Препарат золота ауранофин уменьшает вирусные резервуары в модели спида на обезьянах и сдерживает вирусную нагрузку после отмены антиретровирусной терапии
|
|
Скачать 279.66 Kb.
|
|
Препарат золота ауранофин уменьшает вирусные резервуары в модели СПИДа на обезьянах и сдерживает вирусную нагрузку после отмены антиретровирусной терапии Mark G. Lewisa,1, Sandrina DaFonsecab,1, Nicolas Chomontb, Anna Teresa Palamarac,d, Maria Tardugnoe, Antonello Maie, Matt Collinsa, Wendeline L. Wagnera, Jake Yalley-Ogunroa, Jack Greenhousea, Barbara Chirullof, Sandro Norellif, Enrico Garacif Andrea Savarinof Цели: Основным препятствием для эрадикации ВИЧ является небольшая субпопуляция CD4+ T-клеток памяти, характеризующихся большой продолжительностью жизни, в которых содержится ретровирусный геном. Нами было изучено влияние препарата золота — ауранофина, на фенотип и жизнеспособность CD4+ T в условиях in vitro, а также влияние на клетки с лентивирусом в условиях in vivo. Дизайн: Исследование in-vitro и in-vivo. В ходе пилотного исследования на шести обезьянах, инфицированных вирусом SIVmac251, показавших устойчивое подавление вирусной нагрузки при антиретровирусной терапии (АРТ) (тенофовир/эмтрицитабин/ралтегравир), проводили исследование влияния ауранофина на додифференцировку первичных CD4+ Т-клеток человека и его способность уменьшать размер резервуара вирусной ДНК (вДНК). Данное исследование далее было расширено с добавлением в АРТ комбинации дарунавир/р и включением контрольных особей , получающих усиленную АРТ в качестве монотерапии. Все указанные терапии на конечном этапе отменяли и проводили мониторинг вирусо-иммунологических показателей. Методы: Количественный подсчет субпопуляций клеток осуществляли методом проточной цитометрии в рамках проведения надлежащих гематологических анализов. Расчет вирусной нагрузки и вДНК, ассоциированной с клетками, проводили методом ПЦР в режиме реального времени с использованием зондов TaqMan. Результаты: Ауронофин изменял фенотип как у не участвовавших ранее в иммунном ответе CD4+ клеток, так и клеток иммунной памяти, преимущественно воздействуя на долгоживущее звено. В ходе пилотного исследования in vivo препарат ауранофин приводил к временным уменьшениям размера в периферической крови резервуара клеток, содержащих вДНК. При более агрессивных моделях АРТ устойчивое снижение значения вДНК наблюдалось только у обезьян, которым давали ауранофин; данный эффект в контрольной группе, получавших только усиленную АРТ, не выявлялся. При отмене терапии только у обезьян, которым давали ауранофин, наблюдался период отсутствия роста вирусной нагрузки и более низкий темп роста впоследствии. Вывод: Данное исследование представляет собой первый этап на пути к ремиссии лентивирусных инфекций у приматов. © 2011 Wolters Kluwer Health | Lippincott Williams & Wilkins AIDS 2011, 25:000–000 Ключевые слова: центральная память, эрадикация, ремиссия, резервуар, SIVmac251, ^ aBIOQUAL, Inc. 9600 Medical Center Drive, Rockville, MD 20850, bVGTI-Florida, 11350 SW Village Parkway, Port St. Lucie, FL 34987, cCenci-Bolognetti Foundation, Dept of Public Health Sciences, Sapienza University of Rome, P.le A. Moro, 5, 00185, Rome, Italy, dIRCCS San Raffaele Pisana, via della Pisana 235, 00163 Rome, Italy, eCenci-Bolognetti Foundation, Dept of Drug Chemistry and Technologies, Sapienza University of Rome, P.le A. Moro, 5, 00185, Rome, Italy, and fIstituto Superiore di Sanita`, Viale Regina Elena, 299, 00161, Rome, Italy. Correspondence to Dr. Andrea Savarino, Dept. of Infectious, Parasitic and Immune-mediated Diseases, Istituto Superiore di Sanita`, Viale Regina Elena, 299. 00161 Rome, Italy. Tel: +39 06 4990 2305; fax: +39 06 4990 3561; e-mail: [email protected] 1 Равнозначный вклад. Дата получения: 21 декабря 2010; дата пересмотра: 21 марта 2011; дата принятия к печати: 8 April 2011. DOI:10.1097/QAD.0b013e328347bd77 Введение Несмотря на способность антиретровирусных препаратов ингибировать репликацию вируса, проводимая в настоящее время антиретровирусная терапия не удаляет ВИЧ из организма полностью [1,2]. CD4+ T-клетки памяти, скапливающие транскрипционно «молчащий», но потенциально способный к репликации провирус, играют важную роль в персистенции ВИЧ [3–5]. ВИЧ присутствует главным образом в CD4+ T-клетках центральной памяти (ТCM) и временной памяти (ТTM), которые характеризуются большой продолжительностью жизни благодаря выживанию T-клеток и их непрерывно низкому уровню пролиферативной активности [6]. В отличие от эффекторных CD4+ T-клеток (ТEM) с короткой продолжительность жизни, клетки ТCM и ТTM экспрессируют белки CD27 и CD28 [7–9]. Оба рецептора могут повышать выживаемость делящихся клеток [10]. Белок CD27 особенно важен для поддержания памяти T-клеток [10–12] и дифференцировки клеток с фенотипом Th1 (IFN-γ+) [13], несмотря на то, что его роль в поддержании наивных T-клеток (ТN) и появлении T-клеток из тимических прекурсоров не так значима [11]. В качестве возможных вариантов эрадикации ВИЧ были предложены подмена CD4+ CD27+ CD28+ ТCM и ТTM клеток путем трансплантации ВИЧ-устойчивых стволовых клеток [14], удаление или разрушение латентно инфицированных клеток при помощи так называемых стратегий «шока и уничтожения» [15,16], а также другие подходы, нацеленные на самообновление Т-клеток памяти в комбинации с АРТ [6]. Мы исходили из того, что агенты, способные сместить дифференцировку клеток в сторону фенотипов с короткой продолжительность жизни, либо приводящие к смерти латентно инфицированных клеток ТCM с большой продолжительность жизни, можно использовать для сокращения продолжительности жизни латентно инфицированных клеток, тем самым сокращая размеры вирусных резервуаров. Подобный подход также направлен на предупреждение повторного увеличения резервуара ВИЧ через репликацию скрытого вируса посредством ограничения персистенции в популяции вновь инфицированных клеток. Золотосодержащий препарат ауранофин является препаратом для перорального применения, одобренным для лечения ревматоидного артрита [17], заболевания, характеризующегося, среди прочего, ростом субпопуляции ТCM – клеток в периферической крови [18]. Ауранофин также применяют при лечении других аутоиммунных заболеваний, например, дискоидной красной волчанки [19]. Хорошо изученный профиль безопасности данного препарата позволяет проводить длительную терапию лиц при регулярном мониторинге их состояния. Среди наиболее часто встречающихся побочных эффектов отмечают диарею, протеинурию и в редких случаях тромбоцитопению/супрессию деятельности костного мозга [20]. Механизм действия ауранофина понятен не до конца: известно, что ауранофин: 1) угнетает пролиферативный потенциал T-лимфоцитов в условиях in vitro [20,21]; 2) снижает образование провоспалительных цитокинов в макрофагах и Т-клетках [22,23]; 3) индуцирует апоптоз в Т-клетках линии Jurkat [24,25]. Влияние ауранофина на пролиферацию и выживаемость Т-клеток в условиях in vivo изучено при лечении синдрома Джесснера – доброкачественного лимфопролиферативного заболевания [26]. Кроме того, данный препарат не оказывает влияния на процесс регенерации Т-клеток. Это было показано при терапии лиц, инфицированных ВИЧ-1, с псориатическим артритом, при котором снижения абсолютного числа CD4 не наблюдалось [27]. Также, ауранофин в комбинации с противораковыми препаратами способствует апоптозу и дифференцировке лейкемических клеток в условиях in vitro [28]. Если в отношении клеток, инфицированных лентивирусами, будут наблюдаться схожие эффекты, данный препарат может стать полезным средством, мишенью для которого будет выступать вирусный резервуар. В данном документе мы показываем, что воздействие ауранофина в условиях in vivo уменьшает число вирусных клеток у обезьян, инфицированных SIVmac251 и проходивших АРТ, и задерживает и угнетает возврат вирусной нагрузки (ВН) после прекращения терапии. Методы Разделение и изоляция субпопуляций CD4+ T-клеток методом клеточного сортинга, культивирования клеток и проточной цитометрии Протокол описан в части ^ Content 1, http://links.lww.com/QAD/A141. Лечение животных В рамках данного исследования использовали обезьян (индийские макаки-резусы), которых содержали на базе BIOQUAL, Inc в соответствии со стандартами и руководствами, установленными Законом о благополучии животных, Руководством по содержанию и использованию лабораторных животных, а также требованиями, предъявляемыми Международной ассоциацией по аттестации и аккредитации содержания лабораторных животных (AAALAC), после получения разрешения Комитета по содержанию и использованию животных (IACUC). Схематичное изложение информации по исследованиям на низших приматах представлено на Рисунке 1 в части Supplemental Digital Content 2, http://links.lww.-com/QAD/A141. Низшим приматам, инфицированным SIVmac251, и проходившим терапию с применением тенофовира/эмтрицитабина и ралтегравира [29], показывающим стабильный вирусологический ответ на протяжении восьми недель [т.е. < 40 копий вирусной РНК (вРНК)/мл] перорально давали ауранофин (производство компании Prometheus Laboratories, San Diego, CA) в режиме два раза в день вместе с едой (начальная доза составляла 1,5 мг/кг/день в первую неделю, после чего наращивалась до 2 мг/кг/день). АРТ проводилась непрерывно на протяжении всего периода лечения. Согласно данным, полученным ранее, у тех же обезьян до АРТ отмечалось либо прогрессирующее снижение показателя числа CD4, либо стабильно субнормальные значения, что свидетельствует о том, что данных особей нельзя рассматривать как нонпрогрессоров на протяжении длительного периода времени [29]. Препараты тенофовир (PMPA) и эмтрицитабин (FTC) были любезно предоставлены компанией Gilead Sciences (Фостер Сити, Калифорния). Препараты ралтегравир, дарунавир и ритонавир был приобретены у производителей. Субероиланилид гидроксамовой кислоты (SAHA) был синтезирован для исследования в соответствии с ранее опубликованным протоколом [30]. Степень очистки соответствует лабораторной чистоте. Животным подкожно вводили тенофовир (20 мг/кг/день) и эмтрицитабин (50 мг/кг/день). Ралтегравир (100 мг два раза в день), дарунавир (375 мг два раза в день) и ритонавир (50 два раза в день) животные получали перорально. ^ Методом ПЦР с использованием зондов TaqMan проводили измерение вирусной ДНК (вДНК) и уровня вРНК в плазме (с проведением обратной транскрипции при измерении вРНК) (Biosystems, Фостер Сити, Калифорния) [29]. Гематологические анализы проводились на базе компании IDEXX (IDEXX Preclinical Research, Вест Сакраменто, Калифорния). С протоколом подсчета числа CD4+ и CD8+ Т-клеток можно ознакомиться в ссылочном материале [29]. Анализ образцов проводился на проточном цитометре FACSCalibur (BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния). Соотношение числа ТN, ТCM и ТEMклеток определялось методом поточной цитометрии с использованием шестицветной маркировки в соответствии со стандартным протоколом, описанным Питчером и соавт. [Pitcher et al.] [31]. ^ Статистическая обработка подробно описана в части Supplemental Digital Content 3, http://links.lww.com/QAD/A141. Результаты Ауранофин изменяет дифференцировку клеток с большой продолжительностью жизни в сторону фенотипов с короткой продолжительностью жизни ex vivo На первом этапе мы провели оценку влияния ауранофина на жизнеспособность CD4+ T-клеток при терапевтических концентрациях [32] посредством измерения процентного показателя CD4+ T-клеток, окрасившихся Аннексином V и Vivid (маркеры апоптоза) после воздействия ауранофином на протяжении 48 часов. Ауранофин приводил к дозозависимому повышению числа клеток, окрашенных Аннексином V+ и Vivid+ (Рисунок 1А, В). Поскольку было показано, что ауранофин индуцирует как смерть клеток, так и процесс дифференцировки [28,33], мы предполагаем, что смерть клеток объясняется додифференцирующим действием препарата. Нами было установлено, что ауранофин снижал уровень экспрессии CD27 на поверхности клеток (Рис. 1С), а наблюдаемое снижение уровня экспрессии сопровождалось повышением числа V+ клеток, окрашенных Аннексином (Рис. 1D). Важно отметить, что при измерении значения дифференцировки таких независимых от стадии антигенов, как CD3 или CD4, эффект снижения уровня экспрессии не наблюдался (данные не представлены). В целом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что ауранофин индуцирует процесс дифференцировки CD4+ T-клеток в сторону фенотипов с короткой продолжительностью жизни, и что данная дифференцировка сопряжена со смертью клеток. С целью подтверждения додифференцирующего эффекта ауранофина мы отобрали субпопуляции наивных CD4+ T-клеток (TN; т.е.. CD45RA+ CD27+ CCR7+ ), TCM (CD45RAˉ CD27+ CCR7+ ), TTM (CD45RAˉ CD27+ CCR7ˉ ) и ТEM (CD45RAˉ CD27ˉ CCR7ˉ ) из обогащенных фракций CD4+ T-клеток человека и обработали их ауранофином (10-500 нмоль). Анализ фенотипа, проведенный после двух дней инкубации, показал, что субпопуляции клеток, обработанных ауранофином, быстрее меняли свой исходный фенотип по сравнению с необработанными контрольными образцами (см. Рисунок 2, Supplemental Digital Content 1, http://links.lww.com/QAD/A141, по результатам одного репрезентативного эксперимента). Одна часть клеток ТCM и ТTM прогрессировала в сторону фенотипа ТEM, тогда как другая, хотя и демонстрировала уменьшение CD27, также экспрессировала антиген CCR7 (см. Рис. 2, Supplemental Digital Content 2, http://links.lww.com/ QAD/A141). Клетки CD27low/- CCR7+ обладают сравнительно малоизученным фенотипом, обнаруженным в клеточных культурах после активации ex vivo T-клеток и материалах биопсии подвздошной кишки лиц, инфицированных Вич [6,34]. Показатель распространенности данного фенотипа среди получаемых фенотипов ТN и ТCM клеток, обработанных ауранофином, подтверждает предположение о том, что ауранофин определенно влияет на процессы, ведущие к снижению уровня экспрессии CD27. Индукция фенотипов CD27low/- предшествовала усилению гибели клеток, особенно в звене памяти, что было показано результатами экспериментов в динамике времени (см. Рис. 3, Supplemental Digital Content 2, http://links.lww.com/QAD/ A141). В отношении латентно инфицированных первичных клеток CD4+, изолированных у лиц с ВИЧ-1 и показавших хорошие результаты при АРТ, ауранофин демонстрировал продифференцирующее действие (данные не представлены), однако вирусную реактивацию не индуцировал. Мы приходим к выводу, что ауранофин снижает продолжительность жизни долгоживущих клеток ex vivo, и что такое снижение продолжительности жизни сопряжено с частичным или полным снижением уровня экспрессии CD27. ^ Свойство ауранофина индуцировать изменения дифференцировки CD4+ Т-клеток и смерть долгоживущей субпопуляции, составляющей вирусный резервуар у человека, явилось поводом для проведения пилотного исследования с целью оценки влияния данного препарата на резервуар лентивирусов с использованием недавно предложенной животной модели, а именно, на макаках-резусах, инфицированных SIVmac251 и показавших устойчивое подавление вирусной нагрузки при АРТ тремя препаратами.(тенофовир/эмтрицитабин/ралтегравир) [29] (см. Рис. 1 Supplemental Digital Content 2, http://links.lww.com/QAD/A141 информация по дизайну исследования на животных). Ауранофин хорошо переносился, гематологические показатели и результаты, полученные в рамках биохимических анализов крови (почечных и печеночных ферментов), оставались в норме. После одного месяца терапии ауранофином наблюдалось существенное снижение популяций долгоживущих TCM/TTM CD4+ Т-клеток в периферической крови (Рис. 2А), а также относительное повышение супбпопуляции ТEM (Рис. 2В), в то время как показатели по клеткам ТN оставались без изменений (34,2 ±7,0% на исходном уровне и 42,9 ± 9,3% в день 30; Р =0,1077; односторонний критерий Стьюдента). Схожие эффекты наблюдались в субпопуляции CD8+ T-клеток (данные не представлены). Общий показатель числа CD4+ T-клеток оставался стабильным (1643±653 на исходном уровне и 1550±615 в день 30; Р = 0,52; двухсторонний парный t-критерий), что согласуется с ранее полученными результатами при терапии псориатического артрита ауранофином у человека, показавшими отсутствие изменения количества CD4 [27]. Поскольку существенного повышения числа клеток ТN не наблюдалось, относительное снижение клеток ТCM/ТTM, вероятно, было сопряжено с особым действием препарата и не объяснялось поздним повышением числа клеток ТN, как отмечалось другими исследователями [Autran et al.] у людей при АРТ [35]. Снижение числа клеток TCM/TTM проходило параллельно со снижением уровня вДНК в мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК), уровень которых упал ниже предела обнаружения (2 копии/5 х 105 клеток) у всех особей после четырех недель воздействия ауранофином (Рис. С). У обезьян показатель ВН на уровне ниже предела обнаружения сохранялся на всем протяжении периода исследования, за исключение преходящих отклонений у P044 (720 вРНК копий/мл, 8 недель). Несмотря на устойчивую супрессию вируса у большинства обезьян, мы наблюдали возврат значений вДНК у всех животных через восемь недель после окончания воздействия ауранофином [21,83 ±11,20 вДНК копий/5x105 (среднее ± СО)]. Данный возврат значений вДНК в мононуклеарных клетках периферической крови указывает на репликацию вирусов, скрытых в анатомических резервуарах обезьян, получавших АРТ, что было недавно показано в исследовании со схожими методами моделирования животных [Bourry et al. ] [36]. Это предположение подтверждается данными по клеточным культурам с применением ВИЧ-1, показывающим снижение способности клеток ТEM противостоять вирусной репликации (в сравнении с таким показателем для родственной клеточной линии ТCM/TTM). [37]. Результаты данного пилотного исследования наглядно продемонстрировали, что ауранофин может как минимум временно уменьшать резервуар вДНК. ^ Результаты пилотного исследования подтолкнули нас на проведение оценки продолжительных эффектов ауранофина на вДНК в дизайне контролируемого исследования. В качестве контрольной группы выступали макаки-резусы, показавшие устойчивое подавление вирусной нагрузки на фоне проводимой АРТ, аналогичной той, что использовали в группе, получавшей ауранофин. С целью предупреждения возможного расширения вирусного резервуара посредством проходящей вирусной репликации в тканях-депо, АРТ была интенсифицирована включением дарунавира, усиленного ритонавиром, для всех особей. Усиленная (интенсифицированная) АРТ (уАРТ) дополнительно способствовала наблюдаемому снижению вДНК у обезьян, получавших ауранофин [P= 0,0066; t-критерий Стьюдента]. Данная тенденция не наблюдалась в контрольной группе, получавшей только уАРТ (обезьяны 4416 и 4423) [P= 0,6393; t-критерий Стьюдента]. Различия в группах по качеству ответа были показаны как при обработке данных с помощью критерия Фишера (Рис. 3), так и при помощи дисперсионного анализа ANOVA с повторными измерениями (P = 0,013). Мы заключили, что ауранофин в комбинации с уАРТ существенно снижал показатель вДНК, ассоциированной с CD4+ T-клетками, у обезьян, инфицированных SIVmac251. Вирус не удалось культивировать из CD4+ T-клеток в периферической крови обезьян после одиннадцати недель прохождения уАРТ в комбинации с ауранофином. Данный факт свидетельствует о том, что большинство копий вДНК, все еще выявляемой в мононуклеарных клетках периферической крови части обезьян на данном этапе, были дефектны. ^ SIVmac251, способного к репликации Методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени не удалось выявить вРНК в материале биопсии лимфоузла, полученного у особей, принимавших участие в исследовании, за исключением особей контрольной группы, получавших только уАРТ, т.е. у обезьян 4416, у которых наблюдался уровень 20 копий вРНК/ 5 x 105 клеток. С целью демонстрации влияния ауранофина в комбинации с уАРТ на резервуары вирусов, способных к репликации, мы провели динамический анализ с использованием ингибитора гистоновой деацетилазы (HDAC) — вориностата (SAHA), имеющего свойства воздействовать на активность репликации и уровень латентности вируса [16]. На десятой неделе терапии уАРТ с ауранофином обезьянам начали вводить перорально дозу SAHA в объеме 178,5 мг/м2 поверхности тела в режиме два раза в день на протяжении трех дней, после чего проводили сравнение наблюдаемого ответа с таковым у двух контрольных особей (т.е. особей 4438 и 4398), получавших те же дозы SAHA при прохождении уАРТ согласно аналогичному протоколу без приема ауранофина. Несмотря на два цикла введения SAHA, значения ВН находились на уровне ниже предела обнаружения у всех шести обезьян, проходивших терапию ауранофином. Возврат виремии после одного цикла SAHA наблюдался у двух контрольных особей (Рис. 3В). Данное наблюдение свидетельствует о том, что аурафин в комбинации с уАРТ ограничивает размер чувствительного к SAHA вирусного резервуара, содержащего способный к репликации вирус. ^ С целью изучения способности ауранофина индуцировать естественный продолжительный контроль процесса репликации SIVmac251 без проведения уАРТ, все проводимые терапии были прекращены после того, как показатели вДНК в мононуклеарных клетках периферической крови (МКПК) достигли уровня ниже предела обнаружения при проведении минимум трех анализов. В группе проведения только уАРТ для обезьяны 4423 была прекращена терапия в соответствии с аналогичным протоколом, принятым для группы приема ауранофина. У контрольной особи 4416 из группы, получавшей только уАРТ, выявившей повышение значения вДНК (103 копии/ 5 х 105 МКПК в неделю 14 уАРТ), прекращена терапия в последующую неделю, т.е. после середины периода проведения уАРТ в группе приема ауранофина. Обезьяна P252 отвечала критериям включения в другое исследование и поэтому была исключена из протокола отмены терапии. Группа ауранофина в сравнении с группой проведения только уАРТ показала существенную задержку возврата ВН (P= 0,0495; критерий Гехана-Бреслоу-Вилкоксона; Рис. 4; см Рис. 4 в части Supplemental Digital Content 2, http://links.lww.com/QAD/A141 по кривым выживаемости). Стоит отметить, что у двух обезьян, проходивших терапию ауранофином (M970 и P249), значения вирусной нагрузки вернулись к исходным по истечении 7-й и 8-й недели после окончания терапии, что значительно превышает время возврата ВН в контрольной группе, получавшей только уАРТ (среднее значение: 1,5 недели). Несмотря на то, что активность инфекционного процесса возобновилась, в группе ауронофина наблюдаемая ВН была значительно ниже, чем соответствующее значение ВН до начала терапии у тех же животных, а также ниже, чем в группе, получавшей только уАРТ (Рис. 4A и B). Сравнительный анализ значений до начала терапии и после соответствовал тенденциям, описанным выше для групп человекообразных и низших приматов [38,39]. В расширенный период наблюдения была включена обезьяна M970 (Рис. 4B). На протяжении семи месяцев после отмены лечения данная особь была контрольной по показателю виремии в соответствии с актуальным протоколом [40], т.е. стабильные показатели ВН на уровне ≤5000 копий/мл (ниже предела обнаружения при проведении минимум двух анализов), и высокое число CD4. Несмотря на отмену терапии, значение числа CD4 у данной обезьяны продолжало расти (+15,23±5,408 клеток/мкл/неделя; P= 0,0088; t-критерий Стьюдента; Рис. 4B). У двух других обезьян из группы лечения ауранофином в комбинации с уАРТ существенного накопления CD4 не наблюдалось (M974 и P249; P= 0,2559 и 0,8737 соответственно; t-критерий Стьюдента; Рис. 4B). Стоит отметить, что у всех обезьян из группы лечения ауранофином в комбинации с уАРТ, наблюдалось либо постоянное снижение показателей, либо неизменно субнормальное значение числа CD4 до начала проведения АРТ [29]. Исходя из имеющихся данных о том, что соотношение CD4/CD8 является маркером прогрессирования заболевания [41] и роста вирусного резервуара [4,6], после отмены терапии мы проводили мониторинг данного показателя. Обезьяны из группы лечения ауранофином показали, одновременно с пиком ВН, преходящее снижение соотношения CD4/CD8 (См. Рис. 5А в части Supplemental Digital Content 2, http://links.lww.com/QAD/A141, на котором демонстрируется общая тенденция). Это сопровождалось повышением абсолютного числа CD8+ T-лимфоцитов, статистически выраженным в день 4 (P<0,05; критерий Стьюдента-Ньюмана-Кеулса), т.е. во временной связи с пиком ВН (см. Рис. 4B; и Рис. 5B в части Supplemental Digital Content 2, http://links.lww.com/QAD/A141 по общим тенденциям). Затем у данных особей наблюдался период стабилизации соотношения CD4/CD8 за счет снижения числа CD8 (P<0,05; Стьюдента-Ньюмана-Кеулса) (Рис. 4B; Рис. 5, Supplemental Digital Content 2, http:// links.lww.com/QAD/A141). Обезьяны, проходившие только уАРТ, показывали либо неизменно субнормальное соотношение CD4/CD8, либо снижение числа CD8 по отношению к CD4+ T-клеткам (Рис. 4А и Рис. 5 в части Supplemental Digital Content 2, http://links.lww.com/QAD/A141). Кроме такого параметра, как соотношение CD4/CD8 клеток, обезьяны, стабильные в отношении числа CD4 клеток, также выявляли и другие редкие феномены, ранее выявленные и описанные у лиц инфицированных ВИЧ-1, прекративших терапию после острой фазы, но демонстрировавших некоторый период стабильной вирусной нагрузки без воздействия терапии [42]. К таким параметрам относят число вДНК или вРНК в биоптате прямой кишки ниже предела обнаружения (т.е. <2 копий /5 х 105 клеток) и низкий уровень вДНК в МКПК (см. Рис. 6 в части Supplemental Digital Content 2, http://links.lww.com/ QAD/A141). Как мы и ожидали, последний параметр в значительной степени зависел от изменений уровня CD4 (см. Рис. 6 в части Supplemental Digital Content 2, http:// links.lww.com/QAD/A141), что согласуется с наблюдениями у человека и в итоге свидетельствует в пользу того, что абсолютное число CD4 клеток характеризует «резервуар» ВИЧ [6]. ^ Согласно полученным нами данным, уменьшения вирусного резервуара можно достичь посредством фармакологического воздействия, а снижение вирусного резервуара обуславливает, в свою очередь, контроль репликации после отмены терапии. За исключением Берлинского пациента [14], снижение ВН после отмены лечения наблюдается только при лечении на ранних стадиях, а не в хронической фазе [42–45]. Результаты проведенного нами исследования соответствуют модели, согласно которой ускорение обновления лимфоцитов приводит к изменению фенотипа Т-клетки «резервуара» на фенотип с короткой продолжительностью жизни и последующей гибели как клетки, так и вируса. Данная модель согласуется с фактом значительной зависимости, существующей между изменением CD4+ ТCM/ТTM клеток и периодом полужизни вДНК, ассоциированной с клетками, при лечении ауранофином в комбинации с уАРТ (Таблица 1). В случае правильности данного суждения, стратегия терапии, мишенью для которой являются клетки ТCM/ТTM с большой продолжительностью жизни, может быть использована для уменьшения размера вирусного резервуара. Согласно многофакторному корреляционному анализу возможное повторное восстановление контрольного значения вДНК после отмены терапии в значительной степени зависит как от снижения ТCM/ТTM во время лечения ауранофином, так и других переменных, среди которых выделяют невиремический период после отмены терапии и пик ВН при повторном появлении вРНК в плазме (Таблица 1). Неожиданной находкой в рамках данного исследования было беспрецедентное повышение/снижение ВН, напоминающей острую инфекцию, после отмены лечения у обезьян, проходивших терапию ауранофином/уАРТ. При острой инфекции долгосрочный эффект длины и амплитуды пика виремии на «резервуар» подтвержден исследованиями, проведенными на людях и обезьянах, проходивших антиретровирусную терапию на ранних стадиях заболевания, и демонстрирующих, что угнетение исходной виремии приводит к продолжительному контролю вирусного резервуара [42–44]. Согласно частному корреляционному анализу, схожий феномен также наблюдался у обезьян, получавших ауранофин. После устранения эффектов ауранофина на вДНК и клетки ТCM/ТTM пик ВН был единственным параметром, коррелирующим с возможным резервуаром вДНК в отсутствие терапии (Р = 0,04). Причины, объясняющие раннее противовирусное воздействие и влияние на вирусные резервуары, до сих пор неизвестны. Иммуно-опосредованные механизмы, заслуживающие дальнейшего изучения, также могли сыграть важную роль в наблюдаемом ограничении размера вирусного резервуара при повторном проявлении ВН. Хорошо известно, что иммунный ответ важен для восстановления контроля за виремией при начальных фазах заболевания [46]. У обезьян, проходивших терапию ауранофином, во временной близости к повторному появлению ВН наблюдался пик числа CD8, который не был выявлен в группе особей, проходивших только уАРТ. Можно предположить, что данный пик CD8 показывает вероятность последующего контроля вирусной репликации. В данном контексте исходный баланс между ВН и иммунным ответом может быть ключевым параметром для определения возможного резервуара. Появление пика CD8 в группе приема ауранофина и его отсутствие в группе контрольных особей, проходивших только уАРТ, наводит на мысль, что снижение популяции клеток ТCM/ТTM, вызываемое ауранофином, не только не нарушает иммунный ответ против вируса, но и в некотором смысле способствует ему. Данное предположение подтверждается результатами, показывающими, что популяция клеток ТCM взаимосвязана с анергией по отношению к вирусным антигенам у макак-резусов (Macaca mulatta), но не у дымчатых мангобеев (Cercobus atys), по своей природе устойчивых к потери CD4+ T-клеток и СПИДу с развернутой клинической картиной [47]. Таким образом, данный феномен может иметь важное следствие. Оно заключается в возможности проведения лечения и применении терапевтических вакцин при хронической фазе инфекции [42,48], во время либо перед повторным появлением острой инфекции. Выводы Ауранофин в комбинации с уАРТ снижал популяцию клеток ТCM/ТTM и ограничивал размер вирусного резервуара у макак-резусов. Данные события сопровождались сдерживанием виремии в период после отмены терапии. Последующее исследование данных феноменов, возможно, позволит найти средство лечения от ВИЧ-1/СПИДа.  ^ А.В. Влияние ауранофина на жизнеспособность CD4+ T-клеток человека в день 2 инкубации и снижение уровня экспрессии CD27 (включая общее число CD4+ T-клеток). Анализ смерти клеток проводили по окрашиванию Annexin V и Vivid. С) Дозозависимое снижение уровня экспрессии CD27 в CD4+ T-клетках человека на фоне введения ауранофина. На графиках А, В, С представлены значения по четырем независимым экспериментам. Пунктирные линии соответствуют 95% доверительным интервалам для кривых регрессии. В таблице представлены Р-значения – коэффициенты корреляции различных проанализированных параметров, полученные при проведении многофакторного корреляционного анализа по методу Спирмена. D) На точечной диаграмме показан уровень экспрессии CD27 (%) и частота клеток Annexin V+ в CD4+ T-клетках после 48 часов инкубации при введении ауранофина и без него (данные по живым клеткам и клеткам Annexin V+). Один эксперимент из трех показывает схожие результаты. Р-значения, представленные ниже, относятся к дозозависмому повышению числа клеток CD27low/-, окрашенных Annexin V (согласно линейной регрессии).
 ^ + T-клеток памяти и частота клеток, накапливающих вирусную ДНК в МКПК у резус-макак, инфицированных SIVmac251 и проходивших АРТ в комбинации с ауранофином на протяжении четырех недель. (А) Соотношение TCM/TTM клеток; (В) Соотношении TEM клеток; С) Число копий вирусной ДНК (вДНК) в МКПК. На графиках А и В представлено логит-преобразование, т.е. логарифм[соотношение/(1-соотношение)], нанесенное на ось Y для нормализации. Также представлены Р-значения, полученные методом статистического анализа для связанных групп (парный t-критерий). На графике В представлены значения, полученные с использованием одностороннего t-критерия, поскольку прогнозировалось отсутствие эффекта либо повышения значений вследствие существенного относительного снижения числа TCM/TTM клеток, показанного на графике А с использованием двустороннего критерия.
 ^ (А) Усредненные значения вирусной ДНК (± СПС) в МКПК обезьян, проходивших уАРТ в комбинации с ауранофином (n=6) и только уАРТ (n=2). (B) Усредненные значения вирусной нагрузки (± СПС) в плазме после введения ингибитора деацетилаз гистонов, SAHA, упомянутым выше обезьянам, проходившим уАРТ в комбинации с ауранофином (n=6) и двум контрольным особям, проходившим только уАРТ. Линии, параллельные оси Y, определяют период, на протяжении которого особям вводили SAHA. Первый цикл введения SAHA (штриховые пунктирные линии) проводили всем обезьянам; последующий цикл (точечные пунктирные линии) – только обезьянам на уАРТ в комбинации с ауранофином. На каждом графике Р-значения, показанные черным цветом, отражают существенную разность кривых.
 Рис. 4. Мониторинг вирусо-иммунологических показателей у макак-резусов, инфицированных SIVmac251, после отмены только интенсифицированной АРТ (уАРТ) (А) либо уАРТ в комбинации с ауранофином (В). А, В) Вирусная нагрузка (ВН) показана красным (на оси Y слева). Также представлены значения CD4 (черным) и CD8 (зеленым) (на оси У справа). Черные линии соответствуют наклону для CD4 [сплошные линии обозначают существенные снижения (P<0,05, t-критерий для наклона), пунктирные линии – несущественные снижения]. Обращаем внимание, что у обезьяны M974 низкий уровень CD4 также наблюдался до инфицирования [29]. Обезьяна M970 была включена в расширенный период наблюдения. С) Сравнение контрольных значений ВН после отмены уАРТ (после проведения АРТ) и значения ВН до АРТ. Синий цвет: уАРТ в комбинации с ауранофином; красный цвет: только уАРТ. Р-значения даны по разности показателей ВН до и после проведения АРТ в группе уАРТ в комбинации с ауранофином (горизонтальная сноска) и по разности показателей ВН после проведения АРТ в группах уАРТ в комбинации с ауранофином и только уАРТ (вертикальная сноска).
 Таблица 1 Многофакторная корреляция отобранных вирусо-иммунологических показателей в группе обезьян, проходивших терапию ауранофином и уАРТ
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям