Впч-тестирование: алгоритмы диагностики и требования к молекулярным тестам для выявления вирусов папилломы человека
|
|
Скачать 161.25 Kb.
|
|
ВПЧ-тестирование: алгоритмы диагностики и требования к молекулярным тестам для выявления вирусов папилломы человека Автор: Куевда Д.А., Шипулина О.Ю. Организация: ФГУН «Центральный НИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва, Россия Вирусы папилломы человека (ВПЧ) являются широко распространенной и гетерогенной группой вирусов. ВПЧ имеют кольцевой ДНК содержащий геном размером порядка 8 тысяч пар оснований. Таксономически вирусы папилломы делятся на роды (обозначаются греческими буквами (a, b, g и т.д), виды (обозначаются арабскими цифрами и буквой рода, например a7, a9, b1 и др.), типы (обозначаются арабскими цифрами, например, 16, 18, 6, 11 и др.). Эпидемиологически выделяют «кожные», тропные к ороговевающему эпителию типы (в основном роды b и g) и слизистые или аногенитальные (тропные к слизистым оболочкам) типы вируса (род a). Среди последних выделяют подгруппы низкого (в основном виды a1, a8, a10) и высокого канцерогенного риска (виды a5, a6, a7, a9) по их способности или неспособности оказывать трансформирующее воздействие на клетки эпителия. Эпидемиологическими исследованиями последних лет показано, что к группе высокого риска принадлежат типы 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 и 82. Типы 26, 53 и 66 относятся к категории предположительно высокого риска. К группе низкого риска принадлежат типы 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 72, 81. Остальные типы относятся к категории неустановленного риска и чаще всего не ассоциированы с развитием патологий. Типы ВПЧ как высокого, так и низкого риска способны оказывать продуктивное воздействие на клетки эпителия, приводя к развитию классических проявлений папилломавирусной инфекции – остроконечных кондилом гениталий – и дисплазий легкой степени (L-SIL или CIN1). Типы высокого онкогенного риска отличает способность оказывать трансформирующее воздействие на эпителиоциты, приводя к развитию предрака (дисплазии средней и высокой степени тяжести, H-SIL или CIN2,3) и рака. Следует подчеркнуть, что развитие дисплазий не обязательно сопровождается появлением остроконечных кондилом. ^ Характерной особенностью инфекции является высокая доля спонтанных излечений в течение одного года от момента инфицирования без развития клинических проявлений инфекции (остроконечных кондилом). При этом латентная и субклиническая формы инфекции опасности не представляют. Это обуславливает особенности диагностики. Основным информативным диагностическим маркером папилломавирусной инфекции низкого риска является выявление остроконечных кондилом (клинической формы) при осмотре. Молекулярно-биологические методы исследования (в том числе ПЦР) могут быть использованы для диагностики папилломавирусной инфекции низкого риска. При этом следует помнить, что данный метод позволяет выявлять не только клиническую, но субклиническую и латентную формы инфекции, выявление которых малоинформативно, так как:
Из этого следует, что при проведении плановых обследований и диспансеризаций выявление факта инфицирования типами низкого канцергенного риска в большинстве случаев не оправдано. Исключение представляет обследование беременных. При беременности или ее планировании выявление ВПЧ низкого онкогенного риска является основанием для настороженности по отношению к развитию папилломатоза гортани у ребенка. При этом попытка лечения латентной и субклинической инфекции беременной или родоразрешение методом кесарева сечения не являются правильной врачебной тактикой, так как не обладают должной эффективностью и целесообразностью. Оправданным считается лишь тщательное наблюдение за новорожденным. Кроме того показаниями к проведению обследования на наличие низкоонкогенных типов ВПЧ являются:
Выявление 6 и 11 генотипов ВПЧ является достаточным для диагностики, так как с ними сопряжено более 90% клинических форм низкоонкогенной папилломавирусной инфекции. Оптимальным может считаться выявление 5 генотипов ВПЧ 6, 11, 42, 43, 44. ^ Основная опасность, которую несет инфицирование вирусами данной группы, является риск развития рака шейки матки. роль ВПЧ в развитии рака шейки матки на сегодняшний день доказана и подтверждена ВОЗ. Кроме того показана ассоциация высокоонкогенных ВПЧ с большей долей рака заднего прохода (около 90% случаев), около 40% всех случаев рака влагалища, вульвы, полового члена, 10-15% случаев рака ротовой полости и гортани. ^ – одна из наиболее распространенных онкологических патологий, занимающее второе место по частоте встречаемости среди женщин в мире. Всего в мире ежегодно регистрируется около 600 тыс. новых случаев РШМ и более 250 тыс. смертельных исходов. В случае предрака и рака ВПЧ выявляется почти в 100% случаев, выявление ВПЧ на стадии отсутствия дисплазии характеризуется минимум 300-кратным увеличением риска развития РШМ. При этом рак шейки матки (РШМ) является одной из немногих нозологических форм злокачественных новообразований, которые удовлетворяют всем требованиям для проведения популяционного скрининга. Характерно, что это заболевание имеет надежно распознаваемую преклиническую фазу, длительный период развития, существуют возможности для дальнейшей верификации диагноза и методы эффективного лечения. Длительное время существовал единственный скрининг-тест – цитологический анализ мазка. Появление ВПЧ-тестов позволило усовершенствовать систему скрининга, существенно повысив чувствительность выявления предрака и рака шейки матки. Особенности папилломавирусной инфекции. Концепция ВПЧ-тестирования. Инфекция вирусом папилломы человека имеет ряд важных особенностей, без учета которых использование ВПЧ-тестирования сопряжено с рядом трудностей в трактовке результатов. ^
С другой стороны:
Из перечисленных особенностей папилломавирусной инфекции следует, что положительный результат тестирования на наличие вируса должен трактоваться как
^ тестирования трактуется как отсутствие риска развития тяжелой дисплазии и рака, при этом предсказательная ценность отрицательного ВПЧ-теста существенно выше, чем цитологического исследования. ВПЧ-тестирование и другие методы выявления предраковой патологии. Как ранее отмечалось, основной задачей диагностики папилломавирусной инфекции высокого канцерогенного риска является раннее выявление предраковых изменений. В настоящее время с этой целью используются цитологический, кольпоскопический, гистологический методы (выявляют наличие характерных для папилломавирусной инфекции изменений эпителия, дисплазий, рака). Молекулярно-биологические методы, позволяющие установить факт инфицирования и провести генотипирование ВПЧ, являются новыми методами и в связи с этим возникает вопрос об их необходимости и месте в структуре диагностики. Чтобы обосновать востребованность кратко остановимся на характеристике каждого из методов. ^ – метод выявления морфологических изменений клеток, в том числе связанных с ВПЧ. Метод неспецифичен по отношению к инфекции вирусами высокого онкогенного риска и выявляет случаи легкой дисплазии, связанные с низкоонгкогенными ВПЧ. Качество результата в значительной мере зависит от квалификации врача-цитолога (тактовка субъективна) и от выбора способа окрашивания. Наиболее информативным методом окрашивания является метод Папаниколау, менее информативными – метод Паппенгейма и Лейшманн, не информативными (но наиболее используемыми в России) – по Романовскому-Гимза. Даже при проведении исследования с окраской по Папаниколау чувствительность цитологического анализа по отношению к тяжелой дисплазии и раку составляет в среднем 58% (вариация от 20% до 87%) при специфичности 90-97%. Низкой является предсказательная ценность отрицательного результата теста при наблюдении за пациентами в течение нескольких лет. В связи с этим рекомендуемые интервалы цитологических исследований в диспансеризации и скрининге составляют 1-3 года. Кольпоскопия – метод является неспецифичным для папилломавирусной инфекции так как выявляет морфологические изменения эпителия in vivo. Являясь хорошим вторичным методом подтверждения цервикальной патологии, попытки использования кольпоскопии в качестве скринингового теста показали, что чувствительность исследования составляет порядка 75% при специфичности – 20%. Кроме того метод требует длительного времени, высокой квалификации врача-кольпоскописта, наличия специального оборудования в кабинете врача. ^ – является золотым стандартом диагностики, однако не может быть методом скрининга в силу инвазивности и трудоемкости. Потому так же является вторичным методом диагностики ^ (ПЦР-диагностика) – не позволяют установить стадию инфекции, однако однозначно указывают на наличие или отсутствие инфекции. В связи с этим данная группа методов может использоваться только в совокупности с клиническими методами исследования. В то же время четкое определение принадлежности к группе риска с использованием молекулярных тестов позволяет сфокусировать внимание на отдельных пациентах и тем самым значительно повысить эффективность установления стадии инфекции клиническими методами. Опыт Европы и США показал, что совместное использование ВПЧ-тестирования и цитологии позволяют увеличить чувствительность выявления предрака и рака шейки матки до 96-99% и увеличить рекомендуемые интервалы между регулярными (скрининговыми) обследованиями до 5-7 лет. Последнее возможно так как у пациенток с отрицательным результатом ВПЧ-теста (включая группу с цитологическими L-SIL и ASC-US) в течение 5-7 лет не происходит развития тяжелой дисплазии. Стратегии использования ВПЧ-тестов в диагностике предрака и рака шейки матки 1. Стратегия «скрининга и наблюдения» Под данной стратегией понимают:
Ведущими специалистами и рядом международных организаций (ASCCP, EUROGIN, ESIDOG и другие) предложены алгоритмы диагностики с использованием теста на ДНК ВПЧ:
^  ^  ^  ^ Под данной стратегией понимают проведение двойного исследования цитология+ВПЧ-тест через 6 месяцев после проведенного хирургического лечения и в случае получения двойного отрицательного результата считать пациентку полностью излеченной (в отличие от классической схемы, где для подтверждения статуса излеченности необходимо получение 4-5 отрицательных цитологических заключения) ^  Генотипирование ВПЧ Дополнительные возможности определения прогноза течения заболевания может дать проведение генотипирования. Необходимость генотипирования может быть оправдана так как:
^ Для того, чтобы быть уверенным, что ВПЧ-тесты могут быть использованы в описанных алгоритмах диагностики, они должны удовлетворять ряду требований. На основании мирового опыта применения ВПЧ-тестирования эти требования были сформулированы. При проведении разработок тест-систем для ВПЧ-тестирования в ФГУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора перечисленные мировые требования были взяты за основу и учтены: • ^ ; Не следуя этому правилу и выявляя все генотипы ВПЧ, результат тестирования будет иметь крайне низкую диагностическую специфичность и информативность, так как подобные тесты, наряду с генотипами высокого канцерогенного риска, будут выявлять генотипы не ответственные за развитие предрака и РШМ и часто вообще не связанные с какой бы то ни было патологией урогенитального тракта. Тест-системы «АмплиСенс» производства ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора выявляют исключительно генотипы высокого канцерогенного риска • ВПЧ-тест должен обнаруживать не менее десяти генотипов (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 52, 58, 59), что обеспечивает более чем 95%-ную диагностическую чувствительность теста; Из эпидемиологических данных по распространенности различных генотипов ВПЧ высокого риска в РШМ следует, что выявление лишь 2 наиболее распространенных генотипов ВПЧ 16 и 18 будет обладать низкой диагностической чувствительностью (будет выявлено около 72% всех опухолей). Высокой диагностической чувствительностью будут обладать лишь тесты, выявляющие широкий спектр генотипов ВПЧ высокого риска. Выявление 10 наиболее распространенных генотипов ВПЧ позволяет выявлять 95%-99% всех случаев РШМ. Предназначенные для скрининга тест-системы «АмплиСенс» выявляют не менее 10 наиболее распространеных генотипов ВПЧ высокого риска. • ВПЧ-тест должен иметь возможность выявлять только клинически значимую концентрацию вируса или дифференцировать клинически значимую от незначимой, что существенным образом сказывается на специфичности исследования Основаниями для введения порога клинической значимости послужил ряд работ, указывающих на то, что вирусная нагрузка ниже определенного значения («порог значимости») не встречается в образцах тяжелой дисплазии и рака и ассоциирована с регрессией инфекции (клинически незначимое инфицирование). Нагрузка выше данного порога обозначается как клинически значимое инфицирование. Так же выделяется второй порог («порог прогрессии»). Вирусная нагрузка выше данного значения обозначается как повышенная и ассоциирована с большей вероятностью наличия или прогрессии в CIN2,3. На основании проведенных в ЦНИИ Эпидемиологии исследований и данных мировой литературы были определены и валидированы пороговые значения концентрации ВПЧ в образце: 3 логарифма (или 103) геномов ВПЧ на 100 тыс. клеток человека - порог клинической значимости, 5 логарифмов ВПЧ на 100 тыс. клеток – порог прогрессии. В ходе валидации показано, что введение порога клинической значимости позволяет более чем на 20% повысить диагностическую специфичность исследования, при сохранении диагностической чувствительности. Скрининговые тест-системы «АмплиСенс», работающие по принципу ПЦР в реальном времени (FRT), позволяют выявлять точное количество вируса и нормировать его на количество попавших в образец клеток человека, что нивелирует вариации результата, связанные с неадекватным забором материала. Все расчеты проводятся автоматически. Для тест-систем, использующих принцип электрофоретической детекции или детекции конечной флуоресценции (FEP) разработан и валидирован на клиническом материале алгоритм выявления только клинически значимой концентрации вируса основанный на разведении образца. • ^ Все тест-системы «АмплиСенс» для выявления ВПЧ высокого риска прошли валидацию на гистологически верифицированных клинических образцах с диагнозом В-ПИП/H-SIL и образцах от женщин без патологии шейки матки верифицированных как «норма» в двойных цитологических исследованиях. В ходе валидации были рассчитаны показатели диагностических чувствительности и специфичности по отношению к тяжелой дисплазии и РШМ (для тестов с введением порога клинической значимости).
* в зависимости от варианта ВПЧ-теста «АмплиСенс» чувствительность и специфичность незначительно варьирует • ^ ; Технологии флуоресцентной детекции по конечной точке и в реальном времени, используемые в тест-системах «АмплиСенс» (FEP и FRT) позволяют в значительной степени автоматизировать работу, минуя субъективный учет результатов электрофореграмм и получая результаты измерений непосредственно в компьютере. Пациенты и вид клинического материала для исследования на ДНК вируса папилломы человека высокого риска ^ Материалом для исследования служит соскоб цервикального канала и/или зоны трансформации, выполненный цервикальной цитологической щеточкой. Допускается взятие материала на цитологический и ВПЧ-тесты одной щеточкой: сначала делаются мазки-отпечатки, затем щеточка помещается в транспортную среду. При взятии материала щетку обламывают и сохраняют рабочую часть щетки в транспортной среде до доставки в лабораторию. Допускается использование универсального зонда для взятия материала из цервикального канала при невозможности использования цитологической щетки. Возможно исследование соскобов со слизистых половых органов, ротовой полости. Исследование вагинального содержимого или соскоба уретры менее информативно, чем цервикальных соскобов, потому практически не используется. Количественное исследование на ДНК ВПЧ валидировано и используется только для материала цервикального канала, при условии соблюдения всех правил взятия материала, сохранении щеточки в транспортной среде, использования сорбентных методов выделения ДНК (особенно актуально для полуколичественных методик на базе технологии детекции конечной флуоресценции FEP и электрофореза) ^ . Инфицированность мужчин ВПЧ сходна с инфицированностью женщин, но ввиду анатомических особенностей мужского уро-генитального тракта (отсутствие «зоны трансформации» эпителия) мужчины в большинстве случаев самостоятельно излечиваются или являются бессимптомными носителями инфекции. С учетом того, что: • опасность развития ассоциированной с ВПЧ онкологической патологии у мужчин не велика, а существующие формы рака не имеют 100% ассоциации с ВПЧ • более 70% женщин к 25 годам столкнулись и переболели папилломавирусной инфекцией того или иного генотипа и не могут быть повторно инфицированы теми же генотипами, то есть доля воприимчивых к ВПЧ женщин относительно мала. • инфицирование женщины не означает развитие клинических появлений инфекции так как высока вероятность самостоятельного излечения от вируса (около 80%) проводить скрининговое выявление папилломавирусной инфекции у мужчин не следует. Исследование возможно лишь по эпидемиологическим показаниям и при проведении дифференциальной диагностики клинической формы папилломавирусной инфекции с другими инфекционными и неифекционными патологиями. Следует помнить, что наличие ВПЧ у одного из партнеров при отсутствии ВПЧ у другого или несовпадение у партнеров спектра генотипов являются нормальным отражением биологии вируса и не могут говорить о супружеской неверности. Особенности биологии вируса, приводящие к несовпадению результатов: • Вероятность инфицирования ВПЧ восприимчивого лица при однократном половом контакте – 80%, при двукратном – 99% • вероятность полно самостоятельного излечения от ВПЧ в течение 9-15 месяцев – 80% • обычно у одного их партнеров происходит более быстрая элиминация вируса или при инфицировании пары несколькими генотипами у партнеров может происходить элиминация разных типов, что связано с различной реактивностью макроорганизмов • после самостоятельного излечения от ВПЧ определенного генотипа реинфицирование тем же генотипом не происходит. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям