Учебное пособие. Нижний Новгород: Издательство ннгу им. Н. И. Лобачевского, 2004. 212 с. Isbn 5-85746-804-3
|
|
Скачать 1.35 Mb.
|
|
^ Аминокислотная последовательность V-доменов иммуноглобулинов разных клонов различна (вариабельна) не на всем протяжении. Многие аминокислоты консервативны. В первую очередь это аминокислоты, необходимые для поддержания общего строения (каркаса) V-домена. Участки аминокислотной последовательности, расположенные между вариабельными регионами, называют каркасными регионами (FR) (рис 6). Каркасные регионы образуют β-складчатую структуру, формирующую цилиндрическую форму V-доменов. Гипервариабельные регионы (CDR) образуют между каркасными регионами петли, локализованные на вершине V-доменов. В структуре цельной молекулы иммуноглобулина VH- и VL-домены объединены. Их гипервариабельные регионы примыкают друг к другу и создают единый гипервариабельный участок на вершине Fab-фрагментов в виде кармана. Такой участок является антигенсвязывающим центром молекулы антитела. Антигенсвязывающий центр определяет специфичность антитела, образуя поверхность, комплементарную эпитопу антигена (антигенной детерминанте). Рис. 6. Схема строения активного центра антитела. FR — каркасные регионы, CDR — гипервариабельные регионы Антитела связывают антиген нековалентно. Площадь контакта антигена и антитела оценивается в 700 А2. Силы, принимающие участие во взаимодействии антиген-антитело: — электростатические взаимодействия, возникают между заряженными боковыми группировками аминокислот в виде солевых мостиков; — водородные связи, возникают между электрическими диполями; — силы Ван дер Вальса, формируются вследствие флуктуации электронных облаков вокруг противоположно поляризованных соседних атомов; — гидрофобные взаимодействия, происходят в тех случаях, когда две гидрофобные поверхности стремятся сблизиться, вытесняя воду. ^ Иммунный ответ на каждый отдельный антиген включает продукцию множества молекул антител, синтезируемых разными плазматическими клетками и имеющих разное строение активного центра и изотип. Вследствие различий в строении активных центров образующиеся антитела имеют разную специфичность и разный аффинитет. Один клон плазматических клеток, являющихся потомством В-лимфоцитов, продуцирует антитела одной специфичности. То есть работает закономерность один клон — один тип антител. Специфичность — направленность против конкретного эпитопа какого-либо антигена. Аффинитет (аффинность) — прочность связи одного антигенсвязывающего центра с индивидуальным эпитопом антигена. Обусловлен степенью пространственного соответствия (пространственной комплементарности) активного центра антитела и антигенного эпитопа. Мерой аффинитета служит константа равновесия реакции их взаимодействия. Авидность антител — суммарная сила взаимодействия антитела с антигеном. Антитела содержат от двух до десяти антигенсвязывающих центров. Поливалентность антител существенно усиливает прочность их соединения с антигеном, поскольку для диссоциации образующихся комплексов необходим разрыв сразу всех связей. Применительно к физиологическим условиям более адекватно рассматривать авидность, а не аффинность антител. Полный набор возможных антител называют антительным репертуаром. По разным оценкам, он включает от 1011 до 1016 молекул антител разного строения. В отдельных случаях одни антитела могут распознавать вариабельные участки других антител, составляющие их активные центры. Поскольку нет двух В-клеточных клонов, продуцирующих антитела одной и той же специфичности, то разные вариабельные участки активных центров являются, по существу, маркерами разных клонов В-лимфоцитов. Такие участки называют идиотипами (idios (греч.) — собственный, частный). Идиотип — вариант уникального антигенсвязывающего участка молекулы иммуноглобулина. В организме могут нарабатываться антитела против собственных идиотипов, поскольку каждый новый идиотип является антигеном, с которым иммунная система никогда ранее не встречалась. Антиидиотипические антитела, с одной стороны, взаимодействуют с идиотипом, с другой стороны, сами являются новым антигеном для иммунной системы и могут вызывать иммунный ответ на собственный активный центр. Это приводит к возможному появлению антител уже к их идиотипу. Таким образом, формируется антиидиотипическая сеть, несущая иммунорегуляторные функции. В настоящее время этот эффект используется в практической иммунобиотехнологии и лечении некоторых заболеваний. За создание теории антиидиотипической сети Н. Йерне в 1984 году был удостоен Нобелевской премии. ^ 1. Нейтрализация вирусов. — Связываются с вирусами, предотвращая их проникновение в клетку и последующую репликацию. — Вызывают агрегацию вирусов с последующим поглощением фагоцитирующими клетками. — Взаимодействуют с клеточными рецепторами вирусов, ингибируя связывание вирусов с клеточной поверхностью. — Блокируют межклеточное проникновение вирусов. — Обладают ферментативными свойствами. Антитела особенно эффективны в тех случаях, когда вирусу для достижения клеток-мишеней необходимо пройти через кровоток. Тогда эффективными могут быть даже относительно низкие концентрации антител в крови. Поэтому наиболее очевидный защитный эффект антител наблюдается при инфекциях с длительным инкубационным периодом, когда вирус, прежде чем достичь клеток-мишеней, должен пройти через кровоток, где может быть нейтрализован даже очень небольшим количеством специфических антител. 2. Нейтрализация токсинов. Циркулирующие в крови продукты бактериального происхождения и другие экзотоксины (например, фосфолипаза пчелиного яда) связываются направленными против них антителами. Антитело, присоединившись вблизи активного центра токсина, может блокировать его взаимодействие с субстратом. Даже связываясь с токсином на некотором расстоянии от его активного центра, антитела могут подавить токсичность в результате аллостерических конформационных изменений. В комплексе с антителами токсин теряет способность к диффузии в тканях и может стать объектом фагоцитоза. 3. Опсонизация бактерий. Опсонизация — связывание антител с антигенами поверхности бактерий. В результате опсонизации бактерии становятся объектом интенсивного поглощения фагоцитирующими клетками. Действие антител усиливается белками системы комплемента, которые также связываются с бактериальной поверхностью. (Белки системы комплемента могут и самостоятельно опсонизировать бактерии.) На фагоцитирующих клетках имеются рецепторы для Fc-участков иммуноглобулинов и рецепторы для белков комплемента. 4. Активация системы комплемента. Связываясь с поверхностью клеток, антитела классов IgM и IgG приобретают способность инициировать классический путь активации комплемента. Активация приводит к отложению белков системы комплемента на поверхности бактериальных клеток, образованию пор в мембране и гибели клеток с последующим привлечением к месту событий фагоцитов и поглощением клеток фагоцитами. 5. Антителозависимая клеточная цитотоксичность. Антитела, связавшиеся с чужеродными антигенами на поверхности клеток, приобретают способность взаимодействовать с Fc-рецепторами на мембране цитотоксических клеток (естественные киллеры, цитотоксические Т-лимфоциты). Примерами мембранных чужеродных антигенов могут служить вирусные белки, появляющиеся на поверхности вирусинфицированных клеток. В результате взаимодействия антигена с антителом и Fc-рецептором образуется мостик, сближающий клетку-мишень и цитотоксическую клетку. После сближения цитотоксическая клетка убивает клетку-мишень. 6. Защита от паразитов. Существуют паразиты, слишком крупные, чтобы их можно было уничтожить путем фагоцитоза, например гельминты. Выделяемые паразитом антигены могут взаимодействовать с IgE, связанными через соответствующий рецептор с тучными клетками. В результате такого взаимодействия тучные клетки выбрасывают медиаторы, привлекающие эозинофилы. Последние уничтожают или нейтрализуют гельминтов путем выброса во внеклеточное пространство специфических эффекторных молекул. 7. Иммунорегуляторная функция. Антиидиотипические антитела взаимодействуют с активными центрами других антител (идиотипами) и осуществляют регуляцию гуморального иммунного ответа, подавляя их активность. 8. Проникновение через плаценту. В эмбриональный период и первые несколько месяцев жизни, когда собственная иммунная система ребенка еще недостаточно развита, защиту от инфекций обеспечивают материнские антитела, проникающие через плаценту или поступающие с молозивом и всасывающиеся в кишечнике. Через плаценту в кровь плода поступают антитела класса IgG. Основные классы иммуноглобулинов грудного молока — это IgG и секреторный IgA. Они не всасываются в кишечнике, а остаются в нем, защищая слизистые оболочки. Эти антитела направлены к бактериальным и вирусным антигенам, часто попадающим в кишечник. ^ , как правило, поликлональна, поскольку содержит антитела, продуцируемые разными клонами плазматических клеток. Антисыворотку обычно получают путем иммунизации организма каким-либо антигеном. Поликлональная антисыворотка может быть моноспецифической, то есть содержащей антитела к разным эпитопам одного и того же антигена. Например, выпускают поликлональные моноспецифические антисыворотки против тяжелых цепей иммуноглобулинов М, G, А человека. Каждая такая антисыворотка содержит поликлональные антитела, направленные к различным эпитопам какой-либо цепи иммуноглобулинов. ^ продуцируются одним клоном плазмоцитов. Разработан метод получения больших количеств моноклональных антител с помощью, так называемой гибридомной технологии, являющейся одной из составляющих клеточной инженерии (рис. 7). Рис. 7. Основные этапы получения моноклональных антител (МКА) Гибридомы являются бессмертными клеточными клонами, продуцирующими антитела одной специфичности. Гибридомы получают путем слияния нормальных плазматических клеток, продуцирующих антитела, с опухолевыми В-лимфоцитами. Затем гибридомы отбирают в культуральной среде, не способной поддерживать рост родительских клеток. С помощью последовательных разведений и пересевов получают одиночные гибридные клетки и их клоны, способные неограниченно долго размножаться в условиях in vitro и продуцировать антитела. Клеточные линии, полученные из таких клеток, называют гибридомами. Используя различные методы культивирования гибридом, нарабатывают большие количества моноклональных антител. Моноклональные антитела идентичны по своему строению, то есть относятся к одному и тому же классу, изотипу, аллотипу, имеют одинаковые активные центры, обладают одной и той же специфичностью, взаимодействуют с одним и тем же эпитопом антигена с одинаковой аффинностью. Моноклональные антитела могут нарабатываться в неограниченных количествах и используются в качестве стандартных реагентов в иммунодиагностике, а также в качестве терапевтических антител. За создание гибридомной технологии Келер и Мильштейн в 1984 году получили Нобелевскую премию. ^ Существует два типа перекрестной реактивности антител. — Антитела, направленные против какого-либо антигена одного вида животных, могут реагировать с антигенами другого вида. Причиной такой перекрестной реактивности является консервативность гомологичных биологических структур, например, белков, сохраняющих свою аминокислотную последовательность неизменной в процессе эволюции. Так, известен высоко консервативный белок, называемый Thy-1 антигеном и характерный для клеток тимуса позвоночных. Моноклональные антитела, взаимодействующие с Thy-1 антигеном человека, реагируют с Thy-1 антигеном земноводных и пресмыкающихся. — Антитела, взаимодействующие со стереохимически сходными эпитопами, имеющими разную природу. Так, стрептококки несут антигены, конформационно сходные с антигенами сердечных клапанов. В результате, у лиц, перенесших стрептококковую ангину, может развиться ревматизм сердца вследствие наработки в организме перекрестно реагирующих антител к собственным антигенам. Такие антитела называют также аутоантителами, то есть антителами, направленными против собственных антигенов. В здоровом организме аутоантитела обычно присутствуют в следовых количествах. Наличие эффекта перекрестного реагирования создает определенные трудности в оценке диагностической специфичности. ^ . Полиморфизм проявляется в наличии разных изотопов, аллотипов иммуноглобулинов, а также в разнообразии активных центров антител (идиотипов), определяющих их специфичность по отношению к антигенным детерминантам. Позвоночные в течение жизни способны создавать огромное количество вариантов антител, направленных против разных антигенов. Потенциальное разнообразие антител характеризуется цифрой, равной примерно 1016. Геном позвоночных состоит из нескольких десятков тысяч генов. Так, в составе генома человека присутствует всего 23,5 тысячи генов. Если исходить из основной догмы молекулярной биологии «один ген — один белок», то этого количества генов совершенно недостаточно для того, чтобы обеспечить синтез колоссального числа различных иммуноглобулинов. Однако природа нашла поразительный выход из положения, использовав прием, который характерен только для лимфоцитов. Во всех клетках, кроме созревающих В-лимфоцитов, кодирующая легкие и тяжелые цепи ДНК находится в так называемой «зародышевой конфигурации». Такую конфигурацию называют также генами зародышевой линии, или гаметными генами. Тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов кодируются набором кодирующих нуклеотидных последовательностей, названных генными сегментами и разделенных друг от друга некодирующими участками ДНК. Генные сегменты являются предшественниками функционально активных генов и представляют собой экзоны, перемежающие с интронами. В ходе В-клеточного созревания эти генные сегменты перестраиваются и особым образом соединяются вместе, давая функционально активные гены цепей иммуноглобулинов. У человека и мыши существует три группы генных сегментов, обеспечивающих синтез всего многообразия тяжелых цепей иммуноглобулинов: V (variable — вариабельный), D (diversity — обеспечивающий разнообразие) и J (joining — соединительный). 14-я хромосома человека содержит 51 VH-сегмент, 27 DH-сегментов и 6 JH-сегментов. Сегменты расположены последовательно группами от 5' к 3' концу. V-сегмент кодирует 95-96 аминокислотных остатков, D и J сегменты — 12-14 аминокислотных остатков. К 3'-концу примыкает серия C-генных сегментов, кодирующих константные домены (рис. 8). Аналогичным образом выглядит зародышевая конфигурация ДНК, кодирующей легкие цепи. Так, ДНК, кодирующая каппа-цепи иммуноглобулина человека, состоит из примерно 40 Vκ-сегментов, пяти Jκ сегментов и одного C-генного сегмента. D-сегменты в ДНК, кодирующей легкие цепи, отсутствуют. Зародышевая конфигурация ДНК обеспечивает колоссальное разнообразие активных центров иммуноглобулинов благодаря тому, что в созревающих В-лимфоцитах генные сегменты подвергаются перестройке. В ходе такой перестройки случайным образом объединяется по одному V, D и J сегменту (V и J сегменты для легких цепей). Каждый В-лимфоцит получает собственный набор объединенных сегментов. Природа в данном случае играет в биологический конструктор, добиваясь поразительных результатов. Весь путь созревания В-лимфоцита от незрелой клетки-предшественницы до антителосекретирующей плазматической клетки можно разделить на несколько этапов. 1. ^ — перестройка (реаранжировка) генных сегментов, кодирующих вариабельные домены цепей иммуноглобулинов. Это первый этап на пути к синтезу антител и ключевой момент формирования функциональных вариабельных областей легких и тяжелых цепей. Соматическая рекомбинация идет на ранних этапах созревания В-лимфоцитов в костном мозге с участием специализированных ферментов. В результате соматической рекомбинации объединяются генные сегменты, кодирующие вариабельные домены цепей иммуноглобулинов. Объединенные экзоны, кодирующие V-домен, остаются при этом разделены интроном с генными сегментами, кодирующими константные домены. Соматической рекомбинации в ходе созревания В-лимфоцитов сначала подвергаются генные сегменты тяжелой цепи, затем - генные сегменты легких цепей. Наличие множества генных сегментов, кодирующих вариабельные домены иммуноглобулинов, и их реаранжировка являются основной причиной полиморфизма активных центров антител. Дополнительным источником разнообразия формирующихся активных центров являются включение вставок между сегментами (так называемые P и N-вставки), вариации в соединении сегментов, приводящие к потере или появлению новых нуклеотидов и, соответственно, к сдвигу рамки считывания, комбинации V-доменов легких и тяжелых цепей при сборке полной молекулы иммуноглобулина и, наконец, соматические гипермутации, происходящие позднее в более зрелых В-клетках. В перестроенных генах гипервариабельные участки V-доменов иммуноглобулинов кодируются последовательностями, находящимися на границе между сегментами. Гипервариабельность этих участков связана с тем, что дополнительные механизмы формирования разнообразия затрагивают именно эти районы нуклеотидной последовательности. Перестройка генов легких и тяжелых цепей происходит только в одной из двух гомологичных хромосом. Это обеспечивает аллельное исключение в отношении продуцируемых клеткой антител. В итоге одна В-клетка и ее потомство способны продуцировать только иммуноглобулины, имеющие идентичные активные центры. Не каждая рекомбинация является продуктивной. Подсчитано, что в результате только одной из трех рекомбинаций формируется функционально активный ген. Если перестройка сегментов ДНК одной хромосомы является непродуктивной, то возможность перестроить генные сегменты получает вторая хромосома. Неудачные попытки перестройки генов приводят к смерти в костном мозге 90% созревающих клеток. Смерть происходит путем апоптоза. Существование отдельных генных сегментов, кодирующих V и С регионы иммуноглобулинов, и реаранжировку генов в процессе созревания В-клеток обнаружили в 1976 году Тонегава и Хозуми. За открытие механизмов формирования разнообразия антител Тонегава в 1987 году получил Нобелевскую премию. 2. ^ . Перестроенный ген тяжелой цепи в созревающем В-лимфоците (про-B клетка) содержит объединенные V, D, J сегменты, соединенные на 3'-конце с генными сегментами, кодирующими константные домены иммуноглобулинов разных изотипов. Последовательность расположения таких сегментов от 3' к 5' концу ДНК выглядит следующим образом: μ, δ, γ1-4, ε, α. Самым близким набором генных сегментов являются сегменты, кодирующие константные домены мю-цепи. ^ содержит нуклеотидные последовательности, включающие некодирующие интроны и генные сегменты, кодирующие домены иммуноглобулинов. Первичный транскрипт процессируется с удалением всех участков нуклеотидной последовательности кроме тех, которые кодируют вариабельный и константные домены мю-цепи. Образовавшаяся матричная РНК транспортируется из ядра в цитоплазму, где происходит синтез мю-цепей на полирибосомах шероховатого эндоплазматического ретикулюма. Мю-цепи после синтеза заякореваются на мембране эндоплазматического ретикулюма и объединяются с суррогатным полипептидом, заменяющим им легкую цепь. Затем происходит перестройка гена легкой цепи. На этой стадии В-лимфоцит представляет собой пре-B клетку. Как тяжелые, так и легкие цепи подвергаются гликозилированию сначала в цистернах эндоплазматического ретикулюма, а затем в аппарате Гольджи, где одновременно происходит сортировка белков и перенос через систему везикул на поверхностную мембрану. Синтез легкой цепи приводит к появлению на мембране лимфоцита полноценного мембранного IgM и к переходу В-лимфоцита в стадию незрелой B-клетки. Созревание в зрелую наивную B-клетку сопровождается одновременным появлением на клетке мембранного IgM и IgD. Они имеют один и тот же активный центр, но разные константные домены, образующиеся за счет альтернативного сплайсинга матричной РНК. Обе формы мембранного иммуноглобулина входят в состав В-клеточных рецепторов. В-лимфоцит, экспрессирующий (несущий на мембране) B-клеточный рецептор, выходит из костного мозга и приобретает способность активироваться при встрече с антигеном, взаимодействующим с активным центром иммуноглобулина. 3. ^ . Зрелые наивные В-клетки мигрируют в лимфоузлы и другие лимфоидные органы, где в результате встречи с антигеном происходит их активация. Активация приводит к трем дополнительным событиям, затрагивающим перестроенные гены иммуноглобулинов и характер их экспрессии: — ^ . Путем альтернативного сплайсинга матричной РНК генные сегменты, кодирующие мю-цепи и дельта-цепи, удаляются. На их место перемещаются сегменты, кодирующие константные домены тяжелых цепей других изотипов. В результате взамен иммуноглобулинов классов М и D В-клетки начинают синтезировать иммуноглобулины класса G, А или Е. Такие иммуноглобулины имеют тот же активный центр (вариабельный домен), но принадлежат к другому изотипу. Каждый В-лимфоцит в этом случае синтезирует иммуноглобулины только одного изотипа. Переключение изотипов регулируется цитокинами. — ^ . Активация В-лимфоцитов приводит к их превращению в плазматические клетки — конечный этап дифференцировки В-клеток. Плазматические клетки теряют способность продуцировать мембранную форму иммуноглобулинов, но начинают синтез растворимых иммуноглобулинов. На 3'-конце каждой группы генных сегментов, кодирующих константные домены тяжелых цепей разных изотипов, имеются дополнительные кодирующие последовательности, определяющие принадлежность синтезируемого белкового продукта к растворимой или мембранной форме. Если в результате альтернативного сплайсинга матричной РНК к сегменту, кодирующему последний константный домен, присоединяется дополнительный экзон, определяющий присоединение к С-концу белковой цепи группы гидрофильных аминокислот (S), то образуется растворимый иммуноглобулин. Если в этом участке остается экзон, кодирующий последовательность, состоящую из гидрофобных аминокислот (М), то образуется мембранная форма (рис. 9). Таким образом, антитела можно рассматривать как растворимую форму мембранных иммуноглобулинов. — ^ . Затрагивают только гипервариабельные участки, кодирующие V-домены. Происходят в зародышевых (терминальных) центрах лимфоузлов, где концентрируются активированные В-клетки. Скорость соматических гипермутаций составляет 10-3 на одну пару нуклеотидов за одно клеточное деление. Нормальная скорость мутаций составляет 10-8-10-9 на пару нуклеотидов за одно клеточное деление. То есть скорость мутаций вариабельных участков в генах легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов на несколько порядков превышает нормальный темп мутаций. Одна мутация возникает в среднем за два клеточных деления. Клетки делятся каждые 6 часов. Механизм соматических гипермутаций остается неизвестным. Соматические гипермутации лежат в основе феномена аффинного созревания антител. В зародышевых центрах лимфоузлов происходит отбор и размножение В-лимфоцитов, продуцирующих иммуноглобулины с повышенной аффинностью, возникающей вследствие активного мутационного процесса. ^ Многие иммунологические методы построены на взаимодействии антиген-антитело. С помощью таких методов можно выявлять как антитела, так и антигены. Определение может быть качественным и количественным. Эта группа методов не требует большого количества материала для анализа (микроанализ). Объем анализируемого материала в наиболее совершенных методах составляет 0,1 мл, а чувствительность достигает десятых долей нанограмма на миллилитр. 3.1. Иммунопреципитация Метод основан на поливалентности антител. За счет наличия нескольких активных центров в составе иммуноглобулинов они могут взаимодействовать с одинаковыми эпитопами на нескольких антигенах. В результате образуются видимые глазом и выпадающие в осадок агрегаты (преципитат). Если антиген содержит несколько эпитопов, то с ним связывается несколько антител, что увеличивает массу агрегата. Различают иммунопреципитацию в растворе и преципитацию в геле. ^ является первым из разработанных методов иммунологического анализа и наименее чувствительным (рис. 10). Существует количественный вариант иммунопреципитации в растворе, основанный на измерении мутности раствора с помощью нефелометрии. ^ позволяет определять антитела и антигены с более высокой чувствительностью, которая, однако, недостаточно высока по сравнению с современными методами иммунологического анализа. В качестве геля обычно используют тонкий слой агар-агара или агарозы. Антигены и антитела, нанесенные в лунки на некотором расстоянии друг от друга, диффундируют в толще геля. В месте их встречи образуется видимая глазом полоса (рис. 11). Таким способом можно определить наличие или отсутствие в пробе антигена или антител. В первом случае в одну из лунок наносят антитела, направленные против искомого антигена. Во вторую — тестируемую пробу. Если образуется полоса преципитата, то в тестируемом образце имеется искомый антиген. При определении антител используют раствор антигена, к которому должны быть направлены искомые антитела. Метод может быть использован для определения веществ, находящихся в концентрации от 10 мкг/мл и выше. Ранее иммунопреципитация широко применялась в лабораторной практике, однако в настоящее время не используется в связи с относительно низкой чувствительностью. Для методов, основанных на преципитации, важной является соотносительная концентрация взаимодействующих компонентов. Если концентрация одного из компонентов реакции намного превышает концентрацию второго, то преципитат может не выпадать вследствие быстрого истощения одного из компонентов и невозможности образования полноценного преципитата. Иммунопреципитация в геле может быть полуколичественным и количественным методом. В первом случае используют последовательные разведения тестируемых антител или антигенов. Последнее разведение, в котором антитела или антигены способны давать положительную реакцию, называют титром. При использовании разных иммунологических методов титры могут меняться. Это зависит от чувствительности метода, то есть минимальной концентрации, в которой выявляются тестируемый антиген или антитела. Существует несколько усовершенствованных модификаций иммунопреципитации в геле: ^ В этом случае подготавливается плоский гель, в котором один из компонентов системы антиген-антитело размещен равномерно по всей толще геля. Второй компонент, тестируемый в системе антиген-антитело, помещают в лунку в центре плоского геля. Последующая диффузия тестируемого компонента приводит к образованию кольца преципитации вокруг центральной лунки. Чем выше концентрация тестируемого компонента, тем больше диаметр образующегося кольца. При использовании соответствующих калибровочных образцов, то есть набора проб с известной концентрацией, может быть проведено количественное определение компонента, наносимого в центральную лунку (рис. 12). Иммуноэлектрофорез. Метод является качественным. С его помощью можно одновременно в одной пробе определить наличие множества антигенов, выявляемых антителами. Проводят электрофорез тестируемого образца в агарозном геле, затем по сторонам геля параллельно направлению миграции антигенов делают длинные лунки (траншеи), в которые заливают антисыворотку, содержащую антитела к тестируемым антигенам. При наличии в тестируемом образце искомых антигенов образуются дуги преципитации в тех зонах, куда мигрировали при электрофорезе антигены. Этим же методом можно определить наличие антител к конкретному антигену, находящемуся в смеси с другими антигенами (рис. 13). Агглютинация (от лат. agglutinatio — склеивание). В основе метода лежит формирование видимых невооруженным глазом конгломератов клеток или частиц при образовании между ними молекулярных мостиков. В качестве мостиков могут выступать антитела и антигены. В основе феномена агглютинации лежит поливалентность антител, дающая возможность одному антителу связаться с несколькими клетками или частицами одновременно. Агглютинация может происходить между бактериальными клетками, между клетками крови, в частности эритроцитами, между латексными частицами. Бактериальные клетки несут поверхностные антигены. При добавлении к бактериальным клеткам антител против таких антигенов будет происходить их агглютинация. Определение групп крови с помощью соответствующих антисывороток также основано на феномене агглютинации. В этом случае образование конгломератов клеток с последующим их осаждением происходит в том случае, когда эритроциты несут на своей поверхности антигены (изоагглютинины), взаимодействующие с добавляемой к ним антисывороткой. При агглютинации эритроцитов метод называют гемагглютинацией (рис. 14). Эритроциты и соответствующие им по размерам латексные частицы могут быть химически сшиты с каким-либо антигеном или антителом. Добавление к ним второго компонента системы «антиген-антитело» будет приводить к агглютинации, сопровождающейся быстрым выпадением в осадок больших конгломератов клеток. Метод гемагглютинации и латексной агглютинации широко используется для качественного и количественного определения различных антигенов и антител. Разработано множество модификаций метода. Он более чувствителен, чем иммунопреципитация, и позволяет выявлять антигены в концентрации, равной 10-100 нг/мл и выше. Однако в настоящее время разработаны более чувствительные методы, которым отдается предпочтение. ^ Метод основан на применении в качестве метки флуоресцирующих соединений. Метку химически пришивают к антителу или антигену. Это позволяет регистрировать реакцию антиген-антитело с помощью соответствующих приборов и увеличивает чувствительность анализа. Чаще всего с помощью иммунофлюоресценции определяют антигены на поверхности клеток. С этой целью тестируемые бактериальные или эукариотические клетки обрабатывают антителами, мечеными флуоресцентной меткой, а затем оценивают реакцию с помощью люминесцентного микроскопа (рис. 15). Иммунофлуоресцентный метод широко используется для иммунофенотипирования клеток иммунной системы, то есть для определения набора антигенов, представленных на поверхности клетки. Как правило, с этой целью применяют наборы моноклональных антител, направленных против различных антигенов. Если используют меченые моноклональные антитела, то метод называют прямым. Если клетки обрабатывают немечеными моноклональными антителами, а затем флуоресцентно мечеными антителами, направленными против моноклональных антител, то метод называют непрямым. В этом случае моноклональные антитела называют первыми антителами, а меченые антитела против моноклональных антител вторыми антителами. Вторые антитела чаще всего являются антивидовыми, то есть направлены против иммуноглобулинов того или иного вида животных. Поскольку диагностические моноклональные антитела чаще всего являются мышиными, то используют поликлональные антитела против иммуноглобулинов мыши. В качестве метки используют различные флуоресцирующие соединения. Наиболее распространенным является флуоресцинизотиоционат. Кроме люминесцентной микроскопии для иммунофенотипирования применяют также проточную лазерную цитофлуорометрию. Принцип метода основан на лазерном анализе флуоресценции каждой отдельной клетки, обработанной мечеными моноклинальными антителами. С помощью иммунофлуоресценции определяют популяционный состав лимфоцитов периферической крови. Так, с помощью соответствующих моноклональных антител можно подсчитать количественное соотношение CD4-положительных и CD8-положительных Т-лимфоцитов, определив тем самым иммунорегуляторный индекс. ^ Объединяет возможности иммунологических и биохимических подходов. В качестве метки используются ферменты, химически сшитые с антигеном или антителом. Он шире других методов распространен в диагностической практике. Обладает высокой чувствительностью (десятые доли нанограмма на миллилитр), позволяет анализировать одновременно множество проб, может быть как качественным, так и количественным методом, легко стандартизуется, не требует большого количества времени. Существует множество различных вариантов иммуноферментного метода. Чаще всего применяется твердофазный иммуноферментный анализ (рис. 16). Один из компонентов системы «антиген-антитело» сорбируется на твердую фазу, в качестве которой обычно используется полистирол, имеющий 96 лунок объемом 0,2 мл. В каждой лунке планшета проводится отдельная реакция, которая затем может быть отдельно проанализирована. При анализе антигенов на стенке лунок полистиролового планшета сорбируются антитела против данного антигена, затем добавляется раствор тестируемого антигена и проводится инкубация, в ходе которой происходит взаимодействие «антиген-антитело». После отмывания не-связавшегося материала в лунки планшетов добавляют антитела против того же антигена, сшитые с ферментом. Формируется связанный с твердой фазой комплекс, состоящий из антител, антигена и антител, меченых ферментом. Комплекс напоминает бутерброд, в связи с чем такой вариант иммуноферментного анализа назван сэндвич-методом. Для повышения специфичности метода используют моноклональные антитела, направленные к разным эпитопам антигена. Реакция «антиген-антитело» проявляется добавлением в отмытую лунку планшета субстрата для фермента. Используются такие субстраты, которые способны менять свою окраску в присутствии фермента. Чаще всего в качестве фермента используется пероксидаза хрена. Она расщепляет перекись водорода на воду и атомарный кислород. Последний окисляет бесцветные фенольные соединения, у которых появляется окраска. В настоящее время в этих целях применяют ортофенилендиамин (ОФД) и тетраметилбензидин (ТМБ). Появление окрашивания свидетельствует о связывании фермента с твердой фазой и, в данном случае, о положительной реакции на антиген. Количество антигена в растворе оценивается по интенсивности окрашивания раствора субстрата. Существуют конкурентные и неконкурентные методы анализа. Сэндвич-метод является неконкурентным. В конкурентном варианте определения антигена взамен антител, сшитых с ферментом, одновременно с немеченым добавляется стандартизированный антиген, меченый ферментом. Он конкурирует с немеченым антигеном за связывание с сорбированными антителами. Чем выше концентрация тестируемого (немеченого) антигена, тем меньше меченого антигена свяжется с твердой фазой. То есть в данном случае снижение интенсивности иммуноферментной реакции будет свидетельствовать о наличии антигена в тестируемом растворе. Иммуноферментный анализ применяется для определения самых различных антигенов. С его помощью тестируют наличие в крови антител к самым разным возбудителям инфекций, определяют аутоантитела, оценивают содержание вирусных и бактериальных антигенов, белков крови, опухолевых антигенов, гормонов, наркотиков и многое другое. Метод применяется не только в биомедицине и научных исследованиях, но и в сельском хозяйстве, при экологическом мониторинге и так далее. ^ Обладает наибольшей чувствительностью. Способен выявлять пикограммовые концентрации антигена в миллилитре. Однако т связи с тем, что в качестве метки применяются изотопы, не нашел столь широкого применения, как иммуноферментный метод. Кроме того, выполнение радиоиммунного анализа требует специализированного оборудования и специальных условий, что также осложняет распространение этого метода. Чаще всего при проведении радиоиммунного анализа используют конкурентные методы. Радиоиммунологический анализ в медицине используется для определения кортикостероидных гормонов и некоторых других антигенов. ^ В реализации функций иммунной системы принимает участие целый ряд различных клеток, составляющих единый функциональный ансамбль. Все клетки происходят из полипотентных (плюрипотентных) стволовых клеток. Последние способны на протяжении всей жизни организма давать начало созреванию различных типов клеток иммунной системы. Предполагается, что полипотентные стволовые клетки или обладают уникальной способностью к самовоспроизведению путем деления на протяжении всей жизни организма, или же к моменту рождения в организме имеется пул клеток, который затем постепенно расходуется, не пополняясь за счет пролиферации. Вторая гипотеза предполагает, таким образом, наличие, ограниченного гемопоэтического потенциала стволовых клеток. Полипотентная стволовая клетка дифференцируется на два типа клеток-предшественников: • лимфоидные стволовые клетки, которые при созревании превращаются в T- и B-лимфоциты, а также натуральные киллеры (NK); • миелоидные стволовые клетки, которые являются предшественниками гранулоцитов (нейтрофилы, базофилы, эозинофилы), моноцитов/макрофагов, дендритных клеток, эритроцитов и тромбоцитов (рис. 17). Если лимфоидные стволовые клетки дают начало одному ростку кроветворения — лимфоидному, то миелоидные стволовые клетки дают три отдельных ростка: • гранулоцитарный с образованием гранулоцитарно-макрофагальных предшественников, которые затем дают еще два отдельных ростка: гранулоцитарный и моноцитарно/макрофагальный. Дендритные клетки близки к моноцитам/макрофагам; • эритроцитарный, с образованием эритроидной родоначальной клетки — предшественницы эритроцитов; • мегакариоцитарный, с образованием мегакариоцитов — предшественников тромбоцитов. В итоге, полипотентная стволовая клетка дает начало всем типам клеток, циркулирующим в кровяном русле и принимающим в разной степени участие в иммунных реакциях. Производными полипотентных стволовых клеток являются также тучные клетки, не обнаруживаемые в кровотоке, локализованные в соединительной ткани и играющие важную роль в реакции гиперчувствительности немедленного типа при инвазии организма гельминтами и при аллергических реакциях. Таблица 4.1 Клетки, принимающие участие в иммунных реакциях
4.1. T-лимфоциты Созревают в тимусе из предшественников, мигрирующих в тимус из костного мозга. По месту созревания (thymus-dependent) их назвали T-клетками (T-лимфоцитами). В организме человека по разным оценкам присутствует 1011—1013 T-лимфоцитов. Считается, что почти каждая десятая клетка в организме — это T-лимфоцит. Время жизни Т-лимфоцитов измеряется месяцами и годами. То есть это относительно долгоживущие клетки, среди которых есть T-клетки памяти. T-лимфоциты активно циркулируют по всему организму, перемещаясь между лимфоидными и нелимфоидными органами через лимфатические сосуды и кровь. В крови обычно находится не более 2% от общего пула Т-лимфоцитов. Т-клетки составляют примерно 1/4—1/3 часть всех лейкоцитов и 70—80% всех лимфоцитов. Морфологически характеризуются наличием округлого ядра, небольшими размерами, скудной цитоплазмой. Главной характеристикой T-клеток является наличие на их поверхности ^ , с помощью которого Т-клетки выявляют чужеродные антигены. Каждый клон Т-лимфоцитов несет свой T-клеточный рецептор, отличающийся строением активного центра, связывающего собственную антигенную детерминанту. T-клеточный рецептор в отличие от иммуноглобулинов, моновалентен. Связывание (узнавание) антигена происходит при помощи антигенпрезентирующих клеток, несущих на своей мембране молекулы главного комплекса системы гистосовместимости. ^ T-клетки делятся на две популяции, имеющие разное происхождение: клетки, несущие рецептор, в котором антигенсвязывающий центр построен из α и β цепей (αβ Т-лимфоциты), и клетки, имеющие активный центр рецептора, состоящий из γ и δ цепей (γδ Т-лимфоциты). Первые развиваются в тимусе и имеют широкий репертуар антигенсвязывающих активных центров. Вторые на ранних этапах развития покидают тимус и локализуются в основном под слизистыми поверхностями. В данном разделе мы будем касаться только αβ Т-лимфоцитов. T-клетки делятся на две основные популяции: • CD4+ T-клетки (T-хелперы). Распознают чужеродные антигены, находящиеся в клеточных везикулах и в межклеточном пространстве. Помогают другим клеткам в формировании адекватного иммунного ответа; • CD8+ Т-клетки (цитотоксические Т-клетки). Распознают чужеродные антигены, находящиеся в цитоплазме клеток организма. Уничтожают такие клетки. По степени зрелости Т-клетки, вышедшие из тимуса, разделяют на «наивные» (naive) T-клетки и зрелые, эффекторные клетки. Наивные клетки при дозревании (активации) в лимфоидных органах превращаются в эффекторные клетки, способные выполнять либо хелперную функцию, либо функцию цитотоксических T-лимфоцитов. По профилю продуцируемых T-хелперами межклеточных медиаторов (цитокинов) их делят на незрелые Th0-клетки, Thl-клетки (воспалительные Т-лимфоциты) и Тh2-клетки (истинные Т-хелперы). Thl-клетки обеспечивают реализацию клеточного звена иммунитета, активируя макрофаги и цитотоксические CD8+ Т-лимфоциты. Th2-клетки участвуют в формировании гуморального (антительного) иммунитета, активируя В-лимфоциты. Thl- и Thl-клетки взаимно блокируют активность друг друга, выступая в этом отношении в качестве супрессорных клеток. Супрессорную активность могут также проявлять цитотоксические CD8+ T-клетки, способные уничтожать T-клетки и таким образом угнетать иммунный ответ. 4.2. B-лимфоциты У млекопитающих созревают в костном мозге и лимфоидной ткани. У птиц созревают в сумке Фабрициуса (бурсе), находящейся в районе копчика. От термина «bursa-dependent, бурса-зависимые» В-лимфоциты получили свое название. Морфологически схожи с T-лимфоцитами. Составляют примерно 1/10-1/20 часть всех лимфоцитов. Характерной чертой является наличие на их поверхности ^ , центральной частью которого является мембранный иммуноглобулин. После активации дают клоны плазматических клеток, богатых цитоплазмой и секретирующих иммуноглобулин в околоклеточное пространство. Антитела представляют собой секретируемую форму мембранного иммуноглобулина и распознают тот же самый антиген, что и мембранная форма. Плазматические клетки локализуются в костном мозге и лимфоидных органах. Существует две популяции В-лимфоцитов: В1 и В2. Первые являются В-клетками, отвечающими на тимуснезависимые антигены, продуцирующими антитела класса IgM и имеющими ограниченный репертуар активных центров. Маркером B1-клеток является CD5 антиген. Считается, что B1-лимфоциты эволюционно древнее второй популяции В-лимфоцитов и продуцируют в основном антитела против бактериальных антигенов. В2-лимфоциты составляют основную часть общего пула В-клеток, отвечают на тимусзависимые антигены, дозревают в лимфоидных тканях, имеют широкий репертуар активных центров и могут продуцировать антитела любого изотипа. 4.3. Моноциты/макрофаги Крупные, активно фагоцитирующие клетки. Принимают участие как в работе врожденного иммунитета (естественная резистентность), так и адаптивного (приобретенного) иммунитета. Высокая способность к фагоцитозу известна со времен И.И. Мечникова (1896 г.), назвавшего их макрофагами. Незрелые макрофаги, циркулирующие в крови, называют моноцитами. Моноциты являются, как и лимфоциты, мононуклеарными клетками. Моноциты, проникшие в ткани, дифференцируются в тканевые макрофаги, которые распространены по всему телу. ^ • Альвеолярные макрофаги. Резиденты легочной ткани. Поглощают чужеродные агенты, проникшие через слизистые поверхности легких и бронхов. • Перитонеальные макрофаги. Локализованы в брюшной полости. • Клетки Купфера. Печеночные макрофаги. • Клетки микроглии мозга. Окружают капилляры мозга. • Мезангиальные клетки почки. • Синусные макрофаги селезенки. • Синусные макрофаги лимфоузлов. • Остеокласты костной ткани. Макрофаги активно перемещаются, мигрируя в кровь и обратно в ткани. Содержат множество вакуолей. Являются долгоживущими клетками (десятки дней). Несут множество поверхностных рецепторов для связывания бактериальных углеводов. Среди них маннозный рецептор, скэвенджер-рецептор (рецептор мусора), рецептор бактериального липополисахарида, называемый также антигеном CD14 и являющийся маркером клеток моноцитарного ряда. Таблица 4.2 Функции макрофагов при иммунных реакциях
Важную роль в выполнении фагоцитарной функции играют также рецепторы компонентов комплемента, рецепторы иммуноглобулинов. Наличие большого количества рецепторов позволяет макрофагам выполнять защитные функции до развития полноценного адаптивного иммунного ответа. То есть макрофаги — один из важнейших факторов естественной резистентности организма. В то же время они являются одним из важнейших звеньев адаптивного иммунитета, поскольку являются профессиональными антигенпрезентирующими клетками. Макрофаги выполняют специализированную функцию представления чужеродных антигенов T-клеткам. 4.4. Нейтрофилы Составляют 95% гранулоцитарных полиморфноядерных клеток. Созревают в костном мозге, откуда освобождаются в кровь со скоростью 10 тыс. клеток в секунду. Являются короткоживущими клетками (продолжительность жизни в среднем 2-3 суток). Составляют 60-70% от всех лейкоцитов. Мигрируют в ткани, откуда, в отличие от макрофагов, не возвращаются. От И.И. Мечникова получили название «микрофаги». Служат одним из наиболее важных факторов естественной резистентности. Активно фагоцитируют. Обладают множеством вакуолей и большим набором лизосомальных ферментов. Основная активность — антибактериальная. 4.5. Эозинофилы Содержат множество цитоплазматических гранул, которые окрашиваются кислым красителем — эозином. Составляют 2-5% от общего числа лейкоцитов. Способны к активной дегрануляции. Содержимое гранул токсично для внеклеточных паразитирующих организмов. Кроме того, эозинофилы подавляют воспалительные реакции, в том числе и аллергические. Обладают ферментом, расщепляющим гистамин (гистаминаза). 4.6. Базофилы Составляют 0,2% от общего числа лейкоцитов. Содержат гранулы, окрашивающиеся основным красителем — фуксином. При дегрануляции выделяют вазоактивные пептиды, являющиеся медиаторами воспаления, например, гистамин. Вызывают патологические проявления аллергик. Считается, что выполняют важную роль в антипаразитарном иммунитете. Аналогичную роль выполняют близкие по строению тучные клетки, обнаруживающиеся только в тканях. 4.7. Тромбоциты Мелкие безъядерные клетки, участвующие в свертывании крови и в формировании очагов воспаления. Являются короткоживущими клетками. Несут на своей поверхности ряд рецепторов, связывающих как антитела, так и белки системы свертывания крови. ^ NK-клетки или естественные киллеры. Морфологически сходны с лимфоцитами. Близки к ним по происхождению. Однако крупнее их и содержат множество цитоплазматических вакуолей. Обладают цитотоксической функцией. Распознают чужеродные или измененные собственные клетки с помощью механизма, отличающегося от механизма, используемого Т-лимфоцитами. ^ Клетки, имеющие множество отростков и выполняющие функцию презентации чужеродных антигенов Т-лимфоцитам. Способны к активной и направленной миграции. Имеется несколько разновидностей дендритных клеток, локализованных в эпителиальных и лимфоидных тканях. Разновидностью дендритных клеток являются эпителиальные клетки Лангерганса, локализованные в подкожном слое (не путать с клетками Лангерганса поджелудочной железы!). В крови дендритные клетки находятся в минимальном количестве. 4.10. Эритроциты Кроме выполнения основной функции, связанной с транспортом кислорода в ткани, принимают участие в работе иммунной системы. Имеют на своей поверхности рецепторы, связывающие иммунные комплексы (антиген-антитело). Переносят такие комплексы в печень, где передают их клеткам Купфера для последующей деградации. В последние несколько лет к клеткам иммунной системы стали относить клетки эндотелия сосудов, которые в очагах воспаления приобретают многие черты клеток иммунной системы и активно участвуют в механизмах реализации иммунного ответа. ^ Злокачественные опухоли являются носителями чужеродной генетической информации и, следовательно, объектом защитной реакции со стороны иммунной системы организма-хозяина. Ею уничтожаются любые клетки, несущие чужеродную генетическую информацию. Злокачественно трансформированные клетки содержат продукты собственных измененных (мутировавших) или чужеродных (вирусных) генов. Защитное действие иммунной системы заключается в предотвращении потенциальной опасности развития огромного числа опухолей. Лишь немногие клетки, способные маскировать проявления своей чужеродности и обходящие иммунологический контроль, дают начало злокачественным новообразованиям. Специфические для опухолей антигены уникальны для раковых клеток и не встречаются на нормальных клетках. Они являются результатом мутаций, возникающих в опухолевых клетках. Цитозольный процессинг мутантных белков дает пептиды, которые презентируются молекулами гистосовместимости I класса и индуцируют клеточный ответ на опухоли. Злокачественную трансформацию клеток могут вызывать некоторые вирусы (вирус саркомы Рауса, ретровирусы, вирус папиломы и другие). В таком случае опухолевые клетки несут вирусные белки, которые являются для организма чужеродными и способны распознаваться иммунной системой за счет процессинга и презентации молекулами гистосовместимости I класса. Различают также антигены, ассоциированные с опухолями. Они не уникальны для раковых клеток и нередко являются белками, присутствующими также в эмбриональных клетках. У взрослых их в норме нет или очень мало. В опухолевых клетках эти белки могут появляться за счет реактивации эмбриональных генов. Примером является альфа-фетопротеин, являющийся эмбриональным аналогом альбумина — основного белка плазмы крови. Главную роль в противоопухолевом иммунитете играет клеточный иммунный ответ. ^ Цитотоксические CD8-положительные Т-лимфоциты выполняют прямую киллерную функцию. С помощью Т-клеточного рецептора они распознают на поверхности опухолевых клеток связанные с молекулами гистосовместимости I класса пептидные фрагменты белков, характерных для трансформированных клеток. Специфическое распознавание приводит к реализации цитотоксической функции CD8-положительных Т-клеток и уничтожению опухолевых клеток путем апоптоза. ^ Т-хелперы 1 типа выполняют регуляторные функции, помогая успешной реализации киллерной роли CD8-положительных Т-лимфоцитов. Они также привлекают и активируют тканевые макрофаги, дендритные клетки и моноцитарные клетки. Выработка CD4-положительными Т-клетками 1 типа цитокинов, и в первую очередь интерферона-гамма, приводит к миграции в зону локализации опухоли макрофагальных клеток, их активации и поглощению фрагментов опухолевых клеток, гибнущих путем апоптоза. Показано, что Т-хелперы 1 типа также могут выполнять цитотоксическую функцию. Макрофаги. Макрофаги обладают фагоцитарной функцией и, кроме того, могут выполнять киллерную функцию, осуществляемую за счет локальной секреции цитотоксических продуктов, приводящих к гибели опухолевой клетки. Цитотоксичность макрофагов связана также с описанным выше феноменом антителозависимой клеточной цитотоксичности. Антитела способны связываться с Fc-рецепторами на поверхности макрофагов и одновременно специфически взаимодействовать с опухолевыми мембранными антигенами. Образование мостиков между макрофагами и опухолевыми клетками-мишенями может приводить к атаке макрофага на клетку-мишень, в результате которой последняя погибает. Натуральные киллеры. Натуральные киллеры мигрируют в зону локализации опухолевых клеток под воздействием продуцируемых CD4-положительными Т-клетками 1 типа цитокинов (интерферон-гамма). Интерферон обеспечивает направленную миграцию натуральных киллеров (NK-клеток). Они не обладают антигенной специфичностью, не требуют антигензависимой дифференцировки. Обнаружив злокачественную клетку, способны сразу оказать цитотоксическое действие. Как и цитотоксический Т-лимфоцит, один натуральный киллер может уничтожить множество опухолевых клеток. Многие опухолевые клетки имеют на мембране пониженную плотность молекул HLA I класса, что рассматривается как один из путей ухода опухолевых клеток от иммунологического надзора. Ингибирующие рецепторы натуральных киллеров (KIR) в таком случае не находят достаточного количества своих лигандов — молекул HLA I класса на мембране опухолевых клеток. Ингибирующий сигнал с KIR-рецепторов оказывается недостаточным, и NK-клетки осуществляют цитотоксическую атаку, убивая опухолевую клетку. Кроме того, NK-клетки, несущие на своей поверхности один из Fc-рецепторов IgG (CD 16 антиген), способны проявлять антителозависимую клеточную цитотоксичность. Антитела против опухолевых антигенов, связанные Fc-участком через CD 16 антиген с NK-клеткой, служат мостиком между опухолевой клеткой и натуральным киллером. Формирование таких мостиков может приводить к цитотоксическому воздействию NK-клеток на опухоль. Гуморальное звено иммунитета также участвует в реализации противоопухолевого иммунитета. Интерфероны. Восстанавливают экспрессию молекул гистосовместимости I класса на мембране опухолевых клеток. Тем самым увеличивается противоопухолевая активность цитотоксических Т-лимфоцитов. Интерферон-гамма участвует в привлечении и активации цитотоксических Т-лимфоцитов, макрофагов и NK-клеток, играющих главную роль в иммунном ответе на опухоль. ^ Если с опухолевым антигеном, появившимся на клеточной мембране, специфически взаимодействуют антитела класса IgM, то может инициироваться классический путь активации комплемента. Результатом активации является комплементзависимый цитолиз. Для активации системы комплемента в этом случае достаточно одной молекулы IgM. Антитела. Играют неоднозначную роль в противоопухолевом иммунитете. С одной стороны, они, как описано выше, вызывают гибель опухолевых клеток, активируя систему комплемента или реализуя антителозависимую клеточную цитотоксичность. С другой стороны, антитела могут вызывать защитный эффект по отношению к опухоли. Нередко антитела класса IgG являются не только защитными по отношению к опухолям, но и могут усиливать их рост. Такой эффект связывают с блокадой антителами опухолевых антигенов на мембране опухолевой клетки и с исчезновением антигенов с поверхности клетки за счет эндоцитоза. Защитные эффекты антител относят к способам, с помощью которых опухоль уходит из-под надзора иммунной системы. К другим способам ухода опухоли из-под иммунологического надзора относят понижение плотности экспрессии на мембране молекул гистосовместимости I класса, отсутствие способности опухолевых клеток активировать наивные Т-лимфоциты, выработку белков, подавляющих противоопухолевый иммунный ответ. ^ Выделяют четыре типа нарушений, приводящих к патологическим проявлениям:
^ Иммунодефициты — это нарушения иммунитета, проявляющиеся клинически, то есть характеризующиеся симптомами какого-либо заболевания. Чаще всего при иммунодефицитах манифестируют инфекционные или онкологические заболевания, то есть заболевания, на борьбу с которыми в первую очередь направлена иммунная система. Первичные иммунодефициты обусловлены генетически, то есть имеют наследственную природу и являются врожденными. У человека частота встречаемости оценивается единицами на каждый миллион индивидуумов. Проявляются в детском возрасте. Значительное число больных не доживает до 20 лет. Основой первичных иммунодефицитов являются хромосомные перестройки или мутации генов, кодирующих белки, участвующие в иммунном ответе. До 1952 года не было описано ни одного врожденного иммунодефицита. Гены, дефекты в которых приводят к первичным иммунодефицитом, являются рецессивными. В настоящее время в связи с развитием геномики число известных первичных иммунодефицитов с каждым годом увеличивается. Каждый ген, продукт которого участвует в иммунных реакциях, может давать мутации, приводящие к первичному иммунодефициту. Однако вследствие рецессивности такие мутации остаются скрытыми. Рецессивные мутации приводят к заболеванию только в том случае, когда обе хромосомы несут мутантные гены. Поскольку особи мужского пола несут только одну X хромосому, то все такие особи, несущие дефектные гены в X хромосоме, заболевают, в то время как особи женского пола, имеющие две X хромосомы, совершенно здоровы. Классификация первичных иммунодефицитов 1. Иммунодефициты, связанные с поражением нескольких типов клеток:
^ γ-цепи рецептора IL-2. К ТКИД приводят также два дефекта ферментов, вовлеченных в деградацию нуклеотидов: аденозиндезаминаза (ADA) и пурин нуклеотидфосфотаза (PNP). Оба дефекта приводят к накоплению метаболитов нуклеотидов, которые токсичны для Т- и В-клеток и не позволяют им созревать. Существует ТКИД, вызванный отсутствием на мембране лимфоцитов молекул HLA II класса (синдром «голых лимфоцитов»). Поскольку тимус также теряет молекулы МНС II класса, то CD4+ Т-клетки не могут подвергаться положительной селекции. При этом экспрессия молекул гистосовместимости I класса остается нормальной, и CD8+ Т-клетки развиваются нормально. Это заболевание иллюстрирует важную роль CD4+ Т-клеток в адаптивном ответе на большинство патогенов. 2. Иммунодефициты, обусловленные преимущественным поражением Т-клеток: • синдром Ди Джорджа. Аплазия тимуса вследствие недоразвития 3-го и 4-го жаберных карманов в процессе эмбрионального развития. 3. Иммунодефицита, обусловленные преимущественным поражением В-клеток: • агаммаглобулинемия или гипоглобулинемия. Характеризуется отсутствием В-клеток или их неспособностью дифференцироваться в плазматические клетки и продуцировать иммуноглобулины. Пиогенные или гноеобразующие бактерии имеют полисахаридные капсулы, которые делают их устойчивыми к фагоцитозу. Нормальный организм может бороться с такими инфекциями, поскольку антитела и комплемент опсонизируют бактерии, делая их доступными фагоцитам. Потеря антителопродукции приводит к неспособности контролировать этот класс бактериальных инфекций. Поскольку антитела участвуют в нейтрализации инфекционных вирусов, то больные с нарушением антителопродукции также чувствительны к некоторым вирусным инфекциям. 4. Иммунодефициты, связанные с поражением миелоидных клеток: • хроническая гранулематозная болезнь. Характеризуется выраженным дефектом в продукции активных форм кислорода. Следствием являются хронические инфекции, вызванные бактериями или грибами. Важным этапом в освобождении организма от инфицирования патогенными бактериями является опсонизация бактерий антителами и комплементом. Это позволяет фагоцитам поглощать и разрушать бактерии. Дефекты β2-субъединицы интегринов (CD18 антиген) приводят к тяжелому инфицированию патогенными бактериями. Лейкоцитарные интегрины CD 11a/CD 18 (LFA-1), CD 11b/CD 18 (Mac-1, CR3) и CD11c/CD18 (CR4) важны для адгезии фагоцитирующих клеток, миграции через стенки сосудов и поглощения опсонизированных бактерий. Если они дефектны, то фагоциты не достигают места инфекции. Это приводит к бактериальным инфекционным заболеваниям, которые устойчивы к лечению антибиотиками и развиваются несмотря на, казалось бы, эффективный клеточный и гуморальный адаптивный иммунный ответ. Большинство других известных дефектов фагоцитирующих клеток приводят к нарушениям в их способности опосредовать киллинг внутриклеточных и/или переваренных внеклеточных бактерий. При хроническом грануломатозе фагоциты не могут продуцировать супероксидный радикал, и, вследствие этого, отсутствует антибактериальная активность. Причиной этого может быть серия различных генетических нарушений, воздействующих на один из четырех белков НАДФН оксидазной системы (NADPH). Больные в таких случаях страдают хроническими бактериальными инфекционными заболеваниями, которые в некоторых случаях приводят к формированию гранулем. Нарушение синтеза глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и миелопероксидазы также снижает внутриклеточный киллинг и приводит к подобным, но несколько менее тяжелым заболеваниям. Дефицит лейкоцитарных интегринов предотвращает адгезию фагоцитирующих клеток и их миграцию к местам инфекции. Респираторный взрыв нарушен при дефиците глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы и миелопероксидазы, что приводит к хроническому гранулематозу. При хроническом гранулематозе инфекция персистирует, поскольку нарушена активация макрофагов, что приводит к хронической стимуляции CD4+ T клеток и, как следствие, к гранулемам. 5. Иммунодефициты, связанные с нарушениями в системе комплемента. Встречаются наследственные дефекты, приводящие к дефициту или полному отсутствию самых разных компонентов комплемента. Наиболее тяжелым, приводящим к смертельному исходу, является дефицит СЗ компонента комплемента. ^ — это иммунодефициты, которые не являются врожденными, а возникают в течение жизни. Существует несколько классификаций вторичных иммунодефицитов. Различают иммунодефициты эндогенные и экзогенные. К первым относят возрастные иммунодефициты, нарушения иммунитета в связи со стрессовым воздействием. Ко вторым — нарушения иммунитета инфекционного происхождения, иммунодефициты в связи с недостаточностью питания, в связи с воздействием ультрафиолетового облучения, ионизирующей радиации, химических веществ, лекарственный иммунодефицит. Иммунодефицита разделяют также на обратимые и необратимые. Примером обратимого иммунодефицита может быть голодание или временный дефицит в диете жизненно важных компонентов, необходимых для обеспечения активной работы постоянно пролиферирующих клеток иммунной системы. Примером необратимого иммунодефицита служит ВИЧ-инфекция, поражающая популяцию CD4-положительных клеток, или ионизирующая радиация в запороговых дозах, приводящая к повреждению делящихся клеток иммунной системы, что делает организм беззащитным перед биологической агрессией. Возрастные иммунодефициты связаны с особенностями онтогенеза иммунной системы, которая активно развивается до достижения половозрелого возраста. Однако в первые месяцы жизни ребенка она является функционально неполноценной. В связи с этим часто встречающимся иммунным дефектом является транзиторный (проходящий) дефицит продукции иммуноглобулинов, который проявляется на 6-12 месяцы жизни (рис.). Рис. 51. Динамика уровня иммуноглобулинов в крови новорожденного Благодаря трансплацентарному переносу IgG от матери новорожденные имеют изначальный уровень антител, сходный с материнским. Когда перенесенные иммуноглобулины катаболизируются, уровень антител постепенно падает. Новорожденные дети не продуцируют значительного количества антител до 6-месячного возраста. У некоторых детей это может приводить к временной возрастной чувствительности к инфекциям. Особенно это касается недоношенных детей, у которых созревание иммунной системы занимает более долгий период. С возрастом у людей развивается иммунодефицит, приводящий к повышению частоты возникновения онкологических заболеваний. Это связано с накоплением молекулярно-генетических поломок в работе иммунной системы, в результате которых она становится менее эффективной в распознавании и уничтожении злокачественно трансформированных клеток. Факторы, приводящие к вторичным иммунодефицитам, могут взаимно дополнять друг друга. Так, на фоне утомления, переохлаждения или стресса легче развиваются инфекционные заболевания, которые, в свою очередь, также являются важным фактором, приводящим к нарушениям иммунитета. Примером может служить герпес-вирусная инфекция. Нормальная иммунная система может хорошо контролировать быстро реплицирующиеся вирусы, которые дают острые формы вирусных заболеваний. В этих случаях иммунная система эффективно борется с вирусом, используя цитотоксические CD8-положительные Т-клетки для киллинга инфицированных клеток, интерферон для ингибирования вирусной репликации и нейтрализующие антитела для блокирования инфицирования новых клеток. Однако вирус простого герпеса может входить в латентное состояние, в котором он транскрипционно не активен и слабо распознается иммунной системой. Хотя вирус в таком состоянии не вызывает заболевания, тем не менее он и не может быть устранен из организма. Вирус простого герпеса, причина лихорадки на губах, инфицирует эпителий и распространяется в нейроны, близкие к месту инфекции. При эффективном контроле со стороны иммунной системы вирус персистирует в латентном состоянии в нейронах. Возникает равновесие, которое может быть нарушено при возникновении дополнительных факторов, нарушающих работу иммунной системы. Такие факторы, как солнечная радиация, переутомление, переохлаждение, гормональные изменения, приводят к реактивации вируса. Он спускается по аксону чувствительного нейрона и реинфицирует эпителиальные ткани. В этот момент иммунный ответ опять активируется и берет под контроль локальную инфекцию, уничтожая инфицированные эпителиальные клетки. Такой цикл может быть повторен много раз. Существует две причины, по которым нейроны остаются инфицированными. Во-первых, в клетках продуцируется очень небольшое количество вирусных белков. Вследствие этого генерируется малое число пептидных фрагментов вирусных белков, представляемых молекулами гистосовместимости I класса. Во-вторых, на нейронах присутствует очень мало молекул гистосовместимости, что придает нейронам устойчивость к распознающему и атакующему действию CD8-положительных Т-клеток. Низкий уровень экспрессии молекул гистосовместимости I класса снижает риск того, что нейрон, который не может регенерировать, будет атакован CD8-положительными Т-клетками. То есть низкий уровень экспрессии молекул гистосовместимости сохраняет нервные клетки, но одновременно нейроны становятся необычайно уязвимы для трестирующих инфекций. Многие инфекционные агенты для того, чтобы вызвать вторичный иммунодефицит, повреждают иммунную систему. Распространенный механизм повреждения иммунной системы — это гиперстимуляция иммунитета суперантигенами патогенов и последующая массовая поликлональная гибель активированных лимфоцитов путем апоптоза. Так, суперантигены могут вызывать генерализированную супрессию, сопровождающуюся истощением Т-клеток. Подобное истощение Т-лимфоцитов, связанное с гиперактивацией иммунной системы, происходит при тяжелой ожоговой или при черепно-мозговой травме. При большинстве инфекций значительная часть патологических проявлений обусловлена иммунным ответом хозяина. Например, лихорадка, которая сопровождает бактериальную инфекцию, является следствием освобождения монокинов. Если иммунная система толерантна к инфекционному агенту, то инфекция протекает хронически и часто бессимптомно. Примером может служить инфицирование организма тимэктомированных новорожденных мышей вирусом лимфоцитарного хориоменингита. Такие животные растут полностью здоровыми. Однако перенос в их организм вирус-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов приводит к сильному воспалительному ответу в центральной нервной системе и к смерти. Одним из способов формирования толерантности (иммунологическая неотвечаемость) является инфицирование организма в неонатальный период или при рождении. В Африке широко распространен хронический гепатит В, что является следствием инфицирования плода или новорожденного от матери. Неразвитая иммунная система плода приобретает толерантность к вирусу, что приводит к хронически персистирующей инфекции. Заражение вирусом во взрослом состоянии приводит, как правило, к острой форме вирусного гепатита В. Еще одной формой нарушения иммунитета является дисбаланс Т-лимфоцитов. Различают два основных типа дисбаланса Т-лимфоцитов:
ВИЧ-инфекция ВИЧ-инфекцию выделяют в качестве особого вида вторичного иммунодефицита. Это связано с высокой опасностью этого инфекционного заболевания, не поддающегося излечению и имеющего высокий потенциал распространения. Вакцина против ВИЧ-инфекции не получена, несмотря на многочисленные попытки ее создания. ВИЧ-инфекция вызывает СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита). Возбудителем ВИЧ-инфекции является вирус иммунодефицита человека (ВИЧ). Вирус передается половым путем, при переливании крови и от больной матери ребенку в перинатальный период. Существует два варианта вируса — ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Первый распространен по всему миру, второй — эндемичен для Западной Африки. ВИЧ является ретровирусом, содержит двухцепочечную РНК. Основные гены ВИЧ — это gag, кодирующий белок сердцевины вируса, pol, являющийся геном обратной транскриптазы, и env, кодирующий белок оболочки вируса. Кроме того, несколько дополнительных генов регулируют синтез вирусных белков. Рецептором для ВИЧ является CD4 антиген Т-лимфоцитов. Этот белок присутствует также на мембране моноцитов/макрофагов. В связи с этим инфицируются как CD4-положительные Т-лимфоциты, так и клетки моноцитарного ряда. Молекула CD4 связывается с поверхностным вирусным гликопротеином gp120. В последующем слиянии вируса с клеткой и его поглощении участвуют корецепторы, находящиеся на мембране лимфоцитов и моноцитов/макрофагов. Для СD4-положительных Т-лимфоцитов корецептором является хемокиновый рецептор CCR5. Для моноцитарно-макрофагальных клеток — хемокиновый рецептор CCR4. На клетках иммунной системы существуют также другие рецепторы вируса иммунодефицита. Так, на дендритных клетках присутствует белок адгезии, в норме участвующий в процессах активации лимфоцитов (DC-SIGN, CD209). Этот белок способен связываться с вирусом иммунодефицита, а затем передавать его СD4-положителъным клеткам, инфицируя их. Основной причиной возникновения иммунодефицита является истощение и дисфункция CD4-положительных клеток.
При ВИЧ-инфекции инфицированные CD4-положительные Т-лимфоциты способны соединяться с неинфицированными за счет взаимодействия, находящегося на клеточных мембранах вирусного белка gpl20 и белка CD4, характерного для Т-хелперов. В результате последующего слияния мембран образуются гигантские многоядерные инфицированные клетки и синцитий.
В итоге формируется замкнутый круг, в котором CD4-положительные и CD8-положительные Т-лимфоциты, несмотря на активацию, не способны полноценно выполнять свои функции. Важным является также тот факт, что вирус, попав в клетку, встраивается в геном и может долгое время никак себя не проявлять. Наряду с гибелью при ВИЧ-инфекции CD4-положительных клеток происходят дополнительные нарушения в работе иммунной системы. Нарушается нормальная продукция клетками цитокинов, происходит поликлональная активация В-лимфоцитов, возрастает образование аутоантител и иммунных комплексов. На этом фоне идет обширное расселение вируса по органам и тканям. ^ может сопровождаться кратковременными расстройствами, напоминающими инфекционный мононуклеоз, с недомоганием, мышечными болями, припухлостью лимфоузлов, фарингитом и сыпью. Наблюдается временное уменьшение числа CD4-положительных Т-клеток и повышение — CD8-положительных Т-лимфоцитов. С помощью иммуноферментного метода в крови в этот период можно обнаружить вирусные белки. Затем инфекция переходит в хроническую стадию, которая обычно не сопровождается клиническими проявлениями, однако у трети больных увеличены лимфоузлы. Хроническая стадия может продолжаться до 12 лет, а затем переходит в СПИД. На поздних стадиях заболевания отмечаются неспецифические симптомы общего характера: лихорадка, ночная потливость, диарея и потеря веса. Может возникать кандидоз ротовой полости, различные кожные инфекции, герпес, опоясывающий лишай. Эти расстройства служат, в свою очередь, предвестниками развития тяжелых оппортунистических инфекций и опухолей, что и представляет собой собственно СПИД. К этому времени число CD4-положительных Т-клеток в периферической крови становится меньше 200 на 1 мкл (в норме эта величина превышает 1000 на 1 мкл). Наиболее часто встречающимся видом новообразований при СПИДе является саркома Капоши — многоочаговая опухоль эндотелиального происхождения. Оппортунистические инфекции развиваются в результате реактивации микробов, присутствующих в нормальном организме в латентном состоянии. Обычная оппортунистическая инфекция при СПИДе — пневмоцистная пневмония. Главными объектами поражения при СПИДе являются три системы: дыхательная, пищеварительная и нервная. Неврологические осложнения обусловлены или прямым действием на нервную систему ВИЧ и возбудителей оппортунистических инфекций, или развитием лимфомы. Может развиваться менингит, деменция, токсоплазмоз, приводящий к расстройству неврологических функций. Если больному не назначается специфическая поддерживающая терапия, то его ожидает летальный исход. Для лечения ВИЧ-инфекции применяют лекарственные препараты, содержащие ингибиторы обратной транскриптазы и ингибиторы протеиназ, что снижает смертность в ближайшие сроки после начала лечения и задерживает прогрессировать болезни. Однако эти препараты не способны привести к полной элиминации вируса, поскольку его геном встраивается в геном человека. Надежды на создание действенных способов борьбы с инфекцией основываются на разработке эффективной вакцины против ВИЧ. 12.3. Аллергия Термин «аллергия» ввел Пирке в 1906 году (allos ergon — другое действие) для обозначения изменений чувствительности к субстанциям, с которыми организм ранее контактировал. Аллергия является неадекватным проявлением чрезмерной активности иммунной системы (гиперчувствительности) и развивается при повторном поступлении аллергена в организм. ^ Тип I — гиперчувствительность немедленного типа. В развитии реакции гиперчувствительности основную роль играют IgE-антитела. IgE-опосредованную аллергию называют также атопией. Атопия имеет наследственную предрасположенность. Тип II — опосредуется цитотоксическими антителами классов IgM и IgG совместно с комплементом. Реализуется при переливании несовместимой крови, гемолитической болезни новорожденных. Тип III — опосредуется иммунными комплексами. Проявляется при системной красной волчанке, ревматоидном артрите, феномене Артюса, хроническом громерулонефрите. Тип IV — гиперчувствительность замедленного типа. Опосредуется клетками иммунной системы (Т-лимфоцитарная активация макрофагов). Чаще всего встречаются:
В основе аллергических реакций немедленного типа лежат гуморальные механизмы, приводящие к образованию антител класса IgE вследствие смещения равновесия Th1–Th2 и сторону Th2-клеток. В основе многих аллергических реакций замедленного типа лежат клеточные механизмы, приводящие к активации макрофагов вследствие смещения равновесия Th1-Th2 и сторону Th1-клеток. Таблица 12.1 Особенности реакций гиперчувствительности
Гиперчувствительность немедленного типа
Антитела класса IgE, комплементарно связанные аллергенами, обладают способностью фиксироваться на тучных клетках, базофилах, эозинофилах за счет наличия на их поверхности соответствующих рецепторов (Fc-рецепторы для IgE).
Таким образом, в основе гиперчувствительности немедленного типа лежит многократно усиленная реакция иммунной системы на взаимодействие аллергенов с антителами класса IgE. Реакции гиперчувствительности немедленного типа развертываются в три стадии:
На первой стадии происходит ответ на поступление в организм аллергена, образуются антитела класса IgE. При повторном появлении в организме аллерген связывается с IgE и клетками. Вторая стадия — реакция тучных клеток (первичных мишеней аллергии). Освобождающиеся биологически активные субстанции воздействуют на клетки-мишени второго порядка — гладкие мышцы, эндотелий сосудов, эпителий слизистых поверхностей. На третьей стадии происходит сокращение гладких мышц, клеток эндотелия, раздражение эпителия. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям