Антигипоксическая активность митофена
|
|
Скачать 387.59 Kb.
|
|
АНТИГИПОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МИТОФЕНА Антигипоксическая активность Митофена изучалась в опытах на мышах, крысах, кроликах и собаках. Использовались следующие модели гипоксии:
Так как Митофен относится к классу полиоксиариленов, изучение его противогипоксической активности проводили в сравнении с убихиноном - естественным ферментом дыхательной цепи митохондрий. ^ а) Гипоксическая гипоксия при разрежении атмосферы (опыты на крысах). Использовалась барокамера с приточно-вытяжной вентиляцией, исключающей накопление СО2. Режим "подъема" животных в барокамере был следующим: первые 5.000 м - за 3 минуты, каждые последующие 1.000 м - за 1 минуту. На высоте 12.000 м производили экспозицию крыс в течение 45 минут. Эффективность препарата определялась по следующим показателям: выживаемость животных (в %), расчетный показатель продолжительности жизни животных "на высоте" и отношение этих показателей опытной и контрольной групп. Полученные данные представлены в таблицах 1 - 4, из которых видно, что оптимальной дозой, защищающей животных при гипоксической гипоксии, является 10 мг/кг. Наибольший эффект был получен при введении препарата за 45 минут до начала опыта. Длительность действия препарата - 4 часа. Из таблицы следует, что по всем регистрируемым параметром Митофен превосходит убихинон. Так, выживаемость животных при введении оптимальной дозы Митофена составила 80%, в то время как при введении убихинона наблюдалась 100% гибель животных, а по показателю продолжительности жизни животных "на высоте" Митофен почти в 2 раза превосходил убихинон. б) Асфиксия кроликов. Использовались курарезированные кролики. Об активности мозга судили по данным ЭКоГ, записанной с помощью стальных игольчатых электродов, вживленных в теменную область черепа. Асфиксию вызывали выключением искусственной вентиляции легких на 3 минуты. Препарат вводили внутривенно в дозе 10 мг/кг за 45 минут до асфиксии. Регистрировали: время от момента выключения дыхания до момента наступления изоэлектрической линии (t до изолинии); время от момента включения дыхания до появления первых биоэлектрических колебаний (t реконвалесценции); время до восстановления исходной ЭЭГ-ой картины (t' реконвалесценции). Результаты исследований представлены в таблице 3. Таблица 1 Зависимость выраженности антигипоксической активности Митофена от дозы
Примечание: * - достоверные различия по сравнению с контролем. Таблица 2 Зависимость выраженности антигипоксической активности Митофена от времени введения
Примечание: * - Достоверные различия по сравнению с контролем. Таблица 3 Длительность антигипоксического действия Митофена
Таблица 4 ^ в оптимальных дозах при гипоксической гипоксии
Как видно из таблицы, при профилактическом введении препарата наблюдался значительный защитный эффект его при асфиксии кроликов. Так, в 30% случаев в опытной группе животных изолинии за время асфиксии не наступало. В остальных случаях препарат способствовал достоверному увеличению времени до наступления изолинии (до 2,5 минут вместо 1,5 минуты в контроле). У опытных животных более благоприятно протекал и восстановительный период. Более чем в 3 раза уменьшилось время появления первых биотоков и в 5 раз время нормализации электрокардиограммы. Таблица 5 Защитная активность Митофена при асфиксии курарезированных кроликов M m
* - достоверные различия по отношению к контролю. в) Пребывание животных в герметически замкнутом пространстве. Опыты проведены на крысах. Животные по одному помещались в герметически закрывающиеся сосуды, емкостью в 1.000 мл. В опыт брали одинаковых по массе животных, которых делили поровну на опытных и контрольных. Опытным животным за 45 минут до помещения их в сосуды внутрибрюшинно вводили исследуемые препараты; контрольным - такой же объем растворителя. Регистрировали длительность жизни животных в замкнутом пространстве. В таблице 6 представлены результаты этих исследований. Видно, что Митофен и при этом виде гипоксии показал выраженный защитный эффект, удлинив среднюю продолжительность жизни животных на 40%. На этой модели гипоксии убихинон показал близкий к Митофену антигипоксический эффект. Таблица 6 ^ при гипоксической гипоксии с гиперкапнией
^ Опыты поставлены на мышах. KCN вводили внутрибрюшинно в дозе 15 мг/кг. Митофен в дозах 15 - 70 мг/кг инъецировался также внутрибрюшинно за 30 - 45 минут до отравления цианидом. Из таблицы 7 видно, что Митофен обладает выраженным защитным эффектом при гистотоксической гипоксии. После предварительного его введения в дозе 70 мг/кг из 45 мышей выжило 18 (при стопроцентной гибели контрольных). Жизнь остальных мышей увеличилась более, чем в два раза (на 110%). И на этой модели гипоксии Митофен оказался активнее убихинона. Таблица 7 Защитный эффект Митофена и убихинона при отравлении мышей KCN
* - достоверные различия по сравнению с контролем. ^ В эксперименте использовались мыши. Митофен и убихинон вводили внутрибрюшинно в оптимальной для каждого вещества дозе. Контрольным животным инъецировался такой же объем растворителя. Спустя 45 минут контрольной и опытной группам животных вводили смертельную дозу (240 мг/кг) нитрита натрия. Регистрировали длительность жизни животных. Результаты опытов представлены в таблице 8, из которой видно, что и Митофен, и убихинон практически в одинаковой степени удлинили жизнь отравленных мышей. Таблица 8 Защитный эффект Митофена и убихинона при отравлении мышей NaNO2
* - достоверные различия по сравнению с контролем. ^ а) Перевязка общих сонных артерий. Опыты проведены на крысах. Операция осуществлялась под легким эфирным наркозом. Препараты вводили за 45 минут до операции. Учитывали гибель животных через 12, 24 и 48 часов после острой одномоментной перевязки артерий. Данные этой серии опытов представлены в таблице 9. Как видно из этой таблицы, наибольшую устойчивость к ишемии мозга показали крысы, которым вводили Митофен. Так, через 12 часов выживаемость этих животных составила 90%, в то время как в группе, получавшей убихинон - 70%, а в контроле - 50%. Через 48 часов после операции разница между группами оказалась еще более заметной. Выживаемость животных, которым вводили Митофен, составила 70% при 90% гибели в контроле. Эффект убихинона к этому времени стал практически недостоверным. Таблица 9 Сравнительная антигипоксическая активность Митофена и убихинона при циркуляторной гипоксии, вызванной перевязкой общих сонных артерий
* - достоверные различия по сравнению с контролем. б) Кровопотеря. У крыс кровопускание производили из общей сонной артерии в объеме 3 мл крови на 100 г массы животного. Препараты вводили за 45 минут до кровопотери. Наблюдения за животными проводили в течение суток. Через 24 часа регистрировали выживаемость крыс. И в этой серии опытов Митофен показал высокую защитную активность. Так, через 6 часов после кровопотери (таблица 10) под влиянием Митофена выжило 70% крыс при полной гибели контрольных животных. Убихинон в этой серии опытов оказался практически неактивным. Таблица 10 Сравнительная защитная активность Митофена и убихинона при циркуляторной гипоксии, вызванной кровопотерей
* - достоверные различия по сравнению с контролем. Геморрагический шок у кроликов вызывали по Уиггерсу. Артериальное давление снижали до 25 - 30 мм рт.ст., с экспозицией 30 минут. По истечении этого срока проводили интенсивную трансфузионную терапию гомокровью и кровезамещающими растворами (с добавлением гепарина). Артериальное давление при этом поднималось до исходных величин. Митофен вводили вместе с трансфузионными жидкостями в дозе 10 мг/кг. Как видно из таблицы 11, применение Митофена с лечебной целью в комплексной трансфузионной терапии повысило выживаемость кроликов после кровопускания до 75% (против 16,6% в контроле). Таблица 11 Эффективность применения Митофена в комплексной трансфузионной терапии после массивной кровопотери у кроликов
* - достоверные различия по сравнению с контролем. Геморрагический шок у собак (3 контрольных и 4 опытных) вызывали путем кровопотери, снижая артериальное давление до 30 мм рт.ст. После этого внутривенно вводили Митофен в дозе 10 мг/кг. Компенсаторный подъем артериального давления снимали дополнительным кровопусканием до 30 мм рт.ст. При такой методике одна собака контрольной группы погибла в течение первого часа (58 минут). Смерть остальных двух животных наступила между первым и вторым часом (1 час 35 минут и 1 час 57 минут). Все животные, получившие Митофен, погибали в значительно более поздние сроки. Смерть одной собаки этой группы наступила через 4 часа 10 минут. Три остальные погибли между шестым и восьмым часом после снятия “компенсации”. Таким образом, Митофен значительно повышает устойчивость разных видов животных (мыши, крысы, кролики, собаки) при различных видах гипоксии (гипоксическая, гистотоксическая, гемическая, циркуляторная). ^ Естественным аналогом Митофена по строению является фермент дыхательной цепи митохондрий убихинон, окислительно-восстановительный потенциал которого при рН 7,0 равен 122 мВ. В этих же условиях редокс-потенциал Митофена оказался равным 310 мВ, то есть по электрон-акцепторной способности он значительно превосходит убихинон. Учитывая это, были проведены исследования по выявлению влияния Митофена на тканевое дыхание и фосфорилирование. С указанной целью поставлены 2 серии опытов: - на изолированных митохондриях печени крыс; - на кроликах с регистрацией скорости тканевого дыхания в тканях мозга. ^ ИЗОЛИРОВАННЫХ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ КРЫС. Митохондрии выделяли общепринятым методом путем центрифугирования в изотоническом растворе сахарозы. Осадок митохондрий разводили из расчета 1 мл Среды выделения из 8 г печени. Состав среды инкубации: (в мМ/л) - сахароза - 220, KСl - 10, KH2PO4 - 5, ТрисHCl - 20, рН среды 7,4. Объем ячейки 1,3 мл. Конечная концентрация добавленных веществ (в мМ/л) - сукцината - 5, пирувата - 10, АДФ -200, ДНФ - 40. Митофен вводили в ячейку с выделенными митохондриями, создавая концентрацию 1:10000. Регистрировали начальную скорость в отсутствии субстрата и акцептора фосфорилирования (V0), скорость дыхания после добавления субстратов (V субст.) и после добавления АДФ и ДНФ. Кроме того, рассчитывали скорость и время фосфорилирования, коэффициенты дыхательного контроля по Чаису-Вильямсу и Ларди-Велиману, а также величину отношения АДФ / О2 . Скорость дыхания выражали в микромолях О2 / мг белка в минуту. Белок определяли по Лоури. Результаты исследования представлены в таблице 12 . Из таблицы видно, что Митофен оказывал непосредственное действие на процессы митохондриального окисления и фосфорилирования. Так, препарат повышает выход энергии на единицу кислорода (по отношению АДФ / О2 ) как при активации НАД-зависимого дыхания (на 71%), так и при использовании в качестве субстрата сукцината (на 51%) Повышение выхода АТФ на единицу кислорода объясняет наблюдаемое снижение скорости дыхания митохондрий (V0, V субст.). В дальнейшем с помощью ингибиторного анализа проведены наблюдения с целью выявить место воздействия Митофена на митохондриальную дыхательную цепь. Митофен способен собирать электроны с НАДН-дегидрогеназы и сукцинатдегидрогеназы, минуя ротеноновый и малонатовый блоки. При этом дыхание восстанавливается практически до исходных цифр. Также отчетливо Митофен восстанавливает дыхание, заингибированное антимицином А. Но восстановленное после ингибирования ротеноном и антимицином А, дыхание полностью ингибируется цианидом калия. Проведенный анализ позволяет прийти к следующему заключению: Митофен обладает отчетливым непосредственным действием на дыхательную цепь митохондрий. По сравнению с убихиноном точка приложения действия Митофена в дыхательной цепи находится ближе к терминальному ее концу - между цитохромом С1 и цитохромом а3. Митофен повышает выход энергии на единицу кислорода. Таблица 12 ^
* - достоверные различия по сравнению с контролем. ^ Опыты поставлены на кроликах. Геморрагический шок вызывали по Уигерсу. За интенсивностью тканевого дыхания мозга следили при помощи микроспектрофлюориметра. О скорости тканевого дыхания судили по отношению окисленной формы ФП к восстановленной форме НАДН2. Результаты этих исследований представлены в таблице 13. Таблица 13 Влияние Митофена на интенсивность тканевого дыхания мозга кроликов (M m)
* - достоверные различия по сравнению с контролем. Как видно из таблицы, 30-минутный геморрагический шок на длительное время нарушал тканевое дыхание в мозгу кроликов. Через 60 минут после начала трансфузионной терапии в контрольной группе оно было в 2 раза ниже исходного уровня. В опытной серии кроликов к этому времени интенсивность тканевого дыхания нормализовалась полностью. На основании этих опытов можно заключить, что Митофен в значительной степени стимулирует тканевое дыхание в раннем восстановительном периоде после кровопотери, путем окисления НАДН2 и ФП. ^ Исследования проведены на крысах. Использовался аппарат С.В.Миропольского. Опыты проводили на не накормленных животных. Размеры сосудов, в которых помещались крысы, ограничивали возможность их передвижения. Это позволяло регистрировать практически только основной обмен. Определяли исходное потребление кислорода, а затем животным контрольной группы вводили растворитель, а опытной - Митофен. Измерения проводили в течение 10 минут при комнатной температуре (18 - 20°С). На дно сосудов помещали химический поглотитель углекислоты и паров воздуха (20% раствор КОН). Величину потребления кислорода на 100 г массы животного находили по формуле V • 100 _____________________ О2 мл, масса животного (в г) где V - объем потребленного кислорода по показаниям аппарата. Результаты этих опытов представлены в таблице 14. Таблица 14 Влияние Митофена (10 мг/кг) на потребление кислорода крысами в условиях нормоксии (M m)
* - достоверные различия по сравнению с исходными данными. Видно, что Митофен, введенный за 30 минут до определения, почти в 3 раза понижал потребление кислорода крысами. Наиболее выраженное понижение потребления кислорода Митофен вызывал через 30 минут после введения. Наблюдаемое в этих опытах снижение потребления кислорода целым рядом животных согласуется с результатами исследований на изолированных митохондриях и может быть объяснено повышением эффективности тканевого дыхания. Во второй серии этих экспериментов изучали восстановление потребления кислорода после пребывания крыс “на высоте” (1100 м - 30 минут). Препарат вводили в дозе 10 мг/кг за 45 минут до “подъема”. Определение потребления кислорода проводили до и начиная с пятой минуты после пребывания крыс “на высоте”. У контрольных животных (таблица 15) потребление кислорода после гипоксии на протяжении 120 минут оставалось на низких цифрах, что свидетельствует о нарушении дыхательной функции митохондрий. У защищенных Митофеном животных не наблюдалось постгипоксического понижения потребления кислорода. Отмечено даже некоторое его повышение. Отсутствие снижения потребления кислорода у опытных крыс можно рассматривать как результат лучшей сохранности под влиянием Митофена структуры и функций митохондрий в условиях кислородного голодания. Таблица 15 Влияние Митофена на потребление кислорода крысами в раннем посгипоксическом периоде (M m)
* - достоверные различия по сравнению с контролем. ^ Определение напряжения кислорода (рО2) в тканях мозга проводили в двух сериях опытов на кроликах: - при асфиксии курарезированных животных; - при геморрагическом шоке. В опытах с асфиксией кроликов Митофен вводился в дозе 10 мг/кг за 45 минут до выключения искусственного дыхания. Регистрация напряжения кислорода осуществлялась с помощью платинового электрода (10 мкм) в стеклянной изоляции. Одновременно у этих же животных следили за ЭКоГ. Таблица 16 Влияние Митофена на напряжение кислорода в мозгу курарезированных кроликов при асфиксии (M m)
* - достоверные различия по сравнению с контролем. Как видно из таблицы 16, напряжение кислорода в момент наступления изолинии на ЭКоГ у контрольных и опытных животных было одинаковым и составляло 16% от исходного уровня. В случаях, когда изолинии на ЭКоГ не наблюдалось (в опытной группе), рО2 снижалось до таких же цифр. Первые биотоки у контрольных животных появлялись, когда рО2 составляло 68%, а у опытных - 28% от исходного уровня. К 45 минуте восстановительного периода напряжение кислорода у контрольных животных поднялось до 204,7%, а у опытных - до 104%. В опытах на кроликах, у которых вызывали геморрагический шок, рО2 в мозгу регистрировали на протяжении двух часов после массивной кровопотери. У контрольных животных (таблица 17) к 30 минуте восстановительного периода рО2 в мозгу составило 255% от исходного уровня, к 45 минуте - 245%, и к концу второго часа - 216%. Включение Митофена в кровезамещающие жидкости значительно замедлило подъем уровня напряжения кислорода и к концу второго часа оно достигало только 90%. Резкое повышение рО2 в восстановительном периоде в мозгу контрольных животных, очевидно, свидетельствует о потере за время гипоксии способности дыхательной цепи усваивать кислород. Введенный же кроликам Митофен создает условия для более полного использования кислорода. Таблица 17 Влияние Митофена на напряжение кислорода в мозгу кроликов при кровопотере и в раннем восстановительном периоде (M m)
* - достоверные различия по сравнению с контролем. ^ Об интенсивности окислительных процессов и сопряженности их с фосфорилированием в организме можно судить не только по степени потребления кислорода, но отчасти и по температуре тела. Ректальную температуру у крыс измеряли с помощью электротермометра. Под влиянием препарата Митофен (10 мг/кг) через 30 минут после введения температура тела крыс снизилась в среднем на 4,0 С (таблица 18). Из этой же таблицы видно, что пребывание животных “на высоте” понижает температуру тела у контрольных животных на 2,9 С. У защищенных же Митофеном крыс температура тела практически не снизилась, что, очевидно, свидетельствует о продолжающемся переносе электронов по дыхательной цепи митохондрий, несмотря на резкий дефицит конечного акцептора электронов - кислорода. Таблица 18 Влияние Митофена на температуру крыс (M m)
* - достоверные различия по сравнению с исходными данными. ** - достоверные различия по сравнению с контролем. ^ Исследования проведены на кроликах, у которых вызывали геморрагический шок по Уиггерсу. Изучали влияние Митофена на содержание в крови глюкозы, молочной и пировиноградной кислот при кровопотере и в раннем восстановительном периоде. Кровь забирали из бедренной артерии и сагитального синуса. Для определения глюкозы использовали ортотолуидиновый метод, молочную кислоту определяли колориметрическим методом Barker, Summersson в модификации Stöm, пировиноградную кислоту - методом Фридмана-Хаугена. Избыточный лактат вычисляли по формуле Нискавее, отношение НАД / НАДН2 по Chance. В таблице 19 представлены данные опытов по изучению влияния Митофена на скорость потребления глюкозы тканью мозга. Таблица 19 Влияние Митофена на потребление глюкозы мозгом кролика в условиях кровопотери и в раннем восстановительном периоде
* - достоверные различия по сравнению с исходными данными. ** - достоверные различия по сравнению с контролем. Как видно из таблицы, в ответ на кровопотерю потребление глюкозы упало в 1,5 - 1,6 раза. После массивной трансфузии потребление глюкозы контрольными животными к 30 минуте продолжало снижаться. В последующем наблюдалось незначительное его повышение. Включение Митофена в кровезамещающие жидкости изменяло описанную динамику. Уже в раннем восстановительном периоде после кровопотери значительно повышалось потребление глюкозы. Это наблюдение можно рассматривать как свидетельство стимуляции гликолитических реакций под влиянием препарата. Концентрация молочной и пировиноградной кислот в крови животных, получавших Митофен, была значительно ниже, чем у контрольных кроликов (таблица 20), что, возможно, является следствием утилизации этих продуктов. Известно, что избыток молочной кислоты и снижение отношения НАД/НАДН2 являются чувствительными тестами, указывающими на активацию анаэробного гликолиза. При расчете этих показателей в наших опытах отмечено (таблица 20), что избыток лактата к исходу первого часа после ликвидации дефицита объема циркулирующей крови, возникшего вследствие кровопотери, у животных, получавших Митофен, был в 2 раза ниже, чем у контрольных. У опытных животных к этому времени нормализуется и отношение НАД/НАДН2, в то время как у контрольных кроликов оно составляло еще 75% от нормы (таблица 20). Анализ этих данных и сопоставление их с результатами других опытов (по изучению тканевого дыхания, потребления кислорода животными, напряжения кислорода в тканях, изменения температуры тела) позволяет прийти к заключению, что под влиянием Митофена стимулируется аэробное окисление глюкозы. 
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям