5. Литвинов А.М. Поверхностный кандидоз плотоядных животных / А.М. Литвинов, Н.А. Апанасенко // Ветеринария. – 2010. – № 7. – С. 3-5.  |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям