Иммунобиологические лабораторные критерии в диагностике лимфаденопатий и гемобластозов у детей 14. 03. 09-«Клиническая иммунология, аллергология»
|
|
Скачать 0.56 Mb.
|
1 2
|
На правах рукописи ХАМАТДИНОВА ЗЕМФИРА РОБЕРТОВНА ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ КРИТЕРИИ В ДИАГНОСТИКЕ ЛИМФАДЕНОПАТИЙ И ГЕМОБЛАСТОЗОВ У ДЕТЕЙ 14.03.09-«Клиническая иммунология, аллергология» Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Уфа - 2012 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и Государственном бюджетном учреждении здравоохранения «Республиканская детская клиническая больница» Республики Башкортостан ^ : доктор медицинских наук, профессор Хайруллина Раиса Масгутовна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Зуева Екатерина Евгеньевна; доктор биологических наук, профессор ^ доктор биологических наук Шевчук Наталья Евгеньевна Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН (г.С.-Петербург) Защита состоится «____»_________________ 2012 года в ____часов на заседании Объединенного совета ДМ 208.006.05 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Автореферат разослан «_____»________________2012 г. Учёный секретарь диссертационного совета Лукманова К.А. ^ Актуальность проблемы Актуальность изучения иммунобиологических особенностей лимфопролиферативного синдрома у детей обусловлена, прежде всего сложностью дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных процессов на ранних стадиях. Этой проблеме посвящено немало отечественных и зарубежных работ [Волкова М.А., 2001; Воробьев А.И., 2007; Ковригина А.М., Пробатова Н.А., 2007; Ioachim H, Ratech H., 2006]. В последнее десятилетие возросли возможности диагностики инфекционных заболеваний, стал более понятным спектр клинических проявлений таких инфекций как токсоплазмоз, цитомегаловирусная инфекция, инфекционный мононуклеоз [Баранова И.П., 2002; Башмакова М.А., 2000]. Злокачественные процессы кроветворной и лимфоидной тканей являются одной из важнейших проблем современной медицины и методом, раскрывающим новые перспективы в понимании природы опухоли, ее возникновения, развития и прогрессирования является иммунофенотипирование [Луговская С.А., 2006]. Иммуновариант острого лейкоза, определяющий выбор тактики лечения больных, устанавливают на основании данных об экспрессии поверхностных дифференцировочных антигенов лимфоидных и миелоидных клеток [Дурнов Л.А., 2002; Луговская С.А., 2006]. Кроме того, необходимость оценки состояния функциональной активности и количественного содержания лимфоидных и миелоидных клеток разных типов обусловлена тем, что они избирательно подвергаются воздействию цитостатиков, что может влиять на результаты терапии. Сложно провести четкое разделение между острым лейкозом и лимфобластной лимфомой, так как по клинической картине эти заболевания довольно схожи, отсутствуют специфические лабораторные проявления и различия между ними иногда можно выявить только при изучении опухолевого субстрата. В связи с тем, что в настоящее время метод проточной цитометрии в клинической практике не является рутинным методом диагностики, возникает необходимость более подробного изучения лимфомы для выявления критериев дифференциального диагноза [Воробьева А.И., 2002; Масчан А.А., 2006; Locksley R.M., 2001]. В основе процессов, протекающих как при доброкачественной лимфаденопатии так и при гемобластозах, лежит гиперплазия лимфоидной ткани, т.е. непосредственное вовлечение лимфоидных клеток в процесс пролиферации. Активно пролиферирующие клетки синтезируют ДНК и находятся в разных фазах (G1-, S-, G2- или M-фазе) клеточного цикла, т. е. представляют собой «фракцию роста» [Бычкова Н. В., 2004; Владимирская Е.Б., 1998]. При разных формах патологии количество ДНК в покоящейся (неделящейся) клетке не всегда бывает диплоидным и может отклоняться от нормального содержания (анеуплоидия) в сторону уменьшения или чаще увеличения. Последнее (гипердиплоидия, триплоидия, тетраплоидия и т.д.) часто имеет место при злокачественном росте. Проточная ДНК-цитометрия является одним из методов измерения плоидности бластных клеток позволяющим, кроме того, характеризовать кинетический профиль, что может варьировать в зависимости от интенсивности пролиферации [Müller H-J., 2000; Campana D., 2002]. Прикладное значение ДНК-цитометрии при оценке пролиферативной активности лимфоидных клеток обусловлено быстротой исполнения, информативностью, точностью и надежностью метода. Он дает возможность выявлять патологические изменения на стадиях, когда число клеток, подвергшихся опухолевой трансформации, еще незначительно. Выявление в периферической крови клеток с высоким (гиперплоидным) содержанием ДНК может быть связано только с появлением пролиферирующих клеток и говорит о наличии патологии в этой системе [Новик А.А., 2001; Потапнев М.П., 2003; Хисамова Н.Ф., 2005]. Пролиферативная активность отражает индивидуальные свойства опухоли, ее определение необходимо не только для биологической характеристики, но и для определения прогноза заболевания [Мазурик В.К., 2001; Бычкова Н.В., 2004]. Наряду с этим существует мнение о том, что прогностическое значение плоидности опухолевых клеток вторично и отражает лишь воздействие внешних по отношению к опухоли факторов [Pinto A.,1999; Chassevent A., 2001]. В практической медицине, как правило, в большинстве случаев опухолевые процессы изучаются при развитых клинических проявлениях. Злокачественные новообразования приводят к увеличению лимфатических узлов уже на ранних стадиях заболевания, но принимаются за воспалительную лимфаденопатию, так как клиническая картина еще не ясна и лабораторные данные неспецифичны [Дурнов Л. А., и др., 2002]. Существующие в настоящее время комплексы исследования заболеваний, сопровождающихся гиперплазией лимфоидной ткани, не содержат дифференциально-диагностических тестов, которые могут быть использованы в качестве объективных критериев [Колыгин Б.А.,1990; Динова Е.А.,2007]. Особенно это касается спорных клинических случаев, когда необходима своевременная биопсия лимфатического узла. Это ведет к выбору широким кругом врачей наблюдательной тактики, назначению неадекватной а, следовательно, неэффективной терапии. Особую значимость при формировании подходов к дифференциальной диагностике доброкачественного и злокачественного лимфопролиферативного синдрома у детей имеет изучение взаимосвязей между иммунобилогическими показателями и функциональными характеристиками клеток. В литературе отсутствуют данные о комплексных исследованиях по изучению иммунологических характеристик клеток и пролиферативной активности. Современный проточно-цитометрический анализ дает возможность с высокой степенью достоверности проводить диагностику, осуществлять мониторинг и прогнозировать течение процесса. Весьма актуальной проблемой, в связи с этим, является разработка на основе проточной цитометрии принципов дифференциальной диагностики доброкачественного лимфо-пролиферативного синдрома и гемобластозов, в частности лимфом и острых лейкозов. ^ Разработать иммунобиологические лабораторные критерии для дифференциальной диагностики доброкачественных лимфаденопатий и гемобластозов у детей на основании иммунофенотипирования и ДНК-цитометрии периферической крови, костного мозга и биоптатов. ^
^ Впервые на основе проточной цитофлюориметрии клеток костного мозга, биопсийного материала и периферической крови определены иммунобиологические лабораторные критерии доброкачественных лимфаденопатий и гемобластозов у детей: доброкачественные лимфаденопатии, острые лейкозы и лимфомы характеризуются однонаправленными иммунопатологическими реакциями в виде снижения количества естественных киллерных клеток (CD16+56+) и В-лимфоцитоза в периферической крови. Выявлены различия в показателе экспрессии маркера ранней активации СD25+: высокий уровень при острых лимфобластных лейкозах (18%) и лимфомах (28%) и низкий при лимфаденопатиях (7,5%). Впервые установлены дифференциально-диагностические маркеры неходжкинских лимфом. В отличие от лимфобластного лейкоза из клеток предшественников опухолевые клетки при лимфомах характеризуются высокой интенсивностью экспрессии цитоплазматического и мембранного IgM+, анеуплоидный клон характеризуется отсутствием пролиферации. По результатам диагностического HLA-типирования установлена генетическая детерминированность возникновения анеуплоидного клона в костном мозге при остром лимфобластном лейкозе из В-клеток предшественников. Впервые обосновано значение плоидности и кинетики клеточного цикла в дифференциальной диагностике доброкачественных лимфаденопатий и гемобластозов у детей. Доброкачественные лимфаденопатии у детей характеризуются диплоидным типом гистограмм и высокой пролиферативной активностью лимфоидных клеток периферической крови по сравнению с контрольной группой. Маркерами пре-В острого лимфобластного лейкоза являются анеуплоидия бластных клеток костного мозга и высокая интенсивность экспрессии цитоплазматического IgM+. Бластные клетки костного мозга при В-2 остром лимфобластном лейкозе характеризуются диплоидным набором хромосом и экспрессией антигена ранних предшественников СD34+. Гематологическая ремиссия при остром лимфобластном лейкозе из В-клеток предшественников характеризуется исчезновением анеуплоидного клона бластных клеток в костном мозге и периферической крови. Высокий уровень клеток в фазе пролиферации (S = 0,4-3,0 %) и появление анеуплоидного клона в периферической крови являются маркерами злокачественности процесса. ^ Показано диагностическое и прогностическое значение определения плоидности и кинетики клеточного цикла периферической крови и биопсийного материала у детей с синдромом увеличенных лимфатических узлов. Выявление методом ДНК-цитометрии анеуплоидного клона в костном мозге и периферической крови, является отражением опухолевой трансформации при гемобластозах. Определен иммунофенотипический профиль анеуплоидных бластных клеток костного мозга при остром лимфобластном лейкозе из В – клеток предшественников. В ходе сравнительного анализа установлено, что В2 - лимфобластный лейкоз характеризуется диплоидным типом гистограмм, В3 – анеуплоидным. Определено прогностическое значение индекса анеуплоидных клеток при В3- остром лимфобластном лейкозе: благоприятным является ДНК> 1.16, так как для этих больных характерна большая продолжительность ремиссии. При мониторинге полихимиотерапии установлено, что восстановление кроветворения при полной гематологической ремиссии сопровождается исчезновением анеуплоидного клона как в костном мозге, так и в периферической крови, а также повышением пролиферативной активности и экспрессии маркера готовности клеток к апоптозу (CD95+). Предложен алгоритм дифференциальной диагностики лимфопролиферативного синдрома у детей, позволяющий сократить сроки обследования пациентов с лимфаденопатиями различного генеза и определить на ранних сроках заболевания показания к проведению биопсии лимфатического узла с целью морфологической верификации. Разработанная компьютерная программа на основании результатов иммунофенотипирования бластных клеток костного мозга позволяет упростить процесс постановки диагноза у больных с острым лимфобластным лейкозом из клеток предшественников. ^ Материалы диссертационного исследования внедрены в клиническую практику лечебных и лабораторных подразделений ГБУЗ «Республиканская детская клиническая больница» (РДКБ), используются в учебно-педагогическом процессе на кафедрах лабораторной диагностики Института последипломного образования, госпитальной педиатрии с курсом поликлинической педиатрии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО БГМУ МЗ и СР РФ). Основные результаты работы, касающиеся ДНК-цитометрии периферической крови, представлены в учебных пособиях: «Области применения ДНК-цитометрии периферической крови в педиатрической практике» (Уфа, 2010), «Диагностическое HLA-типирование в педиатрической практике» (Уфа, 2010). ^
^ Основные положения диссертации доложены и обсуждены на ряде научных форумов: Всеросийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», (Санкт-Петербург, 2007); Всероссийской научно-практической конференции «Современные аспекты оказания стационарной медицинской помощи детям, новые технологии специализированной медицинской помощи» (Уфа, 2007); на рабочем совещании по проточной цитометрии “BD FACS Users Meeting” (Санкт-Петербург, 2008); научно-практической конференции «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, 2010); на XIV конгрессе педиатров России с международным участием (Москва, 2010); Всеросийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», (Санкт-Петербург, 2011). Диссертация доложена и обсуждена на совместном заседании кафедр лабораторной диагностики ИПО, факультетской терапии, кафедры детской хирургии, ортопедии и анестезиологии, госпитальной педиатрии с курсом поликлинической педиатрии, оториноларингологии, фундаментальной и прикладной микробиологии, ЦНИЛ ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития (протокол № 9 от «10» сентября 2011 г.). Диссертация апробирована на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (протокол № 10 от «14» октября 2011г.). Публикации По теме исследования в печати опубликовано 23 научные работы, в том числе 15 в журналах, включенных в перечень рецензируемых и рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук, 1 монография, методическое руководство, свидетельство о государственной регистрации программы. Новизна исследования подтверждена патентом РФ № 2416795 от 27.01.2010. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 193 страницах компьютерного текста, содержит 36 таблиц и 37 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований (5 глав), заключения, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 364 источника, в том числе 199 зарубежных. ^ Материалы и методы исследования Основу работы составили результаты комплексного клинико-иммунологического лабораторного обследования 300 детей с лимфаденопатиями и гемобластозами, находившихся на стационарном лечении и амбулаторном обследовании в ГБУЗ РДКБ Республики Башкортостан. В процессе работы на базе лаборатории иммунологии с отделением клинической иммунологии РДКБ было обследовано: 156 детей с доброкачественными лимфаденопатиями в возрасте от 1 года до 10 лет. С впервые установленным диагнозом острый лейкоз в исследование было включено 111 больных: острый лимфобластный лейкоз из клеток предшественников (ОЛЛ) 95 детей, в возрасте от 2 месяцев до 11 лет (медиана 4,5 года), распределение по полу: 43 мальчика и 46 девочек. Все дети получали программную полихимиотерапию по протоколам ALL-BFM-90, ALL-MВ-91 и ALL-МВ-2002; острый миелобластный лейкоз (ОМЛ) 16 человек (9 мальчиков и 7 девочек) в возрасте от 13 месяцев до 13,5 года (медиана 10,5 года). С впервые установленным диагнозом - лимфома 33 пациента: В-клеточные лимфомы (n=21) возраст обследованных от 5 до 12 лет (медиана - 7), распределение по полу: 18 мальчиков и 3 девочки; Т-клеточные лимфомы (n=12) в возрасте от 3 до 11 лет (медиана - 9) из них 7 мальчиков и 5 девочек. Комплекс лабораторных исследований включал: ДНК-цитометрию и иммунофенотипирование методом проточной цитометрии; определение аллелей антигенов 1-го класса главного комплекса гистосовместимости (HLA-I); определение в сыворотке крови иммуноглобулинов классов А, М, G; определение специфических антител к герпес – вирусам. ДНК-цитометрия клеток периферической крови, костного мозга и биопсийного материала с изучением плоидности и кинетики клеточного цикла методом проточной ДНК-цитометрии, основана на связывании ДНК с флуоресцентным зондом пропидиума йодидом, который позволяет определить долю клеток в различных фазах митотического цикла (G0/G1, S и G2+M). Образцы (не менее 20 000 клеток) анализировали на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США), оборудованном модулем дискриминации дуплетов в программе ModFit. Иммунофенотипирование клеток периферической крови, костного мозга и биопсийного материала проводили c использованием моноклональных антител фирмы Becton Dickinson (США). Определение аллелей антигенов 1-го класса главного комплекса гистосовместимости (HLA-I, локусы А и В) проводили с помощью реакции комплемент - зависимой клеточной цитотоксичности по методу Терасаки с ипользованием наборов реагентов фирмы ГИСАНС (С.-Петербург) на базе лаборатории отделения трансплантации ГБУЗ РДКБ. Определение иммуноглобулинов классов А, М, G в сыворотке крови проводили методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини [Имельбаева Э.А. и др., 2006]. Специфические антитела к герпес - вирусам выявляли методом иммуноферментного анализа с применением тест систем Вектор-Бест на автоматическом иммуноферментном анализаторе «Лазурит» (США). Полученные результаты сравнивались с группой сопоставления, объединяющей 30 детей, показатели здоровья которых отвечали следующим требованиям: отсутствие жалоб на нарушения состояния здоровья в момент осмотра; эпизоды вирусных заболеваний не более 4 раз в течение года; отсутствие признаков аллергии и другой хронической патологии [Хайруллина Р.М., 1999; Хисамова Н.Ф., 2009]. У детей группы сопоставления по сравнению с показателями нормы по РФ (табл.1) установлено снижение уровня эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, СОЭ и достоверное увеличение уровня лимфоцитов в крови [Луговская С.А., Морозова В.Т., 2006]. Таблица 1 - Гематологические показатели у практически здоровых детей в сравнении со значениями нормы [Луговская С.А., Морозова В.Т., 2006]
*Различие статистически значимо (р0,05) Клеточное звено иммунитета у детей группы сопоставления характеризовалось: высоким уровнем эффекторных клеток CD8+ (цитотоксических лимфоцитов), CD16+56+ (естественных киллеров), CD19+ (В-лимфоцитов), а также повышенным уровнем маркёра ранней активации (CD25+). При сравнительной оценке гуморального звена иммунитета выявлено незначительное снижение уровня иммуноглобулина G (Ig G) (рис.1). В группе сопоставления на основании анализа результатов ДНК-цитометрии клеток периферической крови установлено, что в норме показатели клеточного цикла варьируют в сравнительно узких пределах и характеризуются высокой стабильностью. В 100% случаев выявлялся диплоидный тип гистограмм, причём основная масса клеток (99,86  0,02%) находилась в G0/1-фазе клеточного цикла. Доля клеток в стадии синтеза ДНК (S-фаза) составляла 0,10,01%, в фазе G2-М - 0,040,01 %. Коэффициент вариации пика G0/1 составил 2,480,09 % , что отражает достоверность полученных данных (табл.2). Рисунок 1- Иммунологические показатели практически здоровых детей ^
Статистическую обработку результатов исследования проводили в операционной среде «Windows-XP» с использованием современных пакетов прикладных программ «STATISTICA 6.0». Для показателей, имеющих нормальное распределение признака, вычислялись среднее арифметическое значение (М) и стандартная ошибка среднего значения (m). Для показателей, не имеющих нормального распределения, вычислялись медиана и интеркартильный размах (25 - 75 перцентилей). Достоверность различий оценивалась по критерию Манна-Уитни. Корреляционный анализ выполнялся по методу Спирмена с определением коэффициента ранговой корреляции (rs). Значения р0,05 приняты статистически значимыми [Гланц С., 1999]. ^ Иммунологическая реактивность и показатели ДНК-цитометрии клеток периферической крови у детей с лимфаденопатиями Увеличение лимфатических узлов (ЛУ), вызываемое различными причинами, является наиболее частым патологическим состоянием, с которым сталкивается педиатр общей практики [Moor SW.et al., Okolo S.N. et al., 2003; Башкина О.А. и др., 2004]. Необходимостью изучения особенностей иммунологической реактивности больных с лимфаденопатиями определяется как высокой распространенностью данной патологии, так и сложностью диагностики и зачастую невозможностью определения этиологического фактора. По данным первичной обращаемости к врачу - иммунологу поликлиники ГБУЗ РДКБ ежегодно отмечается рост числа пациентов с лимфаденопатиями (ЛАП) - манифестным проявлением гиперплазии лимфоидной ткани. В структуре заболеваемости ЛАП занимают третье место после болезней респираторного тракта и аллергической патологии и составляют в среднем 5,9%. Нами проведено обследование 156 детей с синдромом увеличенных лимфатических узлов из группы часто болеющих. Возраст пациентов составил от 1 года до 10 лет. В ходе работы применен комплекс лабораторных исследований, включающий общий анализ крови, иммунологические исследования, иммунофенотипирование методом проточной цитометрии. При анализе показателей гемоцитограммы у больных с ЛАП установлены лейкоцитоз (8,90x109/л), увеличение СОЭ (6,5мм/ч) и низкий уровень гемоглобина (103,5 г/л) (табл.3). Таблица 3 - Показатели периферической крови у детей с лимфадено-патиями
Особенности иммунологического реагирования, по сравнению с группой сопоставления, характеризовались достоверным снижением маркера ранней активности CD25+, подавлением киллерной активности (CD16+56+) и уровня Ig A на фоне В-лимфоцитоза (CD19+) (рис.2).  Рисунок 2 - Иммунологические показатели периферической крови у детей с лимфаденопатиями В связи с тем, что лимфаденопатия является клиническим проявлением пролиферации лимфоидной ткани, чрезвычайно актуальным является поиск новых методов оценки пролиферативной активности клеток. В нашей работе впервые для этих целей были использованы такие новейшие технологии как ДНК-цитометрия клеток периферической крови. По результатам проведенных исследований, так же как и в группе сопоставления, гистограммы характеризовались диплоидным типом (табл.4), но при этом отмечалась более высокая пролиферативная активность клеток (S- фаза клеточного цикла 0,16%) (р<0,05). Таблица 4 - Распределение клеток периферической крови у детей с лимфаденопатиями по плоидности и фазам клеточного цикла
Различие с контролем статистически значимо: * - р0,05; ** - р0,01 Большое значение в формировании синдрома увеличенных лимфатических узлов имеют герпес - вирусные инфекции, резистентные к терапии, с затяжным, хроническим течением [Ведь В.В., 2005; Терегулова Л.М., 2006]. Для определения фоновой инфицированности у детей с лимфаденопатиями проводились исследования на иммуноферментном анализаторе с определением уровней в сыворотке крови иммуноглобулинов классов G и М к цитомегаловирусной инфекции (ЦМВ), вирусу простого герпеса 1,2 типов (ВПГ), вирусу Эпштейна-Барр (рис.3).  % Рисунок 3 - Выявляемость специфических антител (Ig G, %) к герпес-вирусам у детей с лимфаденопатиями По результатам исследований у детей с ЛАП, в 96 % случаев определялся диагностически значимый уровень Ig G к ЦМВ (табл.5). При изучении других возбудителей (вирус Эпштейна-Барр и ВПГ 1,2-го типов) достоверной разницы в уровне фоновой инфицированности в исследуемых группах не выявлено. Специфические антитела Ig М у обследуемых отсутствовали. Таблица 5 - Уровень специфических антител (Ig G) к цитомегаловирусной инфекции у детей с лимфаденопатиями
В настоящее время ЦМВ рассматривается как инфекционная болезнь иммунной системы, при которой длительная персистенция вируса сопровождается инфицированием всех иммунокомпетентных клеток [Воробьев А.А., 2006; Ярилин А.А., 2006; Chen W., 2003]. Выявленные особенности иммунологической реактивности у детей с доброкачественной ЛАП, по нашему мнению, характеризуют функциональную недостаточность системы иммунитета. В целях дифференциальной диагностики и строго по клиническим показаниям детям, находившимся на обследовании в ГБУЗ РДКБ, проведена биопсия лимфатических узлов с последующим исследованием биоптатов на проточном цитофлюориметре. При идентичной клинической картине выявлено два варианта иммунологических реакций: преобладание Т-клеточного звена (рис.4) и одинаковый уровень активности Т- и В-клеточного иммунитета (рис.5). Как в первом, так и во втором варианте отмечался высокий уровень клеток с маркерами CD7+ CD2+ (Т-лимфоциты) и HLA-DR+ (В-клетки и активированные Т-лимфоциты).  % % Рисунок 4 - Т-клеточный вариант иммунологических реакций у детей с лимфаденопатией  Рисунок 5 - Т- В- клеточный вариант иммунного ответа у детей с лимфаденопатиейНаряду с иммунофенотипированием, нами была проведена ДНК-цитометрия клеток биоптатов лимфатических узлов у детей с лимфаденопатией. По результатам исследования клетки лимфоидной ткани имели диплоидный набор хромосом (100,0%) с высокой пролиферативной активностью: 6,09% клеток находились в G2-фазе клеточного цикла (фаза пролиферации), 93,91 % - в G0/1-фазе, в S-фазе 0,0 % (рис. 6).  Рисунок 6 - ДНК-гистограмма клеток лимфоидной ткани больного с лимфаденопатией Корреляционным анализом у больных с ЛАП установлены различные типы межклеточной кооперации между гематологическими показателями и маркерами пролиферации клеток периферической крови (рис.7). G0/1 Лейкоциты  -0,519Лимфоциты   -  0,8020,519 S+G2 Сегментоядерные нейтрофилы  -0,605 0,608 CD95  Обратные связи  Прямые связиРисунок 7 – Взаимосвязи между гематологическими показателями и данными ДНК-цитометрии при лимфаденопатиях По нашему мнению сопряженность общего количества лимфоцитов с маркером готовности клеток к апоптозу (CD95+) и фазами пролиферации (S- и G2-), характеризует нарушения в системе апоптоза и высокую пролиферативную активность. Таким образом, использование проточной цитометрии при обследовании детей с лимфаденопатиями позволило установить наряду с известными маркерами активности процесса - повышением СОЭ, лейкоцитозом, ряд принципиально новых положений: иммунопатологические реакции при доброкачественной гиперплазии лимфоидной ткани проявляются депрессией естественной киллерной цитотоксичности, В-лимфоцитозом и снижением маркера активации CD25+ в крови. Лабораторными маркерами пролиферативной активности лимфоидной ткани являются: изменение кинетики клеточного цикла в виде высокого уровня S-фазы и сопряженность лимфоцитов периферической крови с фазой пролиферации G2 и маркером готовности клеток к апоптозу CD95+. ^ Злокачественные новообразования у детей в последние годы стали одной из важнейших проблем педиатрии. Достаточно отметить, что смертность от рака в развитых странах занимает второе место в структуре детской смертности [Аксель Е.М. 2002]. В Республике Башкортостан заболеваемость острыми лейкозами составляет в среднем 3,3 на 100000 детского населения. При подозрении на онкопатологию, пациенты поступают в ГБУЗ РДКБ г.Уфы, где проходят обследование и лечение. При диагностике гемобластозов нами был применен комплекс лабораторных методов, впервые апробированный при ЛАП, включающий иммунофенотипирование, определение плоидности и кинетики клеточного цикла. Всего было обследовано 111 детей с впервые установленным диагнозом острый лейкоз (рис. 8).  Рисунок 8 - Структура заболеваемости детей острым лейкозом На основании результатов иммунофенотипирования бластных клеток костного мозга самую многочисленную группу составили дети с острым лимфобластным лейкозом из В-клеток предшественников. Диагноз острый лимфобластный лейкоз из Т-клеток предшественников был выставлен в 6,0 % случаях, при этом Т-1 ОЛЛ-1случай, Т-2 ОЛЛ 2 случая, у 3-их пациентов установлен Т-3 ОЛЛ. Всем больным, наряду с иммунофенотипированием проведена ДНК-цитометрия костного мозга. В 5 случаях бластные клетки были диплоидны и характеризовались высокой пролиферативной активностью: фаза G2 составляла в среднем 0,70 %, S фаза - 10,70 %. В 1 случае была выявлена анеуплоидия клеток костного мозга с высокой пролиферативной активностью (число клеток в S-фазе 29,8 %). Из-за малочисленности группы не представлялось возможным проведение статистической обработки. Острый миелобластный лейкоз (ОМЛ) был диагностирован у 15,0 % обследованных на основании результатов морфологического, цитохимического и иммунологического исследования опухолевых клеток костного мозга. Были выявлены следующие варианты ОМЛ: ОМЛ-1 в 37,5%; ОМЛ-2 и ОМЛ-4 в 25,0 %, и ОМЛ-0 –12,50 % случаев. По данным ДНК-цитометрии в 100% случаев бластные клетки характеризовались диплоидным типом гистограмм с высокой степенью пролиферации (в S-фазе находилось 11,50% клеток). Как было отмечено, самую многочисленную группу составили дети в возрасте от 0 до 5 лет с острым лимфобластным лейкозом из В-клеток предшественников. Согласно современным представлениям, на иммунологические особенности опухолевой клетки оказывают влияние перестройки в геноме и отражением таких нарушений являются показатели плоидности и кинетики клеточного цикла. В связи с этим, изучение пролиферативной активности приобретает диагностическое и прогностической значение. В зависимости от плоидности клеток костного мозга пациенты с диагнозом В-ОЛЛ были распределены на подгруппы: в первой подгруппе гистограммы характеризовались диплоидным типом (78 человек), во второй подгруппе (11 случаев) была выявлена анеуплоидия костного мозга: 30,54 % клеток были диплоидными, 62,28 % - анеуплоидными (табл.6). При изучении кинетики клеточного цикла установлено, что основная масса клеток костного мозга как при диплоидном, так и при анеуплоидном наборе хромосом находилась в G0/1-фазе клеточного цикла. Пролиферативная активность оценивалась по S- и G2-фазам клеточного цикла: в первой подгруппе S-фаза составила 7,85 %, G2 фаза - 0,67 %, во второй подгруппе – S фаза - 6,72 %, G2 фаза - 0,33 %. Таблица 6 - Распределение клеток костного мозга у детей с острым лимфобластным лейкозом из В-клеток предшественников по плоидности и фазам клеточного цикла
При проведении иммунофенотипирования бластных клеток костного мозга у больных выявлена экспрессия В-клеточных маркеров (cytCD79а+, CD19+, CD22+, CD10+, cyt IgM+, HLA-DR+, CD34+). Антиген CD19+ чаще отмечался в подгруппе с диплоидным типом гистограмм, частота встречаемости cyt IgM+ была более высокой в подгруппе с анеуплоидией (рис.9).  % Рисунок 9 - Показатели иммунофенотипирования клеток костного мозга при остром лимфобластном лейкозе из В-клеток предшественников Корреляционный анализ показателей иммунофенотипирования при В-ОЛЛ выявил множество прямых и обратных связей. Как для подгруппы с диплоидным, так и с анеуплоидным типом гистограмм, выявлены общие взаимосвязи между линейно-ассоциированными и линейно-неограниченными антигенами CD19+ - CD34+(0,694), CD19+ - HLA-DR+ (0,621), CD22+ - CD34+(0,755), CD10+- CD22+(0,671). Различия касались связей бластных клеток с фазами клеточного цикла: в подгруппе с диплоидией установлена высокая сопряженность стволовых клеток с фазой пролиферации G2 (CD34+ - G2), в группе с анеуплоидией выявлена корреляция с более зрелыми бластами - cyt IgM+ (G2 - cyt IgM+). Этот факт имеет дифференциально-диагностическое значение при постановке диагноза В3-ОЛЛ (рис.10, 11). -0,638    0,703 -0,752 -  0,7530,448 0,559 0,598 -0,760  Pисунок 10 - Корреляции между показателями иммунофено-типирования и ДНК-цитометрии клеток костного мозга у детей с острым лимфобластным лейкозом в подгруппе с диплоидным типом гистограмм Необходимым условием при изучении анеуплоидного клона опухолевых клеток является определение индекса плоидности, представляющего собой соотношение между уровнем ДНК в лейкозных клетках к содержанию ДНК в диплоидных (нормальных). Согласно данным литературы [Chassevent A., 2001] прогностически благоприятными являются значения индекса ДНК> 1,16, при которых у пациентов наблюдается более длительная ремиссия (>5лет). При менее выраженной гиперплоидности бластов (индекс ДНК в диапозоне от 1,10 до 1,16) - прогноз неблагоприятный. В наших исследованиях в 27% случаев при анеуплоидии показатель индекса плоидности был ≤1,16, и на фоне проводимой терапии аплазия кроветворения сопровождалась септическим процессом. Методом корреляционного анализа было выявлено, что высокие показатели индекса плоидности клеток сопряжены с уменьшением количества бластов, несущих маркеры CD34+ и CD19+ (рис.11). Как известно, антиген CD34 – это маркер стволовой клетки, широко представленный на гемопоэтических предшественниках всех линий. Выраженность экспрессии CD34+ антигена постепенно снижается по мере повышения степени дифференцировки клеток. Прогностическое значение этого антигена у детей до сих пор не установлено. Анализ выявленных нами обратных взаимосвязей (CD34+ - G2; CD34+ – CD95+; CD34+ - индекс плоидности), позволил предположить, что наличие экспрессии CD34+ на бластных клетках при В-3ОЛЛ достоверно ухудшает прогноз заболевания.  0,800 0,771 0,795 -0,824 -0,718 -0,790 -0,648 -0,805 -0,667 0,616 -0,646 -0,725 0,778 Прямые связи ----------- Обратные связи Рисунок 11 - Корреляции между показателями иммунофено-типирования и ДНК-цитометрии клеток костного мозга у детей с анеуплоидным типом гистограмм В литературе практически отсутствуют данные о плоидности и кинетике клеток периферической крови при острых лейкозах. Наряду с клинико-иммунологическими исследованиями костного мозга, у детей с В-ОЛЛ проведена ДНК-цитометрия крови. Было установлено, что основная масса клеток находилась в G1-фазе клеточного цикла. Пролиферативная активность периферической крови превышала показатели контрольной группы. Так, при диплоидном типе гистограмм S-фаза составила 0,90 %, при анеуплоидии (дети второй подгруппы) – 0,16%. Сравнительный анализ гематологических показателей у больных с острым лимфобластным лейкозом из В-клеток предшественников по отношению к группе сопоставления выявил высокие значения СОЭ, низкие показатели содержания эритроцитов, гемоглобина, а также тромбоцитопению и наличие бластных клеток в периферической крови в подгруппе с диплоидным типом гистограмм. Отличительными особенностями подгруппы с анеуплоидией являются лейкопения и лимфоцитоз (табл.7). Таблица 7-Данные лейкограммы капиллярной крови у детей с острым лимфобластным лейкозом из В-клеток предшественников (Ме)
В зависимости от плоидности изучались изменения иммунологических показателей периферической крови (рис.12). Между подгруппами не выявлено достоверной разницы. Но при сравнении с группой контроля изменения были идентичны тем, что выявлены и при доброкачественных ЛАП: низкий уровень естественных киллерных клеток (CD16+56+) и В-лимфоцитоз (CD19+) что, безусловно, имеет значение в формировании опухолевого процесса.  Рисунок 12- Иммунологические показатели периферической крови детей с острым лимфобластным лейкозом из В-клеток предшественниковОдно из современных направлений в гематологии – это изучение патогенетической роли апоптоза в развитии опухолевого процесса. С позиций блокирования апоптоза кумулятивные процессы являются одними из ведущих в прогрессировании этих болезней. В процессе работы изучался показатель готовности клеток к апоптозу CD95+ как в костном мозге, так и в периферической крови. Изменения по сравнению с группой сопоставления не были статистически значимыми. Для изучения взаимосвязей между показателями иммунофенотипирования и CD95+ проведен корреляционный анализ. Патогенетическое значение, по нашему мнению, имеют связи CD95+ со здоровыми клетками миелоидного ряда (CD95+ - MPO; CD95+ - CD14+) и обратные взаимосвязи с бластами (CD95+ - бласты; CD34+ - CD95+), что мы расценили как блокаду апоптоза, способствующую опухолевой прогрессии. Ответ на программное лечение больных с острым лейкозом характеризуется скоростью формирования первичного ответа лейкозных бластов и в связи с этим является одним из основных и наиболее надежных прогностических факторов. На основании морфологического исследования костного мозга в процессе полихимиотерапии выявлено, что практически во всех случаях образцы были бедноклеточными, процент бластных клеток в костном мозге варьировал от 0 до 5,0 %, что свидетельствует о гематологической ремиссии. В подгруппе, где опухолевые клетки в дебюте заболевания характеризовались диплоидным набором хромосом, в результате индукционной терапии наблюдалось повышение пролиферативной активности клеток костного мозга (G2 - 1,90 % и S - 16,80 % фазы клеточного цикла). В подгруппе с анеуплоидией (n=11) в 27,0 % случаев развился септический процесс, наступила летальность. У 2 больных, рецидив наступил через 1,5 года, в процессе наблюдения регистрировались частые инфекции, по данным ДНК-цитометрии анеуплоидные клетки оставались в костном мозге и периферической крови. У 6 пациентов отмечалась клиническая картина полной гематологической ремиссии, а по мониторингу ДНК-цитометрии наблюдалось исчезновение анеуплоидного клона и трансформация анеуплоидного типа гистограммы в диплоидный (рис.13).  Рисунок 13 - Пролиферативная активность клеток костного мозга при остром лимфобластном лейкозе из клеток предшественниковС % опоставление данных ДНК-цитометрии клеток периферической крови с показателями до назначения химиотерапии выявило высокий уровень пролиферативной активности с тенденцией к снижению (0-й день - 0,91%, 33-ий день - 0,55%). Изменения иммунологических показателей периферической крови характеризовались повышением Т-лимфоцитов CD3+, высоким уровнем хелперных клеток CD4+, а также естественных киллеров CD16+56+ (рис.14). В ходе терапии повышается и уровень готовности клеток к апоптозу CD95+.  Рисунок 14 - Результаты иммунофенотипирования клеток периферической крови у больных с В-ОЛЛ Проведен корреляционный анализ между показателями иммунофенотипирования и данными ДНК-цитометрии у больных с острым лимфобластным лейкозом из клеток предшественников до начала терапии и в процессе мониторинга. Анализ взаимосвязей выявил различные типы межклеточной кооперации. Было установлено, что в ходе химиотерапии сохранялись основные корреляции между маркерами В-лимфоцитов: CD19+- HLA-DR+ (0,531), CD22+- НLA-DR+ (0,597), CD19+-CD22+ (0,919), CD19+- CD79а+ (0,871). Изменились взаимосвязи между лейкоцитарным маркером и показателями клеточного цикла. Так, до начала химиотерапии определялась связь CD45+ с фазой пролиферации G2, в ходе полихимиотерапии установлена сопряженность с фазой постмитотического отдыха G1, что свидетельствует об угнетении пролиферации лейкоцитарного звена в результате терапии (рис. 15). CD79а+ G1  CD19+      0.910MPO    -0.7780.919 G2+S CD13+  0 CD45+ 0.946 0.535 CD22+ 0.666 cytCD3+  Обратные связиПрямые связи Рисунок 15- Корреляции между показателями иммунофенотипирования и ДНК-цитометрии костного мозга у детей при мониторинге острого лимфобластного лейкоза из клеток предшественников Известно, что ведущую роль в регуляции иммунных реакций играют антигены главного комплекса гистосовместимости (HLA-антигены) и полиморфизм HLA-системы ответственен за вариации иммунного ответа организма. Согласно рабочей гипотезе [Попов Е.А., 2007], гены HLA кодируют не только отдельные нозологические формы гемобластозов, но и характеризуют ту или иную клеточную линию кроветворения, к которой относится опухолевый субстрат лейкоза. Степень ассоциации между заболеванием и HLA-аллелем соответствующего локуса определяется так называемым показателем относительного риска (relative risk, RR). Целью наших исследований было изучение иммуногенетических маркеров острого лимфобластного лейкоза из В-клеток предшественников и риска возникновения анеуплоидного клона. Согласно поставленной цели, мы провели HLA-типирование 37 больных с острым лимфобластным лейкозом (30 человек c диплоидным, 7- с анеуплоидным типом гистограмм). Описательная характеристика спектра выявленных антигенов представлена в табл. 8. Таблица 8 - Частота выявления аллелей, выявленных у больных с острым лейкозом из В-клеток предшественников
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 2
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям