Новые подходы к фармакокоррекции неспецифических составляющих патогенеза токсических поражений 14. 00. 25 фармакология, клиническая фармакология 14. 00. 16 патологическая физиология

^ Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Международной конференции «Новые лекарственные средства: синтез, технология, фармакология, клиника» (Минск, 2001), конференции «Клинические исследования лекарственных средств в России» (Москва, 2001, 2007), IX, X, XI, XIV Российских национальных конгрессов «Человек и лекарство» (2002, 2003, 2004, 2007), I национальной научно-медицинской конференции «Здоровье человека» (Ереван, Армения, 2002), VI, VIII и IX Международной научной конференции «Здоровье семьи – XXI век». (Дубаи, ОАЭ, 2002; Гоа, Индия, 2004; Далянь, Китай, 2005; Бангкок, Таиланд, 2006), на научных сессиях Пермской государственной медицинской академии (Пермь, 2002, 2006), Международной конференции «Reactive oxygen and nitrogen species, antioxidants and human health» (Смоленск, 2003), II съезде Российского научного общества фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии» (Москва, 2003), конференции «Основные общепатологические и клинические закономерности развития критических терминальных и постреанимационных состояний, принципы их коррекции» (Москва, 2003), IV Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 69 печатных работ.

^ Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 283 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы описания материалов и методов исследования, 9 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 621 источник, из них 339 отечественный и 282 зарубежный. Работа иллюстрирована 8 рисунками и содержит 34 таблицы.


^ Материалы и методы исследования.

Экспериментальные исследования проведены на 154 белых беспородных мышах-самцах и самках массой 17-24 г и 956 белых беспородных крысах-самцах массой 140-260 г, содержащихся на стандартной диете вивария в условиях свободного доступа к воде. Использованы также лимфоциты периферической крови 42-х здоровых доноров-добровольцев.

В качестве объекта исследования использовали химически чистые субстанции бемитила (2-этилтиобензимидазола гидробромид) и бромантана (N-(2-адамантил)-N-(пара-бромфенил)амин, соединения Б-16 [2-(3,4-дигидроксифенацил-тио] бензимидазол, а также комбинированные лекарственные формы препаратов: пирабел (комбинированная капсулированная лекарственная форма бемитила 0,25 и пирацетама 0,6); бромитил (комбинированная лекарственная форма таблеток бромантана 0,1 и бемитила 0,125).

Препаратами сравнения в различных сериях экспериментов служили: антиоксидант – ионол; актопротекторы – этомерзол, тиетазол. В работе также применяли антидоты ФОС – М-холиноблокатор – атропин, реактиватор холинэстеразы – диэтиксим; радиопротектор – цистамин; антидот метгемоглобинобразующих ядов – метиленовый синий.

Механизмы и эффективность фармакологической коррекции процессов свободно-радикального перекисного окисления липидов, мембранотоксического действия и метаболических нарушений оценивали по следующим показателям:

1. 
   Антирадикальная активность и антиоксидантная эффективность соединений в модельных системах различной сложности.
   
2. 
   Накопление продуктов ПОЛ в липидных экстрактах (ткани) головного мозга, миокарда, печени и эритроцитов.
   
3. 
   Гемолитическая стойкость и электрофоретическая подвижность эритроцитов.
   
4. 
   Интенсивность флуоресценции зонда АНС в мембранах эритроцитов.
   
5. 
   Активность СОД эритроцитов и каталазы мозга, печени и эритроцитов.
   
6. 
   Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Гл-6-ФДГ) в цитоплазматической фракции печени и мозга, в эритроцитах.
   
7. 
   Активность СДГ, МДГ, аргиназы и КФС в митохондриальной фракции гепатоцитов.
   
8. 
   Активность Na⁺/К⁺ АТФазы в ткани печени и микросомальной фракции мозга.
   
9. 
   Активность аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ), уроканиназы, лактатдегидрогеназы (ЛДГ), щелочной (ЩФ) и кислой фосфатаз (КФ) в сыворотке крови.
   
10. 
    Уровень цитохромов Р450 и b₅ в микросомах и монооксигеназные активности в гомогенатах печени крыс.
    
11. 
    Выживаемость животных при различных видах острой гипоксии и отравлений химическими веществами.
    
12. 
    Уровень малонового диальдегида (МДА), уроканиназы, гистидазы, СДГ, треониндегидратазы (ТДГ), СОД, каталазы, глутатионпероксидазы (ГП), АлАТ, АсАТ, общего билирубина в сыворотке крови пациентов, пострадавших от аварии на Чернобыльской АЭС и принимавших бемитил.
    

Механизмы защитной эффективности бемитила и его совместного применения с антидотами (метиленовый синий, цистамин) оценивали при остром смертельном отравлении нитритом натрия (введение под кожу спины крыс 4% раствора нитрита натрия в дозе 400 мг/кг) и в условиях метгемоглобинемии, вызванной хронической нитритной интоксикацией (подкожное введение крысам нитрита натрия в дозе 50 мг/кг в сутки в течение 4-х недель).

Исследование влияния бемитила и его сочетанного применения с антидотами ФОС (атропин, диэтиксим) на состояние мембран, процессы ПОЛ и некоторые метаболические реакции оценивали на модели острой интоксикации ФОС, вызванной путем однократного внутрижелудочного введения крысам карбофоса в дозах 0,8 - 0,9 LD₅₀ или однократного внутримышечного введения армина в дозе 0,75 мг/кг (0,9 LD₅₀).

Эффективность бемитила при токсическом поражении печени оценивали при экспериментальном циррозе печени, который создавали путем внутрижелудочного введения 50% раствора смеси полихлорированных бифенилов и трихлорбензола, соответствующей рецептуре «Совтол-10», на оливковом масле из расчета 0,25 мл на 100 г массы тела 2 раза в неделю в течение 4-х недель. Вместо воды для питья использовали 10% раствор этанола.

Содержание бемитила, бромантана и бромитила в крови, органах и тканях экспериментальных животных определяли газохроматографическим методом. Анализ проводили на газовом хроматографе (модель 3700 с электроннозахватным детектором, содержащим ⁶³Ni-β-ионизационный источник) с использованием стеклянной колонки длиной 2 м (внутренний диаметр 2,5 мм). В качестве сорбента использовался Chromaton N-Super c 3% жидкой фазы SE-30. Скорость потока газа-носителя (азот особой чистоты): через колонку – 25 мл/мин; через детектор – 60 мл/мин.

Содержание пирацетама, бемитила и пирабела в крови определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Анализ проводили на хроматографе «Perkin Elmer» (США) модель 601 с УФ-детектором при длине волны 280 нм с использованием метода обращенно-фазной хроматографии на колонке длиной 250 мм и внутренним диаметром 2,5 мм, заполненной селикагелем с привитой фазой октадецилсукцината с длиной цепи С18. В качестве подвижной фазы использовали элюент следующего состава: ацетонитрил – 35%, 0,1М трис-буфер с рН=7,5 – 25%, вода – 40%. Скорость подачи элюэнта на колонку 1 мл/мин.

Микросомы печени получали методом дифференциального центрифугирования (Ahokas J. et al., 1977). 12000g-гомогенаты (субмитохондиальная фракция) получали методом O. Pelkonen (Pelkonen O. et al., 1974). Концентрацию белка определяли по методу Лоури или Брэдфорда (наборы Bio-Rad Protein Assay Kit; Bio-Rad Laboratories, США). Содержание цитохромов Р450 и b₅ в суспензии микросом определяли методом T. Omura и R. Sato (1964) на спектрофотометре «Specord M40».

Активность аминопирин-N-деметилазы и анилин-р-гидроксилазы определяли в 12000g-гомогенатах по методу O. Pelkonen (Pelkonen O. et al., 1974). Идентификацию продуктов реакции осуществляли спектрофотометрически стандартным способом, используя реактив Nash в случае аминопирин-N-деметилазной активности и цветную реакцию образования индол-фенольного комплекса в случае анилин-р-гидроксилазной активности.

Скорость О-деметилирования 4-нитроанизола оценивали по количеству образовавшегося р-нитрофенола (микрометод B. Schoene (Schoene B. et al. 1972)). Концентрацию р-нитрофенола определяли на планшетном спектрофотометре Multiscan-Plus (Labsystems, , Финляндия) при λ=450 нм. 2,5-дифенилоксазол-р-гидроксилазную активность определяли по методу J. Ahokas et al. (1987). Концентрацию водорастворимого метаболита 5-(р-гидроксифенил)-2-фенилоксазола определяли на флуориметре Versa FLUOR (Bio-Rad Laboratories, США).

Определение ЭРОД и БРОД активностей в 12000g-гомогенатах печени осуществляли по методу С. Thompson et al. (1989), в лимфоцитах – в модификации С. Сибиряка (Sibiryak S. et al. 2001).

Для постановки реакции бласттрансформации лимфоциты выделяли из венозной крови методом градиентного центрифугирования (45 мин., 400g), на градиенте Ficoll-Paque Plus (Pharmacia Biotech, США). Выделенные мононуклеары ресуспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 50 мкг/мл гентамицина, 10% эмбриональной телячей сыворотки и культивировали 72 часа (37ºС, 5% СО2). Концентрация клеток в культуре составляла 1∙10⁶ клеток/мл. Для индукции пролиферации использовали митогены – смесь фитогемагглютинина Р (10 мкг/мл) и митогена лаконоса (5 мкг/мл).

Эффективность применения бемитила в комплексе реабилитационных мероприятий контингента, пострадавшего от аварии на Чернобыльской АЭС, оценивали у 81 пациента в возрасте от 40 до 70 лет из числа ликвидаторов последствий Чернобыльской аварии, страдающих хроническими заболеваниями гепатобилиарной системы с нарушениями функции печени. Все пациенты, получающие стандартную гепатопротекторную терапию, были случайным образом разделены на две группы. Пациентам исследуемой группы (54 человека) дополнительно назначали бемитил в дозе 750 мг/сут (250 мг в таблетках 3 раза в день) в течение двух недель. Контрольную группу составили 27 пациентов со сходными поло-возрастными характеристиками. Исходно и после проведенного курса лечения оценивали клинические симптомы и лабораторные признаки печеночной дисфункции.


Статистический анализ результатов

Анализ результатов проводили с использованием пакета статистических программ реализованных в Windows 2000/XP: Statistica 6.0 (StatSoft), Pharmacologic Calculation System 4.1. Использовали параметрические и непараметрические методы анализа. Различия между группами считали достоверными при уровне значимости p<0,05.


^ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Антиокислительную активность бемитила и других производных бензимидазола исследовали на двух модельных системах свободнорадикального окисления различной сложности. Активность соединений в системе «этилбензол-ледяная уксусная кислота» оценивали по величине константы К₇ (характеризует антирадикальную активность препаратов), которую сопоставляли с константой К₇ ионола – известного синтетического ингибитора свободнорадикальных реакций. Показано, что бемитил, этомерзол и соединение Б-16 проявляют выраженную антирадикальную активность (табл. 1). Наиболее активными препаратами в данной модельной системе являются этомерзол и соединение Б-16, которые по способности ингибировать инициированное окисление этилбензола не уступали ионолу (ионольный эквивалент - 0,64 и 0,65, соответственно). Тиетазол и диэтиксим не проявляли антиокислительной активности в данной модельной системе.

Активность препаратов также оценивали в модельной системе с использованием гомогената печени крыс, оценивая влияние препаратов (через 1, 2, 3 и 4 часа после инкубации) на процессы свободно-радикального перекисного окисления липидов при спонтанном, неферментном (Fe²⁺ аскорбатзависимом) и ферментном ПОЛ.

Таблица 1

Антирадикальная активность препаратов, оцененная на модельной системе инициированного окисления этилбензола

Препарат	Антирадикальная активность, К7 (л/моль) с	Ионольный эквивалент
Бемитил	(1,00,3) ∙103	4,5∙10-2
Этомерзол	(1,40,1) ∙104	0,6
Соединение Б-16	(1,50,2) ∙104	0,65
Тиетазол	0,0	-
Диэтиксим	(8,12,0) ∙101	3,5∙10-3
Ионол	(2,30,6) ∙104	1,0

В условиях аскорбатзависимого и ферментного ПОЛ антиоксидантная активность бемитила не уступала этомерзолу и соединению Б-16. В условиях автоокисления (система спонтанного ПОЛ) этомерзол был несколько активнее бемитила (препараты ингибировали ПОЛ на 73% и 62%, соответственно). Препараты незначительно уступали ионолу по способности ингибировать свободно-радикальное ПОЛ (51% - 73%, против 75% - 100% под действием ионола). Тиетазол практически не влиял на процессы ПОЛ.

Таблица 2

Антиокислительная активность препаратов, оцененная на модельной системе перекисного окисления липидов печени крыс

Препарат (соединение)	Антиокислительная активность, %
	Спонтанное ПОЛ	Неферментное ПОЛ	Ферментное ПОЛ
Бемитил	62	51	67
Этомерзол	73	55	67
Соединение Б-16	не определяли	62,5	68
Тиетазол	не определяли	20,8	10,5
Ионол	100	100	75

Таким образом, в различных модельных системах показана высокая антирадикальная и антиокислительная активность бемитила и других производных бензимидазола – этомерзола и соединения Б-16.

В условиях острого смертельного отравления экспериментальных животных нитритом натрия, введение мышам бемитила в дозе 25 мг/кг (табл. 3) достоверно не увеличивает длительность жизни отравленных животных, в отличие от метиленового синего (10 мг/кг; +31,6%). Сочетанное применение бемитила (25 мг/кг) и метиленового синего (10 мг/кг) увеличивало продолжительность жизни мышей на 55% (р < 0,01).

Повышение дозы бемитила до 50 мг/кг достоверно, сравнимо с метиленовым синим, увеличивало продолжительность жизни отравленных животных. Сочетанное введение бемитила (50 мг/кг) и метиленового синего (10 мг/кг) приводило к выраженному потенцированному эффекту и увеличивало длительность жизни мышей в 2,1 раза (p < 0,001).

Таблица 3

Влияние бемитила и его комбинации с метиленовым синим или цистамином на продолжительность жизни мышей при острой нитритной интоксикации.

	Препараты	n	Время жизни, мин
			M±m	%
1 серия	Нитрит натрия Бемитил (25 мг/кг) Метиленовый синий (10 мг/кг) Бемитил(25мг/кг)+метиленовый синий(10 мг/кг)	12 12 12 12	12,0±0,85 13,2±1,34 15,8±0,82 * 18,6±1,22 **	100 110 131,6 155
2 серия	Нитрит натрия Бемитил (50 мг/кг) Метиленовый синий (10 мг/кг) Бемитил(50 мг/кг)+метиленовый синий(10 мг/кг)	12 12 12 12	12,0±0,85 15,6±0,56 * 15,8±0,08 * 25,2±2,30 ***	100 130 131,6 210
3 серия	Нитрит натрия Бемитил (50 мг/кг) Цистамин (50 мг/кг) Бемитил(50 мг/кг)+цистамин (50 мг/кг)	10 10 10 10	11,2±0,62 16,4±1,23 ** 15,8±0,66 * 24,5±2,08 ***	100 149 141 218,7

Примечание: *, **, *** – статистически достоверное различие (p < 0,02, p < 0,01, p < 0,001, соответственно) с группой «нитрит натрия»


Бемитил (50 мг/кг) сравнимо с антидотом цистамином (50 мг/кг) увеличивал длительность жизни отравленных животных на 49% и 41% соответственно. Сочетанное введение бемитила и цистамина увеличивало длительность жизни мышей в 2,2 раза (p < 0,001).

Показано, что в условиях острой гемической гипоксии, вызванной введением смертельной дозы нитрита натрия, бемитил потенцирует защитный эффект деметгемоглобинообразователей – метиленового синего и цистамина.

В условиях метгемоглобинемии, вызванной длительной нитритной интоксикацией в качестве антидота использовали цистамин, который имеет большую по сравнению с метиленовым синим широту терапевтического эффекта. Другим преимуществом цистамина является возможность его использования в таблетированной форме для перорального применения.

В условиях длительной нитритной интоксикации на 15 и 30 сутки эксперимента содержание метгемоглобина у крыс составляет соответственно 45,02,15% и 42,62,60% от общего гемоглобина. Введение крысам бемитила не оказывало существенного влияния на динамику образования и разрушения метгемоглобина, поскольку его уровень в крови отравленных крыс существенно не изменялся в указанные сроки тестирования. В то же время применение цистамина, обладающего деметгемоглобинизирующим действием, статистически достоверно снижает содержание метгемоглобина на 15-е и 30-е сутки опыта соответственно до 67,0% и 79,3% от аналогичного показателя в контроле (табл. 4).

^ Таблица 4

Уровень метгемоглобина крови крыс в условиях длительной нитритной интоксикации (в % к общему гемоглобину)

№	Группы крыс	Статистический показатель	Время эксперимента
			15-е сутки	30-е сутки
1	Нитрит натрия	M  m %	45,02,15 100	42,62,60 100
2	Бемитил	M  m %	43,01,90 95,7	40,02,16 94,5
3	Цистамин	M  m %	30,22,90* 67,0	33,82,17* 79,3

Примечание: * – статистически достоверное различие (p < 0,05) с группой «нитрит натрия»


Хроническое отравление нитритом натрия сопровождается накоплением диеновых конъюгатов (ДК) в эритроцитах, ДК и оснований Шиффа в полушариях головного мозга и печени крыс, а также снижением активности ферментов антиоксидантной защиты, что свидетельствует о сдвигах в системе регуляции свободно-радикального окисления липидов (табл. 5 и 6).

Сочетанное введение бемитила и цистамина полностью предупреждает сдвиги прооксидантно-антиоксидантного равновесия в эритроцитах, раздельное введение крысам бемитила или цистамина менее эффективно. Комбинация бемитила и цистамина в условиях метгемоглобинемии имеет преимущество по сравнению с индивидуальными препаратами в значительной степени нормализует процессы ПОЛ, оказывает защитно-восстановительное действие на ферментативную активность в головном мозге и печени крыс.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что интенсивность ПОЛ в эритроцитах выше, чем в мозге и печени, в условиях длительной нитритной интоксикации. Это связано, вероятно, с тем, что эритроциты подвергаются прямой атаке свободнорадикальных метаболитов, возникающих при окислении гемоглобина нитрит-ионом, в то время как в мозге и печени усиление липопероксидации присходит, скорее всего, за счет другого патогенетического механизма, а именно: развивающейся гипоксии и токсического стресса, нарушающих клеточный метаболизм.


Таблица 5

Влияние бемитила, цистамина и их комбинации на прооксидантно-антиоксидантное равновесие в эритроцитах крыс в условиях длительной нитритной интоксикации

Показатели	Группы крыс, n = 8-10	Сутки эксперимента
		15-е	30-е
ДК, нМоль/г Нb	Интактные крысы Нитрит натрия Бемитил Цистамин Бемитил + цистамин	86,2±4,0 156,3±0,5* 120,9±12,4* ** 124,1±13,2* ** 90,8±6,5**	86,2±4,0 179,4±7,3* 130,2±9,3* ** 129,9±9,0* ** 99,5±7,2**
СОД, усл ед/мг Нb	Интактные крысы Нитрит натрия Бемитил Цистамин Бемитил + цистамин	1,04±0,04 1,00±0,03 1,01±0,03 0,98±0,04 -	1,02±0,03 0,89±0,03* 0,90±0,12 0,91±0,48 1,04±0,04**
Каталаза, мМоль в мин/г Нb	Интактные крысы Нитрит натрия Бемитил Цистамин Бемитил + цистамин	32,4±1,19 24,6±0,93* 31,3±1,04** 24,7±0,78* 31,8±1,20**	31,5±0,92 20,1±1,20* 28,5±1,10** 23,0±1,07* 30,2±0,90**
Гл-6-ФДГ, нМоль в мин/мг Нb	Интактные крысы Нитрит натрия Бемитил Цистамин Бемитил + цистамин	15,2±0,56 11,7±0,47* 13,3±0,50* ** 12,8±0,47* 11,2±0,48**	14,6±0,56 12,7±0,49* 13,2±0,52 14,8±0,44** 14,8±0,52**

Примечания: * – статистически достоверное различие (р < 0,05) с группой «интактные

крысы»; ** – с группой «нитрит натрия»


Окислительный стресс и лидирующее его проявление – активация ПОЛ – важное и малоисследованное звено в патогенезе тяжелых отравлений ФОС. ФОС обладают выраженным мембранотоксическим действием. Продукты ПОЛ оказывают дестабилизирующее действие на структурно-функциональное состояние биологических мембран, что выражается в нарушении их основных физико-химических свойств – проницаемости, вязкости, фазового состояния; изменяют молекулярную структуру мембраны клеток: нарушаются липид-липидные, а также липид-белковые взаимодействия, изменяется активность мембраносвязанных ферментов, в частности Na⁺/K⁺ АТФазы.


Таблица 6

Влияние бемитила, цистамина и их комбинации на прооксидантно-антиоксидантное равновесие в условиях хронической нитритной интоксикации

Показатели	Группы крыс, n = 8-10	Головной мозг	Печень
ДК, Д232	Интактные крысы Нитрит натрия Бемитил Цистамин Бемитил + цистамин	0,202±0,017 0,304±0,025* 0,229±0,019** 0,263±0,034 0,220±0,018**	0,454±0,022 0,672±0,039* 0,380±0,026** 0,543±0,035** 0,391±0,036**
ШО, усл ед/мг липидов	Интактные крысы Нитрит натрия Бемитил Цистамин Бемитил + цистамин	0,16±0,01 0,24±0,02* 0,20±0,04* 0,21±0,01* 0,18±0,01**	0,390±0,025 0,570±0,040* 0,390±0,030** 0,420±0,040** 0,402±0,017**
Каталаза, мМоль в мин/мг белка	Интактные крысы Нитрит натрия Бемитил Цистамин Бемитил + цистамин	1,12±0,045 0,75±0,040* 0,78±0,060* 0,86±0,050* 1,13±0,045**	328,0±24,0 222,0±19,0* 310,0±10,0** 254,0±19,0* 318,0±18,5**
Гл-6-ФДГ, нМоль в мин/мг белка	Интактные крысы Нитрит натрия Бемитил Цистамин Бемитил + цистамин	19,9±0,63 20,5±1,55 18,3±1,16 23,4±1,3 -	58,3±3,1 29,4±3,4* 44,9±4,7* ** 50,3±2,8** 54,2±3,5**

Примечания: * – статистически достоверное различие (р < 0,05) с группой «интактные

крысы»; ** – с группой «нитрит натрия»


Введение крысам карбофоса в дозе 0,9 LD₅₀ снизило на 42,6% активность Na⁺/K⁺ АТФазы на 14-е сутки эксперимента у выживших животных. Армин в дозе 0,9 LD₅₀ снижает активность фермента на 38,4% (табл. 7).

^ Таблица 7

Активность Na⁺/К⁺ АТФазы в мозге крыс, отравленных

фосфорорганическими соединениями (в мкМ Ф_н на 1 мг белка/час; n = 12)

№	Группы крыс	Карбофос	Армин
1	Интактные крысы	4,50,44	4,50,44
2	Фосфорорганические соединения	2,60,32*	2,80,36*
3	Атропин (10 мг/кг) + диэтиксим (25 мг/кг)	3,60,50	4,40,74
4	Атропин (10 мг/кг) + диэтиксим (25 мг/кг) + Бемитил (50 мг/кг)	4,20,55**	4,60,56**

Примечания: * – статистически достоверное различие (p < 0,05) с группой «интактные крысы»; ** – с группой «фосфорорганические соединения»


Лечение отравленных карбофосом крыс двумя антидотами ФОС (М-холиноблокатор атропин в дозе 10 мг/кг и реактиватор холинэстеразы диэтиксим в дозе 25 мг/кг) дважды внутримышечно – через 30 минут и 2 часа после введения карбофоса – несколько повысило активность Na⁺/K⁺ АТФазы до 3,60,5 мкМ Ф_н на 1 мг белка в час, но не восстановило активность фермента. В то же время включение в схему лечения бемитила (50 мг/кг 2 раза – на 2-е и 3-и сутки) полностью восстановило активность Na⁺/K⁺ АТФазы (табл. 7).

Введение комплекса антидотов крысам, отравленным армином, через 0,5 мин, 30 мин и 3 часа после интоксикации приводит к недостоверному увеличению активности фермента. Более эффективна комбинация антидотов с бемитилом, который применяли дополнительно на 2-е и 3-и сутки после отравления внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг. Активность Na⁺/K⁺ АТФазы в данной группе крыс была полностью восстановлена до аналогичных показателей здоровых животных (табл. 7).

Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод, что острая интоксикация крыс карбофосом (0,9 LD_{^ 50}) или армином (0,9 LD₅₀) сопровождается интенсификацией процессов ПОЛ, что выражается в резком увеличении содержания продуктов ПОЛ на 14-е сутки постинтоксикационного периода (табл. 8). При отравлении карбофосом уровень ДК повысился в полушариях мозга и миокарде на 232,2% (p < 0,05) и 278,4% (p < 0,05) от контроля соответственно, а уровень ШО на 112,5% (p < 0,05) и на 173,7% (p < 0,05). При отравлении армином содержание ДК в мозге и миокарде повысилось на 133,3% (p < 0,05) и 110,8% (p < 0,05), а содержание ШО на 162,5% (p < 0,05) и на 86,8% (p < 0,05) от уровня интактных животных соответственно.

Применение бемитила в дозе 50 мг/кг в условиях интоксикации карбофосом или армином совместно с комплексом антидотов снижает накопление ДК и ШО в полушариях мозга и миокарде через 14 суток после введения ядов в организм до уровня интактных животных.

Наряду с активацией ПОЛ в условиях тяжелых отравлений антихолинэстеразными ядами наблюдается снижение активности ферментов антиоксидантной системы организма (Сойнов Н.А., 2000; Крылова Е.В., 2003). Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что карбофос (0,9 LD₅₀) вызывает гибель 30% крыс в течение первых суток, а в постинтоксикационном периоде оказывает выраженное действие на систему эритрона. У отравленных животных выявлено увеличение в крови содержания ретикулоцитов, снижение осмотической резистентности и электрического заряда эритроцитарных мембран, подавление активности антиоксидантной системы и увеличение концентрации первичных и вторичных продуктов ПОЛ (табл. 9).

^ Таблица 8

Содержание диеновых конъюгатов и оснований Шиффа в головном мозге

и миокарде крыс, отравленных фосфорорганическими соединениями

Группы животных, условия опыта			Карбофос	Армин
Диеновые конъюгаты (Д232)	Мозг	Интактные крысы	0,180,01	0,180,01
		Фосфорорганические соединения	0,580,03*	0,420,05*
		Атропин (10мг/кг) + диэтиксим (25мг/кг)	0,400,06*	0,340,03*
		Атропин (10мг/кг) + диэтиксим (25мг/кг) + бемитил (50 мг/кг)	0,210,04**	0,220,02**
	Миокард	Интактные крысы	0,370,01	0,370,01
		Фосфорорганические соединения	1,400,12*	0,780,08*
		Атропин (10мг/кг) + диэтиксим (25мг/кг)	0,800,04*	0,540,05*
		Атропин (10мг/кг) + диэтиксим (25мг/кг) + бемитил (50 мг/кг)	0,440,05**	0,300,02**
Шиффовы основания (F)	Мозг	Интактные крысы	0,160,02	0,160,02
		Фосфорорганические соединения	0,340,02*	0,420,04*
		Атропин (10мг/кг) + диэтиксим (25мг/кг)	0,280,01*	0,370,02*
		Атропин (10мг/кг) + диэтиксим (25мг/кг) + бемитил (50 мг/кг)	0,190,01**	0,200,02**
	Миокард	Интактные крысы	0,380,04	0,380,04
		Фосфорорганические соединения	1,040,06*	0,710,04*
		Атропин (10мг/кг) + диэтиксим (25мг/кг)	0,840,06*	0,580,05*
		Атропин (10мг/кг) + диэтиксим (25мг/кг) + бемитил (50 мг/кг)	0,480,03**	0,430,02**

Примечания: * – статистически достоверное различие (p<0,05) с группой «интактные крысы»; ** – с группой «фосфорорганические соединения».


Карбофос приводит к снижению активности СОД и каталазы в эритроцитах отравленных животных на 14-е сутки постинтоксикационного периода на 36,4% (p < 0,05) на 23% (p < 0,05) от контроля соответственно.

Введение отравленным крысам атропина (10 мг/кг) предупреждает развитие ретикулоцитоза и ограничивает рост уровня ДК, однако антидотная терапия не влияет на антиоксидантную систему эритрона, ПОЛ, осмотическую резистентность и электрический заряд мембран. Включение в схему лечения бемитила (50 мг/кг) восстанавливает большинство нарушенных показателей, в том числе содержание ретикулоцитов, активность СОД, каталазы, Гл-6-ФДГ, осмотическую резистентность и электрический заряд эритроцитарных мембран до уровня интактных животных.

^ Таблица 9

Морфофункциональные показатели эритроцитов и их мембран у крыс

после острого отравления карбофосом и коррекции бемитилом и атропином

Показатель	Препараты (группа животных)
	Атропин	Атропин +бемитил	Контроль (карбофос)	Интактные крысы
Гемоглобин, г/л	140,2±4,8	152,0±3,0	142,5±2,8	148,2±5,2
Эритроциты, 102/л	4,6±0,2	4,7±0,09	4,5±0,18	4,6±0,1
Гематокрит, %	41,6±3,5	41,3±1,8	41,5±4,0	42,0±3,4
Ретикулоциты, 0/00	36,4±2,0**	30,6±2,0**	58,2±2,7*	34,0±3,5
ССГ, пг	0,23±0,03	0,24±0,01	0,27±0,03	0,28±0,02
СЭФПЭ, м2/v•с	1,11±0,01	1,13±0,05**	1,00±0,02*	1,13±0,01
Каталаза, ммоль/мин/мг Hb	26,5±1,6*	33,1±2,0**	24,4±2,5*	31,7±1,8
СОД, усл. ед./мг Hb	0,70±0,05*	1,12±0,05**	0,68±0,07*	1,07±0,04
Гл-6-ФДГ, мк моль/мин/мг Hb	12,8±0,4*	16,9±0,4***	10,2±0,4*	15,7±0,4
ДК, н моль/г Hb	125,0±2,4**	99,6±11,2**	182,0±1,8*	102,1±5,0
ТБК-РП, н моль/мг белка	0,68±0,05*	0,25±0,07**	0,56±0,02*	0,26±0,11

Примечания: * – статистически достоверное различие (р<0,05) с группой «интактные крысы»;** – статистически достоверное различие (р<0,05) с группой «контроль (карбофос)».


О состоянии мембран эритроцитов в условиях отравления карбофосом и применения корригирующей терапии бемитилом и атропином судили также по тушению интенсивности флуоресценции мембранного зонда АНС (табл. 10). Зонд АНС является «универсальным» зондом, который встраивается в поверхностные локусы мембраны и реагирует на различные перестройки, происходящие в мембранах, отражая состояние области белок-липидного взаимодействия (Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е., 1980).

Показано статистически значимое уменьшение флуоресценции зонда АНС на 14-е и 21-е сутки как у крыс, отравленных карбофосом, так и у крыс, отравленных карбофосом и леченных атропином, что свидетельствует о нарушении структурной организации мембраны эритроцитов, повышении их микровязкости. Выявленное тушение флуоресценции обусловлено активацией процессов ПОЛ, которые приводят к увеличению поверхностной плотности заряда, увеличению электростатической отталкивающей силы между АНС и мембраной участка связывания АНС и уменьшению флуоресценции системы «АНС – мембрана».

В то же время у крыс, отравленных карбофосом и леченных атропином и бемитилом, интенсивность флуоресценции АНС в мембранах эритроцитов оставалась в пределах нормы на протяжении всего опыта (тушение флуоресценции АНС было меньше 3%), что обусловлено мембраностабилизирующими свойствами бемитила.

^ Таблица 10

Степень тушения флуоресценции мембранного зонда АНС

в мембранах эритроцитов крыс, отравленных карбофосом, ((F₀-F)/F₀)

Группы животных, n=8	Сутки эксперимента
	2–3-и	14–15-е	21-е
Карбофос	0,06±0,01	0,13±0,02**	0,12±0,02*
Карбофос + атропин	0,02±0,01^	0,11±0,01**	0,11±0,01**
Карбофос+атропин+бемитил	0,02±0,01	0,03±0,01^^ ##	0,02±0,01 #

^ Примечания: * – статистически достоверное различие (р<0,05) с группой «интактные крысы»;

** – статистически достоверное различие (р<0,002) с группой «интактные крысы»;

^ – статистически достоверное различие (р<0,02) с группой «карбофос»;

^^ – статистически достоверное различие (р<0,001) с группой «карбофос»;

# – статистически достоверное различие (р<0,01) с группой «карбофос + атропин»;

## – статистически достоверное различие (р<0,01) с группой «карбофос + атропин»;

^ F – интенсивность флуоресценции препаратов (отн. ед.);

F₀ – интенсивность флуоресценции контроля (интактные крысы);

F₀ = 0,9±0,02 ед. фл.


В то же время у крыс, отравленных карбофосом и леченных атропином и бемитилом, интенсивность флуоресценции АНС в мембранах эритроцитов оставалась в пределах нормы на протяжении всего опыта (тушение флуоресценции АНС было меньше 3%), что обусловлено мембраностабилизирующими свойствами бемитила.

Таким образом, включение бемитила в схему лечения отравлений карбофосом предупреждает развитие основных токсических эффектов ФОС: активацию ПОЛ, изменение активности ферментов антиоксидантной системы организма и, соответственно, модификацию важнейших физико-химических свойств мембран – проницаемость, вязкость, фазовое состояние. Оптимальные физико-химические свойства бемитила (коэффициент распределения между полярной и неполярной фазами) обеспечивают его уникальные фармакокинетические параметры и, соответственно, взаимодействие с водорастворимыми и липофильными свободными радикалами. Избирательная кумуляция препарата в эритроцитах при курсовом введении (табл. 21) предупреждает деструкцию липидного бислоя, повышение его микровязкости, предотвращает развитие дезорганизации белкового состава, нарушение функциональной активности ферментов и функционального состояния мембран-рецепторного комплекса в эритроне.

В различных модельных системах установлена высокая антирадикальная и антиокислительная активность других производных бензимидазола – этомерзола и соединения Б-16 (табл. 1). Результаты сравнительного исследования влияния монотерапии бемитилом, этомерзолом и соединением Б-16 на процессы ПОЛ при отравлении ФОС представлены в табл. 11 и 12.

^ Таблица 11

Содержание диеновых конъюгатов в органах крыс, отравленных карбофосом

(отн. ед. оптической плотности/мг липидов, n = 8)

Группы крыс, препараты		Статистический показатель	Время после отравления
			2–3-и сутки	14-е сутки
Головной мозг	Интактные крысы	М±m	0,18 ±0,01	0,18 ±0,01
		%	100	100
	Карбофос	М±m	0,40 ± 0,06*	0,58 ±0,03*
		%	222	322
	Карбофос + бемитил	М±m	0,25 ± 0,05**	0,40 ±0,04**
		%	138	222
	Карбофос + этомерзол	М±m	0,23 ± 0,02**	0,36 ±0,03**
		%	128	200
	Карбофос + соединение Б-16	М±m	0,28 ± 0,05	0,39 ± 0,04**
		%	156	216
Миокард	Интактные крысы	М±m	0,37 ±0,01	0,37 ± 0,01
		%	100	100
	Карбофос	М±m	1,10±0,10*	1,41 ±0,10*
		%	297	381
	Карбофос + бемитил	М±m	0,48 ± 0,02**	0,51 ±0,03**
		%	130	138
	Карбофос + этомерзол	М±m	0,42 ± 0,02**	0,44 ± 0,05**
		%	114	119
	Карбофос + соединение Б-16	М±m	0,50 ± 0,04**	0,42 ± 0,06**
		%	135	114

Примечания: * – статистически достоверное различие (р<0,05) с группой «интактные крысы»; ** – статистически достоверное различие (р<0,05) с группой «карбофос».


Установлено, что карбофос в дозе 0,8 LD₅₀ вызывает гибель 20% животных и значительно увеличивает активность процессов ПОЛ в головном мозге и сердце крыс на 2–3-и, 6-е и 14-е сутки в постинтоксикационном периоде. На 2–3-и сутки количество ДК в головном мозге у отравленных крыс возрастает в 2,2 раза, а на 14-е сутки – в 3,2 раза (табл. 11).

В миокарде крыс, отравленных карбофосом, содержание ДК на 2–3-и сутки увеличивается в 3 раза, а на 14-е сутки – в 3,8 раза. Исследуемые препараты предупреждают чрезмерное накопление ДК примерно в одинаковой степени. Применение бемитила и этомерзола практически нормализует количество ДК в головном мозге на 2–3-и сутки и достоверно снижает их содержание на 14-е сутки, хотя не достигает нормы. В то же время лечение крыс производным бензимидазола – соединением Б-16 – оказывает положительный эффект на 14-е сутки, но не на 2–3-и сутки (табл. 11).

Результаты изучения содержания ШО в головном мозге и миокарде крыс, отравленных карбофосом и леченных исследуемыми препаратами, представленные в табл. 12, показывают, что бемитил ингибирует процессы ПОЛ и, в частности, снижает уровень ШО в головном мозге и миокарде подобно этомерзолу и соединению Б-16.