Н а правах рукописи
Скоробогатых Юрий Иванович
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ СОЧЕТАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ ЦИПРОФЛОКСАЦИНА С ОКСИТОЦИНОМ ДЛЯ МЕСТНОГО ЛЕЧЕНИЯ ГНОЙНЫХ РАН
03.02.03 – «Микробиология»
14.01.17 – «Хирургия»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Оренбург – 2011
Работа выполнена в УРАН Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН и ГОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской федерации.
^
академик РАМН,
доктор медицинских наук, профессор Бухарин Олег Валерьевич
доктор медицинских наук, профессор Курлаев Петр Петрович
^
доктор медицинских наук,
профессор Усвяцов Борис Яковлевич
доктор медицинских наук,
профессор Сафронов Андрей
Александрович
^ ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской федерации.
Защита состоится «26» мая 2011 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д. 208.066.03. при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6, телефон: (3532) 40-35-02, факс (3532) 77-24-59, зал заседаний диссертационного совета, официальный сайт: http://www.orgma.ru/
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОрГМА
Автореферат разослан «___» ______________ 2011 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
д. м. н., профессор Немцева Наталия Вячеславовна
^
Актуальность проблемы
Гнойная инфекция в хирургии занимает особое место среди наиболее важных проблем клинической медицины и с течением времени её актуальность приобретает все большую значимость (Ерюхин И. А., 1992; Русаков В. И., 2000). В настоящее время при лечении гнойных ран используются новые антисептики, химиотерапевтические и иммунотропные лекарственные средства, многокомпонентные мази на гидрофильной и гидрофобной основе, протеолитические ферменты, включаемые в структуру перевязочных, шовных и пластических материалов, методы физического и электрохимического воздействия на рану (Девятов В.А., 2000, Лахно В.М., 2001; Яковлев В.П., 2002). Но, несмотря на это существенного прогресса в терапии хирургической инфекции не достигнуто. Во многих случаях низкая эффективность применения традиционных лекарственных средств обусловлена способностью микроорганизмов, инициирующих гнойно-воспалительный процесс, инактивировать факторы естественной резистентности макроорганизма: лизоцим, интерферон, комплемент и др. (Бухарин О.В., 1992, 1993, 2000), ростом доли антибиотикорезистентных и антибиотикозависимых штаммов микроорганизмов (Курлаев П.П., 2001) и образовнием ими биопленок (Фадеев С.Б., 2006, 2010), частой сменой возбудителя в процессе лечения (Фадеев С.Б., 2005). Кроме того, препараты для местного медикаментозного лечения часто используются без учета фазы раневого процесса.
Местное применение сочетаний антибиотиков с окситоцином позволило значительно улучшить результаты лечения больных с гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей (Курлаев П.П., 2001), с острыми гнойными заболеваниями легких и плевры (Абрамзон О.М., 2002, 2004), с гнойным гайморитом (Райцелис И.В., 2000), при абдоминальном сепсисе в эксперименте (Кретинин С.В., 2008).
Эффективным в настоящее время при лечении гнойных ран считается применение мазей на гидрофильной основе с использованием смеси полиэтиленоксидов разной молекулярной массы (ПЭО-400 и ПЭО-1500 в соотношении 4:1) (Даценко Б.М., 1995), обладающей высоким осмотическим эффектом, необходимым в I фазу раневого процесса. Кроме того, перспективным является использование кремнийорганического глицерогидрогеля (Хонина Т.Г., 2005), обладающего высокой регенерирующей способностью, что важно для II и III фаз гнойных ран.
Однако окситоцин совместно с фторхинолонами, имеющими циклопропильный радикал, в составе мазей на основе ПЭО и КОГ, ранее не применялся, неизвестно их сочетанное влияние на рост микроорганизмов и их персистентный потенциал.
В связи с вышеперечисленным, создание мазей, включающих в свою структуру, помимо гидрофильной основы, препарат фторхинолонового ряда (ципрофлоксацин) и окситоцин позволило бы расширить арсенал средств, используемых в лечении гнойных ран.
^
Целью исследования явилось экспериментальное обоснование эффективности применения комбинации ципрофлоксацина с окситоцином на основе полиэтиленоксидов и кремнийорганического глицерогидрогеля для местного лечения гнойных ран.
Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:
Определить видовой состав, персистентные свойства и образование биопленок клинических штаммов бактерий, возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей.
Изучить антимикробный эффект комбинации «ципрофлоксацин+окситоцин» и их влияние на антилизоцимную активность и биопленко-образование облигатно-анаэробных и факультативно-анаэробных бактерий, в сравнении с монопрепаратами.
Исследовать антимикробное действие гидрофильных основ (полиэтиленоксиды и кремнийорганический глицерогидрогель) совместно с комплексом «ципрофлоксацин+окситоцин», а также влияние комбинации данных препаратов на антилизоцимную активность и биопленкообразование микроорганизмов.
4. В эксперименте на животных при лечении гнойных ран оценить эффективность местного применения комбинации «ципрофлоксацин+окси-тоцин» с ПЭО основой (ципроксиновая мазь І) и комбинации «ципрофлоксацин+окситоцин» с КОГ основой (ципроксиновая мазь ІІ).
^
Проведенные исследования in vitro выявили высокую антимикробную активность совместного применения окситоцина и ципрофлоксацина, что выразилось в значительном снижении МПК ципрофлоксацина при его сочетании с окситоцином в отношении представителей различной гноеродной микрофлоры. При сочетании ципрофлоксацина с окситоцином не только повышалась чувствительность к ципрофлоксацину у чувствительных штаммов микроорганизмов, но и появлению чувствительности у резистентных культур бактерий, что, вероятно, может рассматриваться как один из подходов решения проблемы воздействия на антибиотикорезистентную госпитальную микрофлору.
Установлено выраженное снижение АЛА и БПО клинических изолятов микроорганизмов при их культивировании в питательной среде, включающей комбинацию ципрофлоксацина с окситоцином.
Комбинация «ципрофлоксацин+окситоцин» с гидрофильными основами (ПЭО и КОГ) обладала высокой антимикробной активностью и угнетала антилизоцимную активность и биопленкообразование патогенов. Снижение средних значений АЛА и БПО микроорганизмов при действии комбинации препаратов «ципрофлоксацин+окситоцин» и их сочетания с гидрофильной основой сопровождалось перераспределением клонов бактерий в сторону увеличения численности диссоциантов с низкими значениями признака и без признака.
На основе экспериментальных данных создана мазь для лечения гнойных ран в первой фазе раневого процесса (мазь ципроксиновая І), включающая ципрофлоксацин с окситоцином на основе полиэтиленоксидов (патент РФ на изобретение № 2306947, 27.09.2007). Использование комбинации «ципрофлоксацин+окситоцин» на другой основе – кремнийорганический глицерогидрогель, позволило создать мазь (мазь ципроксиновая ІІ), пригодную для лечения II и III фаз гнойных ран (положительное решение формальной экспертизы по заявке на изобретение, регистрационный № 2011107059 от 24.02.2011).
Местное применение мази ципроксиновой І и ІІ в эксперименте обеспечивало более раннюю элиминацию микрофлоры из очага воспаления, прекращение выделения гнойного экссудата и стимуляцию репаративных процессов в ране, что в конечном итоге приводило к более быстрому выздоровлению животных.
^
Высокая экспрессивность и пенетрантность антилизоцимной активности и биопленкообразования стафилококков, как основных возбудителей ГВЗМТ, в сочетании с определением их антибиотикочувствительности, позволяет считать данные критерии в качестве информативных параметров при исследовании и создании препаратов, пригодных для борьбы с персистирующей инфекцией.
Практическое значение исследования заключается в разработке новой лекарственной формы - ципроксиновых мазей І и ІІ, действенность которых доказана в экспериментах in vitro и in vivo при лечении гнойных ран животных: ципроксиновая мазь І показала свою эффективность в I фазу, а ципроксиновая мазь ІІ – во II и III фазы раневого процесса.
Проведённые исследования служат основанием для представления материалов в отдел регистрации лекарственных средств, при «Федеральной службе по надзору в сфере Здравоохранения и социального развития» для получения разрешения на клиническую апробацию комбинированного препарата – ципрофлоксацина с окситоцином на основе полиэтиленоксидов и кремнийорганического глицерогидрогеля для лечения гнойных ран.
^
1. Широкая распространенность и высокая экспрессивность антилизоцимной и биопленкообразующей активности стафилококков позволяет рекомендовать данные критерии для оценки эффективности препаратов при лечении гнойных ран.
2. Применение комбинации «ципрофлоксацин+окситоцин» в сочетании с ПЭО и КОГ показало высокую эффективность за счет увеличения антимикробного эффекта и снижения антилизоцимной и биопленкообразующей способностей патогенов in vitro и in vivo.
^
Основные результаты исследований представлены и обсуждены на научной конференции ОрГМА «Актуальные вопросы экстренной и восстановительной хирургии» (Оренбург, 2005), научной конференции ОрГМА «Молодые ученые - здравоохранению» (Оренбург, 2006), научно-практической конференции ЮУЖД и ЧелГМА «Актуальные вопросы хирургии» (Челябинск, 2006), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 90-летию образования первой в России кафедры травматологии (Санкт-Петербург, 2008).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, получен патент РФ на изобретение и изданы методические рекомендации.
^
Диссертация изложена на 166 страницах и состоит из введения, 7 глав, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Последний включает 266 источника, в том числе 216 работ отечественных и 50 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 19 рисунками и 6 таблицами.
^
Материалы и методы исследования
Проведены бактериологические посевы содержимого гнойных полостей (раневого отделяемого) полученного от 168 больных в возрасте от 18 до 84 лет, находившихся на лечении в Отделенческой клинической больнице на ст. Оренбург в период с 2000 по 2006 гг.
Бактериологическое исследование проводили путем посева гнойного отделяемого на селективные среды с определением уровня бактериальной обсемененности методом секторальных посевов (Биргер О.М., 1982). Для выделения облигатно-анаэробных бактерий анаэробные условия создавали с помощью газогенераторных пакетов “GasPak Anaerobic System” (BBL, США) в анаэробной камере “GasPak 150” (BBL, США). Биохимический профиль факультативно-анаэробных микроорганизмов оценивали с помощью коммерческих тест-систем: "ENTEROtest 24", "STREPTOtest 16", "STAPHYtest 16", "NEFERMtest" (LACHEMA, Чехия) и "API20CAUX" (bioMerieux, Франция).
Антилизоцимную (АЛА), антикомплементарную (АКА), антикарно-зиновую (АКрА) и «антиинтерфероновую» (АИА) активности исследовали по методикам О.В. Бухарина с соавт. (1999). Образование биоплёнок оценивали по способности штаммов бактерий к адгезии на поверхности 96-луночных полистероловых стерильных планшет (O`Toole G., 2000). Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам проводили методом серийных микроразведений в соответствии с международным стандартом NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1997).
In vitro исследовано влияние ципрофлоксацина, ципрофлоксацина с окситоцином и их сочетаний с ПЭО и КОГ на клинические штаммы бактерий: Staphylococcus aureus (12 штаммов), Staphylococcus epidermidis (12 штаммов), Streptococcus haemolyticus (12 штаммов), Escherichia coli (6 штаммов), Klebsiella pneumonia (6 штаммов), Proteus vulgaris (12 штаммов), Pseudomonas aeruginosae (12 штаммов), Bacteroides fragilis (6 штаммов), Peptostreptococcus anaerobius (6 штаммов).
При определении антимикробного эффекта ципрофлоксацина при его сочетании с окситоцином и гидрофильными основами, а также их влияния на персистентные свойства бактерий, проводилось сокультивирование микроорганизмов исследуемых групп с суббактериостатическим концентрациями антимикробного препарата. ПЭО и КОГ смешивали с питательным бульоном в соотношении 1:9 (Кириллов Д.А., 2004).
Для характеристики гетерогенности популяций использовали индекс диссоциации, который рассчитывали как долю (%) колоний определенного фенотипа к общему числу колоний.
В исследованиях использовали ципрофлоксацин («Dr. Reddy,s», Индия), окситоцин («Гедеон Рихтер», Венгрия), окситоцин-плацебо («Гедеон Рихтер», Венгрия), полиэтиленоксид (ПЭО) 1500 и ПЭО 400 (ОАО «СИБУР-НЕФТЕХИМ», Дзержинск), кремнийорганческий глицерогидрогель (ИОС им. И. Я. Постовского УрО РАН, Екатеринбург).
Названия полученных многокомпонетных мазей составлены в соответствии с методическими рекомендациями «Рациональный выбор названий лекарственных средств» (Стародубцев В.И., 2005).
В экспериментах in vivo использовали 87 взрослых белых крыс линии Vistar весом 150-200 гр., гнойные раны моделировались по методу Е. М. Данилиной (1983). Раны экспериментальных животных инфицировали штаммом S.aureus № 104 в количестве 109 КОЕ/мл. На 4 сутки формировались гнойные раны. На 5 сутки начинали местное лечение.
Для сравнения эффективности лечения экспериментальных животных в I фазу раневого процесса разделили их на 4 группы (эксперимент №1): в 1-й группе (12 крыс) местно применяли комбинацию ципрофлоксацина с окситоцином на основе ПЭО (ципроксиновая мазь І). Перевязки с изучаемой лекарственной формой проводили ежедневно до очищения раны и появления краевой эпителизации с последующим местным применением гидрофобной мази «Метилдиоксилин»; во 2-й сравниваемой группе (12 крыс) местно использовали по такой же методике ципрофлоксацин на гидрофильной основе без окситоцина, в 3 сравниваемой группе (12 крыс) применяли только окситоцин на гидрофильной основе; в контрольной 4 группе (12 крыс) раны заживали естественным путем без применения лекарственных средств. В эксперименте №2 лечение животных было проведено на всех 3-х фазах раневого процесса. В 1-й группе (6 крыс) местно применяли ципроксиновую мазь І. Перевязки проводили по выше описанной методике, с последующим местным применением гидрофобной мази «Метилдиоксилин», в контрольной 2 группе (6 крыс) применяли мазь «Левомеколь» в первую фазу и во второй фазе мазь «Метилдиоксилин» и в сравниваемой 3 группе (6 крыс) в первую фазу раневого процесса использовали ципроксиновую мазь І и во второй фазе ципроксиновую мазь ІІ. Оценка летальности в каждой из исследуемых групп животных была проведена на 21 крысе. Из ран производились отпечатки до лечения, на третьи и пятые сутки. Отпечатки фиксировали на предметных стеклах смесью этанола и метанола (в соотношении 1:1) для последующего микроскопического исследования. Процесс биопленкообразования изучали по нативным препаратам после их окраски кристаллвиолетом с использованием иммерсионной световой микроскопии при увеличении объективов Х40 и Х100 («Carl Zeiss»). Эффективность лечения оценивали по времени очищения и появления краевой эпителизации раны, срокам нормализации показателей периферической крови, высеваемости микрофлоры на 3 и 5 день лечения.
Для гистологических характеристик регенераторного процесса у крыс 1-й, 2-й и 3-й групп (эксперимент№2) брали кусочки тканей через все слои раны до начала лечения, на 5 и 7 сутки. Гистосрезы толщиной 6-8 мкм изготавливались на ротационном микротоме, после депарафинирования окрашивались гематоксиленом Майера и эозином, пикрофуксином по Ван Гизон, метиленовым зеленым по Браше, перйодатом К и реактивом Шиффа по Мак Манусу с постановкой энзиматических контролей (Э. Пирс, 1962) Цитологическая оценка раневого процесса проводилась после окраски препаратов азур-эозином под световым микроскопом путем подсчёта клеточных элементов и определения типа цитограмм по общепринятой методике (Покровская М.П., Макаров М.С., 1942; Кузин М.И., Костюченок Б.М., 1991).
Данные были подвергнуты статистической обработке в компьютерной оболочке Windows с помощью процессора электронных таблиц Microsoft Office Excel 2003 и программы «Биостат» путем подсчета средней арифметической (M) и средней ошибки средней величины (m), вероятность значений разницы (p), коэффициента ранговой корреляции Спирмена для оценки силы и направленности корреляционной связи между двумя изучаемыми явлениями (Гланц С., 1999). Полученные результаты по влиянию ципрофлоксацина, окситоцина, ПЭО, кремнийорганического глицерогидрогеля и их сочетаний на чувствительность к антибиотикам и персистентные свойства бактерий оценивали непараметрическим методом с применением критерия Манна-Уитни. Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при значении р<0,05.
^
Проведенный анализ видового состава микрофлоры, изолированной из ран пациентов с ГВЗМТ, показал, что этиологический фактор при данной патологии представлен широким спектром микроорганизмов. Преобладающее большинство изолированных микроорганизмов составили факультативно-анаэробные бактерии, которые были обнаружены у всех обследуемых пациентов, тогда как представители облигатно-анаэробных неспорообразующих бактерий выявлены только в 11,8 % случаев. Факультативно-анаэробные бактерии по видовому составу были ранжированы следующим образом: S. aureus (79 %) > Streptococcus spp. (7 %) > E. coli, Proteus spp. (5 %) > Pseudomonas spp. (3 %) > C. albicans (1 %). Видовой состав облигатно-анаэробных микроорганизмов был представлен в 74,1 % B. fragilis и в 25,9 % анаэробными кокками. Полученные данные согласуются с результатами исследований других авторов (Блатун Л.А., 2007; Lina G. et al., 1996; Church D. et al., 2006), отметивших, что наряду с факультативно-анаэробными бактериями в видовом спектре при раневой инфекции, встречаются такие облигатно-анаэробные микроорганизмы, такие как B. fragilis и P. anaerobius.
На следующем этапе были изучены распространённость и выраженность факторов персистенции, от которых зависит продолжительность течения и наличие осложнений ряда заболеваний (Бухарин О.В. и соавт., 1993; Бухарин О.В., 1994, 2000; Чернова О.Л. и соавт., 1997; Дерябин Д.Г., Шагинян И.А., 2000).
Распространенность персистентных признаков различалась у представителей грампозитивных кокков, грамнегативных бактерий и дрожжевых грибов. Так, для грампозитивных кокков распространенность секретируемых факторов персистенции убывала в ряду АЛА (69,5 %) > АКрА (65,7 %) > АКА (55,6 %) > АИА (46,5 %). У представителей грамнегативных бактерий и дрожжевых грибов распространенность персистентных свойств снижалась в ряду: АЛА (100 %) > АКА (85,7 % и 91,5 % соответственно) > АИА (68,9 % и 91,3 % соответственно) > АКрА (42 % и 46,5 % соответственно).
Установлено, что представители грамнегативной факультативно- и облигатно-анаэробной микрофлоры обладали более высокими значениями экспрессии антилизоцимной (в среднем 1,61±0,2 мкг/мл*ОП) и антикомплементарной (в среднем 2,0±0,3 анти-СН50) активностей в сравнении с грампозитивными кокками (в среднем 1,1±0,02 мкг/мл*ОП и 1,2±0,2 анти-СН50 соответственно).
В настоящее время известно, что БПО является универсальным способом выживания патогенов в неблагоприятных условиях существования, а также широко распространено у возбудителей хирургической инфекции мягких тканей (Фадеев С.Б., 2010). Проведённые исследования показали, от 92,8 до 100 % патогенов были способны к формированию биоплёнок. Среди исследуемых штаммов бактерий наиболее высокими значениями БПО обладали культуры грамотрицательных факультативно- и облигатно-анаэробных бактерий: E. coli (6,1±0,4 ед), Р. vulgaris (7,3±0,4 ед), Р. aeruginosa (7,7±0,4 ед и B. fragilis (4,9±0,3 ед).
Полученные результаты согласуются с известными литературными данными о роли микробных биопленок и способности патогенов инактивировать лизоцим в развитии целого ряда инфекций человека, включая хирургическую патологию (Бухарин О.В., 2005; Фадеев С.Б., 2010; Davis S., 2008).
Таким образом, проведенные исследования позволяют заключить, что наиболее распространенными признаками персистенции среди возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей являлись АЛА и БПО патогенов, которые были обнаружены в среднем у 86,4% и 97,9 % штаммов соответственно.
Микробные биопленки обладают высокой резистентностью к воздействию различных антимикробных агентов, что затрудняет лечение инфекций у пациентов с различной патологией и приводит к высокой частоте летальных исходов заболеваний (Ильина Т.С., 2004; Costerton J.W., 1999; Donlan R. M., 2002). В связи с этим, на следующем этапе была изучена антибиотикочувствительность биопленкообразующих патогенов и проведён корреляционный анализ антибиотикорезистентности и персистентных свойств микроорганизмов. Было установлено, что наиболее эффективными препаратами в борьбе с возбудителями гнойных заболеваний мягких тканей являются антибиотики группы цефалоспоринов III поколения (цефабол), подавляющие 77,9 % исследуемых штаммов бактерий, за исключением изолятов B. fragilis, которые были наиболее чувствительны к фторхинолонам II поколения (ципрофлоксацин). Кроме того, высокая частота (более 70%) обнаружения антибиотикочувствительности к ципрофлоксацину выявлена у стафилококков, стрептококков и энтеробактерий. Резистентность к данному препарату выявлена у 15,4% клинических изолятов S. aureus, у 30,3% КОС, у 28,8% стрептококков, у 24% энтеробактерий, у 28,6% анаэробных кокков и у 95% бактероидов. Также обращает на себя внимание высокая распространенность антибиотикорезистентности микроорганизмов, изолированных из раневого отделяемого пациентов с ГВЗМТ в отношении антибиотиков пенициллинового ряда: чувствительность к данному препарату была обнаружена всего у 2,2% S. aureus и 2,9% КОС.
Выявлена прямая корреляционная связь антибиотикорезистентности стафилококков с уровнем экспрессии антилизоцимного признака (rxy = 0,85; p<0,01), биопленкообразования (rxy = 0,76; p<0,01) и антикомплементарной активности (rxy = 0,61; p<0,05) данных видов бактерий. Корреляционная связь антибиотикорезистентности стафилококков с их экспрессией антикарнозиновой и «антиинтерфероновой» активностями была слабой (rxy = 0,44 и rxy = 0,26 соответственно).
Анализ полученных данных позволил выбрать критерии эффективности влияния препаратов для последующего лечения ГВЗМТ, которыми являлись:
использование в качестве модельных штаммов бактерий вида S. aureus;
оценка изменений АЛА и БПО бактерий под влиянием препаратов.
Учитывая, что при лечении инфекции в последнее время используют окситоцин, потенцирующий противомикробное действие ряда антибактериальных препаратов в отношении различной гноеродной микрофлоры (Курлаев П.П., 1986) и подавляющий её персистентный потенциал (Курлаев П.П., 2001; Абрамзон О.М., 2004; Кретинин С.В., 2008), мы провели экспериментальное изучение антимикробного эффекта комбинации ципрофлоксацина с окситоцином на клинических штаммах бактерий видов S. aureus, S. epidermidis, E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosae, B. fragilis и P. anaerobius, изолированных из ран пациентов при ГВЗМТ.
Установлено, что грамнегативные и грампозитивные как факультативно-анаэробные, так и облигатно-анаэробные бактерии проявляли большую чувствительность к комбинации «ципрофлоксацин+окситоцин» по сравнению с чувствительностью к монопрепаратам. Внесение в среду культивирования окситоцина совместно с ципрофлоксацином приводило к снижению МПК антимикробного препарата в отношении, как антибиотикочувствительных (S), так и антибиотикорезистентных (R) культур микроорганизмов. Среди S-штаммов бактерий МПК ципрофлоксацина под действием окситоцина снижалась в среднем в 16 раз от исходных значений (0,5 мкг/мл против 8 мкг/мл) (p<0,05). Отмечено исчезновение резистентности к ципрофлоксацину у всех исследуемых R-штаммов микроорганизмов, средние значения МПК которых снизились с 16 мкг/мл до 2 мкг/мл (в 8 раз) (p<0,05), что соответствовало переходу МПК ципрофлоксацина из зоны резистентности в зону чувствительности.
Кроме этого, сочетание ципрофлоксацина с окситоцином более эффективно, чем ципрофлоксацин и окситоцин в отдельности, ингибировало антилизоцимную активность и способность к образованию биопленок патогенов. Соинкубирование исследуемых культур микроорганизмов с комбинацией «ципрофлоксацин+окситоцин» приводило к снижению АЛА в среднем у 88,5±7,2% бактерий на 58,6±6,1% от исходного уровня признака (р<0,05) (рис. 1) и БПО в среднем у 73,3±7,2 % микробных культур на 44,7±5,1 % по сравнению с контролем (р<0,05) (рис.2).
Использование популяционного подхода для изучения влияния препаратов на их персистентные свойства, позволило определить, что одним из механизмов снижения значений антилизоцимной активности и биопленкообразования бактерий под действием комбинации «цирофлоксацин+окситоцин» является перестройка структуры популяции бактерий по АЛА и БПО в сторону снижения доли диссоциантов с высоким уровнем признаков и появлением клонов, не обладающих АЛА и БПО.
Проведенные исследования in vitro позволяют рекомендовать комбинацию «ципрофлоксацин+окситоцин» в качестве эффективного средства в борьбе с антибиотикорезистентными персистирующими патогена-
Р
*
ис. 1 - Частота снижения антилизоцимной активности патогенов под влиянием окситоцина, окситоцина-плацебо, ципрофлоксацина, и комбинации ципрофлоксацина с окситоцином
Примечание: * - р <0,05 (по сравнению с ципрофлоксацином)
Рис. 2 - Частота снижения способности патогенов к образованию биопленок под влиянием окситоцина, окситоцина-плацебо, ципрофлоксацина, и комбинации ципрофлоксацина с окситоцином
Примечание: * - р <0,05 (по сравнению с ципрофлоксацином)
ми, возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей.
Несмотря на успехи клинической медицины и фармакологической науки, проблема лечения гнойных ран не перестает быть актуальной, поскольку вопросы эффективного лечения с учетом фазы раневого процесса решаются не всегда успешно, а применение антимикробных препаратов в отношении антибиотикорезистентной персистирующей микрофлоры не эффективно, что приводит к развитию микробных биопленок, устойчивых к терапевтическим воздействиям и рецидивированию воспалительного процесса в ране с развитием гнойно-септических осложнений.
В связи с этим в дальнейших исследованиях мы изучили антимикробную активность ципрофлоксацина с окситоцином и гидрофильными основами, а также совместное влияние этих препаратов на АЛА и БПО бактерий.
Известно, что раневой процесс представляет собой сложный комплекс реакций, который можно подразделить на три различающиеся между собой и последовательно протекающие фазы: воспаления (I фаза), регенерации (II фаза) и эпителизации раневой поверхности и реорганизация рубца (III фаза) (Кузин М.И., 1991).
В настоящее время в I фазу раневого процесса применяются мази на гидрофильной основе с использованием смеси полиэтиленоксидов с разной молекулярной массой (ПЭО-400 и ПЭО-1500 в соотношении 4:1) (Даценко Б.М., 1995), а также кремнийорганический глицерогидрогель, обладающий высокой регенерирующей способностью (Патент РФ 2255939 МКИ C07F 7/04 2005 г. Рег. № 1075114) (патентообладатель - Институт органического синтеза им. И. Я. Постовского Уральского отделения РАН, г. Екатеринбург), что предполагает его использование во II и III фазы раневого процесса.
Установлено, что при сочетании комбинации «ципрофлоксацин + окситоцин» с ПЭО и КОГ, зона подавления роста исследуемой микрофлоры увеличивалась в среднем на 27,3±2,5% и 29,5±2,5% соответственно в сравнении с комбинацией «ципрофлоксацин+окситоцин» без гидрофильных основ (p<0,05).
Проведенные исследования позволили установить, что сочетание «ципрофлоксацин+окситоцин» с ПЭО и КОГ более эффективно, чем в отсутствии гидрофильных основ, ингибировало антилизоцимную активность и способность к образованию биопленок патогенов. Снижение АЛА бактерий чаще происходило под влиянием комбинации «ципрофлоксацин+окситоцин+ПЭО» (в 98,4±1,6% случаев) и «ципрофлоксацин+окситоцин+КОГ» (в 96,6±3,4% случаев), чем под действием комбинации «ципрофлоксацин+окситоцин» без гидрофильных основ (в 88,5±7,2% случаев) (рис. 3). Выраженность АЛА в среднем снижалась на 75,77,0 % в сравнении - с контролем (без влияния препаратов) (р<0,05) и на 17,12,0 % в сравнении с комбинацией «ципрофлоксацин+окситоцин» без ПЭО (р<0,05). Аналогичная закономерность была отмечена и при сочетании препаратов с КОГ: выраженность признака снижалась на 76,87,0 % в сравнении с контролем (р<0,05) и на 20,23,1 % в сравнении с комбинацией «ципрофлоксацин+окситоцин» без КОГ (р<0,05).
Схожие результаты были получены при влиянии исследуемых препаратов на БПО бактерий (рис. 4). Частота выявления ингибирующего эффекта препаратов при сочетании «ципрофлоксацин+окситоцин+ПЭО» на БПО бактерий была выше, чем комбинации «ципрофлоксацин+окситоцин» (73,37,0% против 91,78,3%) (р<0,05), а выраженность БПО микроорганизмов в среднем снижалась на 76,87,0 % в сравнении с контролем (р<0,05) и на 18,22,1 % в сравнении с комбинацией «ципрофлоксацин+окситоцин» без ПЭО (р<0,05). Внесение КОГ совместно с комбинацией «ципрофлоксацин+окситоцин» в среду культивирования бактерий способствовало увеличению частоты встречаемости ингибирующего эффекта действия препаратов на БПО бактерий в сравнении с комбинацией препаратов без основ (96,7±3,3% против 73,3±7,2 %) (р<0,05).
Рис. 3 - Частота снижения антилизоцимной активности патогенов под влиянием комбинации «ципрофлоксацин+окситоцин», ПЭО, КОГ и их сочетаний. Примечание:- р <0,05(по сравнению с комбинацией « цип+окс»)
цип – ципрофлоксацин; окс – окситоцин; ПЭО – полиэтиленоксиды; КОГ – кремнийорганический глицерогидрогель
Рис. 4 - Частота снижения способности патогенов к образованию биопленок под влиянием комбинации «ципрофлоксацин+окситоцин», ПЭО, КОГ и их сочетаний. Примечание:- р <0,05(по сравнению с комбинацией « цип+окс»).
цип – ципрофлоксацин; окс – окситоцин; ПЭО – полиэтиленоксиды; КОГ – кремнийорганический глицерогидрогель
Выраженность признака в среднем снижалась на 61,7 5,9 % в сравнении с контролем (р<0,05) и на 17 1,9 % в сравнении с комбинацией «ципрофлоксацин+окситоцин» без КОГ (р<0,05).
Использование популяции микроорганизмов в качестве модели для изучения влияния препаратов на персистентные свойства микроорганизмов, позволило определить, что одним из механизмов снижения значений АЛА и БПО при воздействии на них сочетаний «ципрофлоксацин+окситоцин» с ПЭО и КОГ, является перестройка популяции бактерий по АЛА и БПО в сторону снижения доли диссоциантов с высоким уровнем признаков и увеличением доли клонов с низким уровнем признака и не обладающих АЛА и БПО.
Проведенные исследования in vitro позволяют рекомендовать комбинацию «ципрофлоксацин+окситоцин+ПЭО» и «ципрофлоксацин+окси-тоцин+КОГ» в качестве эффективных средств, в борьбе с персистирующими патогенами, возбудителями гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей.
Экспериментальные исследования in vivo подтвердили более высокую эффективность местного применения сочетания ципрофлоксацина с окситоцином на гидрофильной основе, по сравнению с использованием в лечении гнойных ран ципрофлоксацина или окситоцина в отдельности (табл.1), что выразилось в более ранних сроках очищения ран, появления краевой эпителизации и нормализации показателей периферической крови. В 1 группе животных получавших ципроксиновую мазь I на 3 день лечения посевы из раневого секрета не давали роста микрофлоры в 66,7% случаев, в то время как у животных во 2 группе этот показатель составлял 41,7%, а 3 и 4 группах леченных с применением окситоцина и без лечения рост микрофлоры регистрировался во всех случаях.
Табл. 1 - Сравнительные результаты лечения крыс с гнойными ранами мягких тканей в эксперименте №1.
группы
крыс
показатели
|
группа 1
( n=12)
|
группа 2
(n=12)
|
группа 3
(n=12)
|
группа 4
( n=12)
|
Высеваемость микрофлоры на
3 день лечения (число крыс)
|
4
|
7
|
12
|
12
|
^
|
3,3 0,2 *
|
7,8 0,7
|
10,2 0,8
|
11,2 2,3
|
^
|
2,1 0,5 *
|
4,6 0,5
|
6,2 0,5
|
6,6 0,5
|
^
|
4,2 0,4 *
|
6,9 0,9
|
7,0 0,8
|
7,9 0,8
|
^
|
16,72,4% *
|
50 6,1%
|
100%
|
100%
|
Примечание: группа 1 - ципрофлоксацин + окситоцин + ПЭО; группа 2- ципрофлоксацин + ПЭО; группа 3 – окситоцин + ПЭО; группа 4 – без лечения (контроль)
* - р<0,05 ( в сравнении с другими группами животных)
При световой микроскопии патологического материала полученного из ран на 1-е сутки после лечения выявлены единичные скопления микробных клеток без признаков биопленкообразования у крыс всех исследуемых групп.
При проведении лечебных мероприятий на 3 и 5 сутки отмечалось полное отсутствие микробных биопленок в ране у 83,3 и 91,7 % крыс 1 группы, тогда как во 2 группе данный показатель составил 50 и 66,7% соответственно. Лечение крыс одним окситоцином практически не влияло на образование биопленок бактерий: микроскопическое исследование патологических образцов из ран крыс 3 группы было сходно с контрольной группой животных (не получавших лечение) и выявило наличие сформировавшихся (зрелых) микробных биопленок, занимающих большую часть поля зрения у всех животных. Изучение показателей цитограммы выявило более раннюю смену некротического типа в наиболее благоприятный регенераторный тип при использовании разработанных мазей по сравнению с другими группами. Экспериментальные исследования in vivo подтвердили более высокую эффективность местного применения сочетания ципрофлоксацина с окситоцином на гидрофильной основе, по сравнению с результатами лечения гнойных ран во 2, 3 и 4 группах крыс, что выразилось в более ранних сроках очищения ран, появления краевой эпителизации и нормализации показателей периферической крови.
На следующем этапе произведено сравнение результатов лечения гнойных ран у крыс в эксперименте №2 (табл. 2). Как видно из полученных данных, у крыс, леченных в фазу воспаления путем применения мази «Левомеколь» сроки обнаружения признаков наступления II фазы раневого процесса достоверно были увеличены по сравнению с I и III группами животных. При проведении лечения в фазу регенерации и эпителизации гнойных ран у животных, выявлены признаки вторичного инфицирования раны у 66,7 % крыс во II группе, тогда как повторное развитие инфекции в I и III группах отмечалось лишь в 16,7 % случаев.
Табл. 2 - Сравнительные результаты лечения крыс с гнойными ранами мягких тканей в эксперименте №2.
^
|
Группы крыс
Показатели
|
группа 1
( n=6)
|
группа 2
(n=6)
|
группа 3
(n=6)
|
Высеваемость микрофлоры на 3 день лечения
|
2
|
5
|
2
|
^
3 день лечения (КОЕ/мл)
|
105
|
107
|
105
|
^
|
1,21± 0,1*
|
1,54±0,1
|
1,13±0,1*
|
^
|
8,2±0,9 *
|
10,9±1,1
|
7,9±0,9 *
|
^
|
3,3 ± 0,2 *
|
7,8 ± 0,8
|
3,3 ± 0,2 *
|
Сроки нормализации показателей периферической крови (дни)
|
2,1 ± 0,5 *
|
4,2 ± 0,5
|
2,1 ± 0,5 *
|
^
|
4,2 ± 0,8 *
|
8,9 ± 0,8
|
4,2 ± 0,8 *
|
II и III фазы (регенерации и эпителизации)
|
Присоединения вторичной инфекции (% крыс)
|
16,7% *
|
66,7 %
|
16,7% *
|
^
|
101
|
103
|
101
|
АЛА бактерий 5 день лечения (средние значения АЛА в мкг/мл*ОП)
|
0,61±0,08*
|
2,02±0,2
|
0,57±0,07*
|
^
|
5,4±0,9 *
|
13,8±1,2
|
4,6±0,9 *
|
Макрофаги (абс.) в условных полях зрения
|
14,6±4,1 *
|
6,3±1,5
|
16,6±4,1 *
|
Фибробласты
(малодифферен-
цированные), %
|
2,7±0,1 *
|
1,4±0,2
|
3,9±0,2*
|
^
|
+
|
единич. клетки
|
+
|
Сроки полного заживления раны (дни)
|
17,4 ± 2,5 *
|
21,4 ± 2,5
|
14,2 ± 0,7 *
|
Примечание: *- р<0,01 по сравнению со II группой. Обозначения:
1 группа крыс – Ципроксиновая мазь I + «Метилдиоксилин», 2 группа крыс - «Левомеколь» + «Метилдиоксилин» , 3 группа крыс - Ципроксиновая мазь I + Ципроксиновая мазь II
Численность макрофагов и фибробластов, отражающих регенераторные процессы, происходящие в ране, были достоверны выше у крыс III группы, в сравнении с I и II группой. В результате проведенного лечения гнойных ран у животных III группы полное заживление раны происходило быстрее на 14,2 ± 0,7 сутки от начала лечения), чем у крыс I и II групп животных (соответственно на 17,4 ± 2,5 и 21,4 ± 2,5 сутки от начала лечения). Летальность во всех исследуемых группах животных отсутствовала.
Максимальные вышеописанные изменения отмечены при сочетанном действии ципрофлоксацина с окситоцином и кремнийорганическим глицерогидрогелем. Использование в фазах регенерации и эпителизации новой мази ципрофлоксацина с окситоцином и кремнийорганическим глицерогидрогелем в экспериментах in vivo, способствовало стимуляции регенераторных процессов в ткани, что приводило к более быстрому заживлению раны: на 7 дней раньше, чем при традиционном лечении мазями «Левомеколь» и «Метилдиоксилин» и на 3 дня раньше, чем при лечении с применением комбинации ципрофлоксацина с окситоцином на основе смеси полиэтиленоксидов и «Метилдиоксилин».
При микробиологическом обследовании ран экспериментальных животных установлено, что под влиянием комбинации «ципрофлок-сацин+окситоцин» с ПЭО и КОГ происходит снижение персистентных свойств бактерий, что, в конечном итоге, способствует элиминации микроорганизмов из раны.
Местное использование ципроксиновой мази I и II при лечении гнойных ран достоверно снижает уровень бактериальной обсемененности и обеспечивает эффективное очищение раны путем прямого влияния на инициирующую микрофлору. Можно полагать, что в основе механизма антимикробного действия комбинации окситоцина и ципрофлоксацина на основе ПЭО и КОГ лежит не только снижение МПК химиопрепарата в отношении патогена, но и подавление его антилизоцимной активности и биопленкообразования в ране, увеличивает регенераторные возможности эндотелиоцитов, фибробластов и адвентициальнах клеток, тем самым, способствуя эффективному формированию полноценной грануляционной ткани, что позволяет значительно сократить сроки заживления гнойной раны.
Проведенные исследования свидетельствуют о целесообразности совместного применения ципрофлоксацина с окситоцином и смесью полиэтиленоксидов при лечении гнойных ран в I фазу раневого процесса, а во II и III фазы – комбинацию ципрофлоксацина с окситоцином и кремнийорганическим глицерогидрогелем. Применение в клинической практике предлагаемых лекарственных прописей позволит расширить арсенал препаратов, эффективных в отношении хирургической инфекции мягких тканей.
Таким образом, результаты проведённой работы позволили выделить три основных момента:
- наиболее распространенным возбудителем гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей в хирургической клинике остаются микроорганизмы рода Staphylococcus, обладающие высокой пенетрантностью и экспрессивностью факторов персистенции, включая способность к образованию биопленок;
- применение комбинации «ципрофлоксацин+окситоцин» приводит к ингибированию АЛА и БПО микроорганизмов, а использование различных основ способствует дальнейшему снижению персистентных свойств микроорганизмов
- в условиях in vivo доказана эффективность местного применения ПЭО и кремнийорганического глицерогидрогеля в сочетании с комбинацией «ципрофлоксацин+окситоцин» при лечении гнойных ран.
ВЫВОДЫ
1. При ГВЗМТ преобладающее большинство изолированных микроорганизмов составили факультативно-анаэробные бактерии, которые были обнаружены у всех обследуемых пациентов, тогда как представители облигатно-анаэробных неспорообразующих бактерий выявлены только в 11,8 % случаев. Факультативно-анаэробные бактерии по видовому составу были ранжированы следующим образом: S. aureus (79 %) > Streptococcus spp. (7 %) > E. coli, Proteus spp. (5 %) > Pseudomonas spp. (3 %) > C. albicans (1 %). Видовой состав облигатно-анаэробных микроорганизмов был представлен в 74,1 % B. fragilis и в 25,9 % анаэробными кокками.
2. Высокая частота обнаружения золотистых стафилококков, проявляющих персистентные свойства и способность к биопленкообразованию, позволяет обосновать использование S. aureus в качестве модельного вида бактерий, пригодного для оценки эффективности воздействия лекарственных препаратов при лечении ГВЗМТ.
3. Экспериментально в условиях in vitro выявлено, что окситоцин повышал чувствительность к ципрофлоксацину у всех исследованных антибиотикочувствительных культур бактерий в среднем в 16 раз и способствовал появлению чувствительности к антимикробному препарату у исследуемых антибиотикорезистентных микроорганизмов.
4. Применение окситоцина с ципрофлоксацином потенцировало ингибирующий эффект препаратов в отношении персистентных свойств патогенов: угнетение АЛА выявлено у 88,5±7,2 % исследуемых штаммов, БПО - у 73,3±7,2 % культур.
5. Предложен новый препарат (ципроксиновая мазь І) содержащий комбинацию окситоцина с ципрофлоксацином на основе ПЭО в соотношении: 0,2 г ципрофлоксацина и 5 МЕ окситоцина, для борьбы с гноеродной микрофлорой. Включение основы ПЭО - 19,05 г полиэтиленоксида -1500 и 76,2 г полиэтиленоксида – 400 в комбинацию ципрофлоксацина с окситоцином повышало антибактериальный эффект в отношении всех тестируемых микроорганизмов и ингибировало АЛА у 98,4±1,6 % культур и БПО у 91,7±8,3 % штаммов.
6. Использование ципрофлоксацина с окситоцином на основе кремнийорганического глицерогидрогеля, позволило получить другую многокомпонентную мазь (ципроксиновая мазь ІІ), эффективную во ІІ и ІІІ фазах раневого процесса, обладающую высокой антимикробной и регенерирующей активностью, способностью подавлять АЛА и БПО патогенов.
7. Морфологическое изучение ран экспериментальных животных, леченных в I фазe раневого процесса ципроксиновой мазью І и во II и III фазах ципроксиновой мазью ІІ показало увеличение регенераторных возможностей эндотелиоцитов, фибробластов и адвентициальнах клеток, что способствовало эффективному формированию полноценной грануляционной ткани и позволяло значительно сократить сроки заживления гнойных ран.
8. Доклинические испытания ципроксиновой мази І при местном лечении гнойных ран у крыс выявили её высокую эффективность, что выражалось в более коротких сроках очищения ран (3,3 сут. против 11,2 сут.), ускоренных сроках нормализации показателей периферической крови (2,1 сут. против 6,6 сут.), ранних сроках появления краевой эпитализации (4,2 сут. против 7,9 сут.), а также в снижении частоты обнаружения микробных биопленок в ране на 5 день от начала лечения (8,4% против 100%). Ципроксиновая мазь ІІ приводила к ускорению процессов регенерации тканей, сокращая длительность заживления ран (до 14,2 сут. против 21,4 сут.).
^
1. Скоробогатых Ю.И. Видовой состав возбудителей хирургической инфекции мягких тканей и их характеристика / Ю.И. Скоробогатых, П.П. Курлаев, Д.А. Кириллов // Актуальные вопросы экстренной и восстановительной хирургии.- Оренбург, 2005.- С. 89 – 90.
2. Скоробогатых Ю.И. Экспериментальное обоснование сочетанного применения ципрофлоксацина с окситоцином для местного лечения гнойных ран/ Ю.И. Скоробогатых, П.П. Курлаев, Ю.П. Овчинникова // Актуальные вопросы военной и практической медицины.- Оренбург, 2005, С. 436-438. 3. Скоробогатых Ю.И. Биологические свойства и видовой состав возбудителей гнойных заболеваний мягких тканей/ Ю.И. Скоробогатых, П.П. Курлаев, // Актуальные вопросы военной и практической медицины.- Оренбург, 2006, С. 70-71.
4. Скоробогатых Ю.И. Экспериментальное обоснование сочетанного применения ципрофлоксацина с окситоцином на гидрофильной основе для местного лечения гнойных ран/ Ю.И. Скоробогатых // Журнал «Вестник ОГУ» - Оренбург, 2006,-№13,- С. 281-283.
5. ^ Экспериментальное обоснование применения окситоциновой мази для местного лечения гнойных ран / Ю.И. Скоробогатых, П.П. Курлаев // Актуальные вопросы хирургии. – Челябинск, 2006г., С. 209 – 211
6. Бухарин О.В. Экспериментальное обоснование эффективности сочетанного применения ципрофлоксацина с окситоцином/ О.В. Бухарин, Ю.И. Скоробогатых, П.П. Курлаев // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2007,-№5,- С 70-73.
7. ^ Экспериментальное обоснование применения комбинации ципрофлоксацина с окситоцином для лечения гнойных ран/ Ю.И. Скоробогатых, П.П. Курлаев, О.В. Бухарин // Журнал травматология и ортопедия России. Приложение. - Санкт-Петербург, 2008г № 3, - С 54-55.
8. ^ Применение сочетания ципрофлоксацина с окситоцином на гидрофильной основе при лечении гнойных ран в эксперименте / Ю.И. Скоробогатых, П.П. Курлаев, О.В. Бухарин // Актуальные вопросы хирургии. – Челябинск, 2008г., С. 139 – 144.
9.^ . Сочетанное влияние ципрофлоксацина с окситоцином на биологические свойства возбудителей гнойных заболеваний мягких тканей / Ю.И. Скоробогатых, П.П. Курлаев // Актуальные вопросы хирургии: проблемы и пути решения (выпуск второй). - Оренбург, 2009. - c 127- 130.
10. Скоробогатых Ю.И. Экспериментальное изучение комбинации ципрофлоксацина с окситоцином на образование биоплёнок условно патогенными бактериями / Ю.И. Скоробогатых, Н.Б. Перунова, П.П. Курлаев, О.В. Бухарин // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2010,-№6,- С 3-7.
11. Курлаев П.П. Влияние ципрофлоксацина, окситоцина и их сочетания на образование биоплёнок условно - патогенными микроорганизмами / П.П. Курлаев, Ю.И. Скоробогатых, Н.Б. Перунова // Актуальные вопросы хирургии. – Челябинск, 2010 г., С. 139 – 142.
Изобретения по теме диссертации
1. Патент РФ на изобретение № 2306947. Способ лечения гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей микробной этиологии / Ю.И. Скоробогатых,О.В. Бухарин, П.П. Курлаев, Д.А. Кириллов, В.А. Кириллов// Заявлено 09.06.05; опубл. 27.09.2007. Бюл. № 27.
2. Способ лечения гнойных ран в эксперименте/ Ю.И. Скоробогатых,О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова// (получено положительное решение формальной экспертизы по заявке на изобретение регистрационный № 2011107059 от 24.02.2011).
Методические рекомендации
Лечение гнойно-воспалительных заболеваний: Методические рекомендации для врачей / Курлаев П.П., Бухарин О.В., Скоробогатых Ю.И и др.- ЮУЖД МПС: Челябинск, 2001.-15с.
Список сокращений:
АИА – «антиинтерфероновая» активность
АКА – антикомплементарная активность
^
ГВЗМТ – гнойно-воспалительные заболевания мягких тканей
КОГ – кремнийорганический глицерогидрогель
КОЕ – колониеобразующие единицы
МПК – минимальная подавляющая концентрация
ПЭО – полиэтиленоксиды
БПО – биопленкобразование
ПМО - показатель микробной обсемененности
СКОРОБОГАТЫХ ЮРИЙ ИВАНОВИЧ
Экспериментальное обоснование сочетанного применения
ципрофлоксацина с окситоцином для местного
лечения гнойных ран
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
__________________________________________________________________
Оригинал макет подготовлен в программе Word for Windows 2003
Подписано в печать 07/04/2011
Формат 60*84/16. Усл.-печ. л. 1,0. Печать оперативная.
Бумага офсетная. Гарнитура Times.
Тираж 100 экз.
|
