Получение и использование антигенов дерматомицета Trichophyton faviforme и гипериммунной сыворотки в диагностике трихофитии крупного рогатого скота 16.
|
|
Скачать 0.54 Mb.
|
1 2
|
УДК 619:616-097:615.373:616-07:675.019.382 На правах рукописи ЩУРИХИН БОРИС ГРИГОРЬЕВИЧ Получение и использование антигенов дерматомицета Trichophyton faviforme и гипериммунной сыворотки в диагностике трихофитии крупного рогатого скота 16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Республика Казахстан Астана, 2010 Работа выполнена в лаборатории ветеринарной биотехнологии НИИ биотехнологии Казахского агротехнического университета им. С. Сейфуллина и научно-исследовательской лаборатории кафедры морфологии, микробиологии и биотехнологии КазАТУ им. С. Сейфуллина Министерства сельского хозяйства Республики Казахстан. Научный руководитель кандидат ветеринарных наук, доцент Кухар Е. В. Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор Гершун В.И. кандидат ветеринарных наук, доцент Адильбеков Ж.Ш. Ведущая организация Казахский национальный аграрный университет Защита состоится 29 октября 2010 г. в 1000 часов на заседании объединенного диссертационного совета ОД 18.08.03 при Казахском агротехническом университете им. С. Сейфуллина по адресу: 010011, г. Астана, пр. Победы, 62 тел.: 8 (7172) 31-75-64, факс: 8 (7172) 31-75-68, www.agun.kz С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке АО «Казахский агротехнический университет им. С. Сейфуллина» Автореферат разослан « » сентября 2010 г. Ученый секретарь объединенного диссертационного совета, доктор ветеринарных наук, профессор Абдрахманов Т.Ж. ВВЕДЕНИЕ^ На современном этапе развития животноводства, когда Казахстан претендует на вхождение в число 50 конкурентоспособных стран мира и в ВТО, первостепенной задачей становиться увеличение производства высококачественной животноводческой продукции. Одним из путей получения животноводческой продукции является увеличение поголовья скота и повышение продуктивности сельскохозяйственных животных, совершенствование мероприятий по профилактике и искоренению инфекционных болезней. К числу заболеваний, мешающих успешному развитию животноводства, относится трихофития, которая, несмотря на значительные успехи в борьбе с ней, имеет широкое распространение. Данное заболевание причиняет не только существенный экономический ущерб развитию животноводства, но и представляет серьезную опасность для здоровья людей. В Казахстане возбудителями трихофитии животных в основном являются грибы родов Trichophyton и Microsporum. Основными возбудителями являются у крупного рогатого скота – T. faviforme (синоним verrucosum), у верблюдов – T. sarkisovii, T. verrucosum var autotrophycum – у овец и коз, у лошадей – T. equinum и T. mentagrophytes и др. Заболевание наносит значительный ущерб животноводству в результате задержки роста и развития животных, порчи кож и шерсти. Если учесть большие затраты труда и средств на мероприятия, связанные с ликвидацией трихофитии, то станет ясной необходимость более серьезного отношения к ликвидации этого заболевания. По данным Главного управления ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР к концу шестидесятых годов, из общей заболеваемости заразными болезнями крупного рогатого скота стригущий лишай составлял 39-40%, в том числе в Казахской ССР – 4,8%. До разработки специфической профилактики, трихофития крупного рогатого скота проявлялась в виде эпизоотии, нанося огромный экономический ущерб неблагополучным хозяйствам. С началом массовой профилактической вакцинации крупного рогатого скота вакциной ЛТФ-130, разработанной под руководством А.Х. Саркисова, с 1970 года позволило почти полностью предотвратить возникновение вспышек, трихофития стала проявляться спорадически. Это объясняется активным влиянием ветеринарных специалистов на движущие силы эпизоотического процесса путем изоляции больных животных, как источников возбудителя инфекции, проведением специфической терапии, повышением специфической резистентности восприимчивых животных путем систематических плановых прививок против данной инфекции. Одновременно с этим проводился комплекс ветеринарно-санитарных мероприятий, направленных на повышение общей резистентности организма и исключение механизма передачи возбудителя инфекции, что позволило существенно снизить заболеваемость трихофитией у животных на территории СССР с 42% в 1969 г. до 0,6% в 1979 г. После распада СССР, с 1993 по 1998 годы, в АПК Республики происходил процесс разгосударствления и приватизации колхозно-совхозной собственности, результатом чего стали большой спад численности общественного животноводства, а также уменьшение численности крупного рогатого скота в личных подворьях из-за миграции сельского населения в города. С 2000 года ситуация в АПК Республики изменилась, происходит увеличение численности поголовья животных и птиц в сельскохозяйственных формированиях и личных хозяйствах. Однако нарушение централизованного снабжения биопрепаратами, химиотерапевтическими и дезинфицирующими средствами привело к изменению эпизоотической ситуации. В Казахстане изучением трихофитии сельскохозяйственных животных занимались С.Х. Хамиев (1982-1991), А.Г. Демченко, С.С. Мадыбаев, К.К. Муканов, С.А. Турсункулов, А.Р. Сансызбай, С.Т. Толеутаева, Н.П. Иванов, Е.Н. Левченко, М. Умитжанов, А.Б. Бижанов, Е.В. Кухар и другие. В новых условиях ведения животноводства – при различных формах собственности с ограниченным числом поголовья и закрытым типом их содержания – изменилось проявление эпизоотического процесса трихофитии. Ареал распространения трихофитии расширяется, переходя на ранее благополучные районы и регионы республики. Трихофития в настоящее время во многих коллективных, фермерских и личных хозяйствах Республики приобрела характер угрожающих эпизоотий. Исходя из вышеописанного следует, что назрела острая необходимость проведения мониторинга эпизоотической обстановки трихофитии по неблагополучным областям и регионам. ^ Целью наших научных исследований явилось получение специфических антигенов и антител для совершенствования способов диагностики трихофитии крупного рогатого скота. Были поставлены следующие задачи: - проведение анализа эпизоотической и эпидемической ситуации по трихофитии в Республике Казахстан; - получение специфического белкового антигена дерматомицета Trichophyton faviforme № 130 для постановки иммуноферментного анализа; - получение аллергена для отработки кожной пробы с целью выявления больных трихофитией животных; - получение гипериммунной сыворотки для использования в качестве положительного контроля в серологических реакциях. ^ В ходе исследования был отработан способ получения белкового антигена из Trichophyton faviforme с высокой специфической активностью в ИФА. Впервые разработана схема гипериммунизации животных с целью получения высокоактивной противотрихофитийной сыворотки для проведения серологических исследований. Разработана техника постановки непрямого варианта ИФА для диагностики трихофитии крупного рогатого скота на основе использования белкового антигена, выделенного из T. faviforme. Выявлено наличие колострального иммунитета к трихофитии крупного рогатого скота. Разработан план мероприятий по профилактике трихофитии крупного рогатого скота с учетом современных особенностей ведения животноводства. ^ Белковый антиген, полученный из Т. faviforme № 130 по модифицированному методу L. Tabatabai (1979) в нашей модификации, предлагается к использованию в качестве компонента диагностических тест-систем. Гипериммунная сыворотка предлагается к использованию в качестве положительного контроля в диагностических тест-системах при выявлении специфических антител к возбудителю трихофитии крупного рогатого скота. Иммуноферментный анализ на основе белкового антигена предлагается к использованию ветеринарными учреждениями для серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота. Данные диссертационной работы используются в учебном процессе КАТУ им. С. Сейфуллина (г. Астана) и КГУ им. А. Байтурсынова (г. Костанай) при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий у студентов по специальности «Ветеринарная медицина», «Ветеринарная санитария», «Охотоведение и звероводство», «Зоотехния». Полученные антигены и антитела используются в научно-исследовательской работе НИИ биотехнологии КАТУ им. С. Сейфуллина при подготовке курсовых и дипломных работ. По итогам научных исследований подготовлены методические указания, получен инновационный патент. ^ 1. Метод получения белкового антигена Т. faviforme. 2. Схема гипериммунизации крупного рогатого скота для получения высокоспецифичной гипериммунной сыворотки и методы её контроля. 3. Серологическая диагностика трихофитии с использованием иммуно- ферментного анализа. 4. Колостральный иммунитет при трихофитии. ^ Основные результаты работы были представлены на Республиканских научно-теоретических конференциях «Сейфуллинские чтения – 3, 4, 5, 6», (Астана, 2007-2010); Международной научно-практической конференции «Современные средства и методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойных и микотических болезней сельскохозяйственных и промысловых животных, рыб и пчел», посвященной 100-летию со дня рождения академика ВАСХНИЛ А.Х. Саркисова (Москва, 2009); заседаниях Научно-технического совета КАТУ им. С. Сейфуллина (Астана, 2008, 2009), ежегодных заседаниях ученого совета факультета ветеринарии и технологии животноводства КАТУ им. С. Сейфуллина (Астана, 2007-2009). Публикации На основе материалов диссертации опубликовано 12 научных работах, а также получен 1 инновационный патент. ^ Объем диссертации – 132 страница. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, списка литературы и приложений. Список использованных источников включает 253 наименования, в том числе 13 иностранных. Материалы иллюстрированы 26 таблицами и 16 рисунками. ^ В главе «Выбор направления исследований» обосновывается необходимость проведения исследований по повышению качества и эффективности диагностических мероприятий при трихофитии крупного рогатого скота. В главе «Процесс теоретических исследований» раскрываются вопросы истории изучения трихофитии, особенности эпизоотологического процесса при трихофитии, методы диагностики и виды иммунитета при трихофитии, биопрепараты, используемые в диагностике трихофитии. ^ Работа выполнена в лаборатории ветеринарной биотехнологии НИИ биотехнологии КАТУ им. С. Сейфуллина и на кафедре морфологии, микробиологии и биотехнологии КАТУ им. С. Сейфуллина МСХ РК по теме «Дифференциальная диагностика дерматомикозов», выполнявшейся с 2002 по 2009 гг. (№ госрегистрации 0102 РК 00093 от 22.04.02 г.), и по программе 042 «Прикладные научные исследования в области агропромышленного комплекса» (Ветеринария)» с 2006 по 2008 гг. по заданию: 08.05.01.01 «Разработка иммуноферментной тест-системы для дифференциальной диагностики дерматомикозов животных и индикации антигена в объектах внешней среды» (№ госрегистрации 0106РК01270 от 2006 г.). Гипериммунизация продуцентов проводилась на базе ТОО «АФ «Родина» Целиноградского района. ^ При проведении эпизоотического исследования использованы архивные материалы ветеринарной и медицинской отчетности, аналитические и обзорные научные статьи. В работе использованы: - вакцинный штамм T. faviforme 130; - питательные среды Сабуро для культивирования дерматомицетов; - 1% раствор агарозы для постановки реакции преципитации; В качестве антигена для иммунизации животных-продуцентов с целью получения гипериммунной сыворотки использовали вакцинный препарат ЛТФ-130. В серологических реакциях использовали следующие антигены: - корпускулярный антиген - вакцина ЛТФ-130 в концентрации 1·105 кл/см3 (100 тыс клеток в мл); растворимые белковые и полисахаридный антигены дерматомицета T. faviforme; родственных грибов-дерматомицетов, Asp. flavus, а так же туберкулин и единый бруцеллёзный антиген; - для постановки РГА и РНГА использовали эритроциты барана и кролика в концентрации 0,5; 0,85; 1,0%; - для постановки аллергической пробы использован аллерген по методу Плято-Нейссера и антиген по методу L. Tabatabai (1979). В качестве адъювантов использованы полный и неполный адъюванты Фрейнда, левамизол, катазал. В работе использовано: - животные: мыши беспородные 6-8 недельного возраста – 71 голова; бычки в возрасте 6-8-ти месяцев - 40 голов; новорожденные телята - 10 голов; крупный рогатый скот различных возрастных групп от 2-3-х месяцев до 5-7 лет - 136 голов; - сыворотки крови крупного рогатого скота из хозяйств Акмолинской, Костанайской, Северо-Казахстанской областей в количестве 1559 проб. Сыворотка крови животных подвергалась серологическому анализу в РМА, РИД, РГА, РНГА, непрямом варианте ТИФА. ^ В работе применялись эпизоотологические, биохимические, серологические, иммунологические и статистические методы. Анализ эпизоотической ситуации по трихофитии крупного рогатого скота проводили путем собственных исследований, включающих анализ ветеринарной статистики за 20 лет, и изучения литературы по вопросам трихофитии, проведения анкетирования, подворных обходов и иммунологического исследования сывороток крови. Эпидемическая ситуация по трихофитии анализировалась на основании собственных исследований, статистических данных МЗ РК и научных источников. Выделение растворимых белков клеточной стенки дерматомицета Т. faviforme проводили экстракцией цитратным буфером по методу L. Tabatabai (1979) в нашей модификации. Концентрацию белка определяли по методу Bradford M.M. (1976), а концентрацию углеводов в растворе антигена - с помощью пробы Молиша (сернокислотным методом). Получение аллергена из дерматомицета T. faviforme методом проводили методом Плято-Нейссера. Очистку антигенов осуществляли методами фильтрации через асбестовый фильтр и низкоскоростного центрифугирования. Контроль физических и биологических свойств биопрепаратов делали по общепринятой схеме. Белых (беспородных) мышей иммунизировали в течение двух недель по схеме И.И. Фридлянской (1988). Грундиммунизацию бычков проводили в 2-х месячном возрасте вакциной ЛТФ-130 по общепринятой схеме в профилактических дозах. Для проведения гипериммунизации бычков иммунизировали с добавлением в вакцинный препарат иммуностимуляторов, животных контрольной группы – без использования иммуностимуляторов. При анализе активности и специфичности гипериммунной сыворотки применяли серологические реакции: РИД по ^ , РКА, РМА, РГА, РНГА, ИФА по общепринятым методикам. Для проведения иммунологического мониторинга трихофитии крупного рогатого скота использовали непрямой вариант ИФА. Постановку аллергической пробы проводили методом скарификации и внутрикожным введением биопрепаратов на белых мышах, кроликах и телятах 3-8 месячного возраста. Результаты учитывали через 1, 24, 48 и 72 часа. Для обработки полученных данных использовались стандартные классические методы анализа проверки статистических гипотез. Статистический анализ результатов серологических исследований проводили по методу, описанному Т.С. Сайдулдиным (1981) с использованием мастера функций в категории «Статистические» программы Microsoft Excel. Достоверными считали различия при Р ≤ 0,05. Результаты исследования Обоснование необходимости проведения экспериментальных работ Статистический анализ данных отчетности по заболеваемости дерматомикозами в РК свидетельствует о продолжающемся наступлении микозов в последнее время. Это связано с ухудшением экологической ситуации в целом, бесконтрольным применением антибиотиков, неправильным и несбалансированным питанием и другими причинами. Возросли не только число и тяжесть грибковых инфекций, но также разнообразие грибов, выявленных в качестве этиологического фактора. Кроме грибов, традиционно имеющих клиническую значимость и вызывающих большую часть микозов у человека и животных, появились «современные» возбудители, которые вызывают болезни в организме с ослабленной иммунной системой. Это послужило основанием проанализировать эпизоотическую ситуацию заболеваемости трихофитией крупного рогатого скота. В процессе исследований нами выяснено, что трихофития встречается повсеместно, однако официально эта информация не отражается. Анализ заболеваемости животных трихофитией позволил выявить имеющиеся проблемы и разработать план мероприятий по их решению. Одним из предлагаемых методов является серологический мониторинг, для проведения которого требуется наличие стандартной активной тестирующей системы. Для постановки серологических реакций необходимы антигены и специфические сыворотки, которые должны обладать строгой специфичностью и высокой чувствительностью. Полученные антигены и антитела применяли для постановки непрямого варианта твердофазного ИФА. На первом этапе нами был проведен анализ эпизоотической и эпидемической ситуации по трихофитии крупного рогатого скота и дерматомикозам у людей. На следующем этапе провели отработку технологии получения специфического антигена и аллергена, их характеристику и использование в соответствующих тестах. Очередным этапом было получение гипериммунной сыворотки и её характеристика. На заключительном этапе были отработаны параметры постановки непрямого варианта иммуноферментного анализа с полученными нами компонентами и проведено испытание диагностического теста для выявления специфических антител в сыворотке крови животных в производственном опыте. В результате чего определена возможность его использования для серологической диагностики трихофитии крупного рогатого скота. При отработке параметров иммуноферментного анализа нами было выявлено наличие колострального иммунитета у новорожденных телят к возбудителю трихофитии, информация о котором в доступной нам литературе отсутствует. ^ Анализ статистических данных МСХ и Министерства здравоохранения РК, архивных данных за последние 20 лет по Акмолинской и Костанайской областям, данных годовых отчетов в областных территориальных управлениях МСХ РК показал, что официальные статистические данные о степени распространения дерматомикозов среди восприимчивых животных за двадцатилетний период по Республике Казахстан отсутствуют. Официально представлена информация о проведении профилактических мероприятий по трихофитии сельскохозяйственных животных. Планы вакцинации крупного рогатого скота в период с 2002 по 2005 годы успешно выполнялись, причем количество животных фактически вакцинированных в отдельные годы превышало запланированное поголовье. Проведение вакцинации поголовья крупного рогатого скота против трихофитии планировалось в последний раз на 2006 год, хотя фактически её выполнения не было. С целью выяснения эпизоотической ситуации нами было проведено подворное клиническое обследование крупного рогатого скота в населенных пунктах Акмолинской области. Из выявленных нами 47 больных животных в весеннее время у 8 телят отмечали глубокую форму поражения, а у остальных животных отмечалась поверхностная форма. Анализ заболеваемости людей трихофитией по регионам Республики показал, что болезнь регистрируется повсюду. В то же время по северному региону пик заболеваемости приходится на 2000-2002 г.г., по центральному – на 2001-2006 гг, по южному – на 2003-2007 гг., по западному – 2000-2003 гг., по восточному – 2002-2004 гг. (таблица 1) Таблица 1 - Заболеваемость людей трихофитией по регионам РК (на 100 тыс. человек)
При анализе эпидемиологического анамнеза, выявлено, что заражение в 57% случаев происходит при контакте с животными; в 11% – при контакте с больными людьми, в 13% – при посещении бань и спортивных секций. При культуральном исследовании, проведенном в 2009 г., выявлены основные возбудители – T. verrucosum (97,9%) и T. mentagrophytes var. gypseum (2,1%). Среди больных дерматомикозами у 16,8% пациентов диагностировали поверхностно-пятнистую, у 21,0% – инфильтративную и у 62,2% – инфильтративно-нагноительную формы зооантропонозной трихофитии. В последние годы регистрируются случаи проявления атипичной локализации зооантропонозной трихофитии у людей – паховая (лобковая) трихофития. Нами была разработана анкета и проведено анкетирование ветеринарных специалистов областей северного региона, студентов факультета ветеринарии и технологии животноводства, а также жителей Акмолинской области. Согласно результатам анкетирования, наибольший удельный вес по заболеваемости трихофитией среди сельскохозяйственных животных занимает крупный рогатый скот – 44,9%, овцы – 9,2%. Значительный процент респондентов указали на заболеваемость дерматомикозами кошек – 26,5%. Чаще болеет молодняк до года – 77,5% и, как правило, в зимне-весенний период – 40,2%. В качестве лечебно-профилактического средства используется вакцина ЛТФ-130 (38,9%). Вакцинацию проводят нерегулярно (14,9%), большинство населения приобретает вакцину в ветеринарных аптеках самостоятельно (38,8%). На вопрос «Имелись ли случаи заболевания стригущим лишаем среди ваших знакомых или родственников» 31,3% респондентов ответили утвердительно. На основании полученных нами данных составлена карта заболеваемости трихофитией людей на территории РК, согласно которой видно, что показатель заболеваемости людей трихофитией на протяжении семи лет выше среднереспубликанского значения в девяти областях республики. Среди областей северного региона обращает на себя внимание высокий уровень заболеваемостью трихофитией в Акмолинской области. В свете выявленных показателей остается актуальным своевременное выявление и лечение больных трихофитией животных, как домашних, так и сельскохозяйственных. Заболевание животных дерматомикозами, отсутствие профилактических мероприятий и высокий процент заболевания зооантропонозными микозами среди людей делает весьма актуальной проблему своевременной и достоверной диагностики заболевания, идентификации возбудителя для назначения соответствующей схемы лечения. Вышесказанное требует проведения обстоятельного серологического мониторинга трихофитии крупного рогатого скота и других сельскохозяйственных и домашних животных. ^ Для серологической диагностики заболеваний требуется наличие высокоспецифичных диагностических тестов. Таким характеристикам в полной мере соответствует широко внедряемый в ветеринарную практику Республики Казахстан иммуноферментный анализ. Анализ сывороток крови крупного рогатого скота на наличие специфических антител к возбудителю трихофитии проводили в непрямом варианте ИФА с помощью тест-системы «Трихо-серотест» (Кухар Е.В., 2003). Для анализа отбирали сыворотки крови крупного рогатого скота в Акмолинской, Костанайской и Северо-Казахстанской областях у животных различных половозрастных групп (таблица 2). Таблица 2 – Анализ сывороток крови крупного рогатого скота в непрямом варианте ИФА M ± m, при р ≤ 0, 05
Использование ИФА-теста с применением полисахаридного антигена позволило выявить наличие титров противотрихофитийных антител у крупного рогатого скота до 1:25600. У телят до года (невакцинированное поголовье) титры специфических антител выявлены в пределах от1:800 до 1:6400. У взрослых животных – коров 3-7 лет (дойный гурт, вакцинированные животные) показатели титров антител имели значения от 1:3200 до 1:12800. У быков-производителей (вакцинированное поголовье) титры антител имели показатели от 1:6400 до 1:12800. Как видно из полученных результатов, молодые невакцинированные животные имеют более низкие показатели, а взрослые продуктивные животные показывают более высокие показатели титров антител. Одним из вариантов ответа на наличие специфических антител в высоких титрах у животных старше 2-7 лет может быть наличие нестерильного иммунитета, присутствие которого установлено при хронических инфекциях (туберкулез, бруцеллез, сап и другие). Для диагностики трихофитии описаны РА, РП, РСК, РКоА, однако они не используются в повседневной лабораторной практике ветеринарных лабораторий. В дальнейшей работе нами получены антигенные и антительные компоненты реакций, проведена аллергическая проба и отработана постановка иммуноферментного анализа. ^ Получение белкового антигена по методу L. Tabatabai et al. (1979) в нашей модификации состояло в обработке биомассы цитратным буфером и неоднократном центрифугировании супернатанта. Перед непосредственным выделением белка мицелий обрабатывали 45%-ным раствором фенола для максимального освобождения от полисахаридных компонентов, которые составляют основную часть клеточной стенки дерматомицета. Выход основного вещества (белка) с 1 г сырого мицелия составил 0,2500,04 мг/мл или 0,038%. Отношение белков к углеводам – 2:1. В процентном отношении выход антигена от общего количества сырого мицелия составил 0,15%. Наличие углеводов говорит о комплексной природе полученного нами антигена. Очистка полученного антигена проводилась методом диализа и низкоскоростного центрифугирования. Специфическую активность очищенного белкового антигена изучали в РИД и непрямом ИФА в сравнении с полисахаридным антигеном, полученным по методу Westphal-Jann (таблица 3). Таблица 3 – Результаты исследования активности антигенов гриба ^ в ИФА n = 8, при Р < 0,05
Как видно из таблицы 3, результаты опыта свидетельствуют о наличии иммуногенных свойств и сравнительно высокой специфической активности использованных антигенов. При изучении специфических свойств антигенов дерматомицетов для получения иммунных сывороток использовали схему иммунизации по И. Фридлянской (1988). При постановке РИД выявлено наличие преципитирующих свойств у белкового антигена с титром 1:16. Дальнейший анализ антигенов проводили в непрямом варианте иммуноферментного анализа. Полисахаридный антиген в непрямом ИФА обладает достаточной чувствительностью и выявляет специфические антитела в титрах 1:200-1:6400. Белковый антиген (L. Tabatabai) проявляет большую активность в сравнении с полисахаридным антигеном и позволяет выявлять антитела в непрямом варианте ИФА при разведении сыворотки до 1:12800. Таким образом, в результате исследований выявлена достаточно высокая антигенная активность и специфичность белковых препаратов дерматомицетов. Полученные антигенные препараты были расфасованы в пенициллиновые флаконы, этикетированы и установлены на хранение. На отработанный способ получения белкового антигена была подана заявка на изобретение и получено уведомление о положительном результате формальной экспертизы. ^ Аллерген получали методом Плято-Нейссера. В полученном препарате определяли концентрацию белка по Бредфорду, углеводов – серно-фенольным методом пробой Молиша. Концентрация белка в препарате составляла в среднем 0,125 0,02 мг/мл, или 0,013%. Отношение углеводов к белкам составило 20:1. С 1 г сырого мицелия нами получено в среднем 0,452 мл аллергена Плято-Нейссера с концентрацией углеводов 2,5 0,02 мг/мл, что составило 0,25% от общего количества биомассы. Аллерген представляет собой стерильный раствор, имеющий вид прозрачной жидкости светло-желтого цвета с легким запахом фенола. Контроль физических и биологических свойств препарата проводили по общепринятой схеме через 20 суток после разлива, укупорки аллергена во флаконы и установки его на хранение. ^ Иммунизация белых беспородных мышей проводилась по И.И. Фридлянской (1988) с применением полного и неполного адъюванта Фрейнда, катазала и левамизола. Результаты тестирования сывороток мышей позволили выявить наличие титров антител: в 1-й группе – от 1:3200 до 1:12800, во 2-й группе – от 1:800 до 1:12800, в 3-й группе – от 1:400 до 1:1600, в 4-ей группе от 1:400 до 1:3200. Наиболее высокие показатели титров антител выявлены в сыворотках крови, полученных от мышей 1 и 2 групп, т.е. там, где применялись адъюванты: полный и неполный адъювант Фрейнда и «Катазал». В качестве животных продуцентов для проведения гипериммунизации использовали естественно восприимчивых гомологичных животных – здоровых телят черно-пестрой породы. Чтобы увеличить показатель степени нарастания титра антител в сыворотке крови животных в результате иммунизаторного раздражения при гипериммунизации, проводили грундиммунизацию. Перед началом гипериммунизации содержание противотрихофитийных антител составляло от 1:400 до 1:3200. Телятам первой опытной группы антиген вводили внутримышечно в нарастающих дозах в количестве 1-2-3-4 дозы с интервалом 14 дней. Телятам второй и третьей опытных групп антиген вводили аналогично, но одновременно с ним животным 2-й опытной группы инъецировали «Левамизол», а животным 3-й опытной группы – «Катазал». Телятам контрольной группы вакцину ЛТФ-130 вводили 2 раза согласно наставлению по применению вакцины. В результате проведенной гипериммунизации телят более резко титры антител возросли во 2 и 3 опытных группах, где применялись «Левамизол» и «Катазал». Оба адъюванта в достаточной мере активизируют выработку антител у животных продуцентов, однако применение «Левамизола» в качестве иммуностимулятора провоцирует усиленную выработку антител против возбудителя трихофитии. При его применении титр специфических антител возрастает равномернее и стабильнее в более короткие сроки, четвертая иммунизация не оказывает влияния на нарастание титра антител. В целом, применение иммуностимуляторов позволяет достичь показаний 1:102400-1:204800, что намного выше по сравнению с первой схемой и контрольной группой. Сыворотку консервировали 5%-ным раствором фенола в соотношении 1:10, разливали по 1, 3 и 5 мл, укупоривали и ставили на 20 дней при температуре 4 °С для отстоя, затем подвергали проверке по физическим свойствам и активности и специфичности в различных серологических тестах. Гипериммунная сыворотка характеризуется наличием агглютинирующих, гемагглютинирующих и преципитирующих свойств, обладает высокой активностью в РМА, РИД, РГА и РНГА и непрямом ИФА. Результаты исследований по изучению свойств гипериммунной сыворотки в различных серологических тестах представлены в таблице 4. Таблица 4 – Характеристика специфических свойств гипериммунной сыворотки в различных серологических реакциях
Таким образом, использование предлагаемого способа гипериммунизации позволяет получить активную и специфичную гипериммунную сыворотку для применения в качестве позитивной при выявлении антител против трихофитии крупного рогатого скота в ИФА, РА, РНГА и РИД. Сыворотка соответствует требованиям, является стерильной и безвредной. На способ получения ГИС нами получен инновационный патент. ^ Физические свойства определяли визуально через 20 дней после фасовки препаратов. При проверке физических свойств биопрепаратов анализировали цвет и консистенцию, наличие осадка и посторонних примесей, правильность объема расфасовки во флаконы, герметичность укупорки, качество этикетировки. Стерильность биопрепаратов проверяли согласно ГОСТ 28085-89 методом посевов на стандартные питательные среды: МПБ, МПА, МППБ под вазелиновым маслом, среду Сабуро и инкубировали при 37-38 °С. Антигены и ГИС вносили в количестве 0,5 мл препарата в каждую чашку Петри и 0,1 мл – в пробирку. Посевы в среде Сабуро выдерживались при +26 °С и +37 °С в течение 10 суток. Безвредность проверяли на белых мышах, подобранных по методу аналогов. Опытным животным вводили внутрибрюшинно по 0,3 мл биопрепаратов. Контрольным животным вводили фенолизированный физиологический раствор. Результаты контроля физических и биологических свойств представлены в таблице 5. Таблица 5 – Результаты контроля физических и биологических свойства биопрепаратов
Контроль биологических свойств позволил установить безвредность препаратов и отсутствие контаминации. Препараты в дальнейшем использовали для постановки аллергической пробы и серологических реакций. ^ Постановку аллергической пробы проводили на белых мышах, кроликах и телятах. В качестве аллергенов использовали два препарата: аллерген, изготовленный по методу Плято-Нейссера, и белковый антиген, полученный по методу L. Tabatabai (1979). При постановке аллергической пробы применяли накожную пробу со скарификацией и внутрикожный метод введения аллергена. При введении мышам использовали дозы в количестве 0,01 мл, кроликам – 0,1 мл, телятам – 0,2 мл. Результаты аллергической пробы учитывали через 1, 24, 48 и 72 часа. Учет результатов аллергической пробы проводили по схеме, предложенной Н.П. Елиновым. При отработке параметров постановки аллергической пробы на беспородных белых мышах, животных предварительно иммунизировали вакциной ЛТФ-130. Аллергическая реакция у иммунных мышей проявилась в течение 30-35 минут после введения аллергенов в виде эритемы до 5 мм в течение получаса, исчезающей после 2 часов. При этом реакция на белковый антиген была более интенсивной и легко учитывалась. Наблюдением установлено, что цианоз кожи на месте введения сохраняется в течение 24 часов. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 2
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям