Описание системы свертывания
|
|
Скачать 169.02 Kb.
|
|
Пространственная динамика свертывания крови Задача биофизического практикума для студентов 4 курса кафедры биофизики физического факультета МГУ ОглавлениеОглавление 1 Введение 1 Описание системы свертывания 1 Методы 6 Порядок выполнения задачи 11 Приложения 12 1. Техника безопасности и правила поведения 12 2. Дополнительная литература (можно получить в лаборатории) 12 3. Расположение Гематологического центра. 13 ВведениеСистема свертывания крови выполняет задачу поддержания целостности сосудистой системы при ее повреждении. Она представляет собой сложный каскад ферментативных реакций, охваченный положительными и отрицательными обратными связями. Важным свойством системы свертывания является то, что она предназначена для создания локализованного сгустка в месте повреждения, т.е. ее задача является принципиально пространственной. Целью настоящей задачи является наблюдение за ростом сгустка в пространстве с помощью разработанной в нашей лаборатории установки по исследованию пространственной организации свертывания (УПИПОС). Работа выполняется в Гематологическом Научном Центре РАМН. ^ Во всех многоклеточных организмах, за исключением низших беспозвоночных, не обладающих ни кровью, ни гемолимфой, присутствуют механизмы гемостаза — системы, отвечающей за поддержание целостности повреждении сосудистой системы. У млекопитающих выделяют два основных звена гемостаза: первичный, сосудисто-тромбоцитарный, и вторичный, плазменный гемостаз. При повреждении стенки сосуда первыми срабатывают механизмы вазоконстрикции и образования тромбоцитарной пробки за счет того, что при повреждении эндотелия в кровь попадают вещества, которые вызывают сужение сосудов и активацию тромбоцитов. Будучи активированы, тромбоциты, в норме имеющие форму пластинки, становятся шарообразными и приобретают способность к адгезии к месту повреждения и взаимной агрегации. В результате на месте повреждения образуется сравнительно рыхлая тромбоцитарная пробка, предотвращающая потерю клеток крови, но не плазмы. Характерное время срабатывания этих систем — несколько минут. На фоне этих событий развивается плазменный гемостаз, время срабатывания которого имеет порядок десятков минут. Его работа приводит к образованию плотного фибринового сгустка, полностью предотвращающего потерю крови. Спустя несколько часов вследствие сокращения волокон фибрина происходят дальнейшее уплотнение сгустка, ретракция, и далее, по мере репарации повреждений, лизис тромба. In vivo все элементы системы гемостаза находятся в тесном взаимодействии. Так, тромбоциты могут быть активированы одним из главных белков системы свертывания, тромбином. В свою очередь, после активации они предоставляют фосфолипидную поверхность, необходимую для прохождения реакций системы свертывания, а также секретируют десятки веществ, воздействующих на все звенья гемостаза, в том числе факторы свертывания V и XI, фактор Виллебрандта, фибриноген и ряд ингибиторов свертывания. Большую роль в регуляции гемостаза играет эндотелий сосуда, тесно взаимодействующий как с тромбоцитарной, так и с плазменной системами гемостаза. Начало биохимической эпохи исследования свертывания принято связывать с работами Alexander Schmidt и Paul Morawitz, которые датируются концом XIX – началом XX в. В них было высказано предположение, что основными этапами свертывания являются превращение неактивного ферментативного предшественника, протромбина, в тромбин под действием некоторого вещества (веществ), условно названного тромбокиназой, с последующим превращением фибриногена в фибрин под действием тромбина. В течение первой половины XX-го века изучение наследственных пороков свертывания и создание клинических тестов, позволяющих количественно охарактеризовать состояние системы свертывания, привели к открытию десятков веществ, участвующих в этом процессе. В 1964 году в работах MacFarlane и, независимо от него, Davie и Ratnoff схема была усложнена: была предложена парадигма каскада, "водопада" реакций в плазме, ведущих к образованию фибрина, которая является базовой для исследователей в данной области уже на протяжении четырех десятилетий. С тех пор механизм еще более усложнился: единый каскад разделился на две ветви, внутренний и внешний пути активации свертывания, охваченные многочисленными петлями положительных и отрицательных обратных связей и перекрестными взаимодействиями.  Рис. 1. Упрощенная схема реакций системы свертывания. Тромбин, фермент, активирующий фибриноген, сам активируется вышестоящим фактором каскада, фактором Xa. Фактор Х может быть активирован двумя способами, традиционно называемыми «внутренним» и «внешним» путями свертывания. Внутренний путь свертывания - эта длинная цепочка реакций, которая начинается с фактора XII. Другой путь, «внешний путь», начинается с тканевого фактора или тромбопластина, белка, находящегося на поверхности практически всех клеток нашего организма, за исключением клеток, образующих внутреннее покрытие нормальных сосудов – клеток сосудистого эндотелия. Оба пути представляют так называемые каскады ферментативных реакций: в результате каждой из реакций каскада образуется фермент, который активирует множество молекул фермента, стоящего ниже. Такой каскад напоминает лавину и обладает способностью резко усиливать исходное возмущение. Система охвачена рядом положительных (стрелки, заполненные красными плюсиками) и отрицательных (стрелки, заполненные синими минусиками) обратных связей. Дизайн А. Кондратовича и Д. Киреева. В 1949 году Seegers показал, что для свертывания необходимо наличие в системе фосфолипидов. Последующие исследования привели к выводу, что почти все реакции свертывания требуют для своего эффективного прохождения наличия отрицательно заряженной фосфолипидной мембраны. Ее могут предоставлять липопротеины плазмы, поврежденные фрагменты тканевых клеток, мембраны активированных тромбоцитов, тромбоцитарные микровезикулы, мембраны клеток иммунной системы. Достоверно известно, что в случае некоторых заболеваний эритроциты также могут предоставлять прокоагулянтную поверхность. Общепринятым является мнение, что основной вклад в прокоагулянтную активность in vivo в норме вносят тромбоциты. На Рис. 1 приведена упрощенная схема современных представлений о каскаде реакций свертывания. Активация каскада может происходить двумя способами — по внешнему (путь тканевого фактора) или внутреннему пути (путь контактной активации). Внутренний путь активируется при контакте плазмы с чужеродной поверхностью. Классическим активатором in vitro служит стекло. В результате cложной сети реакций с участием XII фактора, высокомолекулярного кининогена и прекалликреина происходит активация XII фактора, который затем активирует фактор XI. Поскольку наблюдаемые в клинике дефициты факторов контактной активации (фактор XII, высокомолекулярный кининоген и прекалликреин) не связаны со склонностью к кровотечениям, считается, что физиологически значимым является внешний путь. В мембранах клеток всех тканей организма (за исключением клеток, находящихся в контакте с кровью — эндотелия сосудов кровеносной системы и форменных элементов крови) присутствует интегральный гликопротеин тканевый фактор (TF). При повреждении эндотелия плазма вступает в контакт с клетками этих тканей, и факторы VII и VIIa, присутствующие в плазме, связываются с TF, образуя комплекс на поверхности мембраны. В норме примерно 1-2% фактора VII, присутствующего в плазме крови, являются активированными. Однако, активный центр свободного фермента не работоспособен, и сам по себе фактор VIIa практически не обладает каталитической активностью, то время как комплекс VIIa-TF способен активировать, путем отщепления небольшого пептида от аминотерминального конца тяжелой цепи, факторы IX и X в активные сериновые протеазы. Фактор Ха, в свою очередь, расщепляет белок протромбин, превращая его в тромбин в очень медленной реакции. Наработанные малые количества тромбина могут активировать факторы VIII и V, которые после активации становятся кофакторами факторов IXа и Ха в реакциях активации фактора X и тромбина, соответственно. Это осуществляется путем образования на фосфолипидной поверхности в присутствии ионов кальция комплексов внутренней теназы IXa-VIIIa и протромбиназы Xa-Va. Эти комплексы способны активировать фактор X и протромбин приблизительно на 3-5 порядков быстрее, чем IXa и Xa, соответственно, сами по себе. Тромбин является центральным ферментом системы свертывания, участвующим в многочисленных реакциях. Главной из них является расщепление белка фибриногена в сложной многоступенчатой реакции с превращением его в фибрин, способный полимеризоваться с образованием разветвленных структур. Попутно, тромбин активирует фактор XIII, который образует поперечные сшивки между молекулами фибрина. Фактор Xa также может активировать факторы V и VIII, но значительно менее эффективно, нежели тромбин. Физиологическая важность этих реакций пока неясна. Еще одна положительная обратная связь, роль которой сейчас активно обсуждается, — активация тромбином фактора XI. Кроме того, как тромбин, так и фактор Xa способны эффективно активировать фактор VII, превращая его в VIIa. Для обеспечения устойчивого стационарного неактивированного состояния и для уничтожения активных факторов после завершения свертывания в системе присутствуют многочисленные стехиометрические ингибиторы, которые связываются с активными факторами и ингибируют их деятельность. Ключевыми среди стехиометрических ингибиторов являются антитромбин III и ингибитор пути тканевого фактора, TFPI. Первый из них блокирует активность тромбина, факторов IXa, Xa, XIa, VIIa. Дефицит его приводит к тромбозам. Второй связывается с фактором Xа и внешней теназой, ингибируя обе протеазы и являясь основным регулятором активности комплекса VIIa–TF. Дефицит TFPI в клинике не наблюдался, предположительно, из-за несовместимости с жизнью. Ингибирующее действие TFPI реализуется довольно сложным образом, вовлекая в процесс ингибирования основной продукт работы комплекса VIIa–TF фактор Ха. Тромбин также ингибируется кофактором гепарина II и альфа-2-макроглобулином, но в значительно меньшей степени, нежели антитромбином. Некоторый вклад в ингибирование различных протеаз каскада свертывания вносят также альфа1-антитрипсин, С1-ингибитор и ингибитор протеина С. Каскад охвачен петлей отрицательной обратной связи, так называемым путем протеина С. Будучи активированным тромбином, протеин C инактивирует факторы Vа и VIIIа, резко снижая скорость образования тромбина и фактора Xа соответственно. Кофактором в этом расщеплении служит протеин S, важный антикоагулянт, присутствующий в плазме. Кроме того, что он ускоряет реакции инактивации, он помогает активированному протеину С (PCa) расщепить фактор Va в протромбиназе, чего в его отсутствие не происходит. Кроме того, протеин S обладает независимым от протеина С механизмом антикоагулянтного действия, предположительно, за счет конкуренции с протромбиназой и теназой за место на мембране. В заключение представляется необходимым упомянуть о влиянии стенок сосудов на свертывающую систему крови, поскольку in vivo оно имеет большое значение. Сосудистая стенка принимает непосредственное участие в регуляции потенциала свертываемости крови. Помимо того, что она служит естественным барьером между кровью и другими тканями, ее клетками синтезируются и/или экспрессируются различные биологически активные вещества, модулирующие тромбообразование. К ним относится фактор Виллебранда, эндотелиальный фактор релаксации (NO), простациклин, тромбомодулин, эндотелин, тканевый фактор, ингибитор пути тканевого фактора и другие. Кроме того, мембраны эндотелиоцитов несут на себе рецепторы, которые при определенных условиях связывают молекулярные лиганды и клетки, свободно циркулирующие в кровотоке. Очень многие аспекты жизнедеятельности этих клеток регулируются тромбином через его взаимодействие со специфическими поверхностными рецепторами. В норме стенки обладают ярко выраженной антитромботической активностью, механизмы которой не вполне ясны. Известно, что с их поверхностью постоянно связано большое количество антитромбина III, а также TFPI, полное содержание последнего на стенках по меньшей мере не уступает пулу плазмы. На поверхности клеток эндотелия содержится трансмембранный белок тромбомодулин, связывающий тромбин и производящий поразительные изменения в его специфичности. В комплексе с тромбомодулином тромбин в сильной степени теряет свои прокоагулянтные свойства, взамен резко возрастает его способность активировать протеин С: скорость активации возрастает на три-четыре порядка. По всей видимости, перечисленные свойства сосудистой стенки играют важную роль в механизме локализации тромба in vivo. МетодыПодготовка плазмы. Кровь доноров и пациентов заготавливается на 3.8 % цитратном буфере (рН 5.5), соотношение кровь : цитрат составляет 9 : 1. После предварительного отделения эритроцитов центрифугированием в течение 20 или 25 минут при 1500g, плазму центрифугируют 5 минут при 10000g для удаления тромбоцитов. Полученная таким образом свободная от тромбоцитов плазма содержит 15-70 мкМ ионов свободного кальция, а концентрация тромбоцитов в ней не превышает 109 клеток/литр. Для обеспечения в плазме конечной концентрации свободных ионов кальция равной физиологической, в эксперименте рекальцификацию производят 10 мкл 1М раствора хлорида кальция на 0.5 мл плазмы. При выбранном методе рекальцификации конечная концентрация свободных ионов кальция достигает 1.1-1.6 мМ. Регистрация роста сгустка. Рост сгустка исследуется в специально сконструированной полистироловой кювете (Рис. 2А, Б). Между полистироловой чашкой Петри (рис. 2А, 1) (Ленинградский завод медицинских полимеров, Россия) диаметром 40 мм и пластиной, вырезанной из крышки чашки (4), на двустороннем скотче (3) вклеивается активатор (2) толщиной 1 мм. Наружная поверхность пластины закрашивается черным маркером Markette 336 (Sanford, США).
Рис. 2. Экспериментальные кюветы с различными активаторами: стекло, фибробласты, аорта (А); стекло (Б). Условные обозначения на рисунках: (1) чашка Петри; (2) фрагмент предметного стекла; (3) скотч; (4) крышка камеры, вырезанная из чашки Петри; (5) сгусток; (6) плазма крови; (7) ПЭТ пленка со слоем фибробластов; (8) фрагмент аорты. Активация по внутреннему пути осуществляется торцом предметного стекла (стекла S 8902, Sigma или #48300-25, VWR Scientific Inc. имеют шлифованные торцы и равномерно активируют свертывание). Рекальцификация предварительно прогретой до 37°С плазмы (0.6 мл) осуществляется 10 мкл 1М СаCl2 в пластиковой пробирке (эппендорф) путем тщательного перемешивания носиком пипетки (в течение около 20 сек). Сразу после этого прогретая экспериментальная кювета заполняется ~0.4 мл плазмы крови, чашка Петри герметично закрывается крышкой и помещалась в водяной термостат регистрирующей системы при 37°С. После юстировки оптической системы установки включается программа захвата изображений Shoot. Между рекальцификацией и заполнением кюветы обычно проходит 30 сек, а первый кадр записывается через 1-1.5 мин после заполнения кюветы. Сгусток растет от вертикальной активирующей поверхности в тонком (1 мм) слое плазмы, ограниченной снизу чашкой Петри, а сверху - крышкой. Регистрация пространственного свертывания осуществляется оптически на специально сконструированной установке (Рис. 3). Наблюдение за фибриновым сгустком производится по методу темного поля. Экспериментальная кювета (Рис. 3А, 1–6) в водяном термостате (Рис. 3Б, 7) освещается снизу под углом 45º 10-ю светодиодами L-1543-E (Kingbright, США) красного цвета (Рис. 3Б, 8; длина волны свечения lpeak = 660 нм, полуширина спектра 20 нм, апертура 30º, яркость 3000 мКанделл). Рассеянный сгустком свет фокусируется на цифровую видеокамеру EDC 1000D (Рис. 4Б, 14; Electrim Corp., США) теле-фотообъективом (Рис. 4Б, 15; Fuji), который для уменьшения фокусного расстояния оптически сопряжен с короткофокусным конденсором (Рис. 4Б, 16; Karl Ceiss, Германия).
Рис. 3. (А) Схема кюветы в держателе. (Б) Схема установки. Установка состоит из исследовательской кюветы (1-6), которая помещается в воду, находящуюся в прозрачном термостатируемом отсеке при 37°С (7), и освещается снизу светодиодами красного цвета свечения (8) или ультрафиолетом: свет от ртутной лампы (9), собранный конденсором (10), проходит через тепловой (11) и входной ультрафиолетовый (12) фильтры и падает на полупрозрачное интерференционное зеркало (13). Изображение области контакта плазмы (5) с активатором (4) фокусируется на охлаждаемой ПЗС матрице (14) с помощью фокусирующей системы, состоящей из теле-фотообъектива (15) и короткофокусного конденсора (16). Оцифрованное ПЗС камерой изображение передается в компьютер (17). Детали устройства кюветы изображены укрупненно на рисунке А: крышка (1), герметизирующая прокладка (2), полистироловая чашка Петри (3), активатор (4), исследуемая плазма (5), полистироловая крышка кюветы (6). Приемный элемент видеокамеры EDC1000D (ПЗС матрица TC244, Texas Instruments, США) для снижения темновых шумов охлаждается элементом Пельтье (температура ПЗС матрицы ~0ºС). Пространственное разрешение матрицы TC244 составляет 753×242 приемных элемента, размер каждого элемента - 8.5мкм×19.75мкм, в каждой строке по 251 приемнику красного, синего и зеленого спектра, глубина потенциальной ямы приемника - 80000 электронов, R.M.S. шум - 35 электронов при 20ºС, интенсивность сигнала кодируется целым 8-битовым числом (256 градаций яркости). В эксперименте регистрируется интенсивность светорассеяния (по красному сигналу, передаваемому матрицей), поэтому пространственное разрешение графического изображения составляло 251×242 пикселей одного цвета. В ходе эксперимента на матрицу проецируется изображение выбранного участка полистироловой кюветы размером ~7.2×5.4 мм (~34 пиксела на 1 мм по горизонтали, точное значение измеряется для каждого эксперимента). П  рограммный комплекс получения и обработки экспериментальных изображений. Для проведения эксперимента, сбора и предварительной обработки данных используется программа Shoot (автор -М.В. Ованесов). Программа реализована на языке Си в среде MSVC5.0 на основе VXD драйвера видеокамеры EDC1000D фирмы Electrim Corp. Эксперимент начинается с момента сохранения на жесткий диск компьютера времени рекальцификации плазмы крови. Затем экспериментальная кювета заполняется плазмой крови (программой сохраняется второй момент времени - приведение плазмы в контакт с активатором). После помещения кюветы в термостат и юстировки оптической системы установки программе дается команда сохранить первый кадр (третий момент времени). Далее каждые 30 сек пространственная картина интенсивности светорассеяния (выдержка составляет 900 мсек) записывается на жесткий диск. Для снижения темновых шумов производится накопление изображения. Для этого подряд без перерыва снимается несколько кадров (4-10 штук), но на жесткий диск сохраняется одно, усредненное ("накопленное") изображение.
Рис. 4. Последовательность шагов обработки экспериментальных данных по светорассеянию. (А) Исходные фотографии растущего сгустка. (Б) Контуры растущих сгустков (см. пояснения в тексте). Контуры соответствуют последовательным кадрам, снятым с 2-х минутными интервалами (контуры выделены оттенками серого). (В) На кадре выбрана полоса, вдоль которой вычислялись профили светорассеяния. (Г) Профили светорассеяния растущего от активатора сгустка. (Д) Зависимость размера сгустка от времени. Скорость квазистационарного роста сгустка вычислялась по наклону линейного участка этой кривой. На рисунке А показан рост сгустка в нормальной плазме. Полоса слева – стеклянный активатор свертывания. Фибрин сильно рассеивает свет, поэтому светлые области соответствуют сгустку, темные – несвернувшейся плазме. На первом этапе обработки данных по светорассеянию вычисляется двумерное изображение контуров, характеризующее динамику свертывания во всей наблюдаемой экспериментальной кювете. Для этого на одном кадре собираются контуры растущих сгустков, соответствующие последовательным двухминутным интервалам времени (рис. 5Б). Контуры (линии уровня) вычисляются на уровне половины средней максимальной интенсивности светорассеяния в сгустке. При обработке все полученные изображения полагаются симметричными относительно перпендикуляра к активатору. Это позволяет перейти от двумерных распределений интенсивности светорассеяния к одномерным на отрезках, проведенных вдоль распространения роста тромба. Для исследования роста сгустка от активатора выбирается область изображения кюветы, свободная от спонтанных сгустков, и в ней выбирается узкая полоса, перпендикулярную активирующей поверхности. Длина полосы составляет 1.5-3 мм, ширина - 0.2 мм (10 линий). Полоса показана на Рис. 4В в виде полупрозрачного прямоугольника. Вдоль этой полосы для всех моментов времени вычислялись профили интенсивности регистрируемого сигнала (Рис. 4Г). При этом, для снижения шумов, производится усреднение значений светорассеяния внутри полосы в направлении, перпендикулярно росту сгустка (т.е. параллельно активатору). Также учитывается искажение пропорций изображения (фотография растянута в 1.16 раза вдоль горизонтальной оси вследствие неправильной формы (прямоугольник, а не квадрат) приемных элементов ПЗС). При активации свертывания по внутреннему пути сгусток начинает расти через несколько минут после рекальцификации, и первый кадр (~1 мин) представляет собой фоновое светорассеяние от полистироловой кюветы, активатора и плазмы. В этом случае первый, фоновый, профиль светорассеяния вычитался из всех последующий экспериментальных профилей. Интенсивность светорассеяния в процессе обработки экспериментальных данных не пересчитывается в концентрацию фибрина.. Однако, недавние предварительные эксперименты нашей лаборатории показали, что в плазме, уровень фибриногена в которой уменьшен путем непродолжительного инкубирования при 55оС, добавление исходной плазмы в увеличивающихся концентрациях (от 0 до 100%) максимальная интенсивность светорассеяния в растущем сгустке зависит от концентрации фибриногена (в диапазоне 5-90%) почти линейно (данные Самойлова А., 2002). Как видно из Рис. 4Г, в нормальной плазме растущий сгусток имеет довольно крутой фронт. Фронт светорассеяния в течение всего времени эксперимента распространяется вглубь плазмы, практически не меняя своей формы. Скорость роста сгустка при таком поведении профиля удобно измерять по скорости движения какой-нибудь точки фронта. Программой по сериям профилей светорассеяния строится график зависимости размера сгустка на уровне половины от максимальной интенсивности светорассеяния в сгустке от времени (Рис. 4Д). Дальнейшая обработка проводится в программе Origin 5.0/6.0 (Microcal Corp., США). Для определения квазистационарной скорости роста на графике зависимости размера сгустка от времени выбирается прямолинейный участок, соответствующий практически постоянному росту сгустка, и аппроксимируется прямой линией методом наименьших квадратов (Рис. 4Д). По наклону прямой определяется скорость роста сгустка в мкм/мин. ^ 1. Внимательно прочитайте описание и ознакомьтесь с дополнительной литературой. Возьмите сменную обувь и приезжайте в ГНЦ РАМН. 2. Беседуя с преподавателем, докажите, что вы ясно понимаете устройство системы свертывания и предстоящий эксперимент. 3. Ознакомьтесь с местом работы и установкой. Прослушайте инструкции руководителя. 4. Включите установку не менее, чем за час до работы, чтобы охладилась матрица видеокамеры. 5. Возьмите кровь. По решению преподавателя, он либо заказывает кровь с вечера, и вы получаете ее около 10-11 утра, либо вы приезжаете в ГНЦ к 9.00 и заказываете ее прямо в день работы. Запишите в рабочую тетрадь индивидуальный номер донора. 6. Процентрифугируйте кровь дважды, получив свободную от тромбоцитов плазму. В случае, если задача выполняется одновременно с задачей по агрегации тромбоцитов, используйте не тот протокол центрифугирования, который указан в этом описании, а тот, который нужен для выделения тромбоцитов. 7. Изготовьте камеры для эксперимента по росту тромба при активации стеклом. 8. Рекальцифицируйте плазму, заполните камеру, поставьте в установку и – снимайте результаты. Стандартное время одного эксперимента — 40 минут. Рекомендуется сделать не менее двух экспериментов. 9. Постройте профили светорассеяния и зависимость размера сгустка от времени с помощью программы Shoot. Рассчитайте скорость роста на линейном участке с помощью Origin. Подготовьте и распечатайте отчет по задаче. Приложения^В связи с тем, что эксперименты по свертыванию должны выполняться на свежей плазме, а анализы на СПИД, гепатит и т.д. занимают длительное время, задача практикума выполняется на непроверенной крови. По этой причине все действия с кровью, плазмой и материалами, постоянно с ними соприкасающимися (пипетки, центрифуги и т.д.), необходимо выполнять в одноразовых перчатках. КАТЕГОРИЧЕСКИ запрещается касаться руками в перчатках клавиатуры компьютера, дверных ручек и прочих предметов, до которых дотрагиваются другие люди без перчаток: в противном случае вы подвергнете их опасности. Старайтесь не касаться руками в перчатках лица. В случае, если у вас чешется нос при работе в перчатках (довольно распространенная проблема), почешите его о плечо. Также, невзирая на перчатки, не рекомендуется выполнять эту задачу, если у вас есть сильные повреждения кожного покрова на руках (глубокие царапины, порезы, незажившие раны и т.п.). Работу следует выполнять в халате. Сменная обувь ОБЯЗАТЕЛЬНА (возьмите с собой). В остальном следуйте стандартным правилам техники безопасности при работе в биохимической лаборатории. ^ 1. М.В. Ованесов. Влияние факторов внутреннего пути свертывания крови на пространственную динамику роста сгустка. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, ГНЦ РАМН, 2002. 2. С. Бутенас, К.Г. Манн. Свертывание крови. Биохимия, т. 67, н. 1, 2002, стр. 5-15. 3. Х. Вайс, В. Елькман. Остановка кровотечения и свертывание крови, в: Физиология человека, Р. Шмидт, Г. Тевс., ред., т. 3, Москва, Мир, 1996, стр. 431-439. ^ Наш адрес : г. Москва, Новый Зыковский пр., 4а. Телефоны : 212-3522, 212-8870, 212-5531 Как добраться: м. Динамо, первый вагон из центра, идти через парк по карте (см. ниже) к ГНЦ. От проходной идти строго прямо вперед, пока не окажетесь перед стеной криокорпуса, который вам нужен. Обойти его справа, войти в дверь и подняться на третий этаж. Позвонить.     Описание подготовлено М.А.Пантелеевым и М.В. Ованесовым. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям