Микробиологические методы выделения и
|
|
Скачать 2.43 Mb.
|
| Министерство здравоохранения Республики Беларусь Инструкция 4.2.10-15-21-2006 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ПРИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПИЩЕВЫХ ОТРАВЛЕНИЯХ Минск – 2006 УТВЕРЖДЕНО Постановление Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь 09 октября 2006 г. № 120 ИНСТРУКЦИЯ 4.2.10-15-21-2006 «МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ПРИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПИЩЕВЫХ ОТРАВЛЕНИЯХ» ГЛАВА 1 ^ Настоящая Инструкция устанавливает микробиологические методы выделения и идентификации возбудителей при бактериальных пищевых отравлениях. Настоящая Инструкция предназначена для специалистов органов и учреждений, осуществляющих государственный санитарный надзор. Настоящая Инструкция является обязательной к применению в ходе проведения микробиологических исследований по реализации санитарно-гигиенических и противоэпидемических мероприятий при пищевых отравлениях. Перечень объектов, которые по предварительным данным санитарно-эпидемиологического расследования связаны с предполагаемой этиологией отравления, сроки забора материала, объем микробиологических исследований, определяются лечащим врачом или врачом эпидемиологом. Пищевые отравления, вызванные микроорганизмами, представляют актуальную проблему здравоохранения. Большинство стран отмечают существенные увеличения на протяжении последних десятилетий значительной распространенности заболеваний, связанных с содержанием условно-патогенных микроорганизмов в продуктах питания. К числу этих микроорганизмов относятся сальмонеллы, кампилобактерии, энтеропатогенные кишечные палочки. Своей актуальности не теряют и другие возбудители: Clostridium botulinum, Staphylococcus aureus, Вasillus cereus, бактерии рода Shigella и др. Различные виды патогенных и условно патогенных микроорганизмов могут явиться причиной пищевого отравления при определенных условиях и массивности дозы. ГЛАВА 2 ^ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ На исследование направляются те материалы, которые по предварительным данным санитарно-эпидемиологического расследования связаны с предполагаемой этиологией отравления. Объектами исследования могут быть: остатки подозреваемой пищи, употребленной заболевшими, а также исходные продукты и полуфабрикаты, которые использовались при ее приготовлении; суточные пробы готовой пищи (если установлен порядок обязательного их хранения); испражнения, рвотные массы, промывные воды, моча пострадавших; кровь для получения гемокультур и для постановки серологических реакций (при подозрении на ботулизм кровь берут до введения лечебной противоботулинической сыворотки); слизь из зева и носа, выделения гнойничковых поражений кожи персонала, занятого приготовлением готовой пищи; смывы и соскобы с инвентаря, оборудования, тары, рук персонала; вода питьевая, в том числе из графинов, питьевых бачков; содержимое желудка, отрезок тонкого кишечника, паренхиматозные органы (печень, селезенка), кровь из сердца, костный мозг, мезентериальные лимфатические узлы, желчь - при летальных исходах заболевания. Общим требованием к процедуре отбора проб является обеспечение условий, исключающих контаминацию посторонней микрофлорой. Клинический материал, подлежащий бактериологическому исследованию собирают в стерильную посуду, которую хорошо укупоривают, снабжают этикеткой с фамилией обследуемого и наименованием материала, пробы нумеруют и опечатывают. В сопроводительном документе (направлении) указывают какое учреждение направляет материал, фамилию, имя, отчество и возраст обследуемого; адрес; место работы, учебы, пребывания в организованном коллективе, закрытом учреждении и др.; дату и время заболевания; предполагаемый диагноз; дату и время взятия пробы; фамилию и должность лица, направляющего материал. Пересылку проб в лабораторию производят в кратчайший срок, если взятые на бактериологическое исследование пробы не могут быть доставлены в лабораторию немедленно, их разрешается хранить в холодильнике при температуре 4-60С не более суток. Испражнения, получают при естественной дефекации или с помощью ректальных тампонов (петель). Для сбора материала путем естественной дефекации используют тщательно вымытые и лишенные следов дезинфицирующих средств судна или горшки. На дно судна, для защиты материала от следов дезинфектанта, можно поместить лист чистой бумаги. Пробу испражнений отбирают сразу после дефекации с помощью стерильной стеклянной палочки, проволочной петли или деревянного шпателя. При наличии патологических примесей необходимо выбрать участки, содержащие слизь, гной, хлопья, но свободные от крови. Получение материала из прямой кишки с помощью ректальных тампонов (петель) осуществляется средним медицинским персоналом. Больного просят лечь на бок с притянутыми к животу бедрами и ладонями развести ягодицы. Петля (тампон) вводится в задний проход на глубину 5-6 см. Для забора материала используют петли из алюминиевой проволоки (отрезок проволоки длинной около 50 см сгибается пополам) или ватные тампоны на проволочной ручке. Ряд фирм выпускает специальные устройства для этих целей. Если планируется проведение исследований на ОКИ, обусловленные условно-патогенными бактериями, то материал может быть получен только путем естественной дефекации. Получение материала путем естественной дефекации является также предпочтительным при проведении исследований на кампилобактеры и энтеропатогенные кишечные палочки. Перед обследованием взрослых на бактерионосительство рекомендуется предварительное назначение солевого слабительного - 25-30 г сульфата магния. Материал собирают в пустую стерильную посуду или в пробирки с консервантом. При исследовании на ОКИ, обусловленные условно-патогенными микроорганизмами консервант не используется. Время до начала бактериологического исследования, если консервант не применяется, не должно превышать 2 часов. В качестве консервантов (транспортных сред) используют глицериновую смесь, боратно-буферный раствор, фосфатную буферную смесь, а при исследовании на кампилобактериоз - физиологический раствор, 0,1% пептонную воду, тиогликолевую среду. Наиболее универсальным консервантом является транспортная среда Кэри-Блер. Применение транспортных сред обязательно, если материал забирается с помощью ректального тампона (петли). Важно отметить, что попадание транспортных сред на слизистую прямой кишки недопустимо! Поэтому ректальная петля должна упаковываться отдельно и погружаться в транспортную среду только после взятия материала. Объем испражнений, вносимых в транспортную среду не должен превышать 1/3 её объема. После внесения пробу перемешивают со средой. Время хранения образцов до начала исследования может составлять до 1 суток в холодильнике, однако оптимальным является проведение посева через 1-2 часа после забора. Взятие крови целесообразно осуществлять во время лихорадочного периода, до начала химиотерапии или через 12-24 часа после последнего введения препарата. Манипуляции проводят с соблюдением правил асептики. Кровь для бактериологического исследования у взрослых забирается в количестве не менее 10 мл, у детей - не менее 5 мл., у новорожденных - 1-2 мл. Кровь берут у постели больного или в перевязочной и тут же засевают на питательные среды в соотношении 1:10 во флаконы со средой. Кровь для постановки серологических реакций забирают из локтевой вены в стерильную сухую пробирку в количестве не менее 8-10 мл. Постановку серологических реакций производят с сывороткой крови. С целью формирования сгустка кровь выдерживают 30-40 минут при комнатной температуре или в термостате при 370С, после чего стерильной пипеткой отделяют сгусток от стенок пробирки и помещают в холодильник при температуре 5-80С для окончательного формирования сгустка; сыворотку отсасывают и используют для постановки серологических реакций. Рвотные массы отбирают в количестве 50-100 мл, промывные воды — в количестве 100-200 мл. При кислой реакции рвотные массы перед посевом нейтрализуют 10% стерильным раствором натрия гидрокарбоната (NaHCO3). Желчь (дуоденальное содержимое) получают путем зондирования, реже, во время операции при пункции желчного пузыря. При зондировании желчь собирают в 3 стерильные пробирки раздельно по порциям А, В, С. Пробы должны быть доставлены в лабораторию в течение 1-2 часов. Среднюю порцию свободно выпущенной мочи в количестве 20-30 мл собирают в стерильную посуду. Перед взятием материала больной должен совершить тщательный туалет наружных половых органов. Пробы мочи могут храниться до начала исследования не более 1-2 часов при комнатной температуре и не более суток в холодильнике. Мочу перед посевом центрифугируют и засевают осадок, или используют для посева нативную мочу. Гной, пунктаты органов, экссудат берут с помощью стерильного шприца или тампона и помещают в стерильные пробирки. Спинномозговую жидкость получают при люмбальной пункции, в количестве 5-10 мл и помещают в стерильную пробирку. Слизь из зева и носа забирают стерильным ватным тампоном и непосредственно засевают на питательные среды или помещают в стерильную пробирку. Секционный материал забирают из каждого органа или ткани, в стерильных условиях: поверхность органа прижигают раскаленным шпателем, кусочки вырезают из глубины стерильными ножницами. Из желудка и кишечника содержимое забирают пастеровской пипеткой путем прокола их стенки. Место прокола предварительно прижигают раскаленным шпателем. Пробы от каждого органа помещают в отдельные стерильные банки. Отбор проб пищевых продуктов проводят в соответствии с ГОСТ 26668-85 «Продукты пищевые и вкусовые методы отбора проб для микробиологических анализов», и другими нормативными документами на конкретный вид продукции. Масса (объем) пробы устанавливается в соответствии с нормативным документом. В тех случаях, когда это невыполнимо, отбор проб производят в количествах менее установленных. Пробы отбирают асептическим способом в стерильную посуду. Продукты заводского изготовления отбирают в оригинальной упаковке. Отбор проб продуктов плотной консистенции и сыпучих можно выполнять путем затаривания в несколько слоев стерильной пергаментной бумаги. Остатки консервов направляют на исследование непосредственно в той емкости, из которой они использовались в пищу. При отсутствии остатков консервов, исследованию подлежит содержимое нескольких невскрытых банок, с маркировкой, полностью идентичной маркировке вскрытой банки. Если в партии консервов одноименной маркировки имеются бомбажные банки, их отбирают и исследуют в первую очередь. Маркировочные знаки, поставленные на донышке и крышке банок, регистрируют в лабораторном журнале. Мясо отбирают для анализа в количестве 500 г, при этом проба отбирается из различных мест туши с обязательным взятием мезентериальных лимфатических узлов, а также участков трубчатой кости. Если возможно, то следует от животных отбирать кровь из сердца, содержимое кишечника, желчь и стенки желчного пузыря. Для исследования могут быть использованы также смывы с поверхности туши. Птицу берут целой тушкой или ее остатки, включая анальное отверстие. Мелкую рыбу отбирают в количестве 2-3 штук, от крупной рыбы — 2—3 куска, в том числе из спинки, ближе к голове и из участков вблизи анального отверстия. Продукты, находящиеся в бочечной таре, берут сверху, из середины и со дна бочки. B отдельную посуду набирают 100-200 мл рассола. Пробы жидких и полужидких объектов (супы, соусы, кремы, салаты, молочные продукты) отбирают после тщательного перемешивания в количестве около 200 г. Для вторых блюд норма выемки 1-2 порции. Остатки фактически употребленной пищи отбирают для анализа непосредственно в тех емкостях, в которых они были обнаружены. Допускается доставка также в стерильной посуде, куда остатки пищи должны быть перемещены с соблюдением правил асептики. Суточные пробы направляют для исследования непосредственно в той емкости, в которой они хранились в холодильнике. В лабораторию пробы пищевых продуктов доставляют в опечатанном виде. В сопроводительном документе указывают: наименование предприятия или учреждения, где произведены выемки проб, его адрес, перечень проб с указанием их веса, характера тары и упаковки (стерильность посуды, охлаждение проб, наличие печати и т. д.), дату и время выемки и отправления в лабораторию; дата и время заболеваниия, срок появления первых клинических симптомов заболевания после употребления подозреваемой пищи, число пострадавших, госпитализированных, наличие случаев со смертельным исходом, предварительный диагноз; при направлении проб нескольких продуктов необходимо отметить, какой из них подозревается как фактор передачи пищевого отравления; цель исследования; должность и подпись лица, произведшего выемку и направившего пробы в лабораторию. Подготовку проб пищевых продуктов для микробиологических исследований проводят согласно ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов». Исследование материалов, доставленных в лабораторию в процессе расследования пищевого отравления, производится немедленно по их получении. Во время регистрации доставленного в лабораторию материала, последний хранится в холодильнике. Непосредственно перед посевом исполнителю необходимо ознакомиться с состоянием упаковки всего материала и каждой отдельной пробы, при этом обратить внимание на целостность упаковки, наличие пломб и печатей, отметить количество доставленного материала. В связи с тем, что большинство проб направляют в лабораторию для бактериологического и для химического исследования, указанный выше осмотр можно проводить совместно с химической лабораторией. Необходимо перед анализом отметить органолептические качества доставленных проб: внешний вид, запах, консистенцию. Продукты подвергают бактериологическому исследованию независимо от признаков порчи. Бактериологические исследования пробы начинают с подготовки навески, которая должна охарактеризовать всю доставленную пробу. Материал для навески продуктов плотной консистенции (мясо, колбаса и др.) отбирают берут из разных мест доставленной пробы: с поверхности и из глубины. Если это тушка птицы - из мест, прилегающих к кишечнику; если рыба - вблизи жаберных дужек и анального отверстия. Возможно использование для приготовления навески всей доставленной пробы, если даже ее вес достигает 500-800 г. Имеет определенное значение исследование навески, состоящей из кусочков, отобранных только из глубины доставленной пробы. В этом случае при отборе материала для навески производят стерилизацию поверхности металлическим шпателем или ножом. Возможно исследование навески продукта, состоящей из кусочков, отобранных только из поверхностных слоев пробы, т. к. это позволяет установить вторичное загрязнение продукта. В этом случае небольшие кусочки пищевых продуктов засевают непосредственно, при этом поверхность пробы не обжигают раскаленным шпателем или ножом, т. к. это может привести к уничтожению патогенной флоры. Навеска продукта должна быть не менее 25-30 г. Стерильно взятую навеску продукта плотной консистенции перед посевом гомогенизируют с небольшим количеством 0,1% пептонной воды или питательной среды (в соотношении от 1:2 до 1:5, в зависимости от консистенции исследуемого продукта). Для получения однородного гомогенизированного посевного материала необходимо пользоваться гомогенизатором. При отсутствии гомогенизатора навеску продукта нарезают мелкими кусочками, помещают в стерильную банку, добавляют необходимое количество 0,1% пептонной воды и подвергают встряхиванию в течение 10-15 минут в аппарате для встряхивания. Крем, масло сливочное, мороженое и т.п. перед посевом подвергают расплавлению. Для этого навеску в количестве 25-30 г отбирают в стерильную стеклянную банку и помещают либо в термостат при температуре 430С, либо в водяную баню при той же температуре. После расплавления производят посев, причем при посевах масла и сливочного крема необходимо использовать нижний слой. Костный мозг перед посевом извлекают из трубчатых костей и эмульгируют в подогретом до 430С физиологическом растворе. Жидкие объекты (молоко, напитки, супы) засевают без предварительной обработки. Пищевые продукты, имеющие кислую реакцию, а также рвотные массы, перед посевом нейтрализуют 10% стерильным раствором натрия гидрокарбоната (NaHCO3) до рН 7,2-7,4. Реакцию среды проверяют по универсальной индикаторной или лакмусовой бумажке. Невскрытые консервы в банках перед посевом осматривают, отмечают внешний вид, наличие бомбажа, ржавчины и т. п., затем обмывают теплой водой с мылом и проверяют на герметичность по ГОСТ 30425-97 «Консервы, методы определения промышленной стерильности». Непосредственно перед посевом банки протирают спиртом, а крышки обжигают. Отбор проб воды производят согласно СТБ ГОСТ Р 51592-2001 «Вода. Общие требования к отбору проб», СТБ ГОСТ Р51593-2001 «Вода питьевая. Отбор проб», МУК РБ 11-10-1-2002. Выемку проб воды производят в количестве не менее 1 литра. При необходимости исследования воды из графинов, ее можно доставлять в лабораторию непосредственно в графинах. Пробы маркируют и сопровождают документом с указанием объема, места отбора, даты и времени отбора, фамилии специалиста отбиравшего пробу. Техника взятия смывов описана в главе 15 настоящей Инструкции. При взятии смывов в направлении записывается номер образца по порядку, место взятия смыва, с какого объекта взят смыв (оборудованиие. инвентарь, посуда и др.). При взятии смывов с рук записывается: номер образца по порядку, фамилия, имя, отчество обследуемого, выполняемая работа (профессия и участок работы). Соскобы производят стерильным или прокаленным в пламени горелки ножом или скальпелем. Их собирают в стерильную банку или чашку Петри с небольшим количеством (2-3 мл) ИХН. Необходимо отметить, что направление бактериологических исследований определяется клинической картиной заболевания и данными эпидемиологических расследований с учетом возможного выявления других, не приведенных в настоящей инструкции, возбудителей пищевых отравлений. ГЛАВА 3 ^ Термином «сальмонеллезы» обозначают большую группу инфекционных заболеваний человека и животных, возбудителями которых являются бактерии, относящиеся к семейству Enterobacteriaceae, роду Salmonella. Род представлен 2 видами: S.enterica и S.bongori. Вид S.enterica состоит из 6 подвидов (subspecies): S.еnteriсa подвид еnteriсa, S. еnteriсa подвид salamae, S.еnteriсa подвид arizonae, S.еnteriсa подвид diarizonae, S. еnteriсa подвид houtenae и S. еnteriсa подвид indiсa. Виды и подвиды можно отличить на основе дифференциальных характеристик согласно приложению 2 к настоящей Инструкции. Сальмонеллы - прямые грамотрицательные палочки (0,7-1,5х2-5 мкм), подвижны (перитрихи), факультативные анаэробы, хемоорганотрофы. Сальмонеллы - оксидазонегативные, каталазопозитивные, индол и Фогес-Проскауэра негативные, метиловый красный и цитрат позитивные, продуцируют сероводород и не расщепляют мочевину. Биохимические свойства бактерий рода Salmonellа согласно приложению 1 к настоящей Инструкции. Основным резервуаром сальмонелл и источником инфекции являются животные (свиньи, крупный и мелкий рогатый скот и др.) и птицы (куры, гуси, утки и др.). Механизм заражения – фекально-оральный, ведущий путь передачи – пищевой: факторами передачи являются яйца птиц, мясо животных и птиц. Наибольшую опасность представляют продукты и блюда, которые после приготовления не подвергаются термической обработке, и особенно, если они длительно хранятся при комнатной температуре. Даже при интенсивном размножении сальмонелл в пищевых продуктах, они не изменяют ни вкуса, ни запаха, ни их внешнего вида. Сальмонеллы долго сохраняют жизнеспособность во внешней среде: в воде открытых водоемов и питьевой воде они переживают от 11 до 120 дней, в морской воде - от 15 до 27 дней, в почве - от 1 до 9 месяцев, в комнатной пыли – от 80 дней до 18 месяцев, в колбасных изделиях – от 60 до 130 дней, в замороженном мясе - от 6 до 13 месяцев, в яйцах - до 13 месяцев, в яичном порошке от 3 до 9 месяцев, в замороженных овощах и фруктах - 0,5-2,5 месяца. Границы температурного режима для роста сальмонелл находятся между + 70С и + 450С, оптимальной температурой для роста сальмонелл является +370С. Они могут расти при значениях рН не ниже 4,1 и не выше 9,0, оптимальная рН для роста 6,5-7,5. Сальмонеллы чувствительны к воздействию высоких температур, при +570С (в жидкой среде) большинство из них погибают в течение 1-3 мин, кипячение убивает мгновенно. Сальмонеллы вида S.еnteriсa обозначаются следующими символами: I – или название серовара для сероваров вида S. еnteriсa подвида еnteriсa. Для представителей других подвидов вида S. еnteriсa введены следующие обозначения: II - для сероваров S.еnteriсa subsp. Salamae; IIIа - для сероваров S. еnteriсa subsp. Аrizonae; IIIb - для сероваров S. еnteriсa subsp. Diarizonae; IV - для сероваров S. еnteriсa subsp. Houtenae; VI - для сероваров S. еnteriсa subsp. Indiсa; V - Вид S. bongori – для 21 серовара S. bongori subsp. bongori. Деление на подвиды имеет определенное эпидемиологическое значение, так как основным естественным резервуаром сальмонелл подвида I служат теплокровные животные, для представителей остальных подвидов (II, IIIа, IIIb, IV, VI) и вида S. bongori (V) – холоднокровные животные и окружающая среда. Число сероваров сальмонелл, входящих в каждый подвид: S. еnteriсa subsp. Еnteriсa 1478 (59,1%), S. еnteriсa subsp. Salamae 498 (19,9%), S.еnteriсa subsp. Аrizonae 94 (3,8%), S. еnteriсa subsp. Diarizonae 327 (13,1%), S.еnteriсa subsp. Houtenae 71 (2,8%), S.еnteriсa subsp. Indiсa 12 (0,5%), S.bongori subsp. Bongori 21 (0,8%). Определение и название подвидов не является обязательными в клинической микробиологической практике. Необходимым для идентификации является только название серовара подвида Еnteriсa. Серовары других подвидов вида S.еnteriсa и вида S.bongori обозначаются № подвида и их антигенной формулой II – О 1,6,14 Н z10, е, n, x, z15. Это значит, что штамм с такой антигенной характеристикой относится к виду Еnteriсa subsp. Salamae. Подвиды включают около 2500 сероваров (серотипов) сальмонелл. Сокращенное название сероваров пишется с заглавной буквы, например: S.typhi (вместо – “Salmonella enterica subs. enterica serovar Typhi”). Антигенная структура сальмонелл: термостабильные О-антигены, сохраняющиеся при кипячении культуры в течение 2-5 часов, расположены на поверхности тела клетки, представляют собой липополисахаридно-пептидные комплексы. Серовары сальмонелл, имеющие общий компонент О-антигена, объединены в одну группу. Таких групп по Кауфману-Уайту насчитывается около 70; термолабильные Н-антигены, жгутиковые, имеют белковую природу, разрушаются нагреванием при температуре 75-1000С. Состав Н–антигенов обуславливает разделение сальмонелл на серовары. Выделяют антигены I (специфические) фазы и II (не специфические) фазы. Сальмонеллы, в которых Н-антигены представлены двумя фазами называют двухфазными (в отличие от монофазных, имеющих антигенные факторы только I фазы); одним из компонентов О-антигена является Vi-антиген. Vi-антиген - соматический антиген, принадлежащий к группе К-антигенов. Исследователи, впервые открывшие его у S.typhi назвали его «антиген вирулентности», считая что этот антиген обуславливает вирулентность возбудителей брюшного тифа, теперь доказано, что он не является прямым носителем вирулентности микроба и обнаружен у других серологических типов сальмонелл - S.typhi, S.paratyphi С, S.dublin. Структурно Vi-антиген представляет собой полимер N-ацетиламино-гексуроновой кислоты. Присутствие его на поверхности тела бактерий препятствует агглютинабельности их в О-сыворотке, т.е. делает бактерии «О-инагглютинабельными» термолабильный поверхностный К-антиген; М-антиген (слизистый) обнаружен у слизистых штамов S. paratyphi В, S. dublin и некоторых других. При серологической идентификации во внимание принимаются три основных антигена (О, Н, Vi). Этот принцип положен в основу диагностической антигенной схемы Кауфмана-Уайта. Основным методом типирования сальмонелл остается серотипирование, точный метод используемый для эпидемиологической характеристики возбудителя. Современные молекулярно-генетические методы не заменяют серотипирование, а лишь дополняют его, позволяя дифференцировать штаммы в пределах одного серотипа. До настоящего времени для серотипирования сальмонелл в Республике Беларусь применяется схема Кауфмана-Уайта, содержащая сведения о серотипах сальмонелл, известных на 31 декабря 1970 года. В соответствии с рекомендациями Референс-центра Всемирной Организации Здравоохранения по исследованию сальмонелл (институт Пастера, Париж), в большинстве стран мира для серотипирования сальмонелл и эпидемиологического надзора за сальмонеллезами применяется схема Кауфмана-Уайта (2001). В ней содержатся сведенья о серотипах сальмонелл известных на 31 декабря 2000 года с учетом изменений в таксономии рода Salmonella и номенклатуре серотипов, полученные за последние 30 лет в результате молекулярно-генетических исследований, схема насчитывает 2501 серологический вариант. Сокращенная схема Кауфмана-Уайта согласно приложению 3 к настоящей Инструкции. Полнотекстовую версию схемы Кауфмана-Уайта (2001) можно получить на сайте ГУ РЦГЭиОЗ www.rcheph.by Критерии диагностики. Доказательством этиологической роли возбудителя является выделение возбудителя одного и то же серологического типа с дальнейшим определением биоваров и фаговаров (эпидемиологических маркеров), определением антибиотикограммы от больных, подозреваемых источников инфекции (людей или животных - больных или бактерионосителей) и возможных факторов передачи инфекции. С целью выявления возможного источника инфекции и подтверждения клинического диагноза у больных необходимо проведение серологических исследований для обнаружения в сыворотке крови обследуемых специфических антител. Бактериологические исследования клинического материала. Первый день. Испражнения суспендируют в ИХН в соотношении 1:5 или 1:10 и засевают в чашки Петри с дифференциально-диагностическими средами (висмут-сульфит агар, Плоскирева, Эндо, агар с эозин-метиленовым синим (далее ЭМС-агар)) и одновременно не разведенные испражнения вносят в среду обогащения (селенитовый бульон, магниевую среду, среды Мюллера или Кауфмана), в соотношении 1:5. Для одновременного выделения шигелл и сальмонелл целесообразно использовать высокоселективные среды (среда для сальмонелл и шигелл (SS-агар)), ксилозо-лизин-дезоксихолатный (XLD-агар). Если испражнения доставлены в консерванте, каплю взвеси наносят на поверхность плотной среды у края чашки и тщательно растирают стерильным стеклянным шпателем по всей поверхности среды и одновременно, испражнения доставленные в фосфатно-буферной смеси, засевают в среду обогащения двойной концентрации в соотношении 1:1, в глицериновом консерванте – в среду обогащения обычной концентрации в соотношении 1:5. При взятии материала ректальным тампоном его погружают в среду обогащения после посева на пластинчатые среды. Кровь засевают в 10-20% желчный бульон или среду Рапопорт в соотношении 1:10. Мочу после центрифугирования или без него, засевают в чашки Петри с плотными средами (Эндо, Плоскирева, висмут-сульфит агар, ЭМС-агар), а также среды обогащения, не центрифугированную мочу – в среды двойной концентрации в соотношении 1:1. Желчь (дуоденальное содержимое) засевают в чашки с плотными средами (Эндо, Плоскирева, висмут-сульфит агар, ЭМС-агар) и во флаконы со слабощелочным питательным бульоном в соотношении 1:10. В последующие 3-5-7 сутки делают высевы на плотные среды, как из бульона, так и из пробирок с дуоденальным содержимым, которые содержат в термостате при температуре 370С. Рвотные массы и промывные воды засевают на плотные среды (Эндо, Плоскирева, висмут-сульфит агар, ЭМС-агар) и в среды обогащения двойной концентрации в соотношении 1:1. Спинномозговую жидкость засевают в среды обогащения и на плотные среды (Эндо, ЭМС-агар). Пунктат воспалительных очагов засевают на плотные среды и в среды обогащения в соотношении 1:5. При исследовании секционного материала кусочки органов, мезентериальные узлы и отмытые от содержимого кусочки кишечника тщательно размельчают с добавлением нескольких миллилитров ИХН. После отстаивания взвеси надосадочную жидкость засевают пипеткой на плотные среды и в среды обогащения. Кровь, мочу, желчь исследуют соответственно. Все посевы помещают в термостат при температуре 370С на 18-20 часов. Второй день. Просматривают посевы на плотных питательных средах в чашках Петри и пересевают подозрительные колонии в пробирку с комбинированой средой (Клиглера, Олькеницкого, трехсахарный агар с солями железа (ТSI) и др.). Посевы инкубируют в термостате при температуре 370С, 18-24 ч. На висмут-сульфит агаре сальмонеллы, как правило, растут в виде черных колоний, с характерным металлическим блеском, при этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией, а также зеленоватых с темно-зеленым ободком. На среде Плоскирева колонии бесцветны, но более плотные и несколько меньших размеров. На среде Эндо (Мак-Конки) сальмонеллы растут в виде круглых, бесцветных или слегка розоватых прозрачных нежных колоний. На ЭМС-агаре колонии прозрачные, слабо-розовые или розово-фиолетовые. На SS-агаре, на XLD-агаре сальмонеллы образуют колонии красного цвета с черным центром, за счет образования H2S. Посевы на висмут-сульфит агаре просматривают дополнительно через 48 часов. Производят высев из среды обогащения на плотные питательные среды. Из посевов желчи в бульон и из исходной желчи, содержащихся в термостате, производят высев на чашки со средами Эндо, Плоскирева и висмут-сульфит агаром. Из посева крови в 10-20% желчный бульон или среду Рапопорт производят высев на чашку со средой Эндо, а исходный посев крови снова помещают в термостат, высевы повторяют на 3-4-6 и 10 сутки. Третий день. Производят идентификацию культур, высеянных на комбинированую среду. По совокупности биохимических свойств, выявленных на комбинированной среде, делают предварительное заключение о возможной принадлежности культуры к роду сальмонелла, а также подбирают необходимый минимум дифференциальных тестов для определения рода и производят посевы на соответствующие среды, согласно приложению 4 к настоящей Инструкции. На этом этапе также проводят ориентировочную серологическую пробу в реакции агглютинации на стекле с поливалентными сыворотками (АВСДЕ и редких групп). Типичными для бактерий рода Salmonellа являются культуры, ферментирующие глюкозу с образованием или без образования газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, образующие сероводород. Дальнейшему изучению подвергают также лактозоположительные бактерии, или бактерии не образующие сероводород, но обязательно ферментирующие глюкозу с образованием или без образования газа. На третий день исследования производят также просмотр чашек с посевами из сред обогащения, и подозрительные колонии отсевают на комбинированную среду. Если при первичном посеве и при высеве из сред обогащения подозрительных колоний не обнаружено, может быть выдан ответ об отрицательном результате исследования. Посевы на висмут-сульфит агаре (из среды обогащения) независимо от результатов просмотра оставляют в термостате еще на 24 часа. В этот же день просматривают чашки с первым высевом из флакона с засеянной кровью и дуоденальным содержимым, подозрительные колонии пересевают на комбинированную среду. На третий день также производят посев выделенной культуры для испытания ее на чувствительность к сальмонеллезному О-фагу, являющемуся высокоспецифичным для этих бактерий, он лизирует 97,5 % штаммов сальмонелл. Для этого две капли четырех- или восемнадцати-часовой бульонной культуры испытуемого штамма наносят тонкооттянутой пастеровской пипеткой или петлей (диаметр 0,4-0,5 мм) на хорошо подсушенный слабощелочной агар в чашки Петри. После подсыхания на одну из капель, петлей или пастеровской пипеткой меньшего диаметра, наносят О-бактериофаг, а на другую, в качестве контроля - каплю бульона. Фаг наносят в рабочем разведении, указанном на этикетке. Чашки с нанесенными культурами и О-бактериофагом помещают в термостат при 37°С на 18-20 часов, после чего учитывают результаты. Появление на месте нанесения фага четко очерченной зоны сливного лизиса или большего или меньшего числа негативных колоний, отчетливо видимых невооруженным глазом, свидетельствует о чувствительности культур к бактериофагу. При отсутствии лизиса в местах нанесения фага будет сплошной рост культуры, как в контроле. О-фаг может быть использован для предварительного испытания культуры из колонии с чашки с дифференциальной средой. Культура, лизировавшаяся О-фагом, является подозрительной на сальмонеллу и может быть прямо с чашки испытана в реакции агглютинации со смесью сальмонеллезных О-сывороток. Атипичные сальмонеллезные культуры в большинстве случаев чувствительны к О-фагу, в то время, как культуры, лишь сходные с сальмонеллами по биохимическим свойствам (например, лактозонегативные E.coli), как правило, не лизируются этим фагом. Четвертый день. Производят учет результатов, биохимических тестов, выделенных культур. После подтверждения биохимическими тестами принадлежности культуры к роду Salmonellа, проводят окончательную серологическую идентификацию. Для идентификации используют культуру выросшую на слабощелочном питательном агаре. Серологическую идентификацию (определение серовара) сальмонелл начинают с испытания их в реакции агглютинации на стекле с поливалентной адсорбированной О-сывороткой к сальмонеллам групп ABCDE. При отсутствии реакции с указанной смесью, культуру испытывают с поливалентной сывороткой, включающей антитела к антигенам сальмонелл редких групп (11, 13, 15, 19, 22, 23 и др.). При получении положительных результатов с поливалентной сывороткой ABCDE культуру испытывают с отдельными О-сыворотками, для определения принадлежности ее к одной из О-групп. После установления принадлежности культуры к какой-либо О-группе (A,B,C,D,E) определяют полную структуру ее О-антигена, а затем испытывают культуру с монорецепторными Н-сыворотками, сначала первой фазы, а затем – второй и таким образом устанавливают антигенную формулу выделенной культуры, т.е. ее серовар в соответствии со схемой Кауфмана-Уайта Для агглютинации с О-сыворотками культуру следует брать с верхней части роста на скошенном агаре, для агглютинации с Н-сыворотками - из самой нижней части роста культуры или из конденсата, где располагаются особи с наиболее развитым Н-антигеном. При серологической идентификации культуры возможны трудности в выявлении Н-антигена или одной из его фаз. Для выявления отсутствующей фазы Н-антигена используют феномен роения по Свену - Гарду. Принцип его заключается в том, что на неплотном агаре (0,9-1%) роятся все подвижные микробы. Если добавить к агару 1-2 капли сыворотки известной нам фазы, т.е. той фазы, которая была определена, то она свяжет выявленный антиген, а особи микробов, богатые другим, неизвестным антигеном будут бурно роиться. Этот антиген легко может быть выявлен при испытании культуры, взятой с края макроколонии, в реакции агглютинации. Для приготовления 1,0% агара к 15 мл 2% агара добавляют 15 мл мясопептонного бульона. Охлаждают до 450С, выливают в чашку Петри, подсушивают в термостате при 370С – 15-20 мин. В центр чашки на агар наносят 1-2 капли сыворотки, соответствующей выявленной фазе Н-антигена. После того, как сыворотка впитается в агар, на то же место петлей наносят испытуемую культуру (18-часового роста на скошенном агаре), диаметром 3-4 мм. Чашки инкубируют при 370С в течение 18-20 часов. На следующий день с края микроколонии берут культуру и испытывают ее в реакции агглютинации на стекле с соответствующими монорецепторными Н-сыворотками. В этот же день производят просмотр чашек со вторым высевом дуоденального содержимого из бульона и третий высев из последнего на плотные среды. При отрицательных результатах первых двух высевов из желчного бульона с посевом крови, высевы повторяются на 5-й и 10-й дни. При идентификации культур, подозрительных на сальмонеллы, чаще всего вызывают затруднение бактерии биохимически сходные с сальмонеллами, но не агглютинирующиеся сальмонеллезными сыворотками, либо дающие агглютинацию, но отклоняющиеся по биохимическим свойствам. В таких случаях, прежде всего, необходимо убедиться в чистоте культуры, для чего следует произвести ее рассев на чашку со средой Эндо, отобрать наиболее типичные колонии и подвергнуть их дополнительному изучению. В случае выделения культур, агглютинирующихся смесью О-сывороток редких групп, но не агглютинирующихся ни одной из О-сывороток, входящих в смесь, необходима постановка дополнительных биохимических тестов. Тесты с помощью которых проводят дифференциацию бактерий рода Salmonellа с другими представителями других родов семейства Enterobacteriaceae, согласно приложению 5 к настоящей Инструкции. Исследование пищевых продуктов. Неселективное предварительное обогащение. Навеску продукта, в массе (объеме) которой нормативно-технической документацией на анализируемый продукт предусматривается отсутствие бактерий рода Salmonellа, засевают в забуференную пептонную воду. Соотношение массы (объема) продукта и забуференной пептонной воды 1:9. При посеве жидких высококислотных продуктов рН продукта перед посевом доводят до 7,0±0,2. При посеве твердых высококислотных продуктов доводят рН до 7,0±0,2 в посевах. Доведение рН проводят асептически при помощи стерильных растворов гидроокиси натрия и соляной кислоты. Посевы инкубируют при температуре 370С в течение 18-20 часов. Селективное обогащение. Культуры полученные после инкубирования пересевают в две среды для селективного обогащения. Для этого 10 см3 культуры переносят в 100 см3 магниевой (селенитовой) среды и в 100 см3 тетратионатной среды. Посевы инкубируют в течение 24-48 часов на магниевой (селенитовой) среде при температуре 370С, а на тетратионатной среде - (43±1)°С. Выделение и идентификация культур на агаризованных дифференциально-диагностических средах. Культуры через 24-48 часов пересевают со сред обогащения на дифференциально-диагностические питательные среды (висмут-сульфит агар, среду Плоскирева, среду Эндо (или Левина)), инкубируют при 370С в течение 24-48 часов. После 24 часов инкубирования проводят предварительный учет результатов, а после 48 часов - окончательный. Отмечают рост колоний характерных для бактерий рода Salmonellа на дифференциально-диагностических средах. Характеристика колоний описана выше. При наличии характерных колоний проводят их дальнейшее изучение. Проводят высев со сред обогащения через 48 часов инкубирования на дифференциально-диагностические среды. Проводят окончательный учет результатов. При отсутствии в посевах характерных для бактерий рода Salmonellа колоний дают заключение об отсутствии бактерий рода Salmonellа в анализируемой навеске продукта. При наличии характерных колоний проводят их дальнейшее изучение как описано выше. Для уменьшения риска получения ложно отрицательных результатов существуют многочисленные методы выделения сальмонелл. Одним из таких методов является метод в соответствии с ISO-6579 стандартом. При выделении сальмонелл из пищевых продуктов и испражнений проводится предварительное обогащение на неселективной питательной среде больших порций образца и селективное обогащение с использованием двух селективных сред. Объем образца определяет чувствительность исследования, чем больше объем исследуемого образца, тем выше чувствительность исследования. Важно, что соотношение между объемом образца и бульоном предобогащения должно составлять 1:9. Первый день. Неселективное предобогащение. К 25 г пищевого продукта или испражнений добавить 225 мл забуференной пептонной воды (соотношение объема образца и воды 1:9), перемешать, инкубировать при 370С 16-20 часов. Второй день. Селективное обогащение. Поместить 1 мл предобогащенной смеси в 10 мл тетратионатного бульона (Мюллер-Кауфмана), инкубировать при 370С 18-24 часа, 0,1 мл предобогащенной смеси поместить в 10 мл Рапопорт-Вассилиадис соево- пептонного бульона, инкубировать при 41,50С 18-24 часа. Третий день. Посев образцов на элективные питательные среды. Образцы из тетратионатного бульона и Рапопорт-Вассилиадис соево- пептонного бульона высеять петлей на XLD-агар и агар с бриллиантовым зеленым (BGA-агар), инкубировать при 370С 18-24 часа. Четвертый день. Регистрация результатов посева на XLD-агаре и BGA-агаре. На XLD-агаре колонии типичные для рода сальмонелла имеют красную периферическую зону с черной центральной частью. Иногда периферическая часть колоний может быть розового цвета. На BGA-агаре цвет колоний варьирует от розово-серого до красного. Отсев подозрительных колоний на простой питательный агар для дальнейшей биохимической идентификации и серотипирования. Пятый день. Биохимическое подтверждение и серотипирование сальмонелл. Колонии выделенной чистой культуры, выращенной на питательном агаре инокулировать на: TSI-агар, агар с мочевиной, L – лизин-декарбоксилазный тест, тест на β – галактозидазу, реакцию Фогес-Проскауэр, тест на индол. Инкубировать при 370С 18-24 часа. Серотипирование сальмонелл выполяется путем идентификации О-антигена и Н-антигенов как описано выше. Шестой день. Регистрация результатов биохимической идентификации. Биохимические свойства бактерий рода сальмонелла согласно приложению 6 к настоящей Инструкции. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям