Актуальность данной темы
|
|
Скачать 410.83 Kb.
|
|
ГБОУ Гимназия №1505 «Московская городская педагогическая гимназия-лаборатория» Диплом Культура тканей: характерные особенности и использование метода человеком Автор: ученик 10 класса «Б» Балычев Глеб Руководитель: Шалимова Е.Г. Москва 2012 Введение Актуальность данной темыВ начале прошлого века, в 1885 г Вильгельм Ру (Wilhelm Roux) проводил эксперименты с костным мозгом куриного эмбриона, в которых он вывел основные методы и принципы поддержания тканей и их частей отдельно от организма. После него сам метод и границы его применения заметно расширились — те методы, которыми пользовался Ру, считаются лишь базовыми и помимо них используются множестно дополнительных материалов, веществ и технологий. Вместе с технологиями выращивания расширились и границы применения — если Ру удавалось только поддерживать часть костного мозга, то в наши дни возможно не только длительное хранение отсепарированных органов, но и выращивание новых, которые в последствии можно будет пересаживать. Например, учеными уже получены такие органы, как кость, невная ткань, роговица глаза, мочевой пузырь и т. д. В настоящий момент, метод культуры тканей, который иногда называют методом культуры клеток, является чрезвычайно перспективной областью науки и медицины, во многом даже абсолютно уникальный — только с использованием этого метода не требуется подавление иммунной реакции человека на пересаженый орган — так как клетки из которых далее будут синтезированы необходимые органы можно брать непосредственно у пациента, иммуно отторгающей реакции происходить не будет. Однако, не смотря на все положительные стороны этого метода существует и множество отрицательных факторов. Например, для выращивания культуры требуется абсолютная стерильность, как культуры, так и среды, в которой культура находится. Казалось бы, вчем проблема один раз очистить препарат? Но для успешного выращивания требуется регулярная очистка культуры от продуктов жизнедеятельности и от мертвых клеток. Ну, а сделать это очень сложно, более того, делать это надо весьма часто. Ко всему этому стоит добавить, что при увеличении количества клеток или при уменьшении колличества питательных веществ в среде, на которой выращиваются клетки, требуется пересадка кульуры на новый питательных раствор (субстрат), и при этой операции надо сделать так, чтобы культура осталась изолированной от многочисленных обитателей внешней среды, таких как бактерии, грибы и вирусы. Таким образом, безошибочно можно сказать, что метод культуры как труден, так и полезен. По крайней мере, может быть очень полезным. К сожалению, данный метод очень затратен, порой, легче бороться с иммуно-отторжением, нежели платить большие суммы, применяя метод культуры клеток. Да и результат, столь ожидаемый может быть не так хорош, как хотелось бы. Всего несколько клеток или вирус могут полностью испортить культуру. Во многом именно поэтому данный метод не пользуется такой популярностью. Несмотря на подобный отталкивающий фактор, у этого метода по-настоящему большое будущее. Да и применяется он иногда там, где мы и не могли догадываться: например, с помощью данного метода выращиваются ферменты редких растений, используемых в парфюмерии — многие редкие виды больше не подвержены истреблению из-за рыночных спросов. Но главным образом, именно с помощью этого принципа возможно создание препаратов, коренным образом изменющих мир — например, создание препаратов против рака. Не просто продлевающих жизнь, а излечивающих от рака. Идея заключается с поздействии не просто на раковые клетки, а на фермент-феломеразу. Таким образом клетки перестанут делиться настолько быстро и в результате потеряют характерную особенность — бессмертие. В результате пациент избавится от раковой опухоли без операций, что гарантирует отсутствие регенерации раковой культуры. При всей уникальной пользе данного метода, о нем мало известно широкой публике, несмотря на все те области, в которых данный метод применяется и все те напасти, какие люди смогли преодолеть с помощью него (например, вакцина против палиомелита). Таким образом, возможно, в рамках моей дипломной работы мне удастся хоть немного рассказать людям, прочитавшим мой диплом, об этом методе, о границах его применения, о потенциальных возможностях и о теоритических знаниях, связаных с методом кутивирования клеток. ^ Создать работу, максимально понятно раскрывающую метод культур клеток и тканей, его особенности и историческое развитие. Помимо вышеупомянутого, в работе указывается развитие и использование метода в настоящее время, перспективные области применения и минимальные особенности работы с клеточными культурами. В работе должны присутствовать схемы или изображения, помогающие объяснить тему. Задачи
Культивирование клеток (эксплантация) - метод длительного сохранения в живом состоянии клеток, тканей, небольших органов или их частей, выделенных из организма человека, животных, бактерий или растений.1 Главным объектом с которым и работают лаборатории, используя метод культивирования клеток, это клеточные линии. Клеточные линии делятся на первичные, диплоидные и перевиваемые клеточные линии. Первичные линии, это клетки, полученные непосредственно из организма; диплоидные — способные сохранять диплоидный набор хромосом на протяжении до 100 клеточных циклов (делений), сохраняя изначальный набор хромосом2; перевиваемые клетки способны выдерживать неограниченно количество делений. Последний тип линий характерен преимущественно для либо опухолевых клеток, либо для одноклеточных. Первым кто попробовал сохранять органы отдельно от организма является физиолог Рингер. Английским физиологом был разработан некий физиологический раствор, способный поддерживать биение сердец крупных животных. Однако больший вклад внес , по современным предположениям, был Вильгельм Ру, в 1885 году проводивший свои известные эксперименты по поддержанию различных органов животных, преимущественно мозга куриного эмбриона. Именно он в последствии и установил самые первые начальные принципы метода культивирования клеток. Другой не малозначной фигурой, внесший свой крупный вклад является американский ученый Росс Гренвилл Гаррисон. Этот биолог проводил опыты зачатками нервной системы эмбрионов лягушек. В проделанном эксперименте Гаррисон поместил в кусочек лимфы зачаток нервной системы. В результате ему удалось продержать образец в пробирке несколько недель. Стоит отметить, что некоторые клетки даже начали давать нервные волокна.3 Однако, как и в большинстве случаев, клетки культуры погибли. Невольно возникает вопрос: «Почему клетки начали даже делиться, а в конечном счете все до единой погибли?» Можно подумать, что рано или поздно происходит заражение культуры из-за несовершенности методов, однако, как бы ни были хороши методы и оборудование, все нормальные клетки рано или поздно перестанут делиться и погибнут. Между прочим, по той же причине происходит старение и смерть человека. Старение и естественная смерть заложены в генах как человека, так и всех многоклеточных организмов. Ген, активирующий выработку фермента теломеразы, отсутствует абсолютно у всех живых существ — и у растения, и у гриба. Но результат один — все эти организмы сначала перестают делиться (митоз, регенерация), стареют, ну, а после и вовсе умирают. Сам процесс старения и апоптоза клеток называют пределом Хайфлика. А если быть точнее предел Хайфлика это количество делений, которое может пройти любая соматическая клетка. У человека предел Хайфлика равен 52. Иными словами, каждая соматическая клетка за все время жизни человека может поделиться не более пятидесяти двух раз. Эта цифра была выведена самим Хайфликом еще в 1965. Ученый отслеживал деления клеточной культуры. В его наблюдениях Хейфлик установил, что клетки, подходя к границе в 50 клеточных циклов начинают проявлять все признаки старения, а все без исключения к 52 циклу уже не делились — в последствии умирали. Ген, вырабатывающий теломеразу активен только у ненормальных раковых клеток. Они могут делиться абсолютно неограниченно количество раз (имеется ввиду митоз, регенерация). Теоретически, люди могли бы жить абсолютно вечно, если бы удалось активировать этот ген, однако, у такой «вечной жизни» есть несколько «минусов». Если даже не думать о перенаселении, которое неизбежно случится на планете Земля, то сразу выяснится, что человек потеряет облик человека — у клеток с активированным геном теломеразы отсутствует часть естественного клеточного цикла — интерфаза. Этот период можно разделить на три условных участка: G1, S-период и G2. Во время этих этапов клетка растет и подготавливается к следующему делению, а у раковых клеток этого просто нет. Они как только разделились один раз, сразу же делятся еще раз, а после еще и еще. В результате клетки получаются ничтожно маленькими, но в невероятно большом количестве за кротчайшие сроки. Во многом из-за своей столь быстрой скорости деления раковые опухоли так и опасны. Одним из основных методов диагностики рака у человека является именно метод культивирования клеток. Основой диагностики является способность раковых клеток делиться не только в горизонтальной плоскости, в два и более слоев в сосуде, что обусловлено отсутствием контактного торможения, в результате чего, клетки растут «друг на друге». Поэтому если взятые клетки заполняют пробирку, а не остаются только на дне, то у пациента рак того или иного органа. Вернемся к истории. После Ру и Гаррисона метод культивирования клеток заметно был усовершенствован. Одним из ключевых открытий можно считать установление возможности выращивать клеточную культуру во взвеси, получаемую из любой твердой клеточной структуры под действием особого фермента трипсина. Этот фермент растворяет межклеточное вещество, разделяя клетки между собой. Выращивание клеток во взвешенном состоянии позволил получать линии не только в ограниченном пространстве на стенках сосудов, но и объектов прямо в растворе, состав которого теперь стал точно известен и вымерен.4 Позже, в середине XX века произошел сильнейший толчок, как всей медицины и фармацевтики, так и культуры клеток в частности. Причиной этому может служить общий подъем науки. Например, одним из главных фактов, повлекшим развитие данного метода является многочисленные открытия в области вирусологии. Новые области применения, открывшиеся перед методом культивирования клеток привели к развитию данной области с новой силой. Впервые массовое выращивание клеток и вирусов стало легко достижимо, благодаря именно методу культуры клеток были получены первые чистые линии вирусного материала. А как следствие возможность проведения массовых вакцинаций населения. Первым успешным препаратом стала вакцина против полиомиелита, нашедшая огромное распространение. Ученым Эндерсу, Уэллеру и Роббинсу в последствии была присвоена Нобелевская премия, за открытие способности вируса полиомиелита расти в культурах различных тканей.» Помимо прочего в настоящее время выращиваются вакцины против полиомиелита, кори, эпидемического паротита, краснухи, ветрянки и многих других широко распространенных заболеваний. С недавнего времени правительство Соединенных Штатов Америки начало активное финансирование исследований по поиску лекарственных препаратов против птичьего группа H5N1 (он же HPAI A). Помимо прочего благодаря методу удалось доказать многие законы и объяснить процессы, доказать которые ранее не удавалось. Например, многие эксперименты, требующие множество живых особей (часто человеческих), можно проводить на нескольких культурах без использования живых организмов. Помимо прочего, используя культуры возможно отслеживать не только морфологические изменения, но и биохимические, что однозначно невозможно при работе с живым человеком. ^ Было бы странно говорить о методе, рассматривая только его историю и ничего не сказав о самом методе — о том как именно выращивают клетки, какие условия необходимо соблюдать и какие условия необходимы для тех или иных клеточных линий. Все выращиваемые клетки можно разделить на две основные группы — животные и растительные. Так как происхождение и строение этих групп абсолютно разное, так же и условия и способы их выращивания тоже сильно отличаются. Для одних необходим свет — для других он абсолютно необязателен, для одних нужен один газовый баланс — для других он совсем другой и так далее. Несмотря на общую схожесть клеток одного царства, разные типы требуют различных добавок, помимо основных, которые присутствуют почти в каждой культуре, поэтому для каждой линии всегда подбирается оптимальный набор и пропорция питательных веществ и среды. Однако, можно выделить и наиболее «популярные» при культивировании вещества и добавки. В состав питательных сред входят макро- и микроэлементы такие как натрий, фосфор, калий, кальций, сера, магний, железо, бор, цинк, медь, кобальт, марганец, йод и молибден. Другим не менее важным компонентом, добавляемым в питательные среды являются витамины. Наиболее часто используемые: В1, В6, В12, РР. В качестве питательной основы используются специальные питательные среды с продуманным составом и, зачастую, созданные под конкретную линию. В случае, когда сложная среда не требуется, могут использовать даже агар-агар с добавлением таких углеводов как сахароза, глюкоза, маннит. Для выращивания растений необходимо наличие фитогормонов (чаще всего цитокинины и ауксины в определенном соотношении). Ауксины вызывают клеточную дедифференцировку, а цитокинины индуцируют деление дифференцированных клеток и необходимы для получения каллусных тканей — растительных не дифференцированных клеток и тканей способных дать целый организм. Большинство обучающих работ при изучении методов культивирований клеток проводятся именно на каллусных тканях — их легко получить и не особо сложно культивировать.5 Но даже для самых простых правил всегда есть исключения. В методе культивирования клеток почти всегда этим исключением являются раковые клетки. Для них не нужны никакие гормоны. Они растут и делятся без «стимуляторов», им достаточна лишь специальная питательная среда. СосудыВ современных лабораториях выращивают различные виды клеток в самых разнообразных сосудах и емкостях. И конечный выбор падает обычно на наиболее характерную для аналогичных клеток среду и емкость. Наиболее часто для всех культивирований используют флаконы. Флаконы представляют собой пластиковые многогранные склянки чуть больше ладони с набором разных крышек с разными фильтрами или без таковых. Во флаконах чаще всего выращивают суспензионные культуры. Главным плюсом флаконов является достаточно большая площадь среды, заполняющей внутреннее пространство и абсолютная прозрачность сосуда, что позволяет постоянно следить за состоянием и процессами культуры используя, к примеру, инвертированный микроскоп. Другими распространенными сосудами являются разнообразные чашки Петри. Они достаточно просты и удобны для культивирования небольших группы и отдельных клеток, что объясняет их популярность. Как и флаконы, чашки Петри имеют прозрачные дно, что удобно при отслеживании состояния культуры. Стеклянные пробирки используются достаточно редко, однако их использование возможно для не слишком требовательных культур, не требующих регулярных пересеиваний, однако даже в таких случаях предпочитают пластиковые флаконы или чашки Петри. Отдельная роль в методе культивирования клеток занимают так называемые фидеры («кормилки»). Обычно это сосуд на котором изначально выращивается какая-либо неприхотливая культура (например, фибропласты), а уже после того, как вырастет полноценный слой, насаждается другая, которую и необходимо вырастить. Таким образом «верхняя» культура питается не от твердой или жидкой среды, а от «нижних» клеток. Обычно эту технику применяют на раковых клетках и вирусном материале (в последнем это единственный возможный способ). Не столько сосудом, но все же емкостью для измерения количества среды или раствора является градуированная пипетка. Она представляет собой стеклянную или чаще пластиковую трубку небольшой толщины с двумя не запаянными концами. К одному из них подключается механический или вакуумный насос, понижающий давление в трубке, что приводит к засасыванию жидкости через нижнее отверстие. Существует множество пипеток на самые разные объемы и различной точности измерений. ^ Отдельное слово стоит сказать о питательных средах, их приготовлении и классификации. По глобальному делению сред для культур растительного происхождения с целью дальнейшего подбора питательных сред к конкретному организму можно разделить следующим образом:
Большинство сред хоть и имеют весьма «богатый» набор различных добавок и ингредиентов, но концентрации всех веществ не превышают 1,5 грамма на литр, что очень мало, однако при приготовлении сред используют намного большие концентрации солей и прочих веществ, нежели при непосредственном пересаживании культуры на раствор. Такие рабочие растворы называются маточными (концентрированными). Объяснить необходимость высоких концентраций довольно просто. Так как нужны крайне точные концентрации ингредиентов, намного проще готовить среду при больших объемах веществ и один раз, нежели несколько раз высчитывать микродозы. Помимо этого, при больших концентрациях солей в растворах уменьшается вероятность поедания микроорганизмами питательных веществ. Сам процесс приготовления крайне сложен. Необходимо соблюдение правильных концентраций для каждого из добавляемых веществ. А так как в большинстве своем все вещества поставляются в совершенно разных тарах и соотношениях с другими, то процесс может занимать достаточно длительное время. Стоит заострить внимание, что некоторые компоненты хранятся в разных агрегатных состояниях и совершенно разных температурах. Например, витамины хранят в сильно замороженном виде, а фитогормоны хранятся при температуре около 2-4 oC в холодильнике. Другим параметром для выращивания растительной культуры клеток может стать агрегатное состояние среды. Ясно, что в газообразном виде культуру выращивать невозможно, а вот в жидкой или на твердой это сделать вполне реально. Основной разницей для этих двух разных путей является необходимость культуры «перемещаться» в случае с жидкостью — культуры нужно постоянно перемешивать для циркуляции кислорода и питательных веществ по сосуду. В противном случае все культура погибнет. Несмотря на большинство просчитанных ингредиентов, многие культуры не делятся в привычных условиях. Поэтому довольно часто в стандартные среды, подобранные для культивирования, уже в лабораториях добавляют различные антибиотики, соли, элементы и прочие примеси. Поэтому иногда лаборатория при работе с малоизученным типом клеток чем-то похожа на кухню — стоит добавлять ингредиенты «по-вкусу». ^ Для изучения процессов обмена веществами между организмами и средой часто используют радиоактивно-окрашенные изотопы. Особо часто применяется метод радиоактивного окрашивания при изучении скорости и путей синтезирования белков, РНК и ДНК. Процессы самого окрашивания и измерения особо сложны, что требует написания отдельной работы, что не требуется ибо на настоящий момент существует достаточно материала по данному вопросу. СтерилизацияОсобое внимание стоит отнести процессам стерилизации оборудования и питательных сред. Зачастую это является чуть ли не важнейшим аспектом в выращивании клеточных линий и культур. Стерилизация (от лат . sterilis — бесплодный) — полное освобождение от микроорганизмов различных веществ и предметов. Осуществляется действием высоких температур, химических антисептических веществ (сулема, окись этилена и др.), ионизирующих излучений (лучевая стерилизация) и др. способами.6 Существуют разные методы стерилизации, дающие разные эффекты и уничтожающие различные микроораганизмы с разной эффективностью. Основными методами являются стерилизация с помощью влажного пара, сухого пара, с использованием облучения ультрафиолетовыми лучами, обработки химическими веществами и микрофильтрации. Одним из наиболее популярных способов обработки сред, не выдерживающих высоких температур (более 100 oC), является дробная стерилизация. Главной особенностью данного метода является сравнительная простота идеи стерилизации — высокая температура. Проводить подобную стерилизацию можно даже не в специальном оборудовании, а в простой пароварке. Минусом данного метода является неспособность подобных температур уничтожать все стадии роста живых организмов, а именно споры. Споры легко переносят термическую обработку и могут заметно испортить будущую культуру, что недопустимо, поэтому дробную стерилизацию повторяют несколько раз с промежутком в день. Зачем это нужно? Споры, оставшиеся после первичной обработки, начинают прорастать, что позволяет уничтожить их в прорастающем виде на следующий день. Для надежности процедуру повторяют не менее трех раз. Другим популярным способом является автоклавирование. Обработка материалов происходит в специальном аппарате, способном создавать различное давление и комбинировать обработку горячим паром с повышенным давлением. В результате при такой обработке, соматические клетки растений и животных гибнут уже через 10 минут при температуре в 60 oC, а споры грибов через 15 минут при температуре в 120 oC. В принципе, казалось бы, автоклавирование продолжать чем больше, тем лучше, однако это совсем не так. Для всех физических объектов характерна так называемая теплоемкость. Величина, определяющая количество энергии, которое тело способно принять. Именно этот показатель зачастую ограничивает продолжительность и температуру автоклавирования на весьма низкие единицы. Для посуды без каких-либо нужных веществ характерны комплексные процедуры очистки. Для начала каждый предмет моется с использованием того или иного детергента (мыло, моющее средство и т. д.), далее очищают с добавлением двухромовокислого калия (дихромат калия) в серной кислоте. Далее происходит очистка водой разной степени очистки, после чего все приборы сушатся в сушильном шкафу длительное время. После всех этих процедур предметы подготавливают к стерилизации. В качестве способов избежания заражения и оседания вредных организмов на стенках и дне сосудов, их заворачивают в плотную бумагу, затыкают плотными ватными пробками и заворачивают в фольгу. И только потом следуют вышеупомянутые способы стерилизации, иногда комбинированные и дополняющие друг друга. Иными словами, только на одну очистку посуды уходит огромное количество времени и сил. Помимо посуды, необходимо стерилизовать и весь набор инструментов, одежду, рабочие материалы (вату, марлю и т. д.), питательные среды и даже сами культуры. Разумеется, для всех их возможны различные способы. Например, клеточные линии настолько требовательны, что ни один из вышеупомянутых способов стерилизации для клеток не годится. Для них чаще всего используют мелкую фильтровальную бумагу с расстоянием между порами 0.45 мкм. Данным метод используют только для объектов, не переносящих нагревания. Для инструментов, таких как ножницы или шприцы, автоклавирование невозможно в следствии того, что горячий пар при высоком давлении быстро окисляет железо и сталь, в результате чего все металлические предметы покрываются ржавчиной и быстро затупляются, что недопустимо при высокоточных операциях. Из-за невозможности автоклавирования, дезинфекция инструментов производится в сушильном шкафу. После завершения этого этапа, непосредственно перед манипуляциями, оборудование погружают в спирт, после чего прокаливают на горелке. Последние два действия повторяют после каждого действия с культурой — в целях соблюдения стерильности, разрешено не более одной манипуляции после одного прокаливания и спиртовой стерилизации. С одеждой, ватой, фильтровальной бумагой и прочими рабочими материалами процесс стерилизации проводится намного проще. Все эти материалы в большинстве своем нормально переносят автоклавирование, что позволяет проводит этот наиболее эффективный метод. Процесс стерилизации занимает в среднем пол часа при давлении в две атмосферы. С питательными средами все несколько сложнее. Далеко не все они способны переносить высокое давление и высокие температуры. Даже не столько этот факт мешает проводить длительную стерилизацию в автоклаве, сколько тот факт, что время процедуры сильно зависит от количества материала в сосуде — иными словами, огромное значение в выборе режима автоклавирования зависит от количества среды, подвергаемой этому процессу. Наиболее наглядным примеров неправильно выбранного режима является «помутнение» среды. ^ Спектр оборудования, разумеется, отличается абсолютно для каждой лаборатории, однако есть незаменимое, которое в том или ином исполнении, но есть абсолютно везде. К такому оборудованию можно отнести автоклав, ламинарный бокс, холодильник, центрифугу и инкубатор. Наиболее часто используемый прибор для сохранения чистых условий является ламинарный бокс (он же ламинар). Основным принципом его работы является определенно направленный ток воздуха, идущий из внутренней части наружу, что в определенной мере позволяет избежать заражение культуры спорами и прочими мелкими микроорганизмами. Такой тип подачи воздуха называется ламинарным. В отличии от турбулентного, все молекулы газа направлены параллельно, что позволяет равномерно удалять объекты из зоны непосредственно наружу без вероятности осаждение на стенках и дне рабочего бокса. Помимо этого, почти всегда ламинары оборудованы ультрафиолетовыми лампами — это наиболее часто используемая методика по дезинфекации помещений и крупного оборудования. Центрифуга есть далеко не везде, однако она необходима для разделения различных жидкостей и смесей на составляющие компоненты, различные по своей удельной массе. К таким «разделимым» жидкостям можно отнести кровь. После центрифугирования невооруженным глазом видна плазма, кровяные тельца и прочее, после чего можно легко отделить одну составляющую от другой. В качестве холодильника чаще всего используют обычный бытовой, ибо для охлаждения и хранения клеток подобного вполне достаточно. Иногда так же используют особый низкотемпературный вариант (до -1500 С). В место холодильника для глубокой заморозки используют так же жидкий азот. В замороженном состоянии все процессы жизнедеятельности практически полностью останавливаются, клетки не стареют и не развиваются. Инкубатор (часто называемый CO2-инкубатором). Такой инкубатор не только поддерживает однородную температуру, но и точный газовый состав. Большинство животных клеток выращиваются именно в 5% СО2-среде. Объяснить это довольно просто, во-первых, наши тела содержат те же 5% углекислого газа, что и задаваемая среда, а во-вторых, это позволяет удерживать кислотно-щелочной баланс среды, не давая ей стать слишком щелочной. Инкубатор представляет собой небольшой шкафчик с подключенным к нему баллоном с углекислым газом, который подается во внутрь как только уровень падает ниже 5%. Особое место в лабораториях занимают всевозможные лабораторные встряхиватели. Обычно это устройства, создающие на счет электрических двигателей мощные импульсы, которые перемешивают содержимое пробирок, флаконов и прочего инвентаря, что необходимо при выращивании суспензионных и некоторых других культур. ^ О биотехнологииКонечно, очень интересно слушать о всей сложности и увлекательности биотехнологических манипуляций, однако, какой во всем этом смысл, если от него нет никакой пользы? Казалось бы, где и как этот метод может помочь простым смертным? Оказывается, с базой этого метода сталкивался почти каждый. Более того, в роли биотехнологов выступали люди более нескольких тысяч лет назад! Другое дело, что никто из них толком и не понимал, что он делает. Приведем самый простой пример. Все знакомы с такими ежедневными продуктами как хлеб или, например, сыр. Каждым из вас примерно представляет как сделать дрожжевой хлеб. Необходимо на основу (тесто) добавить дрожжей и немного сахара. Но что же на самом деле представляет из себя этот простейший процесс? Мы добавляем микроорганизмы и питательную среду для из жизнедеятельности — сахар. В результате окисления или глюкозы образуется углекислый газ, в результате чего тесто поднимается. Даже разобрав суть этого процесса мы не всегда понимаем, что мы сделали. А ведь мы выступили именно в роли биотехнологов, синтезирующих биоматериалы. Собственно сам процесс брожения и является старейшим примером биотехнологий на нашей планете. Таким образом можно сказать, что биотехнология зародилась как минимум восемь тысяч лет назад! Именно в шестом тысячелетии до нашей эры была написана небольшая табличка о принципе приготовления напитка, аналога пива. Другое дело, что наверняка немногие из древних людей понимали глубину совершаемых манипуляций, но это не так важно, когда сама идея создания чего-либо за счет живых существ существует уже несколько тысяч лет.7 Здорово было бы считать что и метод культивирования клеток так же зародился многие тысячи лет назад. Однако между биотехнологией и многократно упомянутом методе есть одно очень важное отличие — для биотехнологии чаще необходимы продукты жизнедеятельности организмов, что для метода культивирования клеток — сами клетки и организмы. Из-за этой особенности метод становится значительно сложнее, нежели другие манипуляции с клетками, какие предусматривает биотехнология. С другой стороны, эти эксперименты и результаты представляют собой более сложные структуры, для выращивания которых общих биотехнологических знаний явно не хватит. Таким образом можно сказать, что метод культивирования клеток является хоть и частью биотехнологии, однако он в себе заключает и другие аспекты, не являющиеся общими для биотехнологических исследований и манипуляций. Казалось бы, если хлеб выпекать просто и главное необходимо, то почему не получают готовые органы в промышленных масштабах? Ну, если учесть то, что сложность строения хлеба и любого, даже наиболее простого органа, несоизмеримо различны, то вопрос исчезает сам собой. ^ В настоящее время невозможно получать огромные объемы продукции, какая необходима в данным момент. Налажен синтез различных тканей (в том числе и человека), но полноценных органов пока не получено. Возможно, в будущем все станет возможным, однако в данным момент выращивание даже одного органа требует большого количества времени и материальных средств. С другой стороны, если считать, что данным метод невозможен для общества, перестать изучать его и совершенствовать, то вряд ли удастся создавать органы, не требующие подавления иммунологической реакции, которую оказывает организм на все чужеродные объекты. А ведь из-за этой реакции иногда не удается спасать людям жизни — организм отторгает искусственные органы или органы другого человека, что ведет к чудовищным последствиям — начиная от воспалительного процесса заканчивая летальным исходом. Используя органы, созданные с использованием данной технологии, возможно отказ от веществ подавляющих иммунологическую реакцию так как можно будет выращивать органы из генного материала самого пациента, в результате чего отторгающей реакции не будет, что несомненно позволит выращивать полноценные органы, после пересадки которых осложнения если и будут, то в минимальном количестве и не опасные для жизни пациента. Если удастся сократить расходы и поставить технологию на промышленный масштаб, то пациентов использующих временные заменители человеческих органов почти не останется, что позволит спасать жизни людям даже с серьезными генетическими и, возможно, с геномными отклонениями, что наверняка сделает мир лучшим местом. ^ Все теоретически возможные пути применения всегда хороши, однако, от них нет никакой пользы, пока они остаются лишь мечтами. От метода должна всегда быть конкретная польза. Для данного метода она, несомненно, есть. Даже если не брать во внимание все то множество препаратов, спасших миллионы человеческих жизней, таких как вакцины от полиомиелита, кори, в настоящее время получено множество различных образцов тканей как человека, так и других животных. Получены линии клеточного материала растений, в том числе редких. Многие ферменты растений, пользующихся огромным спросом на рынке парфюмерной продукции, получают именно этим методом. Если представить, что пришлось бы отказаться от метода культивирования клеток, то многие виды редких растений были бы полностью истреблены за кротчайшие сроки, чего, к счастью, не происходит. Многие жизненно необходимые человеческие органы уже почти полностью воссозданы, однако, пока для пересадки они не годятся, хотя бы потому, что риск проблем с малоизученным материалом может быть слишком много, что недопустимо при работе с человеком. Тем не менее, уже выращены экспериментальные образцы таких тканей как костная ткань (зуба, например), мышечное волокно, ткань легких, молочную железу, часть почки человека. ^ Единственной полностью проработанной и неоднократно применяемой технологией по выращиванию тканей, является методика по пересадке кожи (эпидермы в частности). В Американских клиниках производились многократные пересадки культивированных участков кожи пациентам. Считается, что заранее выращенная ткань дает намного меньше рубцов и быстрее покрывает поврежденный участок, чем естественно регенерирующая ткань человека. При особо сильных повреждениях (например, ожогах 3-4 степени), это может стать единственным способом спасти жизнь. Так как обычно выгорает не только поверхность кожи, но и толща тканей, то без капиллярной системы регенерация практически не будет происходить, а с помощью искусственно культивированной дермы возможно начать процессы восстановления почти сразу после пересадки. При культивировании клеток кожи человека мелкий образец, полученный у пациента, сначала расслаивают, получая слой эпидермиса, потом добавляют такие ферменты как трипсин для разделения клеток. Полученные клетки «сажают» во флаконы, где они растут чуть меньше недели. Потом из сновы выделяют из флаконов, заново разделяя и снова культивируя. Так культивирование занимает от двух до трех недель, что позволяет получать не менее 100 см2 полноценной культуры кожи за неделю, составленной из донорских клеток. Помимо попыток собрать органы или эпителиальную ткань, с помощью этого метода выращиваются штаммы вирусного материала и клетки возбудителей различных заболеваний. Таким образом необходимость «собирать» массу биологически опасных мутагенов отпадает. Достаточно создать условия для размножения того или иного микроорганизма, и он сам создаст необходимое количество себе подобных — все относительно безопасно и геном у всех организмов будет абсолютно идентичным, что является дополнительным плюсом для исследований. ^ Однако данным фундаментальный метод используется не только в научных или медицинских целях. С 2001 года появилась идея попытки отказа от натуральных мышечных волокон и перехода к искусственно выращенным в пробирке. Собственно, в этом и заключается основная идея «мяса из пробирки» (in vitro meat). Главным фактором, влияющим на распространение данной технологии, является полная идентичность в строении и свойствах мяса искусственного по сравнению с натуральным, при чем для выращивания «в пробирке» клетки нужно взять всего один раз, что очень вдохновляет защитников животных. Помимо этого, считается что этот метод позволит заметно сократить необходимое количество ресурсов. Земельные затраты вплоть до 99%, затраты энергии до 45 %, до 96 % меньше воды и на 78-96 % меньше выбросов парниковых газов. К сожалению, на данным момент производство слишком дорогое, чтобы начать глобальный переход, однако в ближайшее время планируется снизить цены за счет технологического прогресса и возможно уже через несколько лет люди откажутся от традиционного способа питания. ^ Еще одной перспективной областью, связанной с методом культивирования клеток, является методика работы со стволовыми клетками. Интересны они своей способностью перерождаться в клетки, которые требуют регенерации. Иными словами способность быть любыми. С медицинской точки зрения, это крайне важно при различных осложнениях с жизненно-важных органах — их можно вырастить и заменить не дифференцированными стволовыми клетками. По своему происхождению их разделяют на эмбриональные, фетальные, клетки пуповинной крови и клетки взрослого человека. В большом количестве стран введены крайне жесткие запреты на использование стволовых клеток по своему усмотрению, введены четкие границы на тип используемых клеток для лечения какой именно патологии. Наиболее часто встречаются случаи операций с клетками взрослого человека, ибо на них наложено меньше всего запретов на использование. Основной источник таких клеток в организме — красный костный мозг — концентрация стволовых клеток в нем максимальная. Другим типом клеток, годных для теоретического (пока не возможно выращивать что-либо на практике) культивирования это эмбриональные клетки. Получают их на самых ранних стадиях развития эмбриона, чуть позже бластулы и гаструлы. Из них можно выращивать целые организмы. Они наиболее подвержены спонтанным изменениям, например, они часто склонны к внезапному перерождению в раковые, без объяснимых на данный момент причин. Третьим видом клеток, выращиваемым в мире являются фетальные клетки. Это клетки, полученные из абортивного материала, что и является одним из главных моральных и юридических вопросов, противодействующим активному развитию именно этого типа клеток. Тем более, что убитый эмбрион теоретически может быть носителем различных вирусных заболеваний, что приведет к заражению рецепиента. Последним, достаточно известным методом получения стволовых клеток является плацентарно-пуповинная кровь, собранная после рождения ребенка. Там имеются стволовые клетки, но в недостаточном количестве для пожизненного использования. В лучшем случае их можно использовать для лечения заболевания ребенка в первые 14 лет жизни.8 Данный метод все еще развивается в данный момент, несмотря на то, что подвергается жесткой критике со стороны некоторых ученых, церкви и других организаций. Во многом из-за неполного соответствия клеток естественных с клетками стволовыми, этот метод не получает достаточного развития. ^ Одним из ключевых преимуществ выращивания клеточных культур по сравнению с живым организмом при научных исследованиях, это возможность пожизненного исследования выращиваемой культуры. Если, например, при использовании организма детальное исследование возможно только после смерти организма, то с клеточными культурами можно проводить всевозможные манипуляции без вреда для всех клеток одновременно. Другим неоспоримым преимуществом является возможность поддерживать и изменять условия, что невозможно контролировать с целым организмом. Например, возможность менять кислотно-щелочной баланс и отслеживать реакцию тех или иных клеток. Помимо этого, культуры значительно снижают концентрации используемых веществ для тех или иных экспериментов, в том числе и радиоактивных или ядовитых. Количества веществ при работе с клеточными культурами значительно меньше, чем при работе с живой системой, при чем реакция ни чуть не меньше.9 ^ Для выбора правильной стратегии в выращивании клеток стоит определить каким именно способом будет выращиваться культура. Без данного шага могут возникнуть проблемы в понимании процессов, происходящих в клетках, при том или ином методе. Классифицировать все способы и типы культивирования клеток можно следующим образом:
^ Для дальнейшего раскрытия темы стоит сказать пару слов о четырех основных фазах развития клеток при наиболее популярном периодическом к  ультивировании.
Клетки со временем переходят из одного отрезка в другой, при этом у них меняются не только свойства и особенности роста и деления, но и меняется химический состав, что в свою очередь несомненно повлияет на скорость прохождения следующей лаг-фазы. Во многом именно поэтому долго культивируемые культуры на одной среде с трудом перевиваются на новую. ^ Этот метод во многом похож на простое периодическое культивирование, разве что питательная среда постепенно добавляется к клеточной массе, что несколько продлевает длительность некоторых циклов. При использовании именно этого метода, чуть ли не единственным лимитирующим фактором является объем среды, что несомненно дает заметные преимущества при выращивании большого количества клеток. Одной из вариаций этого метода можно считать метод диализа. Суть метода заключается в том, что клетки отделены от всего раствора мембраной, проводящей лишь мелкие объекты. Этот метод позволяет выращивать клетки, изолируя их от продуктов жизнедеятельности, постепенно накапливающихся в сосуде. К сожалению этот метод не нашел промышленного применения ввиду сложности и низкой выходной массе продуктов. Однако его еще можно встретить в некоторых лабораториях. Основным плюсом данного метода служит способность мембраны удалять из реакционной смеси ингибиторы, мешающие делиться клеткам, что выполнить другими методами достаточно сложно. ^ Это процесс культивирования при многократном пересеивании, но без стерилизации емкости. Как результат можно наблюдать рост культуры, без затрат времени на очистку. Такой способ используется иногда в нескольких ферментерах, последовательно сменяющими друг друга. По своей природе не особо отличается от периодического метода, однако количество культуры в данном случае заметно выше, но вероятность заражения или загрязнения культуры выше. ^ Характерная особенность — автоматический слив клеточного материала и наполнение рабочей части системы питательной средой. Как следствие можно наблюдать колебательную систему, иллюстрирующую отношение количество клеток к количеству питательной среды. Частота будет зависеть от удельной скорости деления культуры, что зачастую и надо выяснить. Различные варианты полунепрерывных систем используются в производстве дрожжей, водорослей, антибиотиков и других продуктов. ^ Обычно непрерывное выращивание происходит в открытой динамической системе, в которой устоялось равновесие, поэтому культура питается в точно вымеренных объемах, и выделяющаяся среда также должна быть всегда стабильной. Н  а фотографии изображен ферментер лабораторный на десять литров — один из многочисленных примеров систем динамического равновесия. В подобных системах выращиваются культуры в больших объемах, какие обычно нужны для производства или крупных биологических экспериментов, поэтому подобное сложнейшее оборудование в рядовых лабораториях практически не встречается.Однако помимо этого непрерывная система открывает возможности для измерения реакции на те или иные факторы, ограничивающие рост. Например, можно отследить скорость и количество делений клеток при той или иной концентрации микроэлемента в среде. Для этого тот или иной лимитирующий фактор (в данном случае количество микроэлемента) искусственно изменяют, не изменяя прочих факторов. В результате получают точные биологические данные, какие получить в организме или в разовых экспериментах было бы практически невозможно. Процесс изучения влияния того или иного фактора на клетки называют хемостатным культивированием. Стабильные открытые системы имеют управляемые постоянные условия, которые позволяют смоделировать глобальные экологические процессы, которые происходят в природе многие годы и даже столетия. Многие эксперименты проводятся в несколько стадий с использованием нескольких последовательно соединенных ферментеров, в таких случаях процесс ферментирования называют многоступенчатым. Н  а схеме представлен классический трехступенчатый ферментер. ^ Другой способ культивирования используется только для анаэробных условий. Он носит название систем культивирования полного вытеснения. Принципом такого культивирования служит непрерывные поток смеси среды с клетками, идущими через трубку. Как следствие, клетки постоянно растут и уже к концу их биомасса заметно увеличилась. Классический пример такого культивирования — трубчатый реактор.  Смесь из клеток и питательной смеси подаются и смешиваются непосредственно перед входом в трубку, что начинает цикл делений и роста клеток. Так мы рассмотрели основные направления культивирования клеток бактерий. Стоит отметить, что это только основные пути, используемые при выращивании культур, далеко не ограничивающие теоретически возможные пути. Общее представление о культивировании клеток микроорганизмов можно по схеме. О  сновные методы культивирования микроорганизмов ^ Если в истории культивирования клеток бактерий и животных основные скачки развития приходятся на конец XIX века, то с растениями ввиду сложности культивировании долгое время никаких делений не было. Первыми существенными толчками в развии этого метода стали открытия в 1922 г. В. Роббинс и Котте независимо друг от друга показавшие возможность культивирования на синтетических питательных средах клеток меристемы кончика корня томатов и кукурузы. Эти опыты положили начало применению метода культивирования изолированных клеток и органов растений. С тех пор до 60-х годов учеными было постепенно синтезировано более 150 видов клеток растений in vitro. Итак через некоторое время Ф. Стюард, работая с культурой изолированной флоэмы моркови, получил из нее в 1958 г. целые растения. Для растений почти всегда культивируются каллусные клетки растений. Заметно реже клетки опухолей растительного происхождения. Они практически не отличаются морфологически, но отличаются от нормальных лишь гормононезависимостью. Так же, в отличии от каллусной ткани, они не могут дать нормальные органные структуры. Известны случаи, когда они давали лишь тератомы (уродливые органоподобные структуры), дальнейшего развитие которых обычно не происходило. Каллус является тканью, возникающей при исключительных обстоятельствах (обычно при травмах) и функционирующей непродолжительное время. Эта ткань защищает травмированное место, накапливает питательные вещества для анатомической регенерации или генерации утраченного органа. Каллусные клетки можно получить не только при непосредственной травме растения, но и после первого культивирования, (обычно после этого пересаживают именно каллус) на свежую питательную среду сажают клетки и происходит процесс субкультивации. В процессе субкультивирования формируется штамм, характеризующийся индивидуальными генетическими и физиологическими особенностями. ^ Если в клетках бактерий было достаточно много различных способов выращивания, то с растениями все несколько проще. Все методы можно разделить на суспензионные и поверхностные. При использовании поверхностного способа, клетки помещаются на поверхность жидкой питательной среды при помощи мостиков, например, из фильтровальной бумаги. В конкретном случае получается не всегда монотонная, часто совершенно не структурированная, рыхлая масса. В суспензиях культивирование происходит намного сложнее и не всегда удачно. Начнем с того, что клетки при суспензионном культивировании должны быть полностью сепарированы друг от друга. В обратном случае ничего не получится. Следующим этапом является отделение клеток от инородных тел, какое практически всегда остаются после первых культивирований. И только на третьем этапе клетки индуцируют к делению, получают культуру. ^ В отличие от клеток животных, клетки растений «переживают» намного больше этапов развития. К присущим клеткам микроорганизмов добавились фазы линейного роста и замедленного роста, образующие с экспоненциальной фазой график похожий на кубическую параболу, а значит переходы из каждой фазы в другую будет менее выращен, чем, например, у бактерий. С  тоит указать коренные отличия и особенности процессов, происходящих в клетках на разных стадиях.
Основные типы выращиваемых клетокНаиболее часто культивируются следующие элементы:
^ Все животные линии клеток можно разделить на три категории: первичные, диплоидные и постоянные культуры. Первичные — клетки которые только были выделены из организма, существуют до первого пересева. Диплоидные клетки способны переносить не менее 50 клеточных делений, сохраняя диплоидный набор хромосом. А постоянные клетки способны делиться неограниченное количество раз, живя многие десятки лет вне организма. Главным фактором при выборе ткани или линии клеток для дальнейшего исследования является природа процесса, который будет изучаться на этих клетках. Как правило, культуры, полученные из эмбриональных тканей, характеризуются лучшей выживаемостью и более активным ростом по сравнению с культурами из соответствующих взрослых тканей, но несмотря на ряд практических преимуществ, необходимо помнить, что эти клетки по некоторым параметрам отличаются от взрослых клеток. ^ Первичные культуры можно получить практически из любой ткани или органа. Для этого выделяется небольшой пласт клеток, после чего он либо ферментативно (например, 0,01−0,05–0,25% трипсина, 200−2000 ед./мл коллагеназы), либо механически, происходят процессы дезагрегации. После этого клетки сажают на субстрат, где они и выращиваются до следующего этапа. Довольно часто приблизительно на 20-50 клеточный цикл культура гибнет, проявляя признаки старения. Происходит это из-за постепенно перехода клеток из диплоидного набора хромосом в анеуплоидные, что создает в некоторых случаях даже штамм. Культура теряет первозданный набор хромосом со всеми вытекающими последствиями. Обойти этот процесс можно обработав культуру мутагенами или некоторыми вирусами, способными вызывать определенные генные и геномные мутации. ^ Первичные клетки, которые делятся в культуре, могут претерпевать так называемое контактное торможение движения. Когда две клетки приближаются друг к другу, то в зоне контакта прекращаются специфические движения клеточной мембраны животной клетки, что затормаживает рост клеток. Поэтому первичные клетки не могут расти друг над другом, и в большинстве случаев при достижении полного монослоя сопровождается прекращением клеточных делений. Этот феномен характерен не только для первичных клеток, но наблюдается также во многих клеточных линиях. Нетрансформированные клетки могут в течение некоторого времени сохранять жизнеспособность в таком покоящемся состоянии, но если их не пересеять, они погибают. ^ Как и у многих других типов клеточных линий, животные клетки вскоре после пересеивания вступают в лаг-фазу, продолжающуюся от 2х до 24 часов, после чего следует логарифмическая фаза, при которой клетки экспоненциально делятся, пока не достигается полный монослой. После этого начинается период замедленного роста — стационарная фаза, после которой начинается фаза отмирания клеток, уменьшение количества живых клеток.  Растущие клетки регулярно делятся примерно один раз в каждые 24 часа. При отсутствии каких-либо ограничений клетки равномерно распределены по клеточному циклу, и если количество клеток удваивается через правильные промежутки времени, то говорят, что культура находится на стадии экспоненциального роста. Обычно после короткого периода экспоненциального роста тот или иной фактор становится лимитирующим. Это может происходить в результате истощения какого-либо фактора среды или в результате того, что культивируемые клетки полностью покроют поверхность, на которой растут. Скорость роста замедляется, и количество клеток в культуре достигает насыщения (конечная плотность клеток). Когда дальнейшие деления клеток прекращаются, наступает стационарная фаза роста культуры. Однако теоретически возможно поддерживать клетки постоянно в одной наиболее «полезной» фазе — фазе экспоненциального роста, например, если их культивировать в хемостате, где увеличение поступления питательных веществ балансируется увеличением оттока клеточной суспензии. Это приводит к постоянству окружающих условий и числа клеток. На практике, однако, этого трудно достигнуть из-за возможности бактериального заражения, способного полностью погубить культуру, поэтому животные клетки весьма редко культивируются в проточных системах. Другим примером задержки клетки на одном этапе может служить встречающийся «гигантизм» клеток в культуре. Некоторые клетки по ряду причин теряют способность к делению, постоянно увеличиваясь при этом в размерах. Бывают случаи при которых клетки разрастаются более чем до 1мм в диаметре. Обычно это является причиной крайне неоптимальных условий среды, что и вызывает подобные отклонения. ^ Одним из часто использующимся методов выращивания является синхронизация клеток по определенной стадии клеточного цикла. Это необходимо для изучения некоторых процессов на большом количестве одинаково развитых клеток. Синхронизация достигается путем либо ограничивании всей культуры к дальнейшему переходу к другим циклам, что ведет к появлению аномальных клеток, либо путем выделение удовлетворяющих клеток от общей культуры. Обычно последний метод достигается путем резкого изменения условий, при которых выживают только те клетки, которые находятся в заданной фазе, остальные гибнут. ЗаключениеВ моей работе были рассмотрены основные пути выращивания культур клеток, были обозначены основные продукты, получаемые методом культуры тканей в настоящее время, были описаны несколько отраслей медицины и промышлености, в которых наиболее перспективным и интересным решением является этот метод. В настояшее время ведется относительно активное развитие этой области науки и медицины, что, возможно, уже в ближайшем будущем отразится на многих жизненных процессах: медицина сможет лечить больше травматических и хирургических недугов, бактериальных и вирусных заболеваний. Возможно, этот метод позволит коренным образом изменить нашу жизнь. Даже не смотря на всю современную сложность и непостоянность результатов, метод культуры клеток уже сейчас позволяет решать задачи различной сложности: исследовать биологические процессы, лечить и вылечивать пациентов и многое другое. Таким образом я считаю, что большинство поставленных задач реализованы, а цель работы достигнута. Получился текст не слишком сложный для восприятия, но несущий, как я считаю, основные аспекты метода культур клеток и тканей. ^ Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков - М.: Мир, 1983 Блажевич О. В. Культивирование клеток. Курс лекций для студентов специальности «БИОТЕХНОЛОГИЯ» – Мн.: БГУ, 2004 Владимирская Е.Б. Биологические основы и перспективы терапии стволовыми клетками. М..Ж Медпрактика-М, 2005. Кузьмина Н.А. Методики культивирования клеток // http://practice.biotechnolog.ru/metod.htm Ссылка действительна на 14.05.2012 Кузьмина Н.А Биотехнология. // http://www.biotechnolog.ru/ Ссылка действительна на 14.05.2012 Стволовые клетки: история и перспективы // http://p03.org.ru/publ/1-1-0-28 Ссылка была действительна на 12.04.2012 Темников Д.А. Основы культивирования клеток животных. // http://www.ksu.ru/nilkto/cell/rasdel2/r2_p1.html Ссылка действительна на 14.05.2012 Хенч Л., Джонс Д. МИР биологии и медицины: Биоматериалы, искусственные органы и инженеринг тканей. - М.: Техносфера, 2007 Содержание Введение.....................................................................................................2 Актуальность данной темы..................................................................2 Цель работы...........................................................................................3 Задачи.....................................................................................................3 Глава первая 5 Историческая справка ….................................................................5 Процесс выращивания 7 Сосуды 8 Питательные среды 9 Мелкие особенности 10 Стерилизация 10 Лабораторное оборудование 13 Практическое применение 14 О биотехнологии 14 Особенности искусственных органов 15 Практическое применение 15 Искусственный эпидермис 16 Искусственное мясо 17 Стволовые клетки 17 Исследовательские возможности 18 Глава вторая 19 Культивирование клеток бактерий 19 Периодическое культивирование 19 Продленное периодическое культивирование 20 Многоциклическое культивирование 21 Полунепрерывное культивирование 21 Непрерывное культивирование 22 Культивирование клеток растений 24 Методы выращивания каллуса растений 26 Фазы развития клеток растений 26 Культивирование клеток животных 27 Основные типы выращиваемых клеток 27 Животные линии клеток 27 Выделение первичных клеток 27 Контактное торможение 28 Фазы клеточных культур животных 28 Синхронизация клеток 29 Заключение..............................................................................................30 Список литературы................................................................................31 1 Большая Советская Энциклопедия. Статья «Культуры тканей». 2 По Хейфлику, 1965 год 3 Основано на статье «Культуры тканей» - Большая Советская Энциклопедия. 4Основано на статье из Большой Советской Энциклопедии «Культура тканей» 5Основано на данных интернет-ресурса http://practice.biotechnolog.ru/ [ссылка действительна на 21.02.2012] 6По определению из Современного толкового словаря 7Основано на идеях с интернет-ресурса http://biotehnolog.ru/ [ссылка действительна на 23.02.2012] 8Основано на данных с интернет-ресурса «Клеточные технологии» http://www.stemcells.ru/therapy 9 «Методы культивирования клеток для биохимиков» Р. Адамс (R.L.P. Adams) // Издательство «Мир» 1983г. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям