Оксидативный стресс и система оксида азота при постнатальной адаптации и развитии заболеваний у сельскохозяйственных животных 03. 01. 04 биохимия
|
|
Скачать 0.81 Mb.
|
|
На правах рукописи БЛИЗНЕЦОВА ГАЛИНА НИКОЛАЕВНА Оксидативный стресс и система оксида азота при постнатальной адаптации и развитии заболеваний у сельскохозяйственных животных 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Воронеж – 2010Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН.
Защита состоится «^ 2010 года в 10-00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 006.004.02 при Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте патологии, фармакологии и терапии РАСХН (394087, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114-б). Автореферат разослан «__» __________ 2010 г. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИВИПФиТ. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор вет. наук, профессор А.Г. Нежданов ^ Актуальность темы. Процессы свободнорадикального окисления (СРО), лежащие в основе метаболизма всех клеток и определяющие адаптивную состоятельность организма к действию повреждающих факторов, являются не только необходимым звеном жизнедеятельности клетки, но и выступают как универсальное неспецифическое звено в развитии многих патологических состояний (Владимиров Ю.А., 1987; Зенков Н.К., 2001). Исследование состояния и механизмов нарушения регуляции кислородзависимых процессов позволяет выявить общие закономерности и уточнить патогенез различных заболеваний. Решение этих вопросов тесно связано с фундаментальными общебиологическими проблемами, такими как образование свободнорадикальных форм кислорода и азота, пероксидной модификацией липидов и белков, функционированием биомембран, компартментализацией биохимических реакций и может быть весьма полезным для выяснения сложных многоуровневых взаимоотношений различных метаболических звеньев при развитии патологических состояний. Имеющиеся к настоящему времени данные позволяют считать, что, как в реакциях окислительного стресса, так и в механизмах антиоксидантной защиты принимает участие оксид азота (Klebanoff S.J., 1992; Маеда Х., Акаике Т., 1998; Dobashi K. et al., 1997; Ulker S. еt al., 2003). Физиологический эффект взаимодействия АФК и NO остается предметом активных дебатов. В ряде работ in vitro продемонстрировано, что NO может фактически замедлять пероксидное окисление липидов, действуя как скавенджер кислородных радикалов (Laskin J.D. et al., 2001; Серая И.П., Нарциссов Я.Р., 2002). Этот своеобразный “антиоксидантный" эффект NO позволил некоторым исследователям предположить, что взаимодействие между супероксиданионом и NO может быть биологически важным путем детоксикации потенциально опасных активных форм кислорода (Huie R.E., Padmaja S., 1993; Зенков Н.К. с соавт., 2000, 2001; Murphy M.P., 2009). В тоже время есть и противоположные данные, свидетельствующие о том, что оксид азота способен усиливать негативные эффекты супероксидного радикала и других активных форм кислорода, которые играют важную роль в патогенезе заболеваний животных (Epe B. et al., 1996; Greenacre S.A., Ischiropoulos H., 2001). В последнее время появился ряд работ, в которых приводятся отдельные результаты изучения взаимосвязи состояния процессов пероксидного окисления липидов, антиоксидантной системы и интенсивности образования в организме оксида азота при патологиях различной этиологии (Laskin J.D. et al., 2001; Murphy M.P., 1999; Lee K.J. et al., 2004; Реутов В.П. с соавт., 2007). Однако полученные данные зачастую носят противоречивый характер, и у авторов нет единого мнения о роли и взаимосвязи антиоксидантного статуса, как совокупности про- и антиоксидантных процессов и системы оксида азота. Помимо этого процессы свободнорадикального окисления и система оксида азота являются универсальными факторами регуляции стрессорных и адаптивных ответов организма (Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 1998; Stratakis C.A., Chrousos G.P., 1995). В настоящее время выдвинута гипотеза о том, что NO участвует в регуляции стресс-реакции, ограничивая ее чрезмерную активацию, и ее повреждающие эффекты, как на центральном, так и на периферическом уровне (Манухина Е.Б., Малышев И.Ю., 2000). Эта гипотеза предполагает наличие наряду с известными стресс-лимитирующими системами (ГАМК-ергической, пептидергической, антиоксидантной и др.) и NO - ергической стресс-лимитирующей системы (Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 1998). Один из защитных эффектов NO при стрессе связан с его способностью увеличивать активность антиоксидантных ферментов и экспрессию кодирующих их генов (Dobashi K. et al., 1997; Ulker S. et al., 2003). Поэтому изучение окислительного и нитрозативного напряжения, а также локальных антиоксидантной и NO-ергической стресс-лимитирующих систем в норме, в процессе онтогенеза, при стрессе, адаптации и развитии патологических состояний является весьма актуальным и перспективным. Учитывая большую функциональную нагрузку данных метаболических систем, можно предполагать, что регуляция межклеточных и системных взаимодействий, связанных с изменением продукции NO и изменениями антиоксидантного статуса организма, окажется весьма эффективным способом предупреждения и лечения многих заболеваний. Таким образом, всё выше изложенное подтверждает актуальность изучения роли и взаимодействия окислительного и нитрозативного напряжения в адаптивных ответах организма и при развитии различных патологических состояний. ^ Целью настоящей работы является изучение роли системы оксида азота и её взаимосвязи с антиоксидантным статусом организма в возрастном аспекте и при развитии различных патологических состояний у разных видов сельскохозяйственных животных. В соответствии с указанной целью на разрешение поставлены следующие задачи. 1. Изучить видовые и возрастные особенности функционирования антиоксидантной и NO- L-аргинин систем. 2. Определить роль оксидативного стресса и системы оксида азота в постнатальной адаптации животных. 3. Выявить роль оксида азота в формировании колострального иммунитета у новорожденных животных. 4. Изучить динамику свободнорадикального окисления и состояние ситемы NO- L-аргинин при различных патологиях сельскохозяйственных животных. 5. Выявить характер влияния модуляции продукции оксида азота на интенсивность пероксидного окисления липидов и белков, состояние АОС и образование NO и S-нитрозотиолов. ^ Впервые изучены видовые и возрастные особенности состояния системы оксида азота, охарактеризована ее роль в формировании колострального иммунитета у новорожденных животных. Впервые комплексно изучены интенсивность процессов пероксидного окисления липидов и белков, состояние ферментативного звена антиоксидантной системы и образование оксида азота при развитии патологий различной этиологии. Определено влияние индукции синтеза оксида азота L-аргинином и ингибирования образования NO на динамику образования супероксиданиона в митохондриальной и микросомальной электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) клеток печени, интенсивность пероксидного окисления липидов в крови и окислительной модификации плазменных белков как в норме, так и при иммобилизационном стрессе, токсическом повреждении печени тетрахлорметаном и ожоговой травме, а также характер реакции антиоксидантной системы в норме и при патологии. Впервые комплексно изучено применение животным в преддверии стрессовых ситуациях различной этиологии и отличающихся по патогенетическим механизмам развития соединения ФБ-26, обладающего свойствами антиоксиданта и донора оксида азота. Новизна проведенных исследований подтверждена 4 патентами РФ. ^ Изучение характера течения процессов свободнорадикального окисления липидов и белков, функционирования антиоксидантной системы и системы оксида азота позволяют углубить и систематизировать современные представления о значении нитрозотивного и оксидативного стресса в развитии патологий разного генеза. Результаты исследования особенностей этих процессов в условиях модуляции образования оксида азота в организме, как в норме, так и патологии позволят предложить новые подходы в разработке способов и методов прогнозирования исхода, профилактики и лечения заболеваний сельскохозяйственных животных разной этиологии. На основании проведенных исследований разработаны и утверждены на федеральном уровне: Методические рекомендации по оценке и коррекции иммунного статуса животных (Воронеж, 2005); Методические рекомендации по диагностике, терапии и профилактике нарушений обмена веществ у продуктивных животных (М.: РАСХН, 2007); Методические рекомендации по определению стабильных метаболитов оксида азота в плазме (сыворотке) крови (М.: РАСХН, 2007); Методические рекомендации по определению субклеточной генерации супероксиданиона в тканях (М.: РАСХН, 2007); Методические рекомендации по диагностике, профилактике и лечению омфалита у новорожденных телят (Воронеж, 2008); Методические рекомендации по диагностике, профилактике и терапии гепатопатий у крупного рогатого скота (Воронеж, 2009); Методические рекомендации по диагностике, профилактике и терапии гестоза у молочных коров и свиноматок (Воронеж, 2009); Методические рекомендации по оптимизации формирования колострального иммунитета у новорожденных животных (Воронеж, 2009). ^ Основные результаты исследований были представлены на Международных научно-практических конференциях «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях (Воронеж, 2002); «Свободные радикалы, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2003); III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); «Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных» (Воронеж, 2004); XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004); «Актуальные проблемы болезней органов размножения и молочной железы у животных» (Воронеж, 2005); «Актуальные проблемы патологии, фармакологии и терапии» (Воронеж, 2006); съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов России (Воронеж, 2007); Международной научно-практической конференции, посвященной 125-летию ветеринарии Курской области (Курск, 2008); «Трансферт инновационных технологий в животноводстве» (Орел, 2008); «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях» (Воронеж, 2008); съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов России (Казань, 2009). Публикации. Основные научные результаты, включенные в диссертацию, опубликованы в 57 печатных работах, в том числе в 26 статьях в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ, 8 методических рекомендациях, 1 методическом пособии и 4 патентах. ^ 1. Видовые и возрастные особенности функционирования антиоксидантной и NO- L-аргинин систем. 2. Роль оксидативного стресса и системы оксида азота в постнатальной адаптации животных. 3. Характер свободнорадикального окисления и состояние ситемы NO- L-аргинин при различных патологиях сельскохозяйственных животных. 4. Влияние модуляции продукции оксида азота на интенсивность пероксидного окисления липидов и белков, состояние АОС и образование NO и S-нитрозотиолов. ^ Работа изложена на 285 страницах и включает введение, обзор литературы, материал, объем и методы исследований, результаты собственных исследований, их обсуждение, выводы, предложения и список литературы. Диссертационная работа проиллюстрирована 49 таблицами и 41 рисунками. Список литературы включает 449 источников, в том числе 298 иностранных авторов. ^ Работа выполнена в 2005-2010 г.г. в отделе патобиохимии и патофизиологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН в соответствии с планом научно-исследовательских работ по заданиям 04.01.01 “Изучить на молекулярно-биохимическом, структурно-функциональном, системно-физиологи-ческом и экологическом уровнях и определить причины и механизмы перехода организма из нормального состояния в патологическое и на этой основе разработать средства, методы и технологии защиты здоровья и продуктивности животных” (№ гос. регистрации 01.200.117018) и 08.04.01 «Разработать методы ранней диагностики, эффективные средства и способы профилактики и лечения массовых незаразных и вызываемых условно-патогенными микроорганизмами заболеваний у молодняка высокопродуктивных животных» (№ гос. регистрации 15070.3666026906.06.8.001.2). В проведении ряда исследований принимали участие сотрудники и аспиранты ВНИВИ патологии, фармакологии и терапии А.Г. Нежданов, С.М. Сулейманов, А.И. Золотарев, Ю.Н. Масьянов, В.И. Шушлебин, Т.Г. Ермолова, Н.Н. Каверин, С.С. Артемьева, Н.В. Пасько, А.Е. Черницкий, Д.Б. Чусов и другие, а так же сотрудник института геохимии и аналитической химии им. В.И.Вернадского В.А.Сафонов, которым автор выражает искреннюю признательность за оказанную помощь и плодотворное сотрудничество. В проведении экспериментальных и научно-производственных работ использовали: самцов белых беспородных крыс с массой тела 200,0±25,0 г (n=274); откормочных быков (n=18), коров (n=209) и телят красно-пестрой и симментальской породы (n=250); ягнят (n=25), поросят (n=30) и кровь новорожденных детей (n=14). Подробнее схемы проведения опытов и дозировки используемых веществ представлены в соответствующих разделах диссертации. Токсическое повреждение печени у крыс вызывали путем двукратного внутрибрюшинного введения, один раз в сутки тетрахлорметана (CCl4) в виде 40% раствора в оливковом масле в дозе 0,2 мл/100 г массы тела. Исследования проводили через сутки после второго введения CCl4. О степени повреждения печеночной паренхимы судили по изменению активности в сыворотке крови маркерных ферментов: аланинаминотрансферазы (АлАт) и аспартатаминотрансферазы (АсАт). Эмоционально-болевой стресс моделировали путём иммобилизации крыс на спине с жесткой фиксацией конечностей в течение 18 часов. В качестве контроля использовали животных, не подвергавшихся иммобилизации, но лишенных воды и пищи в течение 18 часов. До экстремального воздействия и после иммобилизации животных взвешивали. Затем с соблюдением существующих норм отделяли и взвешивали надпочечники, тимус, селезенку, вычисляли относительную массу органов (мг/100 г массы тела животного). Для оценки стрессогенного ульцерогенеза желудок промывали, просматривали и подсчитывали в нём количество язв, измеряли их длину. Нанесение ожоговой травмы у крыс осуществляли под хлороформным ингаляционным наркозом. Два дозированных симметричных ожога IIIA степени площадью по 300 мм2 наносили на обе стороны предварительно выбритой заднебоковой части тела с помощью специального приспособления при t =100С в течении 10 секунд. Общая площадь ожогов при этом составляла около 5% поверхности тела. Кровь для проведения биохимических исследований у всех лабораторных животных получали под наркозом из сердца. В качестве антикоагулянта использовали ЭДТА-Na2 . Для получения гомогената печени ткань гомогенизировали в 0,05 М трис-буфере рН 7,4 в соотношении вес/объем 1:5. При модуляции продукции оксида азота в качестве эндогенного индуктора синтеза использовали L-аргинин (L-Arg), который вводили животным в дозе 400 мг/кг внутрибрюшинно. Блокаторы синтеза NO аминогуанидин (AG) и метиловый эфир нитро-L-аргинина (L-NAME) вводили животным в одинаковой дозе 50 мг/кг внутрибрюшинно. Животным контрольных групп вводили либо дистиллированную воду, либо 0,9% раствор хлорида натрия. Более подробные схемы применения модуляторов продукции NO, представлены в соответствующих разделах. При изучении влияния соединения ФБ-26 – нитроксисукцинат 2-этил-6-метил-3-оксипиридина – на оксидантно-антиоксидантный статус и систему оксида азота, раствор исследуемого соединения вводили внутрибрюшинно в дозах 20 и 100 мг/кг массы тела при иммобилизационном стрессе и в дозе 100 мг/кг массы тела при токсическом повреждении печени тетрахлорметаном и ожоговой травме. Содержание в сыворотке крови глюкозы, холестерина, креатинина, мочевины, кальция, неорганического фосфора, активность -глутамилтранс-феразы (-ГТ), аспартат- (АсАТ) и аланинтрансферазы (АлАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ) определяли на биохимическом анализаторе «Hitachi-902» (Япония). В ряде опытов активность -ГТ, АлАТ и АсАТ, содержание -липопротеидов, показатель сулемовой пробы, общие липиды определяли с помощью наборов фирм «Vital Diagnostic» (Россия), «Lachema» (Чехия) и KONE (Финляндия), щелочной резерв в об.% СО2 – диффузным методом (Кондрахин И.П. с соавт., 2004). Содержание общих иммуноглобулинов определяли по величине светорассеивания после преципитации сульфатом цинка (Костына М.А., 1997), а IgG – методом простой радиальной иммунодиффузии в геле по G. Mancini (1965). Содержание лигандных форм (Hb, HbO2, MetHb) в растворе гемоглобина определяли при 500, 569 и 577 нм, используя для расчета эмпирическую систему уравнений, предложенную Zwart A. с соавторами (Zwart A. et. al., 1981). Содержание белка (г/л) определяли биуретовым методом (Досон Р., 1991); активность глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Г6ФДГ) (мкМ НАДФ/мин×г Hb) по убыли НАДФН (Асатиани В.С., 1965). Для оценки интенсивности процессов свободнорадикального окисления липидов и белков, состояния системы антиоксидантной защиты и функционирования системы L-аргинин-NO● в крови и сыворотке (плазме) крови животных определяли: содержание диеновых конъюгатов (ДК) (D232 /мг липидов) и кетодиенов (КД) (D278 /мг липидов) (Бузлама В.С. с соавт., 1997); содержание малонового диальдегида (МДА) (мкМ/л) (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977); содержание оснований Шиффа (ОШ) (отн. ед./мл сыв.) (Bidlack W.R., Tappel A.L., 1973); степень окислительной модификации белков (нМ/мг белка) (Reznick A.Z., 1994; Дубинина Е.Е., 1995); содержание молекул средней массы (ед.опт.пл.) (Гребнева О.Л. с соавт., 2006); потенциальную преимущественную генерацию супероксиданиона (нМоль О2 /гсек) (Близнецова Г.Н. с соавт., 2004); содержание НЭЖК (мкМ/л) (Прохоров М.Ю. с соавт., 1977); сорбционную способность эритроцитов (%) (Тогайбаев А.А. с соавт., 1988); содержание восстановленного глутатиона (мМ/л) (Sedlak J., Lindsay R.H., 1968); активность каталазы (мкМ Н2О2/лмин) (Королюк М.А., 1988); активность глутатионпероксидазы (мМ восстановленного глутатиона/лмин) (Кругликова Г.О., Штутман И.М., 1976); активность глутатионредуктазы (мкМ окисленного глутатиона /л×мин) (Кругликова Г.О., Штутман И.М., 1976); активность супероксиддисмутазы (СОД) (усл.ед./мг Hb) (Сирота т.в., 1999); сумму стабильных метаболитов оксида азота (мкМ/л) (Близнецова Г.Н. с соавт, 2002); содержание S-нитрозотиолов (нМ/л) (Kubes P. et al., 1999; Moore K.P. et al., 2002). Каждую пробу исследовали в 3-х аналитических повторностях. Обработку экспериментальных данных проводили методами математической статистики, принятыми в биологии и медицине. Достоверность различий оценивали методом парных сравнений, используя t-критерий Стъюдента. Статистически достоверными считали различия при уровне значимости р<0,05 (Лакин Г.Ф., 1990). ^ 3.1. Видовые и возрастные особенности функционирования NO- L-аргинин стресс-лимитирующей системы Установлено, что для телят в первые часы жизни характерен очень высокий уровень стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови (рис. 1А). Через сутки после рождения уровень стабильных метаболитов оксида азота (NOх) снижается на 33,4%, а через 2-3 дня их концентрация уменьшается более чем в 2 раза по сравнению с содержанием их в сыворотке крови через 30-60 минут после рождения (до получения первой порции молозива). Начиная с 10-суточного возраста, суммарная концентрация NOх продолжает снижаться и к месячному возрасту достигает величин, близких к уровню NOх у взрослых животных, составляющему у коров в зависимости от срока до или после отела от 40 до 150 мкМ/л. Для поросят сразу после рождения (до приёма молозива) также характерен высокий уровень стабильных метаболитов оксида азота, отражающий степень его образования в организме новорожденного (рис. 1Б). На 2-е сутки после рождения содержание в плазме крови NOх уменьшается более чем в 3 раза, а в 3-дневном возрасте концентрация NOх практически снижается до уровня, зафиксированного в возрасте 2-3 недель. Уровень стабильных метаболитов оксида азота у ягнят до первой выпойки молозива так же превышал таковой у взрослых животных более чем в 10 раз (рис. 1В). Далее интенсивность образование оксида азота статистически достоверно снижалась за 1 сутки на 37,9%, в течение вторых суток – на 32,5%, и третьих – на 54,4%. Как видно из представленных данных динамика изменения изучаемого показателя у ягнят в целом была идентична таковой у других видов животных, с той лишь разницей, что содержание оксида азота в крови ягнят менялось более резко и достигало уже к 15-м суткам жизни значений, характерных для взрослых овцематок, составляющих 19-25 мкМ/л.
Рис. 1. Содержание стабильных метаболитов оксида азота в плазме крови: А-телят, Б-поросят, В-ягнят, Г-детей (мкМ/л) При определении суммы стабильных метаболитов в плазме пуповинной крови у новорожденных детей (n=14) установлено, что её величина колеблется в пределах от 25,6 до 45,0 мкМ/л и составляет в среднем 34,38,52 мкМ/л (рис. 1Г). Полученные данные свидетельствуют об отсутствии статистически достоверных различий между показателями, определенными у детей на 1, 5 и 30 сутки жизни. Таким образом, установлено, что для новороженных телят, поросят и ягнят в первые сутки жизни характерно высокое содержание стабильных метаболитов оксида азота (NO2¯+NO3¯), которое существенно снижается к месячному возрасту. ^ Полученные нами данные свидетельствуют о том, что экзогенное поступление больших количеств нитратов и нитритов телятам с молозивом и молоком коров может быть исключено, поскольку у коров их содержание изменялось в пределах 37,8–145,0 мкМ/л в зависимости от периода исследования. Высокая концентрация NOх в сыворотке крови телят не является следствием недостаточной элиминации нитратов и нитритов из плазмы у новорожденных, чем у животных более старшего возраста, так как с возрастом снижается не только уровень стабильных метаболитов оксида азота в крови, но и выделение их с мочой (рис. 2). Можно было бы объяснить установленный феномен тем, что высокая концентрация NOх у новорожденных телят, по сравнению с животными более старшего возраста, является следствием поступления в организм высоких концентраций оксида азота вместе с вдыхаемым воздухом, но при этом, как известно, значительно возрастает содержание метгемоглобина в крови (Salguero K.L., Cummings J.J., 2002). Исследования содержания в крови различных лигандных форм гемоглобина показало, что уровень метгемоглобина в крови у телят сразу после рождения составляет 1,5% от общей концентрации гемоглобина и снижается к месячному возрасту до 0,9 %.
Как показали проведенные исследования через 0,5-1 час после рождения для телят характерно довольно низкое содержание S-нитрозотиолов в сыворотке крови, но спустя 24 часа после рождения происходит резкое возрастание (в 4,2 раза) их уровня, по сравнению с уровнем сразу после рождения (табл. 1). Таблица 1 Содержание S-нитрозотиолов в сыворотке крови клинически здоровых телят
Примечание: * -P<0,05-0,001 по сравнению с уровнем у телят в возрасте 25-30 суток К 10-суточному возрасту концентрация S-нитрозотиолов еще более увеличивается, а к месячному – достигает величин, близких к уровню у взрослых животных, составляющего у коров около 3500 - 4000 нМ/л. Следует отметить различия в динамике содержания метаболитов оксида азота и S-нитрозотиолов. Если содержание NO в первые часы жизни характеризуется очень высоким уровнем, то концентрация S-нитрозотиолов в данный период жизни достаточно низкая. В течение первого месяца жизни уменьшение концентрации NOх происходит на фоне роста уровня в сыворотке крови S-нитрозотиолов. При этом установлено наличие отрицательной корреляции между содержанием NOх и S-нитрозотиолов в сыворотке крови телят (r = – 0,918, P<0,001). Вероятнее всего образование столь высоких количеств оксида азота происходит у телят еще в период внутриутробного развития. Это подтверждается и тем, что при исследовании содержания суммы стабильных метаболитов оксида азота в амниотической жидкости их матерей установлен весьма высокий уровень NOх, существенно превышающий уровень в плазме крови у коров в период родов (табл. 2). Таблица 2 Содержание стабильных метаболитов оксида азота и S-нитрозотиолов в плазме крови и амниотической жидкости коров в период родов
Примечание:* – Р 0,05 по сравнению с показателями в плазме крови Учитывая полученные экспериментальные данные, можно утверждать, что высокая концентрация суммы стабильных метаболитов оксида азота (NO2¯ + NO3¯) в плазме крови новорожденных телят, формируется за счет интенсивного эндогенного образования NO еще во внутриутробный период, которое заметно уменьшается с возрастом. ^ адаптации телят Анализ содержания продуктов ПОЛ в крови телят свидетельствует об активации свободнорадикальных реакций в первые трое суток после рождения и наличие у новорожденных явления оксидативного стресса (табл. 3). Таблица 3 Концентрация продуктов ПОЛ в крови у телят разного возраста
Примечание:* – Р 0,05 по сравнению с показателями у животных в возрасте 30 суток К 10-суточному возрасту содержание конъюгированных диенов (ДК), которое отражает наличие гидроперекисей липидов в крови телят, снижалось на 21,9%. Более существенные изменения были отмечены для более “поздних” продуктов ПОЛ – кетодиенов (КД) и МДА, концентрация которых уменьшалась в данном возрасте на 28,6% и 53,3% соответственно. Наиболее низкий уровень первичных и вторичных продуктов ПОЛ был отмечен у телят в месячном возрасте. Несколько иная возрастная динамика отмечена для интенсивности образования оснований Шиффа (ОШ), являющихся конечными продуктами пероксидации липидов. К третьим суткам жизни их концентрация увеличивалась на 40%, а уже к 10-суточному возрасту повышалась в 2 раза. По-видимому, это является следствием активно протекающих процессов СРО у телят в первые сутки после рождения, что закономерно отражалось в увеличении концентрации ОШ к концу первой декады постнатального развития. Высокий уровень пероксидации липидов в первые сутки жизни, вероятнее всего, обусловлен изменением кислородного режима новорожденного и перестройкой его метаболизма в связи с переходом в новую среду обитания и легочное дыхание. Развитие оксидативного стресса у животных в первые дни жизни отражалось на структурно-функциональном состоянии и устойчивости к повреждению эритроцитарных мембран. Так, сорбционная способность эритроцитов (ССЭ) у новорожденных телят до первой выпойки молозива и в конце первых суток жизни свидетельствовал о более высокой проницаемости их клеточных мембран по сравнению с взрослыми животными (рис. 3).
Полученные результаты позволяют полагать, что сразу после рождения окислительной модификации в первую очередь подвергаются белки, а затем и липиды. Этот факт мы считаем весьма важным в связи с тем, что наиболее интенсивное всасывание колостральных иммуноглобулинов происходит именно в первые 24-48 часов жизни, в последующем скорость их пассивного транспорта резко снижается (Гончарук В.А., 1998; Weaver D.M. et al., 2000). Существенные возрастные изменения происходят и в ферментативном звене системы АОЗ крови телят. В связи с тем, что антиоксиданты преимущественно работают в комплексе (Журавлев А.И., 1989) и действуют на разных этапах восстановления кислорода, особого внимания заслуживают синхронные изменения активности ключевых антиоксидантных ферментов, в частности СОД и каталазы. Установлено, что наиболее высокую активность данные ферменты проявляют сразу после рождения животных, что полностью согласуется с данными о значительном повышении интенсивности пероксидного окисления липидов и белков в первые сутки жизни телят (рис. 4). При этом до выпойки молозива активность СОД составляла 214,7%, в первые сутки – 203,3%, а каталазы – 167,7% и 144,4%, соответственно, по отношению к уровню данных показателей у животных месячного возраста.
Таким образом, переход от антенатального к постнатальному периоду сопровождается явлениями окислительного стресса, которые выражаются в смещении оксидантно-антиоксидантного равновесия в сторону интенсификации свободнорадикального окисления липидов и белков, причем, в первую очередь окислительной модификации подвергаются белки. ^ Формирование иммунитета у новорожденных телят происходит за счет пассивного переноса иммуноглобулинов (ИГ) с молозивом или молоком через стенку кишечника. Причем адекватность иммунитета достигается только в том случае, если иммуноглобулины попадают в кровь в неизменном виде в течение первых часов жизни.
Проведенное исследование взаимосвязи содержания стабильных метаболитов оксида азота через 0,5-1,0 час после рождения (до выпойки молозива) и иммуноглобулинов в сыворотке крови через сутки после рождения у телят показало наличие высокой степени положительной корреляции исследуемых показателей, с коэффициентом r =+0,864, P<0,001.
Сразу после рождения у оставшихся здоровыми телят уровень стабильных метаболитов оксида азота на 18,3% превышал их содержание у заболевших животных, в конце первых суток жизни эта разница составила 18,8%. К третьим суткам жизни содержание стабильных метаболитов оксида азота у оставшихся здоровыми животных на 27,1 % превышало показатели у заболевших телят. На 10 сутки у здоровых телят содержание в сыворотке крови NOх продолжало снижаться, а у больных животных его уровень возрастал, что связано с развитием инфекционного заболевания, при котором продукция оксида увеличивается за счет активации макрофагальной NO-синтазы. ^ Поскольку -глутамилтрансфераза относиться макромолекулярным белкам, которые секретируются альвеолоцитами молочной железы (Lombardi P. et al., 2001; Maden M. et al., 2003) и содержится в большом количестве в молозиве и только в незначительном – в сыворотке у новорожденных и имеет молекулярную массу близкую к таковой IgG (молекулярная масса IgG составляет 140 кД, а -глутамилтрансферазы 90 кД) пассивный перенос этого ферментного белка в кишечнике новорожденного может быть косвенным показателем и переноса IgG из молозива. Установлено, что если до выпойки молозива активность -глутамил-трансферазы в сыворотке крови новорожденных телят была минимальной, то в суточном возрасте (после 4-ой выпойки молозива) она в значительной степени возрастает и превышает исходную более, чем в 10 раз, а далее постепенно снижается (табл. 4). Таблица 4 Возрастная динамика активности -глутамилтрансферазы и содержания иммуноглобулинов у телят
Примечание: *-P<0,05-0,001 по сравнению с показателями в месячном возрасте При этом у телят в суточном возрасте коэффициент корреляции между уровнем IgG и активностью -ГТ составляет +0,86 (P<0,001), через 2-е суток – +0,82 (P<0,01) и 3-е суток – +0,75 (P<0,02). Таким образом, наряду с определением уровня общих иммуноглобулинов преципитацией сульфатом цинка и общего белка в сыворотке крови достаточно информативным тестом для оценки интенсивности всасывания колостральных иммуноглобулинов можно считать определение активности -глутамилтрансферазы в сыворотке крови у новорожденных телят в 1-2 сутки после рождения. При этом активность -глутамилтрансферазы в сыворотке крови новорожденных телят в этом возрасте менее 3 мккат/л свидетельствует о недостаточности колострального иммунитета и риске развития неонатальных болезней инфекционной этиологии. ^ 3.6.1. Роль дисбаланса активных форм кислорода и азота в возникновении и течении бронхолегочной патологии у телят Установлено, что развитие бронхолегочной патологии вызывало существенное повышение содержания первичных и вторичных молекулярных продуктов ПОЛ в крови телят (табл. 5). Таблица 5 Интенсивность процессов ПОЛ при бронхопневмонии у телят
Примечание:* - P<0,05 по сравнению с показателями у здоровых животных При этом выявлены отличия в интенсивности накопления в крови первичных продуктов ПОЛ и продуктов более глубокой пероксидации у животных 2-ой (субклинический трахеобронхит) и 3-ей (бронхопневмония) групп. Так, уровень ДК у телят, больных бронхопневмонией, выше на 71,2 %, кетодиенов – на 54,5 %, а более поздних продуктов ПОЛ: малонового диальдегида и оснований Шиффа в 2,2 и 1,7 раза соответственно по сравнению со здоровыми животными. Содержание конъюгированных диенов и кетодиенов у телят, больных субклиническим трахеобронхитом, статистически достоверно возрастало в 1,5 и 1,2 раза соответственно по сравнению со здоровыми животными, но было ниже на 13% и 20,6 %, чем у телят с клиническими признаками заболевания. Такая же тенденция сохранялась для более поздних продуктов пероксидного окисления липидов – малонового диальдегида и оснований Шиффа. У больных животных была значительно снижена мощность ферментативного звена системы АОЗ (табл. 6). Таблица 6 Некоторые показатели системы антиоксидантной защиты в норме и при бронхолегочной патологии у телят
Примечание:* - P<0,05 по сравнению с показателями у здоровых животных Активность СОД у телят с субклиническим трахеобронхитом составляла 165,4%, с бронхопневмонией – 129,5% от таковой у здоровых животных. Активность каталазы так же возрастала. Наибольшее значение данного показателя было характерно для животных 2-ой группы, для телят 3-ей группы он был несколько ниже. Для ферментов глутатионового звена АОЗ была выявлена иная закономерность – активность глутатионпероксидазы у животных с бронхолегочной патологией возрастала, но незначительно. При этом статистически достоверных различий между изучаемым показателем у животных 2 и 3-ей группы зафиксировано не было. Самые высокие показатели активности глутатионредуктазы были характерны для телят, больных бронхопневмонией – на 23,6 % выше, чем у здоровых телят, и на 15,2 %, чем при субклиническом трахеобронхите. Состояние системы ПОЛ-АОЗ у телят с субклиническим трахеобронхитом является метаболически более предпочтительным, поскольку сохраняется эффективный контроль со стороны АОС. При бронхопневмонии происходит повышение концентрации вторичных продуктов ПОЛ при практически неизменной активности основных биоантиоксидантов, по сравнению с телятами больными субклиническим трахеобронхитом, что косвенно может указывать на повышенное образование активных форм кислорода, а следовательно и более глубокие деструктивные изменениям пораженных тканей. Установлено так же, что уровень стабильных метаболитов оксида азота у животных с симптомокомплексом трахеобронхита составляет 152,2 % от такового у здоровых телят (рис. 7). Повышение содержания NOx в крови у телят может быть обусловлено либо активацией индуцибельной формы NO-синтазы под влиянием цитокинов, а также эндотоксинов и липополисахаридов (Tavaf-Motamen H. at al., 1998), либо за счет конститутивной формы этого изофермента. Закономерно было бы ожидать высоких концентрационных показателей для NOх при бронхопневмонии, учитывая глубокое поражение дыхательной системы, сопровождающееся воспалительным синдромом при данной патологии.
В целом, можно отметить, что в независимости от тяжести поражения дыхательной системы, происходит активация продукции NO. При этом, происходит истощение основного пула депо оксида азота – S-нитрозотиолов. Учитывая современные литературные данные, позволяющие рассматривать NO в качестве медиатора, способствующего расширению бронхов и одновременно препятствующего их констрикции (Лев Н.С., 2000), поддержание гомеостаза системы L-аргинин – NO при бронхолегочной патологии является важной защитно-приспосо-бительной функцией организма при развитии патологии респираторной системы. Нарушение же адекватного функционирования систем антиоксидантной защиты и L-аргинин – NO· является одним из существенных компонентов патогенеза бронхолегочной патологии у телят, и влечет за собой интенсификацию процессов пероксидного окисления липидов и избыточное накопление в организме его токсических продуктов. ^ Установлено, что жировая дистрофия печени у откормочных бычков сопровождается существенным (в 2-2,5 раза) повышением активностей АлАт и АсАт в сыворотке крови, что свидетельствовало о наличии выраженного цитолитического синдрома. Существенное повреждение печеночной паренхимы установлено и при гистологическом исследовании. При этом в печени происходит уменьшение на 60,6% активности ГПО и на 34,6% – витамина Е, увеличение на 62,6% активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и концентрации МДА на 76,6% (табл. 7). Таблица 7 Показатели антиоксидантного статуса в крови и печени бычков при жировой дистрофии печени
Примечание: * – P<0,05 к показателям у здоровых животных С другой стороны, при жировой дистрофии печени в крови животных имелись лишь незначительные изменения активности ГПО и Г6ФДГ, но при этом у больных животных был в 2,1 раза выше уровень МДА и на 25,4 % снижено содержание витамина Е. Выявленные изменения в уровне МДА как в печени, так и в крови свидетельствуют об интенсификации процессов пероксидного окисления липидов и развитии в организме животных окислительного напряжения. Изменения в ферментативном звене системы антиоксидантной защиты в печени в ответ на развитие жировой дистрофии являются свидетельством адаптивного повышения функциональной активности антиоксидантной системы в ответ на развитие окислительного стресса. Значительное уменьшение активности ГПО в печени при данной патологии может быть связано либо с увеличением уровня свободных радикалов в клетках печени, которые угнетают активность фермента, окисляя тиоловые группы или аминокислоты, входящие в структуру белка, либо может свидетельствовать о недостаточном синтезе этого фермента. С другой стороны, отсутствие значительных изменений в активности ГПО и Г6ФДГ в крови при жировой дистрофии указывает на то, что в эритроцитах у крупного рогатого скота при данной патологии отсутствуют признаки окислительного напряжения. Кроме того, роль активных форм кислорода в патогенезе жировой дистрофии может заключаться в снижении уровня эндогенных антиоксидантов в организме, о чем и свидетельствует более низкий уровень витамина Е в сыворотке крови больных животных. Истощение механизмов антиоксидантной защиты может ослаблять клеточные функции и делать гепатоциты более чувствительными к повреждающим эффектам эндогенных и экзогенных перекисей. При патологии печени происходит более чем 3-кратное повышение содержания суммы стабильных метаболитов оксида азота (NO2¯+NO3¯) в плазме крови (рис. 8).
Повышение содержания S-нитрозотиолов в плазме крови животных с жировой дистрофией печени отражает процессы депонирования избыточного количества NO. Наличие пула нитрозотиолов наиболее эффективно позволяет участвовать системе оксида азота в процессах репарации, делает возможным локальное расширение сосудов и капилляров в очаге воспаления, тем самым снижает вероятность попадания токсичных продуктов некроза в соседние участки и клетки. Таким образом, при жировой дистрофии печени у крупного рогатого скота происходит усиление процессов пероксидного окисления липидов и снижение уровня эндогенных антиоксидантов в организме, а определение активности ГПО и Г6ФДГ в печени может быть использовано для диагностики жировой дистрофии печени у крупного рогатого скота. Активация синтеза NO при патологии печени, видимо, обеспечивает быстрое выведение токсинов и поступление биологического материала для репаративных процессов, а также более точную направленность адаптивных перестроек метаболизма. ^ Исследования проведены на 2-х группах коров, которые на основании акушерских исследований ретроспективно были разделены на клинически здоровых (n=22) и коров, в последующем заболевших эндометритом (n=13). Установлено, что в период глубокой стельности у оставшихся здоровыми коров происходит интенсификация процессов СРО, о чем свидетельствует повышение содержание в крови МДА (табл. 8). Выявленное изменение указывает на максимальное напряжение метаболических процессов, протекающих в организме беременных коров, а также может свидетельствовать об усилении стрессового состояния животных. У животных с послеродовым эндометритом в предродовой период содержание МДА было выше на 17%, чем у коров, оставшихся в последствии здоровыми. Более высокая концентрация МДА в крови у животных с послеродовым эндометритом, превышающая данный показатель в 1,5 раза по сравнению со здоровыми животными, по-видимому, обусловлена резким увеличением макрофагальной продукции АФК, происходящим при развитии воспалительного процесса. Таблица 8 Некоторые показатели системы ПОЛ-АОЗ у коров в норме и при послеродовом эндометрите
Примечание: * – P1–2 < 0,05; – P1–3 < 0,05; ▼ – Р3-4 < 0,05, ▲ – Р2-4 < 0,05-0,00 Накопление промежуточного продукта ПОЛ – малонового диальдегида в период глубокой стельности у животных без послеродовых осложнений не связано с недостаточностью функционирования ферментативного звена антиоксидантной системы. В предродовой период у животных, оставшихся здоровыми, активность ферментов, обеспечивающих элиминацию активных форм кислорода – СОД и каталазы – повышалась в 1,3 раза, по сравнению с данными показателями через две недели после родов. Активность ГПО и ГР в предродовой период возрастала примерно в одинаковой степени (в 1,3 и 1,2 раза), что свидетельствовало о сбалансированном функционировании глутатионового звена системы АОЗ и адекватном восполнении общего пула восстановленного глутатиона. У животных с послеродовой патологией матки в предродовой период изменения в системе антиоксидантной защиты организма были менее сбалансированы. Так, активность каталазы была ниже на 21,7%, а СОД – на 15,3%, ГПО – на 24,6%, а ГР – на 14,6% по сравнению с данными показателями у животных без патологии матки. Таким образом, в предродовой период у коров, у которых впоследствии развивался эндометрит, была снижена мощность антиокислительной системы. Это говорит о том, что уже на этапе беременности создаются благоприятные условия для развития заболеваний, как вследствие стрессового характера самого родового акта, так и ввиду определенной недостаточности антиоксидантной системы. Для выяснения роли оксида азота в патогенезе послеродового эндометрита проведено изучение содержаний его стабильных метаболитов, а также уровня S-нитрозотиолов (RSNO), выступающих в качестве соединений, способных потенцировать его биологические эффекты. Установлено, что у здоровых животных перед отелом уровень стабильных метаболитов оксида азота возрастает почти в 3,3 раза (табл. 9). Таблица 9 Содержание NOx и S-нитрозотиолов в сыворотке крови коров в норме и при послеродовом эндометрите
Примечание: * – P1–2 < 0,005; – P1–3 < 0,05; ▼ – Р3-4 < 0,05, ▲ – Р2-4 < 0,05 Такое значительное увеличение продукции NO с одной стороны, необходимо для расслабления цервикального канала, с другой – обусловлено развитием физиологического стресса у коров перед родами. У коров с послеродовым эндометритом в период стельности в 250-260 дней уровень оксида азота был ниже на 21,9%. При этом содержание S-нит-розотиолов статистически достоверно не отличалось от уровня, характерного для животных без акушерской патологии. Возможно, что достижение определенной концентрации оксида азота имеет физиологический смысл для нормального течения родового акта, сократительной функции матки и отделения последа, что и снижает вероятность развития эндометрита. Резкое возрастание продукции NO выявлено при развитии послеродового эндометрита, в этиологии которого существенная роль принадлежит микробному фактору. В этом случае повышение уровня стабильных метаболитов оксида азота уже после отела в 2,9 раза, по сравнению с его уровнем у животных без патологии, возможно, является следствием его генерации в иммунокомпетентных клетках – макрофагах и нейтрофилах. Таким образом, проведенные исследования позволяют считать, что состояние антиоксидантного статуса и системы оксида азота играют существенную роль, как в регуляции функционирования репродуктивной системы, так и в патогенезе послеродового эндометрита. 3.6.4. Интенсивность пероксидного окисления, состояние антиоксидантной системы и системы оксида азота при субинволюции матки Исследования проведены на 2-х группах коров, которые на основании акушерско-гинекологических исследований ретроспективно были разделены на клинически здоровых (n=39) и коров, с нарушением сократительной функции матки после отела (n=26). Установлено, что до родов у оставшихся в последствии здоровыми и коров с послеродовой субинволюцией матки был сходный уровень содержания стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови. В период клинического проявления острой субинволюции матки интенсивность продукции оксида азота возрастала. Уровень NOх в крови коров с острой субинволюцией матки на следующий день после родов превышал таковой у коров с нормальным течением инволюционных процессов на 48,4%, через 2 суток – в 2,5 раза, через 3 суток – в 2,3 раза (рис. 9).
Изменения в динамике содержания S-нитрозотиолов были аналогичны в предродовой период, а после отела носили противоположный характер. Вероятно, более низкая концентрации RSNO после отела у животных с нарушением сократительной функции матки связана с нарушением механизмов регуляции системы оксида азота. Данные нарушения и проявление избыточного релаксирующего действия самого оксида азота на миометрий, могут являться одной из причин сбоя физиологического течения инволюционных процессов в матке. Несколько иная динамика была выявлена при изучении процессов свободнорадикального окисления липидов и функционального состояния антиоксидантной системы. Если в предродовой период статистически достоверных различий между показателями интенсивности системы оксида азота у оставшихся здоровыми и заболевших животных не было выявлено, то для коров с субинволюцей матки за 10-14 дней до отела была характерна пониженная мощность глутатионового звена АОС (табл. 10). Об этом свидетельствует более низкий уровень в крови у заболевших после отела коров глутатионредуктазы (на 38,2%) – фермента, поддерживающего общий пул восстановленного глутатиона в организме. Помимо этого, у заболевших коров в крови снижена активность ГПО на 39,8 %, что в целом свидетельствует о более низком уровне функционального состояния ферментативного звена антиоксидантной системы у коров, предрасположенных к субинволюции матки. Таблица 10 Активность ферментов глутатионового звена системы антиоксидантной защиты в крови у здоровых и заболевших коров
Примечание: * - P < 0,05-0,001 по сравнению со здоровыми животными Следствием сниженного функционального состояния глутатионового звена антиоксидантной системы, контролирующей интенсивность течения процессов свободнорадикального окисления, является и более высокое содержание в крови у заболевших коров первичных и вторичных продуктов пероксидации липидов (табл. 11). Таблица 11 Содержание продуктов ПОЛ в крови у здоровых и заболевших коров в разные периоды до и после отела
Примечание: *- P < 0,05-0,001 по сравнению со здоровыми животными За 10-14 дней до отела у коров, которые после родов имели нарушение инволюционных процессов, содержание малонового диальдегида было выше на 57,1%, чем у оставшихся впоследствии здоровыми животных На второй день после родов у коров без субинволюции матки содержание в крови конъюгированных диенов превышает дородовый уровень на 16,1%, малонового диальдегида – на 75,0%. У заболевших после родов коров, уровень конъюгированных диенов возрастал на 70,5 %, а малонового диальдегида – в 2,3 раза. Таким образом, проведенный сравнительный анализ состояния систем АОЗ и процесса ПОЛ у коров с нормальным и патологическим течением послеродового периода свидетельствует о том, что у животных, у которых в дальнейшем развилась субинволюция матки, уже за 10-14 дней до отела отмечается тенденция к снижению потенциала ферментативного звена системы АОЗ и более интенсивному течению процессов пероксидации липидов. Это не позволяет адекватно контролировать и удерживать в физиологических пределах нарастающий при стрессе уровень активных форм кислорода, сдерживать чрезмерную активацию процессов ПОЛ, что приводит к неблагоприятным метаболическим изменениям. ^ Установлено, что у коров с дисфункцией яичников происходит интенсификация процессов СРО, о чем свидетельствует повышение содержания в крови МДА на 44,0% по сравнению со здоровыми циклирующими животными (табл. 12). Таблица 12 Показатели системы ПОЛ-АОЗ у коров в норме и при дисфункции яичников
Примечание: * – P < 0,05 по сравнению со здоровыми животными Учитывая то, что пероксидное окисление липидов играет важную роль в липидном обмене организма, можно предположить, что значительное возрастание скорости течения СРО при бесплодии, может являться одной из причин угнетения синтеза стероидных гормонов, а, следовательно, нарушения стероидогенеза (Зенков Н.К. с соавт., 2001), характерного для данной патологии. Высокое содержание МДА – промежуточного продукта ПОЛ – у бесплодных животных не связано с функциональной недостаточностью ферментативного звена антиоксидантной системы, о чем свидетельствует более высокий функциональный потенциал антиоксидантной системы у коров с дисфункцией яичников. Так, у них, по сравнению со здоровыми циклирующими животными, активность каталазы была выше на 24,3%, СОД – на 31,9%, ГПО – на 27,7%, ГР – на 10,6%. Однако надо отметить наличие определенного дисбаланса в работе глутатионового звена системы АОЗ, поскольку, при повышении активности ГПО на 27,7%, активность ГР возрастала всего на 10,6%, а следовательно пул восстановленного глутатиона истощался. У коров с дисфункцией яичников наблюдалось снижение суммарной концентрации NO2¯+NO3¯ в сыворотке крови на 61,1% и содержания S-нитрозотиолов на 29,8% по сравнению с контрольными животными (рис. 10).
Дать однозначную оценку физиологическому эффекту снижения продукции оксида азота при дисфункции яичников у коров сложно. Однако, исходя из имеющихся данных о том, что оксид азота способен замедлять процесс старения яйцеклеток (Goud P.T. et al., 2008), можно предположить, что снижение уровня генерации оксида азота у бесплодных животных влечет за собой нарушение процесса ово- и фолликулогенеза и дисфункцию гонад. Кроме того, установлена взаимосвязь образования в организме NO с уровнем эстрогенов (Moreno A.S., Franci C.R., 2004) и прогестерона (Coughlan T. et al., 2005). Таким образом, развитие ряда заболеваний сельскохозяйственных животных, таких как бронхопневмония, жировая дистрофия печени и патологии репродуктивной системы сопровождается изменением в интенсивности образования оксида азота. В этой связи можно полагать, что модулирующее воздействие на систему генерации оксида азота позволит направленно влиять на функциональное состояние организма и может послужить основой для разработки нового класса лекарственных препаратов. 3.7. Влияние модуляции синтеза оксида азота на интенсивность свободнорадикального окисления, состояние АОС и систему оксида азота в норме и при экспериментальных патологических состояниях В опытах на самцах белых беспородных крыс по влиянию модуляции продукции оксида азота на состояние оксидантно-антиоксидантного равновесия и системы оксида азота в качестве блокаторов синтеза NO применяли аминогуанидин (AG) – селективный ингибитор индуцибельной формы NO-синтазы и метиловый эфир нитро-L-аргинина (L-NAME) – неселективный ингибитор NO-синтаз (Гильяно Н.Я. с соавт., 2007). В качестве индуктора синтеза NO использовали L-аргинин (L-Arg), являющегося естественным эндогенным источником образования оксида азота в организме (Wink D.A., Mitchell J.B., 1998) и соединение ФБ-26, являющееся одновременно и антиоксидантом, и донором оксида азота (Мищенко Д.В. с соавт, 2003). ^ Установлено, что введение животным L-аргинина в дозе 400 мг/кг массы тела внутрибрюшинно, однократно, ежедневно в течение 6 суток приводит к увеличению суммарного содержания в плазме крови нитрата и нитрита на 43,5%, а применение ингибиторов NO-синтазы – к снижению более чем в 2 раза суммы NOх в крови у животных (табл. 13). Таблица 13 Содержание суммы стабильных метаболитов оксида азота и нитрозотиолов в плазме крыс в условиях модуляции продукции оксида азота
Примечание: *– P1-2,3,4 <0,05-0,001 ▲– P2-3,4 <0,05-0,001 В то же время введение животным L-NAME и AG – ингибиторов NO-синтаз в дозе 50 мг/кг массы тела внутрибрюшинно, однократно, ежедневно в течение 6 суток не вызвало существенного изменения в содержании S-нитрозотиолов по сравнению с животными контрольной группы. Это, возможно, связано с тем, что в плазме крови существует некий базовый уровень S-нитрозотиолов, выступающий в качестве резервного фонда оксида азота, и который даже в условиях ингибирования его продукции используется незначительно. Генерация супероксиданиона в разных компартментах клетки при введении L-аргинина статистически не отличалась от интенсивности его образования у контрольных животных. В тоже время, применение блокаторов синтеза NO приводило к увеличению как спонтанной, так и стимулированной продукции супероксиданиона (табл. 14). Таблица 14Спонтанная, НАДН- и НАДФН-стимулированная продукция супероксид-анионрадикала в гомогенате печени крыс
Примечание: *– P1-2,3,4 <0,05; ▲– P2-3,4 <0,05 Введение здоровым животным L-аргинина, аминогуанидина и L-NAME не влияло на интенсивность процессов пероксидации липидов и окислительной модификации белков, так как статистически достоверных изменений в содержании диеновых конъюгатов, кетодиенов, малонового альдегида и карбонильных групп в белках не было установлено. Полученные данные подтверждают концепцию о циклических превращениях для NO в организме млекопитающих (Реутов В.П. с соавт., 1998), благодаря чему обеспечивается не только его эффективная наработка, но и достаточно быстрое выведение путем превращения в менее активные вещества (ионы NO2¯ и NO3¯), чем и может быть объяснено отсутствие биологического ответа при применении, как активаторов, так и ингибиторов NO-синтаз. Введение животным эндогенного предшественника оксида азота L-аргинина повышало на 13,6 % активность СОД и на 22,1% – каталазы. Активация синтеза оксида азота L-аргинином у здоровых животных повлияла на активность и ферментов глутатионового звена АОЗ. Так, активность глутатионпероксидазы статистически достоверно возрастала на 16,7%, а активность глутатионредуктазы – на 14,1 %. Применение же блокаторов синтеза оксида азота здоровым крысам не вызывало статистически достоверных изменений в активности ферментов АОЗ. Таким образом, стимуляция продукции NO, с одной стороны не оказывает влияние на интенсивность процессов СРО, а с другой способствует увеличению активности ферментов антиоксидантной защиты. Механизм повышения активности ферментов АОЗ, может быть связан с влиянием NO на экспрессию генов, кодирующих данные ферменты (Dobashi K. et al., 1997; White A.C. et al., 1995). 3.7.2. Влияние модуляции синтеза оксида азота на интенсивность пероксидации липидов и белков, состояние антиоксидантной системы и системы оксида азота при эмоционально-болевом стрессе |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Рис. 4. Возрастная динамика активности супероксиддисмутазы и каталазы в крови телят (в % к уровню у 30-дневных животных)
Рис. 9. Содержание стабильных метаболитов оксида азота (NOх ) в сыворотке крови у здоровых коров и коров с острой субинволюцией матки, мкМ/л
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям