Автореферат диссертации на соискание ученой степени
|
|
Скачать 0.51 Mb.
|
|
На правах рукописи ДМИТРИЕВА-ЗДОРОВА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНОВ-КАНДИДАТОВ03.01.03 – молекулярная биологияАВТОРЕФЕРАТ |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||
Защита диссертации состоится «___» марта 2010 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИ генетика».
Реферат разослан «___» февраля 2010 г.
Учёный секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук |
Т.Л. Воюшина |
^
Актуальность проблемы. Одной из наиболее сложных задач современной генетики является изучение молекулярно-генетических основ многофакторных заболеваний. Важное место среди многофакторных заболеваний бронхолегочной системы человека занимает бронхиальная астма (БА). В некоторых странах БА является главной причиной инвалидности и смертности населения, опережая даже сердечно-сосудистые и онкологические патологии, что характеризует БА как глобальную медико-социальную проблему (Jarvis et al, 1997).
Эпидемиологические исследования последних лет говорят о том, что 4-8% населения страдают БА, в том числе 5-10% детской популяции и 5% взрослой (Чучалин, Баранов, 2006). В России данным заболеванием страдает примерно 10% взрослого и 15% детского населения. В последние десятилетия прогрессивно увеличивается заболеваемость и смертность от БА.
В основе развития БА лежит взаимодействие различных генетических факторов с факторами внешней среды (Cookson WO, 2002; Vercelli D, 2003). Один из эффективных подходов к изучению роли генетических механизмов развития БА связан с выделением группы генов, продукты которых прямо или косвенно могут быть вовлечены в развитие данной патологии, так называемых генов-кандидатов (Федосеев, 1998). В настоящее время известно более 100 генов-кандидатов БА (Scirica, 2007; Фрейдин, 2002). Гены предрасположенности к БА условно можно разделить на 5 групп: 1) гены врожденного иммунитета и гены иммунорегуляции; 2) гены, связанные с дифференцировкой клеток Th2 и эффекторными функциями иммунной системы; 3) гены, экспрессирующиеся в клетках эпителия бронхов; 4) гены, ассоциированные с перестройкой (ремоделингом) дыхательных путей и тяжестью заболевания; 5) гены предрасположенности к БА, открытые позиционным клонированием (Vercelli D, 2008).
Изучение ассоциации генов-кандидатов с заболеванием проводят с помощью полиморфных маркеров, которые могут располагаться внутри гена или рядом с ним. Исследование ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов основано на выявлении и сравнении частот встречаемости генотипов и аллелей в группах с наличием и отсутствием заболевания. Если различия в частотах аллелей и генотипов являются статистически достоверными, считают, что данный маркер ассоциирован с развитием заболевания. Установленные предрасполагающие или предохраняющие генетические маркеры в дальнейшем могут быть использованы для прогнозирования заболевания у человека на основе исследования индивидуальных особенностей его генома. Поэтому анализ ассоциации полиморфных маркеров с атопической БА является актуальной задачей современной молекулярной генетики.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы – оценить уровень ассоциации двенадцати полиморфных маркеров восьми генов-кандидатов БА: интерлейкина-13 (IL13), интерлейкина-5 (IL5), альфа-цепи рецептора интерлейкина-8 (IL8RA), toll-подобного рецептора 4 (TLR4), антигена 4, ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA4), G-белка, ассоциированного с астмой (GPRA), эотаксина-3 (CCL26) и регулятора активности нормальной экспрессии и секреции Т-клеток (CCL5) с атопической БА.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Сформировать группы больных БА различной степени тяжести, а также группу здорового контроля русского происхождения.
Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров C(–1055)T и R130Q гена IL13, С(–703)Т гена IL5, M31R и R335C гена IL8RA, Asp299Gly гена TLR4, C(–318)T и A(+49)G гена CTLA4, rs324396 (С/Т) и rs740347 (G/C) гена GPRA, T(+2497)G гена CCL26, A(–403)G гена CCL5 в группе больных атопической бронхиальной астмой и в группе здоровых индивидов.
Провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов выбранных полиморфных маркеров в группах больных и здоровых индивидов для выявления их ассоциации с развитием БА и тяжестью течения БА.
Провести анализ ассоциации гаплотипов генов IL13, IL8RA, CTLA4, GPRA с БА и тяжестью течения БА.
Научная новизна работы. В данной работе впервые изучена ассоциация полиморфных маркеров генов IL13, IL5, IL8RA, TLR4, CTLA4, GPRA, CCL26, CCL5 с атопической БА и тяжестью ее течения среди русского населения г. Москвы.
Вышеизложенные результаты были получены впервые.
Практическая ценность работы. Результаты молекулярно-генетического анализа полиморфных участков генов-кандидатов атопической БА могут использоваться для медико-генетического консультирования с целью раннего выявления пациентов с повышенным риском развития заболевания, проведения донозологической профилактики и прогнозирования течения болезни.
Апробация работы. Результаты настоящей работы докладывались на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008 г.), на II Всемирном форуме по астме и респираторной аллергии (Санкт-Петербург, 2009 г.), на конференции «The 6th Annual Cytokines & Inflammation Conference» (Орландо, 2008 г.), на 4-й интернациональной конференции «Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnologies for Medicine» (Москва, 2008 г.), на конгрессе «The World Asthma Meeting (WAM’2007)» (Стамбул, 2007 г.) и на ежегодном конгрессе Европейского респираторного общества (Стокгольм, 2007 г.; Берлин, 2008 г.; Вена, 2009 г.). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании межлабораторного семинара ИБМХ РАМН от 17 ноября 2009 г. и секции «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИ генетика» от 9 декабря 2009 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, включая 2 статьи и материалы международных конференций.
Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на ___ страницах машинописного текста и содержат __ таблиц и __ рисунков.
^
Материалы и методы.
В исследовании были использованы образцы ДНК 283 больных атопической БА и 227 здоровых индивидов русского происхождения. Общая характеристика групп представлена в таблице 1. Образцы ДНК и клинические данные больных атопической БА были предоставлены лабораторией аллергодиагностики НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН. В контрольную группу были включены здоровые индивиды без клинически диагностированной БА, аллергических и бронхолегочных заболеваний. Образцы ДНК здоровых людей были предоставлены лабораторией молекулярно-генетической диагностики НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН. Выборки были этнически однородны и составлены из русских (на основании паспортных данных), проживающих в г. Москве. Для выявления ассоциации генетических маркеров с тяжестью течения заболевания больные атопической БА были разделены на две подгруппы согласно критериям GINA: больные с астмой легкой степени тяжести (n=139) и больные со средним и тяжелым течением заболевания (n=152) (Табл. 1).
Анализ нуклеотидных последовательностей интересующих нас хромосомных областей осуществляли с помощью системы NCBI в сети Интернет (www.ncbi.nlm.nih.gov), с использованием следующих разделов: MapView (расположение полиморфных маркеров на хромосоме), dbSNP (информация об однонуклеотидных полиморфных маркерах). Для подбора праймеров и специфических зондов использовали программу Primer Premier 5.0.
Идентификация генотипов полиморфных маркеров проводилась c использованием времяпролетной масс-спектрометрии с лазерно-десорбционной ионизацией образца в матрице (MALDI-TOF). Метод состоит из следующих стадий:
1) пробоподготовка, включающая в себя амплификацию участка ДНК, содержащего исследуемую нуклеотидную замену, и последующую реакцию удлинения праймера (минисиквенс); 2) разделение фрагментов ДНК (праймеров с присоединенным на 3’-конце нуклеотидом, соответствующим аллелю искомого полиморфного маркера) по массе с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF.
^
«БА+» (n=283) |
«БА–» (n=227) |
||
БА легкой степени тяжести (n=131) |
БА средней и тяжелой степени тяжести (n=152) |
||
Пол, м/ж |
71/60 |
65/87 |
103/124 |
Возраст, лет |
34,4 ± 13,4 |
41,8 ± 16,2 |
38,5 ± 10,4 |
Длительность заболевания, лет |
11,9 ± 8,6 |
13,1 ± 8,4 |
- |
Возраст начала заболевания, лет |
15,4 7,6 |
- |
|
Общий IgE, кЕ/л |
230 (65; 620) |
45 (23; 89) |
|
Данные по возрасту и длительности БА представлены в формате M ± SD, где M – среднее, SD – стандартное отклонение. Данные по концентрации IgE – в формате Me (25%; 75%), где Me – медиана, 25-75% – интерквартильный интервал.
Для сравнения частот аллелей и генотипов исследуемых полиморфных маркеров в группах с наличием и отсутствием БА, а также в группах больных различной степени тяжести БА, нами использовался точный двусторонний критерий Фишера. Достоверными считали различия при p<0,05. Распределения аллелей и генотипов всех маркеров проверяли на соответствие закону Харди-Вайнберга. Относительный риск развития заболевания оценивали с помощью показателя соотношения шансов (odds ratio, OR). Значение ОR и 95% доверительный интервал (confidence interval, CI) вычисляли с помощью программы Calculator for confidence intervals of odds ratio (http://www.hutchon.net/ConfidOR.htm). OR=1 рассматривали как отсутствие ассоциации; OR>1 – как положительную ассоциацию ("предрасположенность"), OR<1 – как отрицательную ассоциацию аллеля или генотипа с заболеванием.
Анализ гаплотипов проводился с использованием программы Hapstat 3.0 (University of North Carolina, USA).
-
Результаты и обсуждение.
Исследование ассоциации полиморфных маркеров C(–1055)T и R130Q гена IL13 с атопической БА.
Интерлейкин-13 (ИЛ-13) является одним из основных по значимости цитокинов в патогенезе атопической БА. ИЛ-13 – мощный индуктор эозинофильного, макрофагального и лимфоцитарного ответа, связанного с развитием фиброза дыхательных путей, активацией слизепродуцирующих клеток и повышенной бронхореактивностью (Zhu et al, 1999). Воспалительный ответ реализуется через способность ИЛ-13 стимулировать выработку хемокинов и протеолитических ферментов, таких как металлопротеиназы матрикса. Установлено также, что развитие фиброзных изменений в ткани бронхов – результат активации интерлейкином-13 фиброгенного цитокина TGF-β1 через MMP-9 и плазмин-зависимый путь (Lee et al, 2001). Таким образом, ИЛ-13 является конечной точкой приложения Тh2-опосредованных воспалительных эффектов.
Ген IL13 локализован на хромосоме 5q31.1. Последовательность гена содержит ряд однонуклеотидных замен (Рис. 1), часть из которых ассоциирована с развитием БА и атопией. Наибольшее внимание исследователей в настоящее время привлекают два маркера в данном гене: C(–1055)T в промоторной области гена и R130Q в кодирующей области.
Полиморфный маркер C(–1055)T гена IL13 представляет собой однонуклеотидную замену C → T в положении –1055 промоторной области гена (Рис. 1). Функциональное действие данного маркера может быть объяснено тем, что замена расположена непосредственно перед сайтом связывания Т-клеточного транскрипционного фактора NFAT, который регулирует экспрессию генов IL13 и IL4. Ранее было показано, что наличие тимина в положении –1055 приводит к более активному связыванию NFAT с промотором и, таким образом, данный маркер может влиять на экспрессию гена IL13 (van der Pouw Kraan et al, 1999).
Полиморфный маркер R130Q гена IL13 представляет собой однонуклеотидную замену G → A в положении +2043 в экзоне 4, приводящую к аминокислотной замене положительно заряженного аргинина на нейтральный глутамин в положении 130 α-спирали D-домена интерлейкина-13. Это участок, посредством которого происходит взаимодействие ИЛ-13 с рецептором. В последних исследованиях было показано, что замена аргинина на глутамин в положении +2043 не изменяет константу связывания ИЛ-13 с рецептором и не влияет на стабильность этого комплекса. В то же время, данная замена сопровождается повышенным уровнем экспрессии ИЛ-13 (Arima et al, 2002).
^
При исследовании распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера C(–1055)T в группе больных атопической БА и группе здорового контроля отмечено преобладание аллеля С и генотипа СС (Табл. 2). Минорный аллель Т встречался в обеих группах примерно с одинаковой частотой – 27-28%, что согласуется с частотами данного аллеля в европейских популяциях – 20-33% (Дания, Нидерланды, Германия) (Graves et al, 2000). В группе больных БА наблюдалось увеличение частоты аллеля С и генотипа СС с одновременным снижением доли аллеля Т и генотипов СT и TT по сравнению с контрольной группой. Такие различия не являются статистически достоверными, что свидетельствует об отсутствии ассоциации данного маркера с развитием атопической БА.
^ –1055)T и R130Q гена IL13 в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА–) атопической БА.
Аллели и генотипы |
Частота аллелей и генотипов |
p |
|
«БА+» |
«БА–» |
||
C(–1055)T |
|||
Аллель С |
0,731 |
0,722 |
> 0,05 |
Аллель Т |
0,269 |
0,278 |
|
Генотип СС |
0,526 |
0,515 |
> 0,05 |
Генотип СT |
0,410 |
0,414 |
> 0,05 |
Генотип TT |
0,064 |
0,071 |
> 0,05 |
R130Q |
|||
Аллель Arg |
0,714 |
0,738 |
> 0,05 |
Аллель Gln |
0,286 |
0,262 |
|
Генотип Arg/Arg |
0,509 |
0,551 |
> 0,05 |
Генотип Arg/Gln |
0,410 |
0,374 |
> 0,05 |
Генотип Gln/Gln |
0,081 |
0,075 |
> 0,05 |
^ –1055)T гена IL13 у больных с атопической БА разной степени тяжести.
Аллели и генотипы |
Частота аллелей и генотипов |
p |
OR и 95% CI |
|
БА легкой степени тяжести |
БА средней и тяжелой степени тяжести |
|||
Аллель С |
0,763 |
0,704 |
> 0,05 |
- |
Аллель Т |
0,237 |
0,296 |
||
Генотип СС |
0,611 |
0,461 |
0,025 |
0,54 [0,34–0,87] |
Генотип СT |
0,305 |
0,487 |
0,001 |
2,16 [1,44–3,98] |
Генотип TT |
0,084 |
0,052 |
> 0,05 |
- |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям