М. П. Чумакова рамн, г. Москва Защита диссертации состоится “ ” 2007 г в часов на заседании диссертационного совета д 004. 027. 01 при Институте иммунологии и физиологии Уро ран по адресу: 620049, г. Екате
|
|
Скачать 0.64 Mb.
|
|
На правах рукописи МАЛЬЧИКОВ Игорь Александрович ЗНАЧЕНИЕ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ В ПАТОЛОГИИ, СВЯЗАННОЙ С НАРУШЕНИЯМИ ПРОТИВОИНФЕКЦИОННОЙ ЗАЩИТЫ, И МЕТОДЫ ИХ ВЫЯВЛЕНИЯ 14.00.36 - аллергология и иммунология 03.00.06 - вирусология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Екатеринбург - 2007 Работа выполнена в лаборатории вирусных инфекций ФГУН «Екатеринбургский научно-исследовательский институт вирусных инфекций» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, на кафедре хирургической стоматологии и на кафедре внутренних болезней № 2 ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию. ^ доктор медицинских наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ Нина Поликарповна Глинских доктор медицинских наук, профессор Ирина Александровна Тузанкина ^ доктор медицинских наук, профессор Сибиряк Сергей Владимирович доктор медицинских наук, профессор Кокорев Валерий Серафимович доктор медицинских наук, доцент Гусев Евгений Юрьевич ^ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, г. Москва Защита диссертации состоится “___” _____ 2007 г. в __ часов на заседании диссертационного совета Д 004.027.01 при Институте иммунологии и физиологии УрО РАН по адресу: 620049, г. Екатеринбург, ул. Первомайская, д.106. Факс (343) 374-47-34 С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке УрО РАН (620041, г. Екатеринбург, ул.С.Ковалевской, д.22/20), с авторефератом диссертации - на сайте ВАКа Министерства образования и науки РФ – http:[email protected] Автореферат разослан “____” ________________ 200 __ г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор И.А. Тузанкина ^ Актуальность. Одной из серьезных проблем современности являются нарушения взаимоотношений микро- и макроорганизмов, которые во многом определяются состоянием окружающей среды, а также произошедшими изменениями эндоэкологического равновесия в пользу вирусного микроокружения. Вследствие этого персистирующие вирусные инфекции рассматриваются не только как инфекционное заболевание, но и как проявление глубоких генетических нарушений внутренней среды организма человека, ведущих к необратимым для него, как биологического вида, последствиям (Черешнев В.А., 2000). Существует мнение о том, что в развитии многих патологических состояний ведущая роль принадлежит вирусам, однако, продолжается поиск доказательств характера их участия - либо в роли этиологического фактора, либо триггера (Цинкернагель Р.М., 2005). Значительная роль во взаимодействии организма с внешней средой принадлежит иммунной системе. Известно, что иммунитет – это комплекс реакций, направленных на поддержание постоянства внутренней среды организма. Его дисбаланс приводит к развитию иммунопатологических состояний - синдрому нарушений противоинфекционной защиты, аллергии, аутоиммунным и пролиферативным процессам (Петров Р.В., 1989). Реакции иммунной системы на различные этиологические факторы правомерно рассматривать как ведущие и формирующие основное звено патогенеза инфекционного процесса (Черешнев В.А. с соавт., 2006, Сепиашвили Р.И., 2003). Вирусные инфекции, приводя к развитию иммунопатологических процессов, способствуют развитию патологических состояний во многих системах организма. Это особенно важно в критические периоды развития человека – антенатальный, период раннего детства и старения. В настоящее время важное значение приобретает оценка происходящих иммунологических изменений при развитии инфекционных процессов и патологических состояний с ними связанных. Особенно при различных физиологических состояниях, определяющих здоровье поколений, одним из которых является беременность. Баланс иммунологических факторов может обеспечивать как физиологическое течение беременности, так и защиту организма женщины и плода от вирусной инфекции. Но некоторые изменения, в том числе дисбаланс выработки активных форм кислорода нейтрофилами и продукции противовирусных цитокинов клетками иммунной системы, приводят к патологии беременности, проявляющейся в преждевременном её прерывании, задержке внутриутробного развития плода. При этом недостаточная иммунокомпетентность женщин является одной из причин внутриутробного инфицирования плода (Ганковская Л.В. с соавт., 2006; Соловьева А.С. с соавт., 2006; Зуйков И.А. с соавт., 2006). В последние десятилетия внимание исследователей все чаще привлекает наличие связи инфекционных агентов, включая вирусы, с формированием различных воспалительных процессов, в том числе при заболеваниях опорно-двигательного аппарата (ОДА), широкое распространение которых наблюдается с развитием цивилизации (Никонова Е.П., 2000: Ивашкин В.Т., 2005; Cai X.Y. et.al., 2003; Regev E. et.al.,2003). Заболевания, поражающие крупные и мелкие суставы, в частности височно-нижнечелюстной сустав (ВНЧС), составляют проблему в клинической практике. Они могут приводить к длительной нетрудоспособности из-за частых обострений, принимать хроническое течение (Насонова В.А., 2000; Фоломеева О.М., 2001). Но имеющиеся в настоящее время данные недостаточно отражают этиопатогенетическую роль отдельных вирусов и их возможных сочетаний. В проводимых исследованиях зачастую не учитываются активность и локализация патологических процессов, диагностика которых требует постоянного совершенствования. Вопросы влияния различных видов возбудителей на клинические проявления и особенности течения болезней, на характер иммунного ответа, до сих пор остаются окончательно не решенными (Королев М.А., 2001; Соколова Л.А., 2002). Для решения вопросов о возможности распространении воспалительного процесса в суставах и торпидности к терапевтическим мероприятиям необходимо получение объективных данных об этиопатогенезе заболеваний ОДА. Используемые в настоящее время методы выявления этиопатогенетических факторов имеют ряд недостатков - они весьма дорогостоящи, информативность их повышается лишь при комплексном повторном их применении в динамике патологического процесса. В этой ситуации особую значимость приобретают иммунологические исследования, помогающие выявить и проанализировать взаимосвязь вирусных агентов с развитием, как инфекционных заболеваний, так и индуцируемых ими патологических процессов, происходящих в макроорганизме, а также предупредить осложненное течение заболеваний путем своевременной и целенаправленной коррекции терапевтических комплексов. Таким образом, высокая социально-экономическая значимость и широкая распространенность патологии беременности и детей раннего возраста, а также заболеваний ОДА, существующие недостатки в их диагностике, делают актуальными исследования этиопатогенеза указанных состояний и поиска новых информативных и экономичных методов их диагностики. Цель исследования. Определение значения вирусных инфекций в развитии патологических процессов при нарушениях противоинфекционной защиты организма и разработка новых инструментально-диагностических способов их выявления. Задачи исследования: 1. В эксперименте на животных оценить возможность вовлечения опорно-двигательного аппарата (ОДА) в инфекционный процесс, связанный с респираторными и герпетическими вирусами. 2. Определить морфологические признаки возможного присутствия вирусных агентов респираторной и герпетической группы в синовиальной жидкости с оценкой их роли в поражении суставов методом электронной микроскопии. 3. Оценить различия морфотекстур биологических жидкостей больных с различными патологическими процессами опорно-двигательного аппарата, развившимися при участии респираторных и герпетических вирусов, методом поляризационной микроскопии. 4. Дать характеристику иммунологическому профилю больных с патологией опорно-двигательного аппарата, имеющих клинико-лабораторное подтверждение наличия респираторной, герпетической инфекции и выявить специфические иммунологические изменения у больных с различными заболеваниями ОДА. 5. Охарактеризовать состояние иммунной системы женщин во время беременности и оценить роль персистирующих вирусных агентов респираторной, герпетической групп в формировании патологии плода. 6. Дать сравнительную оценку состояния иммунной системы детей раннего возраста, имеющих нарушения противоинфекционной защиты, и их матерей, с оценкой роли вирусных агентов в формировании патологии. Научная новизна. Впервые получены данные, свидетельствующие об инфицировании суставов респираторными и герпетическими вирусами, которые могут рассматриваться не только как триггерные, но и как этиологические факторы при развитии различной патологии опорно-двигательного аппарата. Впервые методом электронной микроскопии в синовиальной жидкости больных с поражениями опорно-двигательного аппарата обнаружены вирусы герпеса. Получены новые данные о том, что на фоне нарушения противоинфекционной защиты у беременных, при инфицировании их респираторными вирусными агентами, происходит реактивация персистирующих в организме женщины герпесвирусов, что приводит к вовлечению в инфекционный процесс социально значимых возбудителей, таких как вирусы гриппа и энтеровирусы Коксаки группы В, наряду с бактериальными и грибковыми инфекционными агентами. Представлены новые данные о специфических изменениях иммунологического профиля, развивающихся в различные периоды беременности у женщин, а также у детей раннего возраста на фоне респираторной, герпетической и энтеровирусной инфекций. Определено значение вирусных агентов в развитии инфекционной патологии новорожденных и детей раннего возраста, развившейся на фоне синдрома нарушений противоинфекционной защиты и индуцируемой патологией матери. Проведена оценка иммунологического профиля матерей, имеющих новорожденных и детей раннего возраста с синдромом нарушений противоинфекционной защиты. Определено место внутриутробного инфицирования детей в структуре инфекционных заболеваний новорожденных и детей раннего возраста, госпитализированных в стационарные отделения с синдромом нарушений противоинфекционной защиты. На основе поляризационной микроскопии разработаны диагностические морфотекстурные тесты для использования в комплексной диагностике патологии опорно-двигательного аппарата, определены отличия частоты встречаемости морфологических текстур при различных инфекционных процессах вирусной этиологии. ^ Результаты проведенных исследований продемонстрировали необходимость использования клинико-анамнестического обследования и иммунологического исследования больных различными заболеваниями, ранее не относимыми к инфекционным, для выявления вирусиндуцированных процессов, имеющих эпидемиологическую значимость в силу их распространенности, в целях определения стадии активности патологического процесса, характера нарушений противоинфекционной защиты организма и индуцированных вирусами аутоиммунных процессов. Использование в практической деятельности данных таких исследований дает возможность предупредить развитие осложнений, выработать эффективные меры терапевтической и профилактической направленности. Полученные нами новые данные о роли инфекционных вирусных агентов в развитии патологии ОДА, позволят использовать их для определения спектра терапевтических вмешательств, направленных на повышение эффективности проводимого лечения. Выявленные данные о том, что изменения клеточных иммунологических параметров - ведущий механизм в патогенезе развития заболеваний ОДА герпетической этиологии, открывают практическую перспективу повышения эффективности планируемого лечения за счет включения в терапевтический комплекс иммунотропных препаратов, прицельно действующих на клеточные механизмы противоинфекционной защиты. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что у иммунокомпрометированных женщин, не подготовленных к беременности профилактическими мероприятиями, обеспечивающими ее физиологическое течение, встреча с инфекционными агентами во время беременности заканчивается развитием инфекционного заболевания, что увеличивает риск инфицирования плода и угрозу прерывания беременности. Выявленные факты, свидетельствующие о том, что у детей, родившихся от матерей с респираторными, герпетическими и энтеровирусными инфекциями, достоверно чаще наблюдались недоношенность и пороки развития, такие как врожденные пороки сердца, атрезия прямой кишки и пищевода, расщелины неба и д.р., позволяет направить мероприятия по предупреждению их развития в сторону профилактики инфекций и улучшению функционирования иммунной системы. Использование метода поляризационной микроскопии позволит получать более экономичным и менее трудозатратным путем подтверждение наличия специфических изменений при различных заболеваниях опорно-двигательного аппарата, протекающих с участием респираторных и герпетических вирусов. Получаемые результаты исследований могут быть применены в комплексном диагностическом процессе, а также в качестве скринингового метода получения диагностически значимой информации, определяющей последующий выбор тактики лечения больных. Они могут быть использованы при дальнейших исследованиях в области вирусологической и клинической иммунологии. ^
2. Перенесенная беременными женщинами респираторная инфекция может приводить к иммунодепрессивному состоянию, что ведет к обострению герпетической инфекции, персистирующей в организме, и способствует развитию осложнений беременности, преждевременных родов, патологическому их течению, формированию пороков развития у детей и синдрома нарушений противоинфекционной защиты, что сопровождается изменениями в структуре тимуса и микст – инфицированием бактериальными и грибковыми агентами. 3. Спектр актуальных вирусных агентов при патологических состояниях беременности достоверно различен. 4. Биологические жидкости организма человека и животных характеризуются специфическими морфотекстурными особенностями, визуализирующими физико-химическое состояние многокомпонентных коллоидных систем, состоящих из липидов, полипептидов, белков и солей, выявляемыми методом поляризационной микроскопии, результаты которого, в комплексе с другими лабораторными методами, могут служить маркёрами патологии опорно-двигательного аппарата, протекающей с участием инфекционных вирусных агентов. ^ Результаты исследования внедрены в практику работы городского ревматологического отделения ЦГБ № 6 г. Екатеринбурга и стоматологической клиники ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия». Материалы диссертации вошли в учебные программы для студентов и врачей факультета усовершенствования врачей хирургической стоматологии ГОУ ВПО «Уральская государственная медицинская академия». ^ Основные положения диссертации доложены на итоговой научно-практической конференции ЕНИИВИ (Екатеринбург, 1999); VII Всероссийском съезде стоматологов (М., 2001); 1 общероссийском конгрессе стоматологов (Пермь, 2001); VII Всероссийской научно-практической конференции (М., 2001); на III съезде ревматологов России (Рязань, 2001); 1 конференции иммунологов Урала (Екатеринбург, 2001); научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» (Москва, 2002); 4 Всероссийской научно-практической конференция «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Тверь,2002); объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004); Всероссийском стоматологическом форуме «Дентал-ревю» (Москва, 2005); научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической гнатологии» (Тюмень, 2005); V Всероссийском конгрессе «Эстетика в стоматологии, новые технологии в стоматологии» (Екатеринбург, 2005); окружной научно-практической конференции «Актуальные аспекты вирусных инфекций в современный период» (Екатеринбург, 2007), 8-ой международной летней школе им. J. Humphrey «Immunology and Viral Infection» (Москва, 2007). Публикации. Основные результаты исследования опубликованы в 48 печатных работах. В том числе в 5 изданиях, рекомендованных ВАК, издан «Атлас текстур биожидкостей кристаллов при патологии суставов», получено 4 патента на изобретение, 2 свидетельства о депонировании и регистрации произведения – объекта интеллектуальной собственности. Объем и структура диссертации. Работа изложена на 254 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы описания материалов и методов, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка используемой литературы, включающего 426 источников, в том числе 276 отечественных и 150 зарубежных. Работа иллюстрирована 34 рисунками, 15 таблицами, 3 схемами и 2 приложениями. ^ Работа проводилась в течение 1998-2006 гг. Объем выполненных исследований представлен на схеме 1. В экспериментальных исследованиях использовано 150 беспородных белых мышей, на биологическом материале которых проведено 2392 лабораторных теста. В клинических наблюдениях обследовано 785 человек. Проведено 18523 лабораторных теста, 1146 инструментально-диагностических и 1626 морфологических исследований. ^ Для моделирования гриппозной инфекции были сформированы следующие группы: - группа Iа - мыши массой 10-12 г (n=30), которых инфицировали под эфирным наркозом интраназально по 0,05 мл аллантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа А/PR/8/34 (H1N1); - группа Iб - контрольные мыши массой 10-12 г (n=30), которым интраназально вводили физиологический раствор в объеме 0,05 мл. Схема. 1 ^
^ использованы программы «Statistica 6,0» и «SPSS v.13.0» – определялся характер распределения, параметрические и непараметрические методы, проводилась сравнительная оценка двух групп с использованием парных критериев (t-критерий, Колмогорова-Смирнова, Сhi-квадрат), более двух групп (дисперсионный анализ ANOVA/MANOVA, Краскала-Уоллиса, поправка Бонферрони, критерий Мантеля-Гензеля). При значениях <5 – двухсторонний точный критерий Фишера. Применяли также четырехпольную таблицу, нулевая гипотеза отвергалась при p<0,05. III этап Обработка полученных данных  IV этап Анализ результатов исследования Обсуждение полученных данных, формулирование выводов и практических рекомендаций  Примечание: * - исследования выполнялись в соответствии с правилами проведения работ по использованию экспериментальных животных (GLP), а также приказом МЗ РФ №267 от 19.06.03 г. Для моделирования герпетической инфекции были сформированы: - группа IIа - мыши массой 20-22 г (n=30), которые были инфицированы внутрибрюшинно ВПГ с инфекционным титром 4,5 lg ТЦП50/мл: в объеме 0,2 мл - для воспроизведения острой герпетической инфекции; - группа IIб - мыши (n=30) доза вируса 4,5 lg ТЦП50/мл в 0,02 мл, для моделирования хронической герпетической инфекции, была подобрана предварительно опытным путем и доведена до объема 0,2 мл физиологическим раствором; - группа IIв – контрольные животные (n=30), которым внутрибрюшинно вводили 0,2 мл 0,9% физиологического раствора. Для исследования использовали ткани легких, головного мозга, печени, почек, селезенки и суставов, с последующим их патолого-морфологическим анализом. Отбор биожидкостей и органов осуществляли в динамике на 2-е,5-е,7-е,10-е,15-е,25-е,30-е и 45-е сутки с момента инфицирования. Методом поляризационной микроскопии проведены исследования ротовой жидкости, сыворотки крови, мочи (всего 598 исследований). В РИФ - с целью обнаружения антигенов вирусов гриппа и герпеса (всего 900 исследований). ^ с вовлечением ВНЧС (n=380) проводились в ревматологических отделениях ГКБ №6, ОКБ №1, а также амбулаторно в артрологическом центре стоматологической клиники Уральской государственной медицинской академии г. Екатеринбурга (всего 7812 исследований). При формировании клинических групп больных с патологией ОДА учитывались следующие факторы: а) наличие лабораторно подтвержденных вирусных инфекций в РИФ, РТГА, РСК, ИФА, ПЦР; б) достоверно верифицированный в процессе всестороннего медицинского обследования клинический диагноз; в) наличие артритов периферических суставов; г) исключение других артритов (септический артрит, Лайм-артрит и спондилоартропатии). д) для РА и ОА - наличие II, III и IV рентгенологических стадий заболевания по Келгрену; е) для РА - подтверждение активности патологического процесса по острофазовым белкам и показателю СОЭ; ж) при РеА наличие урогенитальной инфекции в стадии ремиссии, а также наличие факторов, свидетельствующих о предшествующих инфекциях (заболевания, возникшие в пределах 4-х недель до клинических проявлений артрита); з) информированное согласие пациентов на проведение исследований. ^ из исследования: а) наличие острых и обострение хронических (кроме респираторных и герпетических) инфекционных заболеваний; б) тяжелая сопутствующая патология сердечно-сосудистой системы, органов дыхания, пищеварения, печени, системы крови; в) отсутствие достоверных критериев для постановки диагноза РеА, РА, ОА, НДСТ; г) для РА - отсутствие данных, подтверждающих активность процесса по острофазовым белкам и показателю СОЭ; д) наличие бактериальной инфекции (при проведении исследований методом поляризационной микроскопии); е) несоблюдение протокола исследования, отказ больного или его родственников от проведения дополнительных методов обследования. С патологией ОДА обследовано 302 пациента, которые были распределены на 4 группы. Группа I - больные ревматоидным артритом (РА) с вовлечением ВНЧС (n=76). Диагноз РА ставили с учетом диагностических критериев Американской ревматологической ассоциации (1987), а при его формулировке использовали классификацию РА, предложенную Институтом ревматологии (1989). Группа II - больные реактивным артритом (РеА) с вовлечением ВНЧС (n=77). Диагноз РеА формулировали с учетом диагностических критериев, принятых на III международном Конгрессе (Берлин, 1995) согласно международной классификации болезней МКБ-10 (Москва, 1996). Группа III - больные с остеоартрозом (ОА) с вовлечением ВНЧС (n=74). Группа IV - пациенты с недифференцированной дисплазией соединительной ткани (НДСТ) с вовлечением ВНЧС (n=75). Диагноз ОА и НДСТ выставляли в соответствие с международной классификацией болезней МКБ-10 (Москва, 1996). Исследование иммунологического профиля проведено у 86 больных с диагнозом реактивный, ревматоидный артрит и остеоартроз, у которых клинически и лабораторно подтверждено наличие респираторной или герпетической инфекций. Сформированы 3 группы больных, каждая из которых состояла из трех подгрупп, выделенных по наличию или отсутствия вирусной инфекции. Группа I – больные «ревматоидным артритом» (n=46): 1.1. – РА с герпетической инфекцией (n=16); 1.2. – РА с респираторной инфекцией (n=14); 1.3. – РА без этих инфекций (n=16). Группа II – больные «реактивным артритом» (n=48): 2.1. – РеА с герпетической инфекцией (n=16);. 2.2.– РеА с респираторной инфекцией (n=15); 2.3. – РеА без этих инфекций (n=17). Группа III – больные «остеоартрозом» (n=44): 3.1. – ОА с герпетической инфекцией (n=15); 3.2. – ОА c респираторной инфекцией (n=14); 3.3. – ОА без этих инфекций (n=15). Контрольная группа – здоровые доноры (n=78) отделения переливания крови, не имевшие достоверных отличий по полу и возрасту с основными группами, а также без нарушений иммунитета, респираторных и герпетических инфекций на момент исследования. Материалы от лиц указанной группы были использованы для контроля исследований методом поляризационной микроскопии (n=62) и иммунологических параметров (n=30). ^ проводили в отделении дородовой подготовки и в консультативной поликлинике при ГУНИИ ОММ г. Екатеринбурга (всего 3534 исследований). В результате клинико-анамнестического подбора и лабораторного исследования были сформированы группы беременных женщин, имеющих лабораторно подтвержденную герпесвирусную (n=45), респираторную (n=48) и энтеровирусную (n=33) инфекции. Группу сравнения составили 33 женщины, которые во время беременности вышеуказанными инфекциями не болели. Обследованные группы беременных женщин по возрастной характеристике, соматическому статусу, акушерско-гинекологическому анамнезу и срокам беременности были сопоставимы между собой. ^ с инфекционной патологией, имеющих признаки синдрома нарушений противоинфекционной защиты, и их матерей, проведены у госпитализированных в отделения патологии новорожденных и детей раннего возраста ОКДБ № 1 г. Екатеринбурга (всего 6547 исследований). Были сформированы группы матерей и их детей: - группа Iа состояла из детей с герпетической инфекцией (n=31); - группа Iб - дети с респираторной инфекцией (n=28); - группа Iв – с энтеровирусной инфекцией (n=23). - группа Iг - без указанных инфекций (n=48). Группу IIа составили матери с герпетической инфекцией в стадии обострения (n=39); - группу IIб – с респираторной инфекцией (n=33); - группу IIв – с энтеровирусной инфекцией (n=27); - группу IIг составили 50 матерей без указанных инфекций. Обследованные группы были сопоставимы между собой. ^ В соответствии с поставленными задачами у больных осуществляли определение наличия респираторных, герпетических и энтеровирусных инфекций лабораторными методами. Для реакции иммунофлуоресценции использовали наборы НИИЭМ им. Гамалея РАМН, г. Москва – флуоресцирующие глобулины к антигенам вирусов гриппа А, В, парагриппа, аденовируса, респираторно-синцитиальному (РС), простого герпеса (ВПГ) и цитомегаловирусу (ЦМВ) – (5495 исследований). Уровень специфических антител в сыворотке крови к респираторным вирусам определяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) (4710 исследований), связывания комплемента (РСК) (785 определений) с использованием диагностикумов предприятия по производству диагностических препаратов НИИ гриппа РАМН, г.С-Петербург. Серологические исследования по определению уровня специфических иммуноглобулинов в сыворотке крови к герпетическим вирусам проводили на оборудовании для иммуноферментного анализа (ИФА) фирм “Labsystems” (Финляндия) и “Abbott” (США) с использованием диагностических иммуноферментных систем «Вектор ВПГ(ЦМВ)-IgМ-стрип» и «Вектор ВПГ(ЦМВ)-IgG-стрип», выпускаемые ЗАО «Вектор-Бест» (пос. Кольцово, Новосибирская обл.) – 1570 определений. Выявление ДНК ВПГ и ЦМВ - методом полимеразной цепной реакции с использованием оборудования и диагностических наборов НП фирмы института физической и химической медицины «Литех» (г.Москва) -1900 тестов. Для индикации наличия вирусов в синовиальной жидкости больных с патологией ОДА методами РИФ и РН использовали культуры клеток ЛЭЧ 4 (81), ФЭЧ, Vero, MDСK из коллекции клеточных культур Екатеринбургского НИИ вирусных инфекций (312 исследований). Анализ и фоторегистрацию препаратов осуществляли на электронном микроскопе «ЭМВ-100ЛМ» при 28000-кратном увеличении. В качестве материалов для поляризационной микроскопии с поляризационными насадками МБИ-6 и микрофотонасадками МФН-10У4.2 при 200-кратном увеличении использовали: сыворотку крови, синовиальную жидкость, носовой секрет, ротовую жидкость и мочу (1900 определений). Выполнено 4344 лабораторных иммунологических тестов, включающих определение популяций и субпопуляций лимфоидных клеток методом иммунофлуоресценции с использованием панели ФИТЦ-меченных моноклональных антител к мембранным CD-рецепторам. Исследования выполнены на проточных цитометрах FACScan (Becton Dickinson) и FС-500 (Becman-Coulter). Определение содержания иммуноглобулинов классов А, М, G в сыворотке крови проводили методом радиальной иммунодиффузии по Манчини (1964). Определение общего IgE - методом ИФА. Окислительно-восстановительную функцию (активность НАДФ-оксидазной системы) нейтрофилов оценивали с помощью НСТ-теста по стандартной методике. Показатели фагоцитарной активности нейтрофилов оценивали в тестах спонтанного и стимулированного микробными полисахаридами (зимозаном) фагоцитоза с латексными частицами. Оценку уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови, проводили методом преципитации в полиэтиленгликоле по общепринятой методике. ^ Проведено комплексное исследование, состоящее из экспериментального и клинико-лабораторного блоков исследований. При выполнении экспериментальных исследований, мы учитывали возможность возникновения патологических изменений многих систем организма в результате действия респираторных и герпетических вирусов, включая патологические процессы в суставах. В группе Iа (мыши с экспериментальной гриппозной инфекцией) при патолого-морфологическом исследовании были выявлены выраженные изменения в легких, печени и суставах. В органах респираторного тракта наблюдались типичные патолого-анатомические изменения, характерные для этой инфекции - дистрофия и некробиоз эпителия трахеи и бронхов с последующим отторжением клеток в просвет дыхательных путей. В печени животных наблюдалась гиперемия и стаз в мелких сосудах и капиллярах, вакуольная дистрофия печеночных клеток с очаговым некробиозом и некрозом. В тканях суставов фаза экссудативного воспаления синовиальной оболочки сопровождалась мукоидным набуханием. Отмечалась гиперплазия ворсин. Все это свидетельствует о роли вируса гриппа как инициатора сложнейших каскадных механизмов, ведущих к поражению всего организма. В группе IIа (животные с экспериментальной острой герпетической инфекцией) патолого-морфологическое исследование органов подтвердило типичные патолого-анатомические изменения, соответствующие их клиническим проявлениям. В легких - отек перибронхиальных и периваскулярных пространств, циркуляторные нарушения, развитие мелкоочаговой, затем крупноочаговой пневмонии. В белом веществе головного мозга развивались периваскулярные инфильтраты. Мягкая мозговая оболочка была отечна, полнокровна и инфильтрирована лимфоидными, лимфогистиоцитарными и лимфолейкоцитарными элементами. В печени наблюдалась гиперемия и стаз в мелких сосудах и капиллярах, распространенная вакуольная дистрофия печеночных клеток с очаговым некробиозом и некрозом. В очагах некробиоза отмечалась значительная гистиоцитарная и макрофагальная инфильтрация. Наблюдалась краевая вакуолизация и некробиоз гепатоцитов. В почках имели место мелкие и крупные лимфоидные инфильтраты в интерстициальной ткани со сдавлением канальцев, а также дистрофические изменения канальцевого эпителия, полнокровие клубочковых и стромальных капилляров. В синовиальной оболочке суставов определяли признаки отечности, очаговую десквамацию и некроз структур. В эпифизарных пластинках сустава – интерстициальный отек. Данные наблюдения также доказывали способность ВПГ вызывать аналогичные, множественные, системные процессы. В группе IIб (животные с экспериментальной хронической ВПГ-инфекцией) при патолого-морфологическом исследовании в легких пролонгировались циркуляторные нарушения в виде гиперемии и кровоизлияний, выраженным отеком перибронхиальных и периваскулярных пространств. В просвете альвеол наблюдали скопления отечной жидкости, продуктов распада некротизированных клеток и лейкоцитов. Наблюдалась интерстициальная пневмония. В головном мозге наблюдались репаративные процессы соследами глиофиброзной пролиферации. Процессы резорбции и пролиферации затухали в динамике наблюдения. В печени сохранялась гиперемия и стаз в мелких сосудах и капиллярах, в очагах некробиоза - гистоцитарная и макрофагальная инфильтрация. В почках усиливались дистрофические изменения канальцевого эпителия, оставалось полнокровие клубочковых и стромальных капилляров. В тканях суставов мышей обнаружено разрастание грануляционной ткани в субинтимальном слое, мукоидное набухание структур хрящевого матрикса, очаговая деструкция хондроцитов. Наблюдалось разрушение хряща с образованием узур, трещин и секвестров, что указывало на усугубление патологических процессов, приводящих к необратимым изменениям. Это, может быть связано с прямым и длительным воздействием вируса на ткань пораженного органа. Необходимо учитывать тот факт, что персистенция герпесвирусов в органах создает патогенетически неблагоприятные условия для функционирования последних, а также является одной из причин развития вторичных иммунных нарушений и состояний с этим связанных. Столь выраженные изменения, происходящие в тканях и системах организма, не могли не повлиять на физико-химические свойства биожидкостей. Поэтому нами были проведены исследования последних, позволившие оценить возможность использования поляризационного метода для выявления в организме экспериментальных животных процессов, наблюдаемых при развитии респираторных и герпетических инфекций. Достоверные отличия от контрольных показателей получены в следующих случаях. У мышей, инфицированных вирусом гриппа, в сыворотке крови были выявлены средние сферодендриты и скелетные дендриты. В моче были найдены достоверные отличия по измененным сферолитам и трипельфосфатам; У мышей, инфицированных ВПГ, в сыворотке крови появлялись такие структурные признаки, как средние сферолиты, средние, крупные сферодендриты, тонкие и скелетные дендриты. В ротовой жидкости – визуализировались маслянистые бороздки и веерные текстуры, аномальные связи «маслянистые бороздки–веерные текстуры» (МБ–ВТ), атипичные формы «веера». При исследовании мочи выявлены измененные и гигантские сферолиты и трипельфосфаты. Полученные результаты продемонстрировали информативность поляризационно-микроскопического метода, который может быть использован в диагностическом процессе различных заболеваний в качестве дополнительного метода получения информации, что позволило нам применить его в дальнейшем для исследования биоматериалов различных групп больных. ^ Получены данные о том, что вирусы, особенно герпетической группы, служат триггерным фактором развития патологии ОДА, а в ряде случаев (РеА) в качестве этиологических факторов. У больных РеА, обследованных серологическими методами, определено диагностически значимое увеличение титров антител в сыворотке крови к вирусам гриппа в 26% случаев, к другим респираторным вирусам – 28,6%. Антитела IgM-класса к ВПГ – в 24,6%, к ЦМВ – 29,8% случаев. У больных РА – 21,1% , 19,7%, 17,8% и 17,8% случаев соответственно. При исследовании синовиальной жидкости методом клеточных культур с индикацией антигенов вируса в РИФ у больных РеА вирусный агент респираторной этиологии обнаружен в 50,5%, герпетической – у 45,5% случаев. У больных РА и ОА (40,5%, 43,5% и 39,1%, 32,4% случаев соответственно). В материале синовиальной жидкости больных РеА достоверно чаще определяли антигены герпесвирусов по сравнению с больными других групп. Чрезвычайно сложно трактовать данные, оценивающие те виды инфекций, которые относятся к персистирующим формам, например герпетическую инфекцию, учитывая их неоднозначность. Также трудно прогнозировать тяжесть и спектр осложнений со стороны различных органов и систем организма после перенесенного инфекционного заболевания, в частности гриппозной этиологии. Поэтому представлялось важным сопоставить результаты, полученные нами с помощью разных лабораторных методов выявления данных инфекций у больных с патологией ОДА, для чего проведено сравнение частоты выявления антигенов и антител к респираторным и герпетическим вирусам различными лабораторными методами. Оказалось, что выявление антигенов вирусов гриппа А (12,9%), парагриппа (9,1%), ВПГ (66,8%) методом люминесцентной микроскопии чаще наблюдалось в группе больных РеА. Реже всего – у пациентов с НДСТ (6,7%, 6,7%,52,0) (р<0,05). По данным ИФА, антитела IgM класса к ВПГ и ЦМВ чаще всего выявлялись у больных РеА (24,6% и 29,8% случаев) (р<0,05), реже – у больных НДСТ (2,7% к ВПГ, отсутствие к ЦМВ). Достоверно высокий уровень антител IgG класса (1:3200>) к ВПГ определялся у больных РеА, РА и ОА (p<0,05). Чаще всего ДНК герпетических вирусов в биожидкостях определялась у больных РеА (ДНК ВПГ – 64,9%, ДНК ЦМВ –29,7%). Обнаружение антигенов и высоких титров антител к респираторным и герпетическим вирусам различными лабораторными методами у больных РеА, РА, ОА свидетельствует о взаимосвязи патогенеза этих заболеваний с вирусной инфекцией. При этом, реактивный артрит (РеА) можно рассматривать как воспалительный процесс вирусной этиологии в активной стадии заболевания, протекающий на фоне выраженного синдрома нарушений противоинфекционной защиты, для которого характерно: политопность инфекционных поражений, упорство или атипичность течения заболеваний, торпидность к терапевтическим мероприятиям, наличие множества этиологически значимых инфекционных агентов, в том числе бактериальных, грибковых (Петров Р.В. с соавт, 2002, Сепиашвили Р.И., 2003). Подтверждения этому были получены проведенными иммунологическими исследованиями, выделением вирусов из синовиальной жидкости методом клеточных культур и обнаружением их методом электронной микроскопии. Вирусный агент при РеА выступал в роли этиологического фактора. Ревматоидный артрит (РА) – другое патологическое состояние, которое можно рассматривать как хронический иммунопатологический процесс аутоиммунного характера, возникающий у больных, перенесших острое воспалительное заболевание, о чем свидетельствовало проведенное иммунологическое исследование. В данном случае процесс носил иммуноопосредованный характер, а вирусы играли роль триггера. Недостоверные отличия уровня антител к ВПГ (>1:3200) в сыворотке крови пациентов НДСТ и контрольной группы позволили говорить об отсутствии связи данного заболевания с герпесвирусной инфекцией. Факт обнаружения антигенов вирусов в культурах клеток с синовиальной жидкостью наблюдаемых больных может свидетельствовать о присутствии данных инфекционных агентов в полости суставов и, вследствие этого, развитии индуцированных вирусами патологических изменений, что было подтверждено электронной микроскопией. В культурах клеток с синовиальной жидкостью больных РеА, РА были выявлены сформированные вирусные структуры, которые идентифицированы нами как принадлежащие герпетическому вирусу. Эти частицы находились в процессе репродукции, которая наблюдалась преимущественно у внутренней поверхности ядерной мембраны с нарушением ее целостности и выходом вирионов в перинуклеарное пространство и цитоплазму. Методом электронной микроскопии в синовиальной жидкости у больных с патологией ОДА респираторные вирусы не были обнаружены, хотя методом клеточных культур в этих же образцах биожидкостей они были выявлены. Это может объясняться тем, что процесс инфицирования при гриппе происходит достаточно быстро, поэтому уловить высокую концентрацию патогена в суставе, необходимую для выявления методом электронной микроскопии, не всегда представляется возможным. При этом изменения воспалительного характера обнаруживались в тканях суставов. Такие патолого-морфологические данные были получены нами при проведении экспериментальных исследований на лабораторных животных. При анализе иммунологических параметров здоровых лиц и лиц с патологией ОДА выявлено следующее (рис.1). ^ больных РА в зависимости от наличия инфекции выявлены следующие достоверные иммунологические особенности: – при герпесвирусной инфекции – уменьшение количества лейкоцитов, относительного количества лимфоцитов, концентрации IgA, IgM в сыворотке крови, относительного количества CD3+ и CD4+лимфоцитов, субпопуляционного индекса, НСТ-теста стимулированного, увеличение таких показателей, как СОЭ, уровень ЦИК, сывороточной концентрации IgG, CD8+лимфоцитов, НСТ-теста спонтанного, т. е. происходило снижение фагоцитарных функций и числа иммунокомпетентных клеток, активация гуморальных параметров иммунитета; – при респираторной инфекции – уменьшение относительного количества CD3+, CD4+лимфоцитов, увеличение общего количества лейкоцитов, СОЭ, ЦИК, концентрации сывороточных IgM и IgG, т. е. наблюдался дисбаланс клеточных и гуморальных параметров иммунитета; – без вирусной инфекции – выявлено уменьшение количества CD3+ и CD4+лимфоцитов, увеличение ЦИК, содержания IgM в сыворотке крови; у этих больных основным диагностическим критерием являлось также наличие в сыворотке крови ревматоидного фактора – аутоантител IgM–класса. ^ больных РеА в зависимости от наличия инфекции выявлено следующее. При герпетической инфекции – выявлено снижение количества лейкоцитов, лимфоцитов, концентрации IgA, IgM, относительного числа CD3+, CD4+ лимфоцитов, субпопуляционного индекса, функциональной активности нейтрофилов, увеличение СОЭ, уровня ЦИК, относительного числа CD8+ лимфоцитов, т. е. данные свидетельствуют о нарушениях функциональной активности иммунокомпетентных клеток, снижении их числа, активизация цитотоксической активности, что создает условия для персистирования инфекционных агентов и хронизации процесса. Утяжеление течения воспалительного процесса сопровождалось снижением субпопуляционного индекса за счет повышения числа CD8+лимфоцитов. При респираторной вирусной инфекции наблюдалось увеличение общего количества лейкоцитов, показателя СОЭ, уровня ЦИК, сывороточных IgM и IgG, НСТ-теста. Без вирусной инфекции – выявлено снижение количества лейкоцитов, увеличение ЦИК, концентрации IgM в сыворотке крови, т.е. полученные в этой группе сравнения результаты иммунологических исследований подтвердили участие иммунных механизмов в развитии РеА, но иммунокомпетентность пациентов обеспечила более легкое течение заболеваний и отсутствие участия вирусных агентов в развитии патологического процесса, имеющего, по-видимому, конституциональную обусловленность.  а) 1 __________________ # # # # # #    б) 1 # # __________________    в) 1 __________________ # # #  __________________  # 1 г) # Рис. 1 Достоверные отличия иммунологических параметров у больных ревматоидным и реактивным артритами: а) и в) при герпетической инфекции, б) и г) при острой респираторной инфекции. Примечание: индекс 1  соответствует медианам нормативных значений иммунологических параметров здоровых лиц, по оси ординат указан процент отличий медиан в группах больных относительно нормативных значений, по оси абсцисс – иммунологические параметры # p<0,05 – отличия от группы сравнения.^ |
||||||||||||||||
атери без вирусных инфекций (n=50)
руппа беременных женщин: (n=93)
линико-лабораторные методы: визуально-аналоговая шкала (ВАШ), опросник боли MC GILL, общеклинические показатели, иммунологические показатели, в т.ч. серовирусологические лабораторные исследования биожидкостей организма (назальной, ротовой, синовиальной жидкости, сыворотки крови, мочи)
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям