Исследование белков с помощью программы OrthoFocus Обсуждение результатов и выводы Использованные материалы
|
|
Скачать 1.24 Mb.
|
|
Факультет биоинженерии и биоинформатики Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия Исследование эволюции участвующих в патогенезе болезни Альцгеймера белков с помощью программы OrthoFocus Ахмадуллина Александра Ильдаровна cтудентка 2 курса E–mail: [email protected] Тьютор: д.х.н. Сергеева Марина Глебовна, НИИ ФХБ им. А.Н.Белозерского МГУ E–mail: [email protected] Москва, 2008 Оглавление 1. Тезисы……………………………………………………………………………………..…… 3 2. Введение…………………………………………………………………………………..…….3 3. Литературный обзор…………………………………………………………………….……..4 3.1. Статистика роста заболеваемости болезнью Альцгеймера……………………….……....4 3.2. Симптоматика болезни Альцгеймера……………………………………………….……...5 3.3. Предполагаемые механизмы развития болезни…………………………………..………..6 4. Материалы и методы………………………………………………………………….……….7 5. Результаты…………………………………………………………………………….………..7 5.1. Построение каскада белков, приводящих к болезни……………………………………...7 5.2. Формирование списка белков……………………………………………………………….8 5.3. Исследование белков с помощью программы OrthoFocus……………………………….8 6. Обсуждение результатов и выводы…………………………………………………………...9 7. Использованные материалы…………………………………………………………………11 8. Приложения…………………………………………………………………………………12 8.1. Приложение 1. Критерии прижизненного диагноза болезни Альцгеймера…………….12 Приложение 2. Характеристики белков, участвующих в патогенезе болезни………….12 Альцгеймера Приложение 3. База данных GOLD………………………………………………………...62 Приложение 4. Программа OrthoFocus…………………………………………………….63 Приложение 5. Использованные для поиска геномы……………………………………..65 Приложение 6. Таблица белков, участвующих в патогенезе болезни Альцгеймера и их представленность в живых организмах……………………………………………………65 Приложение 7. . Другие источники и информационные БД по вопросам болезни Альцгеймера………………………………………………………………………………………….72
Болезнь Альцгеймера - нейродегенеративное заболевание, поражает людей в возрасте 60-70 лет, характеризуется неврологическими расстройствами, приводящими к массовой гибели нейронов гиппокампа, лимбической и ассоциативной коры головного мозга, нарушению когнитивных способностей, рассудочной деятельности, абстрактного мышления и языка, и, в конечном итоге, к смерти. Заболеваемость растет параллельно с ростом продолжительности жизни, становясь главной причиной смерти после сердечно-сосудистых и раковых заболеваний. На сегодняшний день в мире насчитывается около 12 млн. больных, к 2050 году ожидается увеличение этого показателя втрое. Благодаря активным исследованиям мы сейчас располагаем данными о связанных с патогенезом болезни нарушениях, в частности – изменениях свойств некоторых белков. Однако отсутствие адекватных моделей на животных ограничивает определение причинно-следственных связей при данном системном заболевании. ^ – поиск объектов для изучения болезни с использованием подходов биоинформатики. Поставлены следующие задачи: выявить белки, изменения которых экспериментально описаны при данном заболевании, изучить эволюцию белков, характерных для заболевания, выделить отдельные подмножества в данном множестве и объекты, удобные для моделирования отдельных этапов заболевания. Получены следующие результаты. Анализ литературы позволил выделить 99 белков, изменения которых достоверно показаны, в том числе APP (amyloid precursor protein), PSN1 (presenilin1) и PSN2 (presenilin2), ApoE (apolipoprotein E), МАРТ (microtube-associated protein tau). На основании информации, почерпнутой из баз KEGG[7], GOLD[6], были выстроены биохимические пути их взаимосвязей. Эволюцию белков анализировали с помощью разработанной в нашей лаборатории ранее программы OrthoFocus[8], которая позволяет находить ортологов заданного гена или группы генов. Работа программы заключается в формировании для заданного гена (генов) группы паралогов, найденных в геноме того же вида (в нашем случае – Homo_sapiens), и дальнейшем поиске по интересующим нас геномам, опираясь уже на сформированную группу. Были исследованы геномы Anopheles_gambiae, Apis_mellifera, Bos_taurus, Caenorhabditis_elegans, Canis_familiaris, Ciona_intestinalis, Ciona_savygni, Danio_rerio, Drosophila_melanogaster, Echinops_telfairi, Gasterosteus_aculeatus, Monodelphis_domestica, Mus_musculus, Oryctolagus_cuniculus, Rattus_norvegicus, Strongylocentrotus_purpuratus, Takifu_rubripes, Tetraodon_nigroviridis, Xenopus_tropicalis и др. Полученные результаты показывают, что программу OrthoFocus можно использовать для изучения процесса формирования взаимодействующих компонентов белковых систем в ходе эволюции и анализа комбинаций, в которых белки-компоненты системы представлены в живых организмах, на базе их филогенетических профилей. Такой анализ позволяет выбрать удобные объекты для изучения отдельных компонентов систем белков, участвующих в патогенезе болезни Альцгеймера.
По последним данным американского Национального центра медицинской статистики (National Center for Health Statistics[1]), в структуре 10 ведущих причин смерти за последние годы болезнь Альцгеймера заняла 7 место, поднявшись на одну позицию (смертность от болезни Альцгеймера увеличилась на 1,4%). Большая социальная значимость болезни Альцгеймера стимулирует научные исследования, направленные на раскрытие механизмов этой болезни. Несмотря на огромный объём накопленных в последние десятилетия знаний о биологических основах болезни Альцгеймера, этиология подавляющего большинства случаев заболевания остается до сих пор неизвестной. Насколько предсказуема болезнь? Можно ли в данном случае говорить о генетической предрасположенности? На основании каких показателей можно заключить о наличии болезни? Какие структуры головного мозга вовлекаются в процесс и каким образом можно воздействовать на этот процесс извне? Эти вопросы так и остаются открытыми. И ключ к решению так или иначе связан с построением наглядных примеров, моделей. Предложены некоторые модели на животных, способные воспроизвести достаточно близкие к человеческим последствия болезни – такие, как прогрессивная нейродегенерация, а в некоторых случаях даже похожие изменения поведения. Сама возможность изучать похожие патологические процессы на животных приоткрыла завесу механизма болезни, а так же обеспечила материал для создания и тестирования лекарственных препаратов. Однако не нашли пока такой модели, которая могла бы полностью повторить состояние страдающего болезнью Альцгеймера человека. Мы решили подойти к вопросу использования моделей на животных с точки зрения биоинформатики и поставили перед собой следующие задачи:
По данным Американского министерства здравоохранения в десятку ведущих причин смерти вошли: - сердечно-сосудистые заболевания – 654000 смертей - онкологические заболевания – 550000 смертей - инсульт – 150000 смертей - хронические заболевания бронхов и легких – 123000 смертей - несчастные случаи – 108000 смертей - сахарный диабет – 72800 смертей - болезнь Альцгеймера – 65829 смертей - грипп и пневмония – 61472 смертей - заболевания почек – 42762 смертей - сепсис (инфекция крови) – 33464 смерти  Рис.1. Ведущие причины заболеваемости для разных возрастов по материалам National Center for Health Statistics[1]. По горизантали – группы, представляющие разные возрастные категории; по вертикали – количество людей. В странах с высоким уровнем дохода более двух третей всего населения живет более 70 лет и умирает от хронических болезней, среди них болезнь Альцгеймера занимает лидирующее положение. 3.2. Симптоматика болезни Альцгеймера Состояние, характеризующееся прогрессирующим снижением интеллекта, расстройством памяти и изменением поведения, было описано еще в 1907 году немецким психиатором Аллоизом Альцгеймером. Вероятность развития патологии связывают с увеличением средней продолжительности жизни (в особенности в развитых странах). Считается, что после 85 лет риск достигает 50%. Начало заболевания постепенное, незаметное. Обычно ни больные, ни их близкие не могут точно обозначить период начала болезни. Чаще всего сначала возникают нарушения кратковременной памяти: больной забывает, куда положил очки, выключил ли свет, принимал ли пищу. Усугубление этого дефекта приводит к снижению запоминания, забыванию имен близких людей, их внешнего облика, названий предметов и слов. Одновременно с нарушениями памяти начинают прогрессировать расстройства речи: больные с трудом находят нужные слова, с трудом воспринимают смысл прочитанного. Поведение больного становится шаблонным, стереотипным, безразличным. При этом достаточно долго могут сохраняться профессиональные навыки, которые выработаны годами. Благодаря этому больные могут какое-то время удерживаться на работе, не смотря на заметное развитие признаков болезни. На более поздних этапах болезни - через несколько лет, - присоединяются расстройства настроения. Так, наблюдается его неустойчивость, раздражительность, гневливость, эпизоды эмоционального возбуждения, сменяющиеся апатией и безразличием. Возможно появления эпилептических припадков, а так же бреда и галлюцинаций. Бред и галлюцинации имеют так называемый "малый размах", т.е. отражают реальные бытовые ситуации - давние ссоры с соседями, привычные конфликты в метро или аптеке, политические события в новостях по телевизору или в газетах, которые больные интерпретируют с точки зрения намеренного причинения им ущерба. На поздних стадиях заболевания возможно расстройство влечений - прожорливость и гиперсексуальность, - которые часто ошибочно расцениваются родственниками больного не как симптомы заболевания, а как проявления ранее не свойственных ему черт характера. Отсутствие понимания истинных причин болезни затрудняет постановку диагноза (достоверное подтверждение возможно только с помощью данных нейроморфологического, как правило, посмертного, исследования головного мозга). В соответствии с диагностическими рекомендациями, разработанными международными экспертными группами и утвержденной ВОЗ Международной классификацией болезни 10-го пересмотра прижизненный диагноз болезни Альцгеймера основан на критериях, описанных в приложении 1. 3.3. Предполагаемые механизмы развития болезни Изначально гипотеза возникновения заболевания основывалась на микроскопическом наблюдении начала XX века, и в течение почти 80 лет основным критерием патогенеза болезни Альцгеймера являлось наличие специфических бляшек в мозгу пациентов. И лишь относительно недавно было выяснено, что эти амилоидные бляшки представляют собой отложение бета-амилоида (А-бета), представляющего собой небольшой пептид размером в 42 аминокислотных остатка. Пептид продуцируется при расщеплении довольно большого мембранного белка нейронов, получившего название "предшественник амилоидного пептида" (АРР). В норме "секреция" А-бета не приводит к каким бы то ни было проблемам, поскольку в здоровой ткани мозга поддерживается баланс между продукцией пептида и его "уборкой" клетками-мусорщиками ("скавенджерами"). Нарушение функции этих клеток может вести к накоплению амилоида в межклеточных пространствах. Расщепление предшественника амилоида АРР осуществляется другим трансмембранным белком, получившим название. В настоящее время выделено две формы пресенилина и соответственно им два гена (I и 2). В суммарном виде пресенилин представляет собой большой интегрированный в мембрану нейрона белок с 8 трансмембранными доменами и 4 внеклеточными петлями. Аминотерминальный и карбоксильный концы протеиновой цепи, а также еще одна петля локализованы в цитоплазме клетки, точнее, в ее подмембранном пространстве. Поначалу было выдвинуто предположение о том, что пресенилин необходим для секреции амилоидного пептида, в результате чего белку приписали роль секретазы. И поскольку секретазная активность пресенилина по отношению к АРР проявлялась в различный сайтах предшественника амилоида, были выделены альфа-, бета-, гамма- и вплоть до эпсилон-секретазы. Затем выяснилось, что секретаза обладает также активностью аспартил-протеазы, в частности наиболее важные при продукции амилоида бета- и гамма-секретазные участки пресенилина. Интересно, что альфа-секретаза расщепляет амилоидный пептид А-бета почти посередине между сайтами секретаз бета и гамма. Как в пресенилине, так и в АРР выявлены многочисленные мутации, которые приводят к фамильным формам болезни Альцгеймера. После десятка лет интенсивных исследований самых разных аспектов болезни Альцгеймера можно довольно уверенно говорить о гипотезе амилоидного каскада. Каскад запускается мутациями в генах АРР и пресенилинов, что ведет как к большей "ломкости" АРР, так и повышению продуцирующей А-бета активности секретаз бета и гамма. Увеличение продукции амилоидного пептида превышает способности клеточных систем процессировать как мономерные, так и олигомерные отложения, что ведет к выпадению нейрофибрилл и бляшек и вызывает токсическое воздействие на синапсы и нейроны. Это в свою очередь активирует микроглию и астроциты, что проявляется в воспалении. Прогрессирующее поражение синапсов и нервных клеток ведет к нарушению ионного гомеостаза мозговой ткани и ее коры, что вызывает генерирование реактивных окислов и радикалов, вызывающих оксидативный стресс. Параллельно нарушается активность клеточных киназ и фосфатаз. Это способствует накоплению фибриллярных отложений, которые в еще большей степени вызывают дисфункцию нейритов-отростков и тел самих нейронов. Вовлечение в патологический процесс нейрональных отростков с их синапсами приводит к нейротрансмиттерному дефициту. Все эти события, в конечном счете, завершаются клеточной смертью - некрозом. . Выполненные к настоящему времени многочисленные нейрогистологические и нейрохимические исследования аутопсийного мозга больных с деменцией альцгеймеровского типа позволили установить несколько каскадов биологических событий, происходящих на клеточном уровне, которые предположительно вовлечены в патогенез заболевания: нарушение процессов фосфорилирования белков, изменения в метаболизме глюкозы и активация процессов перекисного окисления липидов. Высказано предположение, что каждый из таких каскадов патологических событий или их совокупность могут в конечном итоге приводить к описанным выше структурным изменениям, которые лежат в основе нейрональной дегенерации и сопровождаются развитием деменции.
В работе использовались следующие информационные ресурсы и программы:
5.1. Построение каскада белков, приводящих к болезни Согласно данным MedLine, ключевое место в патогенезе занимает предшественник амилоидного пептида (amyloid precursor protein, APP). По базам KEGG[7] и GOLD[8] нам удалось найти описание процесса, сопровождающего изменения в строении и функционировании АРР (Рис. 2). На данной схеме можно проследить путь взаимодействия АРР, ApoE, белков семейств BACE и PSN, приводящего к формированию амилоидных скоплений и, как следствие, нарушению функций головного мозга. Изучив метаболические пути, показанные для других нервных расстройств – таких, как болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона, Прионная болезнь, мы обнаружили некоторые белки, показанные при болезни Альцгеймера (на схеме обведены):  Рис. 2. Каскад белков, приводящий к нарушению функций головного мозга. 5.2. Формирование списка белков На данном этапе поиска мы обратились к бд SwissProt[5]. По запросу “Alzheimer’s disease” для организма “human” было найдено 89 белков. Мы изучили их функциональные характеристики и связь с болезнью Альцгеймера (результаты – в таблице приложения 2). 5.3. Исследование белков с помощью программы OrthoFocus Следующая часть работы проводилась с использованием разработанной в нашей лаборатории ранее программы OrthoFocus[8], которая позволяет находить ортологов заданного гена или группы генов. На первом шаге мы проводили BLAST-поиск внутри человеческого генома. Для каждого белка была сформирована группа, включающая все последовательности с наибольшим сходством с данной (условием отбора было неизменение группы в результате поиска по каждой из них). Множественное выравнивание для этой группы (построенное с помощью MUSCLE) помогло идентифицировать изоформы. Таким образом, мы отобрали последовательности так, чтобы каждый ген был представлен только одной изоформой. Остальные же маскировались, не влияя более на результат поиска. Заключительный этап работы программы - BLAST-поиск по принципу “group Reciprocal Best Hit”. Заключается он в следующем: для гена а_1 из нашего генома (в данном случае, Homo_sapiens, назовем его геном1) мы проводили поиск внутри другого генома (назовем его геном2). Это так называемый прямой поиск (“forward search”). Теперь для каждого гена из списка находок, начиная с лучшей, проводится поиск в обратном направлении (“backward search”) – ген а_1 из генома2 по геному1, ген а_2 из генома2 по геному1, ит.д. Если лучшая находка обратного поиска входит в состав сформированной группы паралогов – эта последовательность включается в итоговый список. Обратный поиск прекращается, как только обнаружится последовательность, лучшая в списке находок, но не входящая в нашу группу. На данном этапе анализ изоформ выполняется программой IsoSVM. По результатам поиска была составлена таблица, отражающая представленность исследуемых белков каждом из организмов (приложение 3).
По результатам поиска, для таких организмов, как Apis_melifera (пчела), Cavia_procellus (морская свинка), Ciona_savigniy (асцидия), Ochodonta_princeps (пищуха, или американская пика), Rattus_norvegicus (крыса) поиск белков не дал никаких результатов. Здесь нельзя утверждать об отсутствии белков в данных протеомах; возможно, причина – в незавершенной расшифровке последовательностей для указанных организмов. Представленность белков в организмах можно охарактеризовать следующей таблицей (белки отмечены цветом, о диапазоне охваченных организмов можно судить по высоте столбца, соответствующего белку):  Рис.3. Распределение по исследуемым организмам белков, участвующих в патогенезе БА. Что же касается остальных 35-ти протеомов – нашлись белки, присутствующие в каждом из них. Это:
Мы видим, что в патогенез вовлечены белки, несущие незаменимую функциональную нагрузку, поэтому наличие их в других организмах неудивительно. Таким образом, исследователю предоставляется широкий выбор для создания адекватных моделей на животных, в зависимости от его цели – изучать развитие заболевания на разных этапах или же сравнивать причины, его вызвавшие. Основанные на таких данных модели могут так же помочь разобраться в первопричине деменции. На данный момент существует две гипотезы: согласно первой, выпадение нейрофибрилл и бляшек связано с увеличением продукции амилоидного пептида, что превышает способности клеточных систем процессировать возникающие отложения, вызывая токсическое воздействие на синапсы и нейроны. Согласно второй гипотезе, молекулярный механизм болезни основана на изменении белка тау - он представляет собой протеин, связывающийся с микротрубочками в теле и отростках нейрона. В мозгу пациентов с БА микрофибриллы белка тау образуют плотные спиральные переплетения с нейрофибриллами, в результате чего тау-белок теряет свою функцию и приобретает нейротоксические свойства. Известно так же, что амилоид-бета стимулирует формирование тау-фибрилл. Но как они ведут себя независимо друг от друга? В таблице можно выделить организмы, в которых на фоне остальных участников каскада присутствует только один из этих белков - либо тау, либо амилоидный пептид. Это: Ciona_intestinalis (асцидия), Gallus_gallus (курица), Mus_musculus (мышь), Nasonia_vitripennis(оса), Takifugu_rubripes(фугу) содержащие в протеоме последовательность белка тау, Anopheles_gambiae(комар) и Gasterosteus_aculeatus(колюшка). Возможно, подобрав организмы для моделей таким образом, удастся разделить этапы каскада и проследить изменения, вызываемые каждым из этих двух белков. В заключение хотелось бы обратить внимание еще на одну немаловажную деталь. Как мы убукдились, в человеческом геноме нет таких «особенных» генов, ответственных за развитие болезни Альцгеймера. Клинические проявления болезни являются следствием уменьшения числа синапсов в лобной и височной коре и в гиппокампе. У человека такие изменения приводят к нарушениям памяти, интеллектуальных операций и различных корковых функций: речи, праксиса, зрительного гнозиса, оптико-пространственной деятельности, а также письма, чтения, счета и др. А значит, о наличии болезни можно судить именно по нарушению высших психических функций (об этом говорит еще и тот факт, что больные проходят психологический анализ для постановки диагноза). Все это указывает на то, что сама возможность проявления деменции связна с высшей нервной деятельностью, присущей только человеку. Поэтому использование животных моделей будет оправдано лишь в случае изучения отдельных компонентов, формирующих состояние деменции или влияния того или иного фактора на каскады изменений.
[1] - National Center for Health Statistics ftp://ftp.cdc.gov/pub/Health_Statistics/NCHS/Publications/NVSR/56_10/table09.xls [2] – OMIM ……………………………….. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=omim [3] – PubMed …………………………….. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=PubMed [4] – MEDLINE ………………………... http://www.nlm.nih.gov/databases/databases_medline.html [5] – SwissProt …………………………………………………………… http://cn.expasy.org/sprot/ [6] – GOLD …………………………………………………………………. http://gold.tugraz.at [7] – KEGG ……………………………………… http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway.html [8] – OrthoFocus …………………………………………………… http://lipidomics.ru/main.html [9] - Molecular Neurodegeneration ……………. …. …………………... http://www.molecularneurodegeneration.com/ [10] - Pathological and physiological functions of presenilins ^ 1, Yun-wu Zhang2, Huaxi Xu2 and Gopal Thinakaran1 http://www.molecularneurodegeneration.com/content/1/1/4 [11] - The amyloid precursor protein: beyond amyloid ^ 1,2 and Edward H Koo1,2 http://www.molecularneurodegeneration.com/content/1/1/5 [12] - Pharmacologic reductions of total tau levels; implications for the role of microtubule dynamics in regulating tau expression ^ , Peter Ash, Natalia Klosak, Wing C Lee, Leonard Petrucelli, Michael Hutton and Christopher B Eckman http://www.molecularneurodegeneration.com/content/1/1/6 [13] - Apolipoprotein E decreases tau kinases and phospho-tau levels in primary neurons ^ , Jacob Freeman and G William Rebeck http://www.molecularneurodegeneration.com/content/1/1/18 [14] - Tramiprosate, a drug of potential interest for the treatment of Alzheimer's disease, promotes an abnormal aggregation of tau ^ 1, Félix Hernández1, Joaquín Del Rio2,3, Francisco J Moreno1 and Jesús Avila1,3 http://www.molecularneurodegeneration.com/content/2/1/17 [15] - The Alzheimer's disease β-secretase enzyme, BACE1 ^ and Robert Vassar http://www.molecularneurodegeneration.com/content/2/1/22 [16] - Transgenic Models of Alzheimer's Disease: Learning from Animals ^ http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1144486
Приложение 1. Критерии прижизненного диагноза болезни Альцгеймера 1. Наличие синдрома деменции. 2. Развитие множественного дефицита познавательных функций, который определяется сочетанием расстройств памяти с ухудшением запоминания новой и/или воспроизведения ранее усвоенной информации и присутствием признаков по крайней мере одного из следующих когнитивных нарушений: афазии (нарушение речевой функции), апраксии (нарушение способности к выполнению двигательной активности, несмотря на ненарушенные моторные функции); агнозии (невозможность распознавать или идентифицировать объекты, несмотря на сохранное сенсорное восприятие); нарушений собственно интеллектуальной деятельности, т.е. планирования и программирования деятельности, абстрагирования, установления причинно-следственных связей и др. 3. Нарушения как памяти, так и когнитивных функций должны быть выражены настолько, чтобы вызывать снижение социальной или профессиональной адаптации больного по сравнению с ее прежним уровнем. 4. Течение характеризуется постепенным малозаметным началом и неуклонным прогрессированием нарушений когнитивных функций. 5. Отсутствуют данные клинического или специальных параклинических исследований, которые могли бы указать на то, что расстройства памяти и когнитивных функций обусловлены каким-либо другим заболеванием или повреждением центральной нервной системы (например, церебрально-сосудистым заболеванием, болезнью Паркинсона или Пика, хореей Гентингтона, субдуральной гематомой, гидроцефалией и др.), системным заболеванием, о котором известно, что оно может вызывать синдром деменции (например, гипотиреоидизм, недостаточность витамина В12 или фолиевой кислоты, гиперкальциемия, нейросифилис, ВИЧ-инфекция, тяжелая органная недостаточность и др.) или состоянием интоксикации (в том числе медикаментозной). ^ Анамнестические сведения и данные клинического исследования исключают связь выявляемых расстройств когнитивных функций с каким-либо другим психическим заболеванием (например, с депрессией, шизофренией, умственной отсталостью и др.). Приложение 2. ^ Данные получены с помощью БД SwissProt. Отдельными цветами выделены семейства:
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям