Макарова светлана Ивановна роль полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в предрасположенности к атопическим заболеваниям и гепатотоксичности противотуберкулёзной терапии
|
|
Скачать 0.8 Mb.
|
|
На правах рукописи МАКАРОВА Светлана Ивановна РОЛЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ В ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К АТОПИЧЕСКИМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ И ГЕПАТОТОКСИЧНОСТИ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЁЗНОЙ ТЕРАПИИ 03.02.07 – генетика Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Уфа – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН
Защита состоится «____»_______________2011 г. в «_____» часов на заседании Объединенного Диссертационного совета ДМ 002.133.01 при Учреждении Российской Академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, Уфа, пр. Октября, 71. ИБГ УНЦ РАН С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского научного центра РАН (Уфа, пр. Октября, 71), с авторефератом – на сайте ВАК РФ и на сайте ИБГ УНЦ РАН ibg.anrb.ru/dissov.html e-mail: [email protected] Автореферат разослан «___»________________2011 г.
^ Актуальность проблемы. Последние десятилетия характеризуются увеличением заболеваемости атопическими болезнями (АЗ). Эти заболевания называют ещё экологически обусловленными, так как наблюдается положительная корреляция заболеваемости с увеличением химической нагрузки на среду обитания человека [Авдеенко, 1990; Балаболкин, 1994; Шамов и др. 1997; Brunekreef, 1997; Schaid, Rowland, 1998; Ciccone et al., 1998; Norris et al., 1999; Gavett, Koren, 2001; Burr et al., 2003; Соломон, 2003]. По своей генетической природе эти заболевания являются полигенными, или многофакторными с аддитивно-полигенным наследованием с пороговым эффектом [Holgate, 1997; Пузырев и др., 1998; Hall, 1999]. Идентификация в различных популяциях специфичных генов и средовых факторов, взаимодействие которых формирует норму реакции человека и его адаптацию к меняющейся среде обитания, приобретает в последние десятилетия всё большую актуальность [Спицын и др., 2006]. Атопический дерматит (АД) является первым по срокам возникновения атопическим заболеванием. Наличие атопического дерматита у ребёнка считается одним из факторов высокого риска развития бронхиальной астмы (БА) [Wahn, 2002]. В настоящее время известен ряд полиморфных генов, определённые варианты и генотипы которых обнаруживают связь с АЗ [Фрейдин, 2001; Cookson, 2005; Lee et al., 2006]. В их число входят гены, функции белковых продуктов которых тесно связаны с развитием изучаемой патологии. К ним относят гены факторов антигенного распознавания и гуморального иммунного ответа; гены факторов воспаления, среди которых большую важность имеют гены ферментов метаболизма медиаторов воспаления; гены рецепторов цитокинов и агентов воспаления, гены внутриклеточных сигнальных молекул. Гены ферментов биотрансформации ксенобиотиков (ФБК) также являются кандидатными в формировании предрасположенности к данным патологиям, так как их белковые продукты осуществляют взаимодействие со средой, детоксицируя или токсифицируя чужеродные химические соединения, попадающие в организм, в том числе и лекарственные препараты [Jacqz-Aigrain, Cresteil, 1992; Ingelman-Sundberg, 1995; Mancinelli et al., 2004]. Но они ещё недостаточно исследованы в качестве генетических факторов предрасположенности к этим заболеваниям. Эти гены являются достаточно сложным объектом исследования в силу ряда их специфических особенностей. Это и перекрывающаяся субстратная специфичность, и индуцибельность, и участие в метаболизме эндогенных соединений. Но именно эти особенности ФБК и позволяют предполагать, что они могут быть генетическими маркёрами на всех этапах развития заболевания от его инициации к исходу и, соответственно, позволят выявить предрасположенность, помочь в ранней диагностике заболевания, зная генотип больного, составить прогноз течения заболевания, выбрать наиболее оптимальную терапию. Кроме того, в случае АЗ, диапазон проявления генотипа в фенотипе для генов ФБК может быть очень широким. Показано, что фенотипические эффекты проявления генов могут различаться для разных рас, этнических групп одной расы, у мужчин и женщин, в разных возрастных группах, при воздействии различных внешних факторов. В связи с этим ясно, что каждая конкретная популяция должна быть обследована для того, чтобы выявить ту группу людей, в которой исследуемый полиморфизм играет важную роль в развитии заболевания [Garte, 2001; Ляхович и др., 2006]. Так как гены ФБК участвуют в метаболизме лекарств, то они часто являются ответственными за побочные эффекты лекарственной терапии [Ryan et al., 1985; Huang et al., 2002; Bhaiya et al., 2006; Vuilleumier et al., 2006]. Трудностями медикаментозного лечения такого социально значимого заболевания, как туберкулёз лёгких, являются частые побочные реакции. Изониазид, метаболизируемый в основном N-ацетилтрансферазой 2 (NAT2), со времени начала его использования остаётся одним из наиболее широко используемых препаратов в лечении туберкулёза. NAT2-зависимый метаболизм изониазида в нетоксичный ацетилизониазид и далее в ацетилгидразин и диацетилгидразин служит противовесом для амидазо-зависимого пути, в результате которого образуется токсичный гидразин [Huang, 2002]. Несмотря на длительный период времени, в течение которого известны быстрый и медленный фенотип ацетилирования и полиморфизм гена NAT2 как его основа, попытки сопоставления фенотипа ацетилирования и генотипа NAT2 в целях оптимизации терапии туберкулёза лёгких являются немногочисленными, выполнены на небольших группах здоровых добровольцев и с дозами изониазида в 2-4 раза более низкими, чем используемые в клинической практике лечения туберкулёза в Росиии [Kita et al., 2001; Kinzig-Schippers et al., 2005; Сhen et al., 2009]. В то же время больные часто имеют целый ряд сопутствующих хронических заболеваний желудочно-кишечного тракта, бронхо-лёгочной и эндокринной систем, алкоголизм, наркоманию, а также ВИЧ-инфекцию [Зарецкий, 1997; Колпакова, 2002; Montoro, Rodriguez, 2007]. Решение этих задач является особо важным для России, учитывая широкое распространение атопических заболеваний среди детей, а также высокий уровень побочных эффектов при медикаментозной терапии туберкулёза. В настоящее время информация о роли полиморфизма генов ФБК в предрасположенности к атопическим заболеваниям и развитии побочных эффектов лекарственной терапии туберкулёза является достаточно ограниченной не только в России, но и во всём мире. Учитывая это, целесообразным было проведение настоящего исследования. ^ : Изучение полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков как возможных генетических факторов риска возникновения атопических заболеваний у детей (бронхиальной астмы и атопического дерматита) и некоторых клинических проявлений этих заболеваний, а также гепатотоксичности при лечении туберкулёза лёгких у взрослых. ^ : 1. Изучить ассоциацию полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (цитохрома Р4501А1 (CYP1A1), глутатион S-трансфераз М1 (GSTM1), T1 (GSTT1) и Р1 (GSTP1), ариламин N-ацетилтрансферазы 2 (NAT2)) c атопическим дерматитом и бронхиальной астмой. 2. Сравнить величины показателей ассоциации с бронхиальной астмой полиморфных вариантов генов ФБК (CYP1A1, GSTM1, GSTT1, GSTP1, NAT2) и полиморфных вариантов генов интерлейкинов (IL4, IL5), их рецепторов (IL4R, IL5R) и антагониста рецептора (IL1RA). 3. Оценить возможное увеличение показателей ассоциации полиморфных вариантов генов ФБК с бронхиальной астмой у детей с наследственной отягощённостью в семейном анализе и в исследовании «случай – контроль», как проявление феномена антиципации. 4. Изучить межгенные взаимодействия в формировании предрасположенности и особенностей течения атопических заболеваний у детей. 5. Изучить влияние курения на показатели ассоциации полиморфных вариантов генов ФБК (GSTM1, GSTT1, GSTP1, NAT2) с риском возникновения атопических заболеваний. 6. Изучить влияние комплексных конститутивных признаков (пол и возраст) на ассоциацию полиморфных вариантов генов ФБК с атопическими заболеваниями. 7. Охарактеризовать генетический полиморфизм гена NAT2 у больных туберкулёзом с сопутствующими заболеваниями и оценить связь полиморфных вариантов с развитием побочных реакций на противотуберкулёзные препараты. 8. Сопоставить скорости ацетилирования тестовых препаратов с генотипами NAT2 у больных бронхиальной астмой и туберкулёзом легких. 9.Оценить фармакокинетику изониазида у больных туберкулёзом лёгких и ассоциацию показателей элиминации препарата с развитием побочных реакций на противотуберкулёзные препараты. 10. Оценить информативность фенотипа ацетилирования и генотипа NAT2 в оценке предрасположенности к побочным эффектам лекарственной терапии туберкулёза лёгких. ^ Впервые определены частоты встречаемости полиморфных вариантов генов ФБК и интерлейкинов в выборках детей – европеоидов, в основном русских, больных АД и БА и, соответствующей контрольной группы без атопических заболеваний г. Новосибирска. В исследованиях «случай – контроль» показана ассоциация полиморфных локусов генов ФБК и генов интерлейкинов с атопическими заболеваниями. Показано, что в формировании предрасположенности к БА преимущественно задействованы полиморфные варианты генов ФБК, тогда как в развитии клинических форм заболевания большую роль играют полиморфные варианты генов интерлейкинов. Показано, что и для АД, и для БА одни и те же полиморфные варианты генов ФБК являются факторами риска заболевания и изменения клинико-лабораторных показателей атопии, общих для АЗ, таких как повышенный уровень иммуноглобулина Е в сыворотке крови и количество эозинофилов. Впервые было показано, что такие показатели атопии, как уровень общего IgE в сыворотке крови, процент эозинофилов и диаметр пятна в кожном прик-тесте у детей, больных БА, возрастают с накоплением нулевых аллелей в генотипе GSTM1. Показано, что величина показателя ассоциации полиморфных вариантов генов ФБК с БА зависит от возраста и модифицируется полом. Установлено, что группами максимальной подверженности атопическому дерматиту являются девочки с гомозиготным генотипом GSTP1(105Ile/Ile), подвергавшиеся воздействию курения в семьях (OR = 6,38**), особенно девочки младше 11 лет (OR = 26,25***). Гомозиготный генотип NAT2(C481T)(СС) также вносит наибольший вклад в предрасположенность к бронхиальной астме в группе девочек младше 11 лет, как подвергавшихся (OR = 20,0***), так и не подвергавшихся воздействию курения в семьях (OR > 35, 5**). Показано, что гетерозиготные генотипы по исследованным признакам являются факторами устойчивости к атопическим заболеваниям. Выявлена значительная вариабельность элиминации изониазида у больных туберкулёзом и процента ацетилирования сульфадимезина у больных бронхиальной астмой с одинаковым генотипом NAT2. Наиболее широкая вариабельность фенотипа ацетилирования показана у пациентов с гетерозиготным генотипом NAT2. Показано, что медленный фенотип ацетилирования предрасполагает к гепатотоксичности при противотуберкулёзной терапии как в группах с отсутствием, так и в группах с наличием сопутствующих заболеваний. ^ Результаты исследования ассоциаций полиморфных вариантов генов ФБК с многофакторными заболеваниями могут быть использованы в профилактической медицине для формирования групп повышенного риска заболевания. Знание показателей ассоциации полиморфных вариантов генов ФБК с клиническими особенностями течения БА и АД у детей и последствий противотуберкулёзной терапии у взрослых дают возможность прогнозирования течения заболевания у конкретного больного и оптимизации терапии. Результаты исследования ассоциаций генотипов при воздействии курения могут быть использованы для профилактической работы с родителями. Результаты проведённого анализа гепатотоксичности противотуберкулезных препаратов у лиц с разным генотипом NAT2 и его фенотипом, определённым по элиминации изониазида, могут быть применены в лечебных противотуберкулёзных учреждениях для выявления среди больных лиц с высоким риском развития гепатотоксических реакций. Теоретической значимостью данной работы можно считать получение экспериментальных подтверждений важного положения популяционной генетики о приспособительном значении гетерозиготных генотипов на примере устойчивости гетерозиготных генотипов генов ФБК к атопическим заболеваниям у детей. ^ 1. Полиморфизм генов ФБК является важной составляющей генетической основы как предрасположенности, так и устойчивости к атопическим заболеваниям. 2. Величина показателей ассоциации полиморфных вариантов генов ФБК с предрасположенностью к БА сравнима с таковой для генов цитокинов, вовлечённых в основной патогенетический механизм. 3. Пассивное курение, пол и возраст существенно влияют на величины показателя ассоциации полиморфных вариантов генов ФБК с предрасположенностью к АЗ у детей. 4. Гены ФБК играют роль не только в развитии предрасположенности к АЗ, но и в формировании некоторых клинических проявлений этих заболеваний. 5. Вариабельность скорости ацетилирования тестовых препаратов у пациентов с гетерозиготными генотипами NAT2 превышает таковую у пациентов с гомозиготными генотипами. 6. Фенотип ацетилирования изониазида и генотип NAT2 могут служить маркёрами возможного развития гепатотоксичности при противотуберкулёзной терапии. ^ Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на 7-м Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 1997), IV, V Национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 1997, 1998), 2-м, 3-м и 4-м съездах Российского Биохимического общества (Москва, 1997; Санкт-Петербург, 2002; Новосибирск, 2008), 6-м Европейском съезде международного общества изучения ксенобиотиков (ISSX) (Готенбург, Швеция, 1997), Международных конгрессах «Interasthma 97» (Канары, 1997), «Интерастма» (Москва, 1998), 12-м международном симпозиуме по микросомам и окислению лекарств (Монпелье, Франция, 1998), конгрессе Европейского общества респиратологов (ERS) (Мадрид, Испания, 1999), 13-м международном симпозиуме по микросомам и окислению лекарств (Стреза, Италия, 2000), III съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Екатеринбург, 2000), Всероссийской научной конференции с международным участием «Север – человек: Проблемы сохранения здоровья» (Красноярск, 2001), 1-й Всероссийской конференции с международным участием «Влияние загрязнения окружающей среды на здоровье человека» (Новосибирск, 2002), XVII Всемирном конгрессе по астме (Санкт-Петербург, 2003), 6-й научно-практической конференции врачей «Современные лечебные и диагностические методы в медицинской практике» (Новосибирск, 2005), Международной конференции «Фундаментальные науки для биотехнологии и медицины» (Новосибирск, 2006), 16-м Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2006), 3-й международной конференции «Фундаментальные науки – медицине» (Новосибирск, 2007), 4-ом международном рабочем совещании по ариламин N-ацетилтрансферазе (Александрополис, Греция, 2007), Международном рабочем совещании «Research on Tuberculosis/ State of Art in Russia» (Москва, 2007), 2-й международной конференции «Erlich II Magic Bullets» (Нюрнберг, Германия, 2008), Всероссийской конференции, посвящённой 10-летию кафедры генетики БГПУ им. М. Акмуллы, приуроченной к ежегодным Вавиловским чтениям (Уфа, 2009), 2-м съезде клинических фармакологов Сибирского федерального округа (Барнаул, 2009). Публикации: По материалам диссертации опубликовано 53 работы, в том числе в журналах из Перечня ВАК РФ – 17, из них в журналах из международной базы цитирования – PubMed. – 10. ^ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трёх глав собственных результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 356 страницах, иллюстрирована 98 таблицами и 37 рисунками. Список литературы содержит 498 источников, из них 364 зарубежных. ^ Характеристика выборок обследованных людей. Изучение ассоциации полиморфных вариантов исследуемых генов с БА у детей выполнено в рамках программы «Здоровье населения Сибири», проект «Выявление детей с высокой степенью риска хронизации бронхолёгочных заболеваний с помощью оценки полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков» (руководители – академик РАМН В.В. Ляхович, член-корреспондент РАМН С.М. Гавалов). Обследовано 100 детей, больных БА – от 4 до 14 лет, средний возраст 8,2 лет. Дети, подвергавшиеся пассивному курению, составили группу пассивных курильщиков (ПК). Группу детей, не подвергающихся такому воздействию табачного дыма, мы обозначили как НК. Наличие аллергии к 3-м и более типам аллергенов расценивали как поливалентную аллергию. За раннее начало заболевания принимали его развитие в возрасте не позднее 3 лет. Степень тяжести заболевания оценивали в соответствии с критериями, рекомендованными в Национальной программе «Бронхиальная астма у детей, стратегия лечения и профилактика». Клиническое наблюдение за больными осуществлялось врачом к.м.н. Рябовой О.А. Контрольную группу (104 ребёнка) составили пациенты травматологического отделения в период проведения контрольных анализов перед выпиской. Основным критерием отбора в контрольную группу было отсутствие любых проявлений сенсибилизации. Исследование ассоциации нуль-полиморфизма глутатион S-трансферазы М1 с атопической БА в семейном анализе было проведено для 100 детей с БА и 268 членов их семей. Критерием отбора в группу обследования было наличие клиники БА, атопического статуса, выраженной сенсибилизации к бытовым или пыльцевым аллергенам. Постановка диагноза проводилась по классификации БА согласно документу «Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы» (2002). Степень тяжести заболевания оценивалась по клиническим проявлениям, частоте, тяжести и длительности приступов, показателям функции внешнего дыхания, состоянию ребёнка в период ремиссии. Отбор пробандов, больных БА, и их родственников в семейном анализе осуществляла врач-аллерголог к.м.н. Батычко О.А. Для оценки роли полиморфизма ариламин N-ацетилтрансферазы 2 в формировании предрасположенности к БА в семейном анализе использовались образцы крови представителей 48 семей г. Томска, любезно предоставленные Институтом Медицинской генетики СО РАМН. Среди обследованных было 74 здоровых и 15 больных взрослых, 15 здоровых и 46 больных детей. Исследование ассоциации полиморфизма генов ФБК с АД проводилось на выборке 109 детей в возрасте от 1 до 15 лет с диагнозом АД из числа госпитализированных и наблюдаемых в Областном Аллергодерматологическом центре (МУЗ ГДКБ №1 г. Новосибирск). Работу с больными проводила к.м.н. Ляпунова А.А. Для оценки роли фенотипа и генотипа NAT2 в развитии побочных эффектов противотуберкулёзной терапии под наблюдением находились 178 пациентов. Группа I (75 человек) получала противотуберкулёзную терапию в интермиттирующем режиме – 2 раза в неделю. Группа II (103 человека), получали лекарства ежедневно внутрь. По наличию и характеру сопутствующих заболеваний пациенты каждой из I и II групп были распределены на 3 подгруппы. Больные с хроническими вирусными гепатитами В, С, В и С составили подгруппы IА и IIA. Больные с рядом хронических латентно-протекающих заболеваний желудочно-кишечного тракта и желчевыделительной систем составили подгруппы IB и IIB. Больные, не имевшие сопутствующих заболеваний, составили подгруппы IС и IIC. Функциональное состояние печени оценивали при поступлении, планово ежемесячно, а также в период развития реакции на препараты и её регрессии по результатам активности аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланинамино-трансферазы (АЛТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), γ-глутамилтранспептидазы (ГГТП), а также по содержанию в сыворотке крови общего и конъюгированного билирубина. При госпитализации у больных клинико-лабораторные проявления хронического гепатита отсутствовали. Клиническое наблюдение за больными осуществлял врач к.м.н. Мутайхан Ж. Для выполнения поставленных задач использовались следующие методы:
Таблица 1 Определение генотипов с помощью аллель-специфичной ПЦР
Таблица 2 Определение генотипов с помощью аллель-специфичной ПЦР
Таблица 3 Определение генотипов с помощью метода полиморфизма длин рестрикционных фрагментов по исследованным полиморфизмам
Продолжение таблицы 3
^ Ассоциация полиморфных вариантов генов ФБК с атопическими заболеваниями Показаны различия в распределении генотипов и аллелей генов ФБК в выборках детей без признаков атопии (контрольная группа) и группах с АД и БА: достоверные в группах контроля и АД для генотипов (p<0,01) и аллелей (p<0,001) гена GSTT1, генотипов гена GSTP1 с АД (p<0,001), генотипов по однонуклеотидным заменам С481T (p<0,05) и G590A (p<0,01) гена NAT2; в группах контроля и БА для генотипов и аллелей гена CYP1A1 (p<0,05), для генотипов (p<0,01) и аллелей (p<0,001) гена GSTT1, для генотипов гена GSTP1 (p<0,01), для генотипов (p<0,01) и аллелей (p<0,001) по однонуклеотидной замене С481T гена NAT2. В гене NAT2 оценены частоты внутрилокусных гаплотипов. Во всех группах гаплотипы 1/1 и 0/0 встречались реже, а гаплотипы 1/0 и 0/1 чаще, чем при случайном распределении, что соответствует литературным данным: гаплотип 0/0 является аллелем NAT2*6E [Human NAT2 alleles (Haplotypes), 2010], который встречается у европеоидов редко [Dandara et al., 2005]. Генотипы и гаплотипы, для которых были выявлены статистически значимые величины отношений шансов АД и БА, представлены в табл. 4. Таблица 4 Ассоциация генотипов ФБК c АД и БА
Примечание: * – p<0,05; ** – p<0,01; *** – p<0,001 Анализ ассоциации генотипов ФБК с АЗ показал, что большинство генотипов генов ФБК являются или факторами риска обоих АЗ: NAT2(C481T)(11), NAT2(G590A)(00) гаплотип CC/GG гена NAT2, GST1(00), GSTP1(00) и GSTP1 (10), или факторами устойчивости к ним: NAT2(C481T)(10), GSTT1(1), GSTP1(10) и гаплотип TT/GG гена NAT2. Результаты исследований ассоциации генотипов NAT2 c БА, проведенных другими авторами, показывают, что они были ассоциированы либо с предрасположенностью, либо с устойчивостью к БА в выборках разной этнической принадлежности или занимающих разное географическое положение. Так, в выборке детей русской этнической принадлежности Башкортостана, как и в нашей, гомозигота NAT2*481T/T (NAT2(C481T) (00) является фактором устойчивости к бронхиальной астме (OR = 0,49) [Фёдорова, 2009], а в польской [Pawlik et al., 2009], индийской [Batra et al., 2006], и турецкой [Tamer, 2006] выборках этот генотип является фактором предрасположенности к БА. Гомозиготная делеция гена ^ являлась фактором риска заболевания БА у детей в семейном анализе (OR = 19,29***) в группе детей с двусторонней наследственной отягощённостью по аллергическим заболеваниям, а в группах детей с односторонней (OR = 2,95), без наследственной отягощённости (OR = 2,08) и в исследовании «случай – контроль» (OR = 1,52) показатель ассоциации не достигал статистической достоверности. Анализ 87 статей, опубликованных до 2008 года, посвящённых ассоциации GST c БА, показал, что в большинстве работ делеции GSTM1 и GSTT1 ассоциированы с заболеванием БА, лишь в некоторых работах ассоциаций не выявлено. Генотипы GSTP1 могут быть либо факторами предрасположенности, либо факторами устойчивости к БА в выборках разной этнической принадлежности: гомозигота по мутантному алллелю GSTP1(00) является фактором риска БА в нашей и в одной из турецких выборок, но является фактором устойчивости в других выборках. Гетерозигота же по этому признаку всегда является фактором устойчивости к БА [Minelli, 2010]. Таким образом, полученные результаты выявили ассоциацию следующих генотипов генов ФБК: NAT2(C481T)(11), NAT2(G590A)(00) гаплотип CC/GG гена NAT2, GST1(00), GSTP1(00) и GSTP1(10) с предрасположенностью к АЗ, а генотипов: NAT2(C481T)(10), GSTT1(1), GSTP1(10) и гаплотип TT/GG гена NAT2 с устойчивостью к ним. Различия эффектов гомозиготных вариантов полиморфных генов ФБК в предрасположенности к атопическим заболеваниям в разных этнических группах, вероятно, обусловлены эволюционно сложившимися взаимодействиями генотип-среда, специфичными для каждой человеческой популяции. ^ В клинико-эпидемиологических наблюдениях установлено, что пассивное курение является фактором риска возникновения у детей как АД [Балаболкин, 1991; Schäfer, 2006], так и БА [Гавалов, 1984; Infante-Rivard., 1999]. Взаимодействие комплекса специфичных генов и внешних факторов формируют норму реакции устойчивости человека к среде обитания, а заболевания – результат их взаимодействия уже за пределами нормальной реакции на среду [Бочков, 1997; Алтухов, 2003]. Курение, будучи одним из факторов риска атопических заболеваний, является также одним из немногих факторов окружающей среды, поддающимся учёту со стороны исследователя. Достоверные ассоциации полиморфных вариантов генов ФБК раздельно для пассивно курящих (ПК) и не подвергавшихся фактору курения (НК) детей, представлены в таблице 5. Таблица 5 Ассоциация генотипов ФБК с атопическими заболеваниями детей в зависимости от курения
Примечание: Примечание: * – p <0,05; ** – p < 0,01; ◊ – минимальная величина OR, рассчитана из предположения, что следующий индивид в контрольной группе будет иметь указанный генотип; # – максимальная величина OR, рассчитанная из предположения, что следующий индивид в выборке больных будет иметь указанный генотип. Анализ показал, что дети ПК, имеющие генотип GSTP1(11), имеют повышенный риск заболеть АД, по сравнению с НК детьми, а бронхиальной астмой только девочки ПК (OR = 4,5*). Сочетания генотипов ФБК, в которых имеется GSTP1(11), также имеют бóльшее значение в предрасположенности к АД у детей, подвергавшихся курению, это обусловлено, вероятно, токсификацией компонентов табачного дыма ферментом этого гена. Показано, что аллозим фермента GSTP1, имеющий изолейцин в 105 положении аминокислотной последовательности, более активен в отношении 1-хлор-2,4-динитробензола и алкилирующих агенов, чем валиновый аллозим [Eaton, Bammler, 1999]. Показатели ассоциации генотипа NAT2(G590A)(00) с АД, GSTT1(00) с АД и с БА существенно выше при отсутствии влияния фактора курения. Возможно, это связано с участием ферментов этих генов в метаболизме эндогенных субстратов, такое участие показано и для NAT, и для GST. Но это может быть связано и с тем, что курение воздействует также и на какие-то иные механизмы, отличные от участия ФБК, и таким образом, заболевают и носители генотипов, устойчивых к заболеванию в отсутствии воздействия фактора курения. Косвенно об этом свидетельствуют наши же данные о том, что курение влияет и на предрасположенность к астме, связанной с полиморфизмом тандемных повторов антагониста рецептора к интерлейкину 1 (IL1RA). ^ Результаты, представленные в табл. 6, показывают, что у детей обоих полов одни и те же полиморфные варианты большинства исследованных генов ФБК являются факторами предрасположенности к БА и АД. Таблица 6 Ассоциация АЗ с генотипами ФБК в зависимости от пола ребёнка
Примечание: * – p<0,05; ** – p<0,01; *** – p<0,001 Но наблюдаются заметные различия между мальчиками и девочками для глутатион-S-трансфераз. Причём, ассоциация гомозиготной делеции GSTT1 с БА более выражена у мальчиков, тогда как гомозиготы по Ile аллелю GSTP1 (GSTP1 (11)) – у девочек. Несколько признаков являются значимыми для девочек, но не являются таковыми для мальчиков в предрасположенности к АД: NAT2(G590A)(10), GSTP1(11), GSTP1(10). В работе [Miyagi et al., 2009] показано, что имеются половые различия в развитии антиоксидантной защиты, включая цитозольные глутатион S- трансферазы, у детей разного пола. У девочек уровень активности цитозольных GST был достоверно ниже, чем у мальчиков. Возможно, это объясняет наблюдаемый нами факт. Литературные сведения о возможных половых различиях в функционировании суперсемейства GST, которые бы позволили объяснить наблюдаемые нами ассоциации, недостаточны. Согласно Singhal S.S. et al., 1993, GSTP1 является главной формой глутатион S-трансферазы, экспрессируемой в коже, и её активность существенно выше у лиц женского пола, чем мужского. ^ Исследованные гены ФБК располагаются на разных хромосомах: NAT2 на 8-ой, CYP1A1 на 15-ой, а GSTT1 – на 22-ой, GSTM1 – на 1-ой, GSTP1 на 11-ой хромосомах, но кодируемые ими белки могут функционально сопрягаться в метаболических путях через общие интермедиаты, поэтому следовало оценить взаимодействие исследованных полиморфных вариантов в предрасположенности к АЗ. Анализ результатов взаимодействия изученных полиморфных локусов генов ФБК методом MDR показал, что вклад полиморфизмов генов в правильность распознавания генотипов больных АД и здоровых детей уменьшается в следующем ряду: делеционный полиморфизм GSTT1 (HGSTT1 = 5,24%), локус Ilе105Val гена GSTP1 (HGSTP1= 2,55%), локус G590A гена NAT2 (HG590ANAT2 = 2,25%), локус C481T гена NAT2 (HС481TNAT2 = 1,54%) и наименьший вклад вносит делеционный полиморфизм гена GSTM1 (HGSTM1 = 0,46%). Для БА прослеживается уменьшение вклада полиморфных генов в следующем ряду: локус C481T гена NAT2 (HС481TNAT2 = 5,10%), делеционный полиморфизм GSTT1 (HGSTT1 = 3,03%), локус Ilе105Val гена GSTP1 (HGSTP1= 1,77%), локус Ilе462Val гена CYP1A1 (HCYP1A1 = 1,01%), делеционный полиморфизм гена GSTM1 HGSTM1 = 0,81%), локус G590A гена NAT2 (HG590ANAT2 = 0,16%) (рис. 1). Эти результаты согласуются с результатами сопоставления показателей ассоциации (отношений шансов) генотипов ФБК с атопическими заболеваниями. Последовательность этих величин находится в соответствии с результатами сопоставления отношений шансов. Одним из несомненных достоинств метода MDR является то, что чем больше полиморфизмов взято в рассмотрение, тем точнее модель оценивает вклад каждого полиморфного локуса и их взаимодействий. Метод MDR позволяет также, благодаря анализу взаимодействий между полиморфными локусами, уменьшить размерность (число) необходимых для правильной дискриминации генотипов больных и здоровых индивидов. В данном исследовании удалось вычленить малоинформативные полиморфизмы (CYP1A1, GSTM1 и NAT2G590A – для БА и GSTM1 – для АД). Однако, выявить комбинацию полиморфных локусов, которая бы была более информативна, чем отдельные локусы не удалось (рис. 1), это объясняется, не только биологическими свойствами продуктов данных генов - у них разная субстратная специфичность - но и особенностями метода MDR: он учитывает вклад полиморфизма в целом, не учитывая отдельных его генотипов. Метод сопоставления показателей ассоциации (OR) более чувствителен к вкладу отдельных генотипов конкретных полиморфных локусов. Сопоставление отношений шансов, полученных при анализе ассоциаций индивидуальных генотипов, с полученными при совместном анализе нескольких полиморфных локусов генов ФБК, показало отсутствие выраженных изменений величин этого показателя. Только если в генотипе индивида сочетаются гомозиготная делеция гена GSTT1 и гомозигота по аллелю дикого типа GSTP1(A313G), ассоциированные с предрасположенностью к обоим АЗ, риск заболевания и АД (OR = 10,51***), и БА (OR = 6,08*) значительно возрастает.  Рисунок 1. Граф взаимодействий полиморфных локусов генов ФБК при атопическом дерматите (А) и бронхиальной астме (Б). Вероятной метаболической основой этого эффекта может быть неэффективная детоксикация ксенобиотиков, в конъюгации которых с глутатионом участвуют обе эти GST. Например, известна перекрывающаяся активность цитозольных GST в отношении хлорнитробензолов [Hayes, 2005]. Бóльший вклад полиморфизма GSTP1 в развитие АД, чем БА, возможно также является отражением того, что основной формой GST в коже является GSTP [Jernstorm et al., 1989; Raza et al., 1991]. ^ Для АД и для БА общими характеристиками являются повышенный уровень IgЕ и количество эозинофилов периферической крови. В исследованиях «случай – контроль» мы использовали как количественные, так и качественные показатели («нормальный» уровень IgЕ и «повышенный» (≥120 E/мл); «гиперэозинофилия» (>4% для АД и >8% для БА)). В семейном анализе, где была возможность выявить гетерозиготные генотипы GSTM1, использовались количественные показатели. Повышенный уровень IgE у больных АД ассоциирован со следующими генотипами ФБК: GSTM1(00)+GSTP1(10) (OR = 4,0; p<0,05); GSTT1(00)+NAT2(C481T)(10) (OR = 5,4, p<0,05); GSTP1(10)+NAT2(C481T)(10) (OR = 3,33, p<0,05); GSTM1 (OR = 1,55) (у девочек (OR = 5,60, p<0,05)). Уровень иммуноглобулина Е у больных БА прямо коррелирует с числом нулевых аллелей GSTM1 в генотипе пациентов (семейный анализ) (табл. 7). Количество эозинофилов в крови больных БА также коррелирует с числом нулевых аллелей гена ^ количество эозинофилов достоверно выше (7,47* ± 5,88), чем во всей группе больных детей (5,39 ± 4,9). Повышенный уровень эозинофилов ассоциирован у больных АЗ с генотипами, в состав которых входят гомозиготные делеции генов GSTM1 и GSTT1: у больных АД: GSTM1(00) (OR = 3,77, p<0,01), GSTM1(00) + GSTT1(1) (OR = 3,86, p<0,05), GSTM1(00)+NAT2(C481T)(10) (OR = 3,0, p<0,05), у больных БА с генотипами: GSTM1(00)+NAT2(G590A)(10) (OR = 3,39, p<0,05; для НК – 7,81, p<0,01), GSTT1(00)+NAT2(G590A)(10) (OR = 8,71, p<0,001; для НК – 11,56, p<0,05). Таблица 7. Количественные показатели сенсибилизации у детей с атопической бронхиальной астмой с учётом генотипов GSTM1 в группах с различной наследственной отягощённостью по аллергическим заболеваниям (n = 100)
Примечание: Сравнение проводилось с генотипом GSTM1(1) * – p<0,05; ** – p<0,01; *** – p<0,001; I – дети из семей с двусторонней наследственной отягощённостью; II – дети, у которых один из родителей страдал АЗ; III – дети, у родителей которых отсутствовали АЗ. Для таких клинических проявлений как тяжесть заболевания, раннее развитие для БА или форма заболевания (младенческая, детская, подростковая) для АД, поливалентная аллергия для БА, генотипы, предрасполагающие к их развитию, были индивидуальными для каждого заболевания. Таким образом, общность генетических признаков, предрасполагающих к обоим АЗ и являющихся прогностическими факторами общих клинических проявлений этих заболеваний, указывает на связь данных генов с механизмами формирования атопии. ^ Группа многофакторных заболеваний характеризуется, как правило, более ранним началом и некоторым утяжелением клинических проявлений в нисходящих поколениях семейных случаев (Бочков, 1997; Горбунова, 1999; Altshuler et al., 1998). Сравнение детей с наследственной отягощённостью по аллергическим заболеваниям и детей без таковой показало, что величины отношения шансов выше для детей с наследственной отягощённостью (табл. 8). Чтобы судить о причастности полиморфных вариантов генов ФБК к реализации патогенных эффектов окружающей среды, мы проанализировали ассоциацию генотипов с предрасположенностью к БА в обеих группах раздельно для детей ПК и НК (табл. 8). Показатели ассоциации (OR) генотипов генов ФБК с БА различались в группах НК и ПК. У НК ассоциация генотипов NAT2(C481T)(11), GSTT1(00), GSTT1(00) + GSTM1(00) с БА значительно выше, чем у ПК, и выше у детей с наследственной отягощённостью, чем без таковой. Таким образом, можно утверждать, что полиморфизмы генов ФБК участвуют в формировании восприимчивости, обусловленной взаимодействием генов с факторами окружающей среды, когда заболевают дети от здоровых родителей, имеющие варианты генов ФБК, способствующие заболеванию в конкретных условиях окружающей среды. Кроме того, высокие величины OR для GSTT1(00) и NAT2(C481T)(11) в условиях отсутствия курения и наследственной отягощённости позволяют предположить, что дефекты ФБК имеют значение для становления иммунной системы и формирования бронхиальной реактивности у детей. Таблица 8 Ассоциация генотипов ФБК с бронхиальной астмой в зависимости от воздействия курения и наследственной отягощённости
Примечание: * – p<0,05; ** – p<0,01; *** – p<0,001 В семейном анализе с участием жителей г. Новосибирска мы показали, что процент больных с генотипом GSTM1(00) возрастает в ряду: дети от здоровых родителей, дети из семей с одним больным родителем, дети из семей с двусторонней отягощённостью (табл. 9). Таблица 9 Распределение и статистические показатели различий генотипов GSTM1 у детей с АБА в группах с учётом наследственной отягощённости
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям