Ассоциация рака гортани с онкогенными вирусами папилломы человека и эпштейна-барр 14. 00. 16 патологическая физиология
|
|
Скачать 316.56 Kb.
|
|
На правах рукописи ШИЛОВА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА АССОЦИАЦИЯ РАКА ГОРТАНИ С ОНКОГЕННЫМИ ВИРУСАМИ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА И ЭПШТЕЙНА-БАРР 14.00.16 – патологическая физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук НОВОСИБИРСК – 2008 Р абота выполнена в ГУ научно-исследовательском институте онкологии Томского научного центра СО РАМН Научный руководитель: доктор биологических наук Уразова Людмила Николаевна ^ чл.-корр. РАМН, профессор, д.м.н. Чойнзонов Евгений Лхамацыренович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Сидоров Сергей Васильевич доктор биологических наук Макарова Ольга Петровна ^ ГУ научно-исследовательский институт онкологии им. профессора Н. Н. Петрова МЗ РФ (Санкт-Петербург). Защита состоится «____» __________________ 2008 г. в ______ часов на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 в ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН по адресу: ул. Академика Тимакова, д. 2, г. Новосибирск, 630117. Тел/факс 8 (383) 333-64-56 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НЦКЭМ СО РАМН. Автореферат разослан «_______» 2008 г. Ученый секретарь  диссертационного совета д.б.н. Пальчикова Н.А.^ Актуальность проблемы. Рак гортани (РГ) занимает лидирующие позиции среди злокачественных опухолей верхних дыхательных путей, составляя 65-70%, а в структуре общей онкологической заболеваемости – 1,4%, среди которых 2,8% приходится на мужчин и 0,2% - на женщин. Так, в 2006 году в России было выявлено 6655 новых случаев заболевания раком гортани (Чиссов В.И. и др., 2008). По данным госпитальных регистров 60-70% больных обращаются в специализированные учреждения с уже распространенным опухолевым процессом (Пачес А.И., 2000; Хабибулаев Ш.З. и др., 2005; Чойнзонов Е.Л. и др., 2006). К числу факторов, которые приводят к поздней диагностике, относится и бессимптомное течение, которое наблюдается у 35% больных. Все вышеперечисленное свидетельствует о необходимости поиска новых методов ранней диагностики и скрининга лиц с предопухолевыми заболеваниями гортани, которые составляют группу риска. Многочисленные эпидемиологические исследования, проводимые в различных странах мира, показали, что основными этиологическими факторами развития РГ являются курение, алкоголь, воздействие на слизистую оболочку верхнего респираторного тракта канцерогенов, состояние хронического стресса, а также хронические процессы различного генеза, такие как хронический гиперпластический ларингит (ХГЛ) и папилломатоз гортани (ПГ). Согласно классификации ВОЗ (2003) ХГЛ и ПГ отнесены к облигатному предраку. Так, частота встречаемости ХГЛ в популяции варьирует в пределах 30-65%, а вероятность малигнизации данного заболевания составляет от 3% до 35%, достигая в отдельных случаях 60% в сроки от 6 мес. до 7 лет (Чумаков Ф.И. и др., 2002; Осипов В.Д., 2006). Однако, в последнее время, все большее число исследователей приоритетное значение в вопросе канцерогенеза гортани придают вирусной составляющей. Это обусловлено частым выявлением генетической информации онкогенных вирусов папилломы человека (ВПЧ) в слизистой оболочке гортани, как при доброкачественных, так и при злокачественных процессах, а также детекцией повышенного уровня антител к антигенам литической инфекции вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) у больных с данной патологией. Так, частота выявления ВПЧ в доброкачественных и предопухолевых новообразованиях области головы и шеи варьирует от 18,5% до 35,9% (McKaig R. et al., 1998). На долю же ВПЧ-ассоциированного папилломатоза гортани, по оценкам ряда авторов, приходится 40-100%, с последующей малигнизацией в 8-20% случаев в сроки до 10 лет (Пачес А.И., 2000, 2004; Szydlowski J. et al., 1999). Поскольку в литературе, практически, не встречается работ по комплексной оценке частоты синтеза антигенов литической и латентной инфекции вируса Эпштейна-Барр и выявления вирусов папилломы у больных раком и предопухолевыми заболеваниями гортани, в сопоставлении с клинико-морфологическими особенностями опухолевого процесса, представляется актуальным осветить данную проблему в рамках представленной работы. ^ Изучить ассоциацию вирусов папилломы человека и Эпштейна-Барр с клинико-морфологическими показателями у больных раком и предраковой патологией гортани, определить диагностическую и прогностическую значимость изученных показателей. ^
^ Проведено комплексное исследование частоты ассоциации онкогенных вирусов со злокачественными и предопухолевыми заболеваниями гортани. Показан 8,5-кратный риск развития рака гортани, ассоциирующий с инфицированностью эпителия гортани вирусом папилломы человека 6 типа. Определена частота встречаемости делеции генов глутатион-S-трансфераз GSTT1 и GSTM1 у больных раком и предопухолевыми заболеваниями гортани. Установлен ассоциирующий с носительством делеции гена GSTT1 3-х и 4- кратный риск развития РГ у больных предопухолевыми заболеваниями и РГ. Проведен сравнительный анализ результатов определения латентного мембранного протеина (LMP-1) в опухолевых клетках больных РГ и иммунного ответа к антигенам литической инфекции ВЭБ. Показано, что в 87,5% случаев синтез LMP-1 сопровождается повышением уровня антител к антигенам литической инфекции ВЭБ. Показано значимое увеличение частоты встречаемости высокого уровня IgG к вирусному капсидному антигену ВЭБ у больных РГ с Т3 объемом опухоли. Выделены критерии формирования группы повышенного онкологического риска развития рака гортани. ^ Выявление опухолей гортани, ассоциированных с онкогенными вирусами папилломы человека и Эпштейна-Барр, может служить важной предпосылкой для углубленного изучения их этиопатогенеза, разработки новых подходов к ранней диагностике и прогнозированию клинического течения заболевания. Установленная ассоциация инфицированности эпителия гортани ВПЧ 6 типа и носительства делеции гена GSТT1 с РГ, свидетельствует о возможности использования изученных показателей в качестве дополнительных критериев формирования групп повышенного риска развития рака гортани. Определение в опухолевых клетках больных раком гортани синтеза латентного мембранного протеина (LMP-1), сопровождающегося повышением уровня антител к антигенам литической инфекции ВЭБ может свидетельствовать о вкладе вирусной составляющей в процесс канцерогенеза гортани. Выявленные факторы риска могут быть использованы в качестве дополнительного критерия при скрининге лиц с предопухолевыми заболеваниями. Результаты, полученные на модели одной из наиболее распространенных эпителиальных опухолей человека, будут способствовать более глубокому пониманию механизма вирусного канцерогенеза. ^ Метод ПЦР для определения вирусов папилломы человека и Эпштейна-Барр, а также полиморфизма генов ферментов детоксикации ксенобиотиков адаптирован и внедрен в практику работы лаборатории онковирусологии ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН. Полученные результаты используются в учебном процессе на кафедрах онкологии, биологии и генетики Сибирского государственного медицинского университета. ^
^ Основные положения диссертационной работы были представлены и обсуждены на региональной конференции молодых ученых имени академика РАМН Н.В.Васильева “Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии”, Томск (2005-2007); III Российской научной конференции с международным участием “Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера”, Новосибирск (2006); Российской научной-практической конференции с международным участием “Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи”, Барнаул (2006, 2007); IV съезде онкологов и радиологов СНГ, Баку (2006); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием “Опухоли головы и шеи”, Анапа (2006);VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Генодиагностика инфекционных болезней – 2007» Москва (2007). Публикации. Основные результаты исследования опубликованы в 18 печатных работах, из них три – в журналах, рекомендованных ВАК. ^ Диссертация изложена на 164 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 34 рисунками и 32 таблицами. Библиографический список включает 171 источник: 81 отечественных и 90 зарубежных. ^ В исследование было включено 126 пациентов с патологией гортани, из них 103 - с диагнозом рак гортани, 23 - с предопухолевыми заболеваниями гортани (хронический гиперпластический ларингит и папилломатоз) (табл.1). Больные раком гортани находились на стационарном и амбулаторном лечении в отделении опухолей головы и шеи ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (зав. отделением – чл.-корр. РАМН, профессор, д.м.н., Е.Л. Чойнзонов). Таблица 1 Характеристика групп обследованных
Образцы опухолей гортани и прилежащей к опухоли морфологически неизмененной ткани были получены в результате диагностических биопсий и/или после оперативного вмешательства по поводу рака. Гистологическое и иммуногистохимическое исследование проводилось в отделении патологической анатомии и цитологии ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (зав. отделением – профессор, д.м.н. В.М. Перельмутер). Диагноз подтверждался результатами клинического, эндоскопического, рентгенологического и морфологического обследований. Для анализа сравниваемых групп по гистологическому типу использовалась рекомендуемая ВОЗ (1999) «Гистологическая классификацией опухолей гортани». Гистологическое и иммуногистохимическое исследования проводились в отделении патологической анатомии и цитологии ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН (зав. отделением – профессор, д.м.н. В.М. Перельмутер). У всех обследованных больных РГ верифицирован плоскоклеточный тип разной степени дифференцировки. При этом у 24,3% больных отмечена высокая, у 63,1% - умеренная и у 8,7% - низкая степень дифференцировки опухоли. Распространенность опухолевого процесса оценивалась по международной классификации TNM (табл.2). Наблюдение за больными, проходившими стационарное лечение в клинике ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН, проводилось в течение 2-х лет. Рецидив отмечен у 12 (11,65%) больных в сроки от 6 месяцев до 2-х лет от момента проведения оперативного вмешательства, при этом, у 9,7% зарегистрирован летальный исход. Контрольная группа представлена лицами, не имеющими морфологических изменений эпителия гортани (n=56). Таблица 2 Распространенность опухолевого процесса в гортани
^ Геномная ДНК, полученная из лимфоцитов периферической крови и биопсийного материала, была выделена с использованием протеиназы К с последующей фенол-хлороформной экстракцией (Дейвис К., 1990). Генетическую информацию вируса папилломы человека в ДНК, выделенную из биопсийного и операционного материала, выявляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Амплификация фрагментов ДНК папилломавирусов 6, 11, 31, 33, 16 и 18 типов проводилась по стандартной программе на амплификаторе «Термоцик МС2», с регулированием температуры по матрице (скорость нагрева-охлаждения не менее 1оС/сек). Для визуализации продуктов амплификации применяли 2,5% агарозный гель. Для определения ДНК ВПЧ использовали коммерческие наборы фирмы «Амплисенс» (ФГУН ЦНИИЭ, Москва). Определение латентного мембранного протеина (LMP-1) вируса Эпштейна-Барр проводили иммуногистохимически, авидин-биотиновым методом с использованием моноклональных антител Epstein-Barr Virus (latent membrane protein) – NCL-EBV-CS1-4 (Novocastra Laboratories Ltd) на серийных парафиновых срезах, сделанных из биопсийного и операционного материала лиц со злокачественной патологией гортани, проходивших лечение в клинике ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН г. Томска в период с 2005 по 2007 гг. Уровни специфических антител к антигенам литической инфекции ВЭБ (IgG и IgА к вирусному капсидному антигену, IgG к комплексу ранних антигенов) в сыворотке периферической крови обследуемых лиц определяли методом непрямой иммунофлюоресценции (Henle W., 1979). Оценку полиморфизма генов ферментов детоксикации ксенобиотиков GSTT1 и GSTM1 (кодируют соответственно глутатион S-трансферазы θ1 и μ1) проводили с помощью мультиплексной ПЦР с использованием трех пар олигонуклеотидных праймеров, специфичных к участку гена рецептора эстрогенов, ER (F: 5'-caa-gtc-tcc-cct-cac-tcc-cc; R: 5'-gtg-cga-gtg-gct-cag-tgt-gt) и генов GSTT1 (F: 5'-ggt-cat-tct-gaa-ggc-caa-gg; R: 5'-ttt-gtg-gac-tgc-tga-gga-cg), и GSTM1 (F: 5'-tgc-ttc-acg-tgt-tat-gga-ggt-tc; R: 5'-gtt-ggg-ctc-aaa-tat-acg-gtg-g) (Spurdle A.B. et al., 2001). Продукты амплификации фракционировали в 3%-ом агарозном геле с добавлением бромистого этидия в течение 30 мин при напряжении 130 В и визуализировали в УФ-свете (рис.1).   Рис. 1. Примеры идентификации 0/0 и + генотипов по генам GSTT1 и GSTM1: ER – контроль амплификации (183 п.н.); 1 – генотип GSTT1 0/0 GSTM1 0/0; 2, 5, 7 – GSTT1 + GSTM1 + (131 и 114 п.н. соответственно); 3, 4, 6 – GSTT1 0/0 GSTM1 +; 8 – GSTT1 + GSTM1 0/0. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows 6.0». При сравнении частот генотипов применяли стандартный критерий Пирсона (χ2). В случае малого объема выборки (≤5 человек) использовали критерий Пирсона с поправкой Йетса и критерий Фишера. Для оценки ассоциации между генотипами и риском развития заболевания рассчитывали отношение шансов (OR-odd ration). OR указывался с 95% доверительным интервалом (Confidence interval - Cl). Прогностическая значимость признаков в отношении общей и безрецидивной выживаемости у больных РГ оценена с использованием программы Survival Analysis, STATISTICA 6.0. Кривые кумулятивной выживаемости строились по методу Каплана-Майера. Значимость различий в выживаемости между группами оценена по критерию Гехана-Вилкоксона. ^ В ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН на протяжении ряда лет проводились исследования по изучению распространенности вируса Эпштейна-Барр среди населения Сибири и Дальнего Востока, кроме того, изучалась его роль как фактора прогноза и формирования групп повышенного риска развития опухолей различных локализаций, в том числе, области головы и шеи (Исаева Т.М., 1992; Чойнзонов Е.Л., 1997). Литературные данные относительно вклада вируса папилломы человека в патогенез рака гортани разноречивы и, зачастую, диаметрально противоположны. Кроме того, практически, не встречается работ, посвященных изучению частоты встречаемости ВПЧ у лиц, страдающих хроническим гиперпластическим ларингитом и папилломатозом гортани, которые официально признаны факторами риска развития РГ и рассматриваются как заболевания с высокой частотой малигнизации. На первом этапе нашей работы была изучена частота ассоциации рака и предопухолевых заболеваний гортани с вирусом папилломы человека и проведено сопоставление изученного показателя с клинико-морфологическими особенностями опухолевого процесса. Максимальный уровень инфицирования вирусом папилломы человека был зарегистрирован у больных РГ (20,0%), значимо различаясь с таковым в контрольной группе (5,4%), в то время как у пациентов с ПЗГ значение данного показателя составило 8,7% (рис.2). Следует отметить, что у больных раком гортани ВПЧ инфицирована как опухолевая (16%), так и прилежащая к ней, нормальная (5,0%) ткань, тогда как у больных предопухолевыми заболеваниями и лиц контрольной группы ВПЧ был детектирован только в нормальной ткани в 8,7% и 5,4% случаях, соответственно. Изучение частоты инфицированности как нормальной, так и опухолевой ткани гортани одним или несколькими типами ВПЧ, показало преобладание в нормальной ткани больных РГ моно-инфекции (13,0%), а в опухолевой ткани - микст (6,0%). У больных предопухолевыми заболевания гортани оба типа инфицирования были обнаружены с одинаковой частотой – в 4,0% случаев. При этом в контрольной группе обнаружено только микст-инфицирование (5,4%). Исследование спектра инфицирования ВПЧ эпителиальной ткани гортани среди больных и лиц контрольной группы показало, что наиболее часто во всех трех группах выявляются 6 и 11 типы вируса. Так, у больных РГ данные типы обнаружены в 10 и 7,0% случаев, соответственно, тогда как среди больных предопухолевыми заболеваниями гортани и в контрольной группе ВПЧ 6 и 11 были обнаружены с одинаковой частотой – в 4,0% случаев. ВПЧ 31 и 33 были определены у больных РГ и в контрольной группе в равном проценте случаев – 2,0% .  Рис.2. Частота встречаемости вируса папилломы человека в изученных группах больных и контрольной. Примечание: * - статистически значимые различия с контрольной группой (р≤0,05). Следует отметить, что в группе больных РГ спектр инфицированности опухолевой ткани был шире по сравнению с нормальной тканью. Так, кроме ВПЧ 6, 11, 31 и 33, представленных в нормальной ткани, в опухолевой дополнительно были выявлены ВПЧ 16 и 18 в 1,0% и 2,0% случаев, соответственно. При сопоставлении частоты детекции и спектра инфицированности ВПЧ с таким клинически значимым параметром, как стадия заболевания, были получены следующие результаты. При одинаковом уровне инфицированности нормальной ткани больных со II и III стадией опухолевого процесса, у пациентов с III стадией заболевания частота выявления ВПЧ в опухолевой ткани в два раза превышала значение этого показателя у больных со II стадией (рис. 3, 4). Однако при детальном рассмотрении зависимости спектра типов ВПЧ от стадии опухолевого процесса было установлено, что у больных с III стадией диапазон вирусов папилломы человека, инфицирующих нормальную ткань, более широк. Кроме 6 и 11 типов вируса, присутствие которых было отмечено также и в нормальной ткани больных со II стадией, у больных с III стадией были определены с одинаковой частотой 31 и 33 типы. Аналогичная тенденция отмечена при сравнении спектра ВПЧ в опухолевой ткани больных РГ. Максимальный спектр типов ВПЧ был зафиксирован в опухолевой ткани больных с III стадией опухолевого процесса. Помимо 6, 11 и 31 типов ВПЧ, обнаруженных в опухолевой ткани больных со II стадией процесса, у больных с III стадией дополнительно и с одинаковой частотой (13,0%) были определены 33, 16 и 18 типы.  Рис. 3. Частота детекции вируса папилломы человека в нормальной ткани больных раком гортани со II и III стадией опухолевого процесса. Аналогичная тенденция наблюдалась при изучении спектра инфицированности и частоты детекции ВПЧ в ткани больных РГ во взаимосвязи со степенью дифференцировки опухоли. Так, у больных с высокой степенью дифференцировки частота детекции вируса в нормальной и опухолевой ткани была, примерно, равнозначна. Однако, в опухолевой ткани, помимо ВПЧ 11, выявленного и в нормальной ткани, присутствовал ВПЧ 6 (7,0%). Спектр инфицированности как опухолевой, так и нормальной ткани больных РГ с умеренной степенью дифференцировки опухоли был более широким. Кроме ВПЧ, выявленных у больных с высокой степенью дифференцировки, у больных с умеренно-дифференцированной опухолью обнаружены ВПЧ 16 и 18 (в 2,0 и 3,0% случаев, соответственно). Причем, с максимальной частотой и в опухолевой (в 9,0 и 5,0% случаях, соответственно), и в нормальной ткани (в 11,0 и 8,0% случаях, соответственно) были обнаружены 6 и 11 типы ВПЧ. С одинаковой частотой (2,0%) в обеих типах эпителиальной ткани гортани больных РГ выявлены ВПЧ 31 и 33.  Рис. 4. Частота детекции вируса папилломы человека в опухолевой ткани больных раком гортани со II и III стадией опухолевого процесса. Поскольку, от момента инфицирования до возникновения опухоли проходит продолжительный латентный период, длящийся годами, а иногда и десятилетиями, мы сочли целесообразным изучить частоту встречаемости и спектр ВПЧ во взаимосвязи с длительностью течения заболевания, для чего больные РГ были разделены на соответствующие подгруппы (длительность заболевания менее 0,5 лет; 0,5-2 и 2-4 года). Показано 2,4- и 1,2-кратное увеличение частоты встречаемости ВПЧ в опухолевой ткани больных РГ, заболевание которых длилось 0,5-2 и 2-4 года, соответственно, по сравнению с больными с минимальным сроком развития патологического процесса. Тенденция инфицирования нормальной ткани больных была подобна предыдущей, однако, у больных с максимальным сроком развития заболевания частота детекции вируса была в 1,5 раза ниже, чем у лиц с 0,5-2-летним и составила 9,0%. Следует отметить, что нормальная ткань больных именно с минимальным периодом развития опухолевого процесса была инфицирована, помимо ВПЧ 6, 11, вирусами папилломы 31 и 33 типа, чего не наблюдалось ни в одной другой подгруппе больных. Тогда как, в опухолевой ткани присутствовал только 6 тип вируса. В подгруппе больных с продолжительным течением заболевания частота и спектр инфекции, напротив, были наиболее широко представлены в опухолевой ткани (ВПЧ 6, 11, 16 и 18), тогда как в нормальной были выявлены только 6 и 11 типы. У больных с предопухолевыми заболеваниями гортани различий в частоте инфицированности ВПЧ между подгруппами показано не было. Однако нормальная ткань пациентов с минимальным сроком развития заболевания была инфицирована 6 и 11 типами, тогда как у больных с 2-4-летним процессом – ВПЧ 31. Таким образом, присутствие ВПЧ 31 типа в нормальной слизистой гортани больных раком и предопухолевой патологией неоднозначно влияет на длительность течения патологического процесса. Существуют разные точки зрения на причинно-следственные аспекты вирусного канцерогенеза. Так, связь между инфицированностью эпителия у больных с предопухолевой патологией гортани и тяжестью течения заболевания объясняется наличием латентной инфекции в морфологически здоровой ткани, прилегающей к патологическому очагу (Плужников М.С. и др., 2006). Согласно гипотезе, предложенной Г.Ф. Иванченко и др. (2001), не исключая вклада вирусной составляющей, ведущая роль в поддержание и прогрессирование патологического процесса отводится особенностям макроорганизма, в частности, дефициту системы интерферона и показателей Т-клеточного звена иммунитета, регистрируемому у 98% больных рецидивирующим респираторным папилломатозом. О важности CD4+ и/или CD8+ - Т-клеточных реакций в контроле ВПЧ-инфекции, в том числе, частоты ее рецидивирования у больных с Т-клеточной иммуносупрессией, свидетельствует и большое число заболеваний, ассоциированных с ВПЧ различных типов (Benton C. et al., 1992). Вышесказанное подтверждается, также, гистологическими исследованиями, выявляющими, в случаях самопроизвольной регрессии папиллом, наличие Т-клеточной инфильтрации в биоптатах кожи и слизистых оболочек (Berman A. et al., 1980; Iwatsuki K. et al., 1986; Delius H. et al., 1998). Данный факт подтверждается данными, согласно которым, развитию и прогрессированию вирусной инфекции у 48% больных папилломатозом гортани способствует дибаланс Th1/Th2 (Clerici M. et al., 1998; Snowden T.R. et al., 2001). Оценив риск развития рака гортани у лиц, инфицированных папилломавирусами, нами установлено, что инфицирование эпителия гортани больных РГ ВПЧ 6 ассоциировало с 8,5-кратным риском развития злокачественной опухоли по сравнению с контрольной группой. При этом только у больных РГ и исключительно в опухолевой ткани были обнаружены 16 и 18 типы вируса папилломы, отсутствующие в других исследуемых группах. Отмечено, что только у больных с III стадией злокачественного процесса и умеренной степенью дифференцировки в опухолевой ткани обнаружено присутствие всех 6 изученных типов ВПЧ. Несмотря на получение определенных результатов относительно ассоциации ВПЧ с патологией гортани, их неоднозначность оставляет вопрос о вкладе вируса папилломы человека в этиопатогенез рака гортани открытым и требующим дальнейшего изучения и уточнения. Несмотря на практически 95-100% инфицирование населения планеты вирусом Эпштейна-Барр, механизм канцерогенеза, ассоциированный с этим вирусом, достаточно сложен и мало изучен. До настоящего времени нет четких данных о роли вируса Эпштейна-Барр в патогенезе РГ, не выявлен вклад факторов, которые могут способствовать онкогенезу, в частности, ВЭБ-ассоциированных хронических воспалительных процессов эпителия слизистой, его иммунодепрессивное влияние при инфицировании организма хозяина. Учитывая вышеизложенное, вторым этапом нашего исследования явилось определение гуморального иммунного ответа к антигенам литической инфекции вируса Эпштейна-Барр в изучаемых группах и сопоставление полученных данных с клиническими параметрами, такими как размер первичного опухолевого очага, регионарное и отдаленное метастазирование, общая и безрецидивная выживаемость. Изучение зависимости уровня антител к антигенам ВЭБ от размера опухоли показало, что максимальная частота повышенного уровня антител класса G к вирусному капсидному и комплексу ранних антигенов ВЭБ (40,0% и 48,0%, соответственно) характерна для больных, размер опухоли которых соответствовал Т3, значимо различаясь с аналогичным показателем у больных с Т1, Т2 и Т4 объемом опухоли. При этом между уровнем антител класса G к антигенам ВЭБ и регионарным метастазированием была показана обратная пропорциональная зависимость. Так, высокие уровни антител класса G к вирусному капсидному и комплексу ранних антигенов ВЭБ с большей частотой (44,0% и 56,0%, соответственно) были определены у больных РГ с отсутствием метастазов, значимо различаясь с данным параметром у больных с одним или несколькими регионарными метастазами. У больных РГ с отдаленными метастазами в распределении уровней антител к антигенам ВЭБ наблюдалась тенденция, аналогичная предыдущей. Высокие уровни антител были зафиксированы только у больных без метастазов. Однако в единичном случае в группе больных с одним отдаленным метастазом мы наблюдали повышенные уровни антител класса G к комплексу ранних антигенов. При этом значимые различия были показаны между низким значением антител и отсутствием, либо наличием одного отдаленного метастаза. При изучении такого клинически важного прогностического критерия, как безрецидивная выживаемость, в сопоставлении с уровнем антител класса G к вирусному капсидному антигену ВЭБ, статистически значимых различий между кривыми выживаемости показано не было (р>0,05). Однако тенденция к наличию различий наметилась между кривыми выживаемости при изучении уровня антител класса G к комплексу ранних антигенов ВЭБ (рис.5). Следует подчеркнуть, что в данном случае максимальное количество рецидивов (n=9) было отмечено в группе больных с низкими значениями антител. Таким образом, полученные данные по состоянию специфического гуморального иммунного ответа у больных РГ в сопоставлении с клиническими параметрами носят, как и в случае инфицирования пациентов вирусами папилломы, несколько противоречивый характер: с одной стороны, вполне обоснованно наблюдается повышение уровня антител к антигенам ВЭБ у больных с Т3 размером опухоли, с другой – снижение, практически, до нулевых значений - при регионарном или отдаленном метастазировании.  Рис 5. Безрецидивная выживаемость больных РГ в зависимости от уровня антител класса G к комплексу ранних антигенов ВЭБ. Примечание: нецензурированные данные – завершенные наблюдения, в которых зафиксирован случай рецидивирования; цензурированные данные – незавершенные наблюдения, в которых исследуемый исход не наступил, или объект выбыл и больше не наблюдался. Группа 1 – уровень антител класса G к РА в значении ≤1:20, группа 2 – уровень антител класса G к РА в значении ≥1:40. Статистически значимых различий между кривыми выживаемости не выявлено (р=0,6172). Одновременно с синтезом антигенов литической инфекции ВЭБ, сопровождающимся повышением уровней специфических антител, в организме может наблюдаться и экспрессия генов, индуцирующих синтез антигенов латентной инфекции. Одним из представителей этой группы является латентный мембранный протеин (LMP-1), обладающий онкогенной потенцией и инициирующий злокачественный фенотип клеток эпителия. Согласно литературным данным, в опухолевых клетках больных со злокачественной патологией верхнего отдела респираторного тракта отмечается синтез именно этого протеина (Baumforth K. R. N, 1999; Prince S., 2003; Bar-Sela G, 2003). Однако, время начала его синтеза в клетке и пусковой механизм, который приводит к малигнизации, остаются неясными. При сопоставлении частоты синтеза LMP-1 с уровнем антител к антигенам литической инфекции ВЭБ, нами показано, что в большинстве случаев (87,5%) повышение уровня антител к антигенам ВЭБ сопровождается присутствием в опухолевых клетках генетического материала ВЭБ – мембранного протеина LMP-1, что не исключает возможности использования специфических антител ВЭБ на этапе ранней диагностики ВЭБ(+) рака гортани. В последнее время в литературе все чаще обсуждается вопрос о влиянии полиморфизма генов ферментов детоксикации ксенобиотков – GSTT1 и GSTМ1 на предрасположенность к развитию онкологических заболеваний, в том числе и рака гортани (Jourenkova N., 1998; Risch A., et al., 2003). Получены данные о модифицирующем влиянии канцерогенных факторов внешней среды на чувствительность эпителиальных клеток к инфицированию вирусами (Niedobitek G., 2000). В этой связи мы сочли целесообразным изучить частоту встречаемости делеции данных генов в группах больных раком и предопухолевыми заболеваниями гортани, а также рассчитать риск развития РГ в изученных группах (табл.4). Частота детекции гомозигот по нулевому аллелю (0/0) гена GSTT1 в группе здоровых лиц оказалась несколько ниже популяционной для Северо-Западного региона Сибири (23,3%) (Попова С.Н., 2002), в том числе и для г.г. Томска и Новосибирска (23,7%) (Ляхович В.В. и др., 2000; Вавилин И.О. и др., 2002; Брагина Е.Ю., 2005), составив 15,0%. Максимальная частота нулевого генотипа GSTT1 среди изученных групп была отмечена у больных раком гортани (58,2%). Это значение в 3,8 раза превышало соответствующий показатель в контрольной группе и в 1,3 раза – в группе больных предопухолевыми заболеваниями гортани. При этом различия по данному показателю между группами онкологических больных и контрольной оказались значимыми (2=40,75; p=0,0001), что может свидетельствовать об ассоциации риска развития заболевания с данным генотипом (ОR=3,88; CI95%2,37-6,37). Различия по нулевому генотипу GSTT1 между группами пациентов с предопухолевыми заболеваниями гортани и контрольной также оказались значимыми (p≤0,05) и риск развития злокачественной патологии был повышен у больных предопухолевыми заболеваниями гортани по сравнению с группой контроля (ОR=2,90; CI95%1,50-5,60). При сравнении частоты распределения нулевого генотипа GSTT1 среди больных раком и предопухолевыми заболеваниями гортани значимых различий выявлено не было. Частота гомозигот по нулевому аллелю глутатион-S-трансферазы M1 в контрольной группе составила 43,0%, соответствуя таковой в популяции Северо-Западного региона России (42,2%) и практически совпадая с аналогичным показателем (54,8%) для жителей г. Томска (Попова С.Н., 2002, Брагина Е.Ю., 2005). У больных раком гортани частота гомозигот GSTM1 0/0 составила 29,1% (что в 1,4 раза ниже популяционного уровня). В группе больных с ПЗГ частота нулевого генотипа GSTM1 (26,1%) практически соответствовала таковой (29,1%) в группе больных раком гортани, в 1,6 раз превышая аналогичный показатель в контрольной группе. Указанные различия в сравниваемых группах больных оказались незначимыми (р≥0,05). При рассмотрении частоты встречаемости делеции GSTТ1 и GSTM1 у больных РГ, инфицированных ВПЧ, установлено, что у данной категории лиц выявлялась делеция только одного из двух изучаемых генов. При этом больные, инфицированные ВПЧ 11, являлись носителями только делеции GSTM1 гена. При сопоставлении носительства делеции GSTТ1 и GSTM1 генов с высоким уровнем антител к антигенам ВЭБ какой-либо зависимости установлено не было. Таблица 4. Частоты нулевого (0/0) генотипа GSTT1 и GSTM1 в обследованных группах
Примечания: * – уровень статистической значимости различий параметров в сравнении с контрольной группой; ОR – относительный риск развития заболевания в сравнении с контрольной группой. OR указывался с 95% доверительным интервалом (Confidence interval - Cl).Для установления связи между изучаемыми клинико-морфологическими и вирусо-генетическими параметрами был проведен корреляционный анализ (рис.6). На схеме представлены корреляционные связи с уровнем статистической значимости р≤0,05. Наличие прямых связей показано как внутри, так и между клинико-серологическим и вирусо-генетическим блоками. Тогда как обратная зависимость была выявлена только между вирусологическим и вирусо-генетическим параметрами. Так, синтез антител класса G и А к антигенам литической инфекции ВЭБ связан между собой, а также с гистологическим диагнозом, что является закономерным с патофизиологической точки зрения, указывая значимость и возможность применения данного параметра при диагностике заболеваний гортани. Наличие корреляционной связи между инфицированностью опухолевой ткани ВПЧ 6 и 11, также как наличием в опухолевой ткани ВПЧ 16 и 18, можно интерпретировать с позиции как принадлежности к одной группе онкогенности, так и их широкой распространенности. Наличие связи между носительством делеции генов ферментов детоксикации ксенобиотиков – GSTT1 и GSTМ1 объяснимо, возможно, высокой частотой встречаемости делеции гена GSTM1 в популяции Томской области и повышенной частоты – гена GSTT1, выявленной среди больных РГ. Обратные корреляционные связи были показаны лишь в двух случаях: между наличием в опухолевой ткани ВПЧ 11 и 18, что может быть объяснено как принадлежностью к разным группам онкогенности, так и взаимоисключающими или конкурирующими взаимоотношениями со стороны обоих типов; а также между инфицированной ВПЧ 11 опухолевой тканью и делецией GSTT1 гена, создающей, возможно, неблагоприятные условия для интеграции данного типа вируса в эпителиальные клетки гортани. Однако, наиболее значимыми, с точки зрения патофизиологии, мы считаем наличие корреляции, установленной между инфицированностью нормальной и опухолевой ткани ВПЧ 6, что может свидетельствовать о частичной моноклональности опухолевого пула клеток и тем самым подтверждать вклад вирусной составляющий в процесс канцерогенеза гортани. На основании анализа корреляционных связей можно сделать вывод о причастности вирусов папилломы человека и Эпштейна-Барр к опухолевому процессу в гортани. Однако, на наш взгляд, полученные данные недостаточны для установления прямой причинно-следственной связи между изученными клиническими показателями и вирусной компонентой. Вероятно, попав в организм, вирус может реализовать свой онкогенный потенциал через цепь последовательных звеньев, приводящих, в совокупности, к злокачественной трансформации клеток и, в конечном итоге, инициирующих канцерогенез. Для выявления факторов риска развития рака гортани был проведен первый этап регрессионного анализа с включением всех клинико-морфологических и вирусо-генетических параметров, в результате которого были отобраны наиболее информативные (с коэффициентом значимости р≤0,05). В результате было показано, что основополагающими в процессе злокачественной трансформации являются: вирусная составляющая, включающая повышенный уровень иммуноглобулинов класса G к вирусному капсидному антигену вируса Эпштейна-Барр, свидетельствующая о наличии в организме литической инфекции; инфицирование эпителия гортани вирусом папилломы человека 6 типа, который был выявлен во всех трех изученных группах, с максимальной частотой определен как в нормальной, так и в опухолевой ткани больных раком и предопухолевыми заболеваниями гортани, и носительство которого ассоциировало с 8,5-кратным риском развития рака; генетическая компонента, заключающаяся в делеции гена GSТT1, носительство которой ассоциировало с 3-х и 4- кратным риском развития злокачественного процесса у больных с предопухолевыми заболеваниями и раком гортани, соответственно; анамнестический показатель – возраст, являющийся универсальным фактором риска для многих заболеваний, в том числе онкологических.  Р   ис 6. Корреляционные связи между вирусо-генетическими и клиническими параметрами в группе больных раком гортани. Примечание: - прямые связи, -обратные связи. На схеме представлены связи с уровнем статистической значимости р≤0,05 и коэффициентом корреляции Спирмана >0,5.ВЫВОДЫ
^ 1. Шилова О.Ю. Роль вирусов в этиологии и патогенезе злокачественных опухолей: протоколы общества онкологов / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова // Сибирский онкологический журнал. - Томск. - 2005. - №2. - С.61 – 62. 2. Шилова О.Ю. Исследование частоты ассоциации предопухолевых заболеваний и рак гортани с онкогенными вирусами / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова // Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи. Материалы Российской научно - практической конференции с международным участием. – Барнаул. - 2006. - С. 247. 3. Частота выявляемости вируса папилломы человека при патологических процессах гортани / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова, Е.Л. Чойнзонов, М.Р. Мухаммедов, О.В. Черемисина, В.А. Евтушенко // Сибирский онкологический журнал. - Томск. - 2006. - Прил.№.1. – С.130 - 131. 4. Шилова О.Ю. Патологические процессы гортани, ассоциированные с онкогенными вирусами / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова // IV съезд онкологов и радиологов СНГ. Материалы съезда. - Баку. - 2006. – С.400. 5. Частота выявления вируса папилломы человека у больных хроническими заболеваниями и раком верхних дыхательных путей / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова, Е.Л. Чойнзонов, М.Р. Мухаммедов, О.В. Черемисина, В.А. Евтушенко // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: третья российская конференция с международным участием. Тезисы докладов. - Новосибирск. - 2006. - С.263-265. 6. Выявление вирусов папилломы человека у больных хроническими заболеваниями и раком верхних дыхательных путей / / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова, Е.Л. Чойнзонов, М.Р. Мухаммедов, О.В. Черемисина // 10 Российский онкологический конгресс. Материалы конгресса. - М. - 2006. - С.200. 7. Шилова О.Ю. Выявление HPV-ассоциированных форм хронических заболеваний и рака гортани / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии: региональная конференция молодых ученых. Сборник материалов. - Томск. - 2006. - С.68-69. 8. Ассоциация рака гортани с вирусами папилломы человека и Эпштейна-Барр: проспективные исследования / О.Ю. Шилова, М.Р. Мухамедов, О.В. Черемисина, Л.Н. Уразова // Профилактика и лечение злокачественных новообразований в современных условиях: Российская научно-практическая конференция с международным участием. Материалы конференции. - Новосибирск. - 2007. - С.374-375. 9. Онкогенные вирусы в патогенезе хронических заболеваний и рака гортани / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова, М.Р. Мухамедов, Е.Л. Чойнзонов // Buletinul academiei de stiinte a Moldovei stiinte medicale: revista stiintifico-practica. - Chisinau. - 2007. - №4. - С.341-342. 10. Шилова О.Ю. Ассоциация рака гортани с вирусами папилломы человека и Эпштейна-Барр / О.Ю. Шилова // Сибирский онкологический журнал. - Томск. - 2007. - Прил. № 2. - С.126-127. 11. Шилова О.Ю. Исследование частоты ассоциации предопухолевых заболеваний и рака гортани с онкогенными вирусами папилломы человека и Эпштейна-Барр / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова // Проблемы фундаментальной и прикладной медицины: четвертая Всероссийская конференция молодых ученых в рамках 13 международного конгресса по приполярной медицине. - Новосибирск. - 2006. - С.53-54. 12. Вирус папилломы человека у больных хроническими заболеваниями и раком верхних дыхательных путей / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова, Е.Л. Чойнзонов, М.Р. Мухаммедов, О.В. Черемисина // Молекулярная диагностика: VI всероссийская научно-практическая конференция с международным участием. Сборник тезисов. - М. - 2007. - Т. III. - С.168-169. 13. Полиморфизм генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков: взаимосвязь с риском развития рака гортани / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова, П.А. Гервас, М.Р. Мухамедов, О.В.Черемисина, В.А.Евтушенко, Е.Л. Чойнзонов // Сибирский онкологический журнал. - Томск. - 2007. - №2. - С.62-65. 14. Вирусы папилломы человека и Эпштейна-Барр в патогенезе предопухолевых заболеваний и рака гортани / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова, М.Р. Мухамедов, О.В. Черемисина // XII межрегиональная конференция онкологов. Материалы конференции. - Якутск. - 2007. - С. 108-110. 15. Синтез латентного мембранного протеина (LMP-1) вируса Эпштейна-Барр в опухолевых клетках больных раком гортани / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова, Н.Г. Крицкая, Е.Л. Чойнзонов, О.В. Черемисина // Совершенствование онкологической помощи в современных условиях: Российская научно-практическая конференция с международным участием. Материалы конференции. - Барнаул. - 2008. - С. 151-152. 16. Ассоциация с риском развития рака гортани делеции генов биотрансформации ксенобиотиков (GSTT1 и GSTM1) / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова, О.В. Черемисина, Е.Л. Чойнзонов, М.Р. Мухамедов // Совершенствование онкологической помощи в современных условиях: Российская научно-практической конференция с международным участием. Материалы конференции. - Барнаул. - 2008. - С.321-322. 17. Синтез латентного мембранного протеина вируса Эпштейна-Барр в опухолевых клетках больных раком гортани / Л.Н. Уразова О.Ю., Шилова, Е.Л. Чойнзонов, Н.Г. Крицкая // 100 лет Российской оториноларингологии: достижения и перспективы: Всероссийская научно-практическая конференция. Материалы конференции.- С.-Петербург. - 2008. - Прил. №2.- С.424-427. 18. Изучение полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков GSTT1 и GSTМ1 у больных хроническими заболеваниями и раком гортани / О.Ю. Шилова, Л.Н. Уразова, Е.Л.Чойнзонов, О.В.Черемисина, В.А. Евтушенко, М.Р. Мухамедов // V съезд онкологов и радиологов СНГ. Материалы съезда. - Ташкент. - 2008. - С.65. ^ РГ – рак гортани ПЗГ – предопухолевые заболевания гортани ХГЛ – хронический гиперпластический ларингит ПГ – папилломатоз гортани ВПЧ – вирус папилломы человека ВЭБ – вирус Эпштейна-Барр ВКА – вирусный капсидный антиген вируса Эпштейна-Барр РА – комплекс ранних антигенов вируса Эпштейна-Барр LMP-1 – latent membrane protein-1 Ig – иммуноглобулины А втор выражает глубокую признательность за ценные теоретические и методические рекомендации, а также практическую помощь, оказанную при проведении исследований и обсуждении результатов профессору, зав. лаборатории иммунологии НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН Чердынцевой Н.В., доктору медицинских наук, ведущему научному сотруднику отделения опухолей головы и шеи Мухамедову М.Р., доктору медицинских наук, ведущему научному сотруднику отделения эндоскопии Черемисиной О.В., доктору медицинских наук, профессору, заведующему отделением патологической анатомии и цитологии Перельмутеру В.М., кандидату биологических наук, старшему научному сотруднику отделения патологической анатомии и цитологии Крицкой Н.Г., доктору медицинских наук, старшему научному сотруднику лаборатории биохимии Бочкаревой Н.В. и коллективу лаборатории онковирусологии. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям