Рыжих павел Геннадьевич оптимизация лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза на основе методов амплификации нуклеиновых кислот
|
|
Скачать 402.39 Kb.
|
|
На правах рукописи РЫЖИХ Павел Геннадьевич ОПТИМИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРИХОМОНИАЗА НА ОСНОВЕ МЕТОДОВ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ 14.03.10 – клиническая лабораторная диагностика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург – 2012 Работа выполнена в ФБУН Центральном научно-исследовательском институте эпидемиологии Роспотребнадзора. Научный руководитель: Кандидат биологических наук Гущин Александр Евгеньевич ^ Козлов Антон Владимирович – доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО Северо-западный государственный медицинский университет им. Мечникова Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра клинической лабораторной диагностики, заведующий ^ – доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ учебно-научный медицинский центр управления делами Президента Российской Федерации, кафедра дерматовенерологии, микологии и косметологии. ^ Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования Российская медицинская академия последипломного образования Министерства здравоохранения Российской Федерации. Защита диссертации состоится 22 января 2013 г. в 13-00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.08 при ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ (194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д.6). С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ Автореферат разослан «___» __________ 2012 года Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор МИТИН Юрий Алексеевич ^ Актуальность проблемы Урогенитальный трихомониаз (УТ) – широко распространенная инфекция, передаваемая половым путем, возбудителем которой является Trichomonas vaginalis – простейший одноклеточный микроорганизм, приспособившийся в процессе эволюции к паразитированию в органах мочеполовой системы человека. По данным официальной статистики, трихомониаз имеет наибольшую долю в структуре заболеваемости ИППП. В 2008 году его доля составила 38,9% из всех зарегистрированных случаев заболеваний инфекциями, передаваемыми половым путем (Иванова М.А., 2009). У женщин в воспалительный процесс могут вовлекаться вульва, влагалище, уретра, парауретральные протоки, шейка матки, матка и ее придатки, большие вестибулярные железы, мочевой пузырь, почечная лоханка; у мужчин – уретра, предстательная железа, семенные пузырьки, мочевой пузырь, почечные лоханки. Для трихомониаза, как и для других ИППП, в большинстве случаев характерно отсутствие специфических признаков заболевания, а у значительного числа пациентов инфекция протекает бессимптомно. Классический для трихомониаза “клубничный” симптом встречается только у 2% пациенток; пенистые выделения, которые можно связать с активным ростом трихомонад, наблюдаются только примерно у 12% инфицированных женщин (Fouts A.C., et al. 1980). Кроме того, часто трихомониаз сочетается с другими ИППП: гонореей, хламидиозом, микоплазмами, что объясняется общностью путей передачи инфекции (Щербакова Н.И., 1982; Делекторский В.В., 1985; Межевитинова, 1999). В связи с неспецифическими клиническими проявлениями диагноз трихомонадной инфекции основывается на результатах лабораторных методов исследования, которые включают микроскопические, культуральные, серологические и молекулярно-биологические. Согласно приказу Минздрава СССР № 1570 от 4 декабря 1986 г регламентированными методами диагностики трихомониаза считались микроскопия (нативного или окрашенного) препаратов и культуральное исследование. Несмотря на то, что приказом Минздрава РФ №398 от 23.12.2003 г приказ № 1570 от 4 декабря 1986 г. был признан не действующим, в нашей стране наиболее часто для диагностики трихомонадной инфекции используется метод микроскопии, что объясняется его относительно низкой стоимостью и быстротой исполнения (Фриго Н.В., с соавт., 2008). Тем не менее, данный метод недостаточно чувствителен и воспроизводим, субъективен и требует высокой квалификации исполнителя. Культуральный метод долгое время рассматривался в качестве «золотого стандарта» диагностики трихомонадной инфекции. Но его эффективность в значительной степени зависит от качества используемых питательных сред. Ограничивают его применение также большие сроки получения результата анализа, вплоть до 11-17 суток после посева, т.к. длительность цикла развития влагалищных трихомонад в культуре зависит от посевной дозы. Кроме того, культуральный метод имеет высокие требования к транспортировке и хранению клинического материала. В последние годы во всем мире в лабораторной диагностике различных инфекций, в том числе ИППП, все большее распространение стали получать методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), направленные на выявление специфических фрагментов ДНК или РНК возбудителей. Одним из наиболее распространенных МАНК является метод ПЦР. Преимуществами данного метода являются высокие аналитические и диагностические показатели чувствительности и специфичности, менее строгие требования к хранению и транспортировке клинического материала, короткие сроки исполнения, относительно невысокая стоимость анализа и его универсальность в отношении других урогенитальных инфекций. Согласно рекомендациям Центра по контролю и профилактике заболеваемости (CDC – Centers for Disease Control and Prevention) в связи с более высокой аналитической чувствительностью амплификационных методов верификацию их результатов следует проводить на основе альтернативных амплификационных тестов (CDC, 2002). В своей работе A.J. McAdam предложил требования, которым должен соответствовать дополнительный метод для решения вопросов, связанных с дискордантными результатами: аналитическая чувствительность дополнительного метода должна быть сопоставима с исследуемым методом; должна использоваться отличная мишень для амплификации; должен использоваться другой принцип амплификации (McAdam A.J., 2000). Одним из методов, соответствующих требованиям, предложенным McAdam, является метод определения рибосомальной РНК (рРНК) на основе реакции транскрипционной амплификации (Transcription-Mediated Amplification – TMA). На основе данного метода за рубежом применяется серийно выпускаемый тест для диагностики инфекции, вызванной T.vaginalis – APTIMA Trichomonas vaginalis Assay (Gen-Probe Inc., San Diego, CA). Данный тест имеет высокие показатели диагностической чувствительности не только по сравнению с методами микроскопии и микробиологического посева, но и в сравнении с ПЦР (Hardick A., et al., 2006; Nye M.B., et al., 2009; Andrea S.B., et al., 2011). Аналогом TMA является реакция транскрипционной амплификации НАСБА (Nucleic acid sequence-based amplification – NASBA). В работе Morre S.A. и соавт. на примере C.trachomatis была показана возможность с помощью метода НАСБА оценивать наличие жизнеспособных микроорганизмов в образце в процессе и после терапии (Morre S.A., et al., 1996). На сегодняшний день за рубежом предложено множество протоколов выявления ДНК T.vaginalis с помощью метода ПЦР (Riley D.E., et al., 1992; Kengne P., et al., 1994; Shaio M.F., et al., 1997; Madico G., et al., 1998; Mayta H., et al., 2000). Было показано, что диагностическая чувствительность ПЦР выше, чем у традиционных методов выявления T.vaginalis (микроскопия и культуральный посев), однако она варьировала в широких пределах (от 60 до 100%), а сами исследования проводили на различном биологическом материале (моча, вагинальное отделяемое, соскобы из уретры и цервикального канала), среди различных групп населения, полученном от мужчин и женщин. При этом аналитическая чувствительность в предложенных протоколах не была установлена. В свою очередь аналитические характеристики (аналитическая чувствительность и специфичность) определяют диагностические чувствительность и специфичность метода. Для повышения аналитической чувствительности метода необходимо выбрать оптимальную мишень, размер амплифицируемого фрагмента, программу амплификации и метод его детекции. Одной из причин, ограничивающих использование ПЦР в клинической лабораторной практике, является отсутствие в методиках образцов, которые бы контролировали проведение всего процесса ПЦР-исследования (от экстракции нуклеиновых кислот, до детекции продуктов амплификации) предотвращающих выдачу лабораторией ложноотрицательных и ложноположительных результатов исследования. На сегодняшний день отсутствуют нормативные документы, регламентирующие использование метода ПЦР при лабораторной диагностике конкретных нозологических форм, и нормативно-правовая база диагностики мочеполового трихомониаза, как таковая, отсутствует. Поэтому необходима разработка новых регламентирующих документов, которые, в свою очередь, должны базироваться на объективных данных об аналитических и диагностических характеристиках различных лабораторных методов. ^ Разработка стандартизованных методик лабораторной диагностики урогенитального трихомониаза на основе технологий ПЦР и НАСБА в реальном времени и обоснование необходимости их применения. ^
^ Впервые проведено сравнение аналитической чувствительности методов амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР и НАСБА) и рутинных методов диагностики трихомонадной инфекции (микроскопия нативного и окрашенного препаратов, микробиологический посев). Впервые в отечественной лабораторной практике разработана методика для выделения РНК T.vaginalis на основе реакции транскрипционной амплификации NASBA в режиме реального времени. Использование разработанной методики на основе ПЦР позволяет оптимизировать и повысить качество лабораторной диагностики трихомонадной инфекции. ^ Разработаны методики на основе высокочувствительных и специфичных методов амплификации нуклеиновых кислот, которые увеличивают эффективность диагностики трихомонадной инфекции. Методика НАСБА может быть использована как дополнительный высокочувствительный МАНК для решения вопросов, связанных с получением дискордантных результатов при совместном использовании метода ПЦР и традиционных методов выявления трихомонад (микроскопии и культурального посева). ^
^ На основе разработанных методик созданы наборы реагентов: «АмплиСенс Trichomonas vaginalis-FL», «АмплиСенс T.vaginalis-РИБОТЕСТ», которые зарегистрированы Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ и внесены в государственный реестр изделий медицинского назначения и медицинской техники. Разработанные методики применяются для диагностики урогенитального трихомониаза в более чем 800 лабораториях различных регионов Российской Федерации, ближнего и дальнего зарубежья. Материалы проведенных в ходе работы исследований входят в программу сертификационного цикла усовершенствования «ПЦР — диагностика инфекционных заболеваний» на базе ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора и НМАПО им. П.Л. Шупика МЗ Украины. ^ Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, протокол №10 от 1 ноября 2012 г. Основные положения диссертации были доложены на IХ Всероссийском съезде дерматовенерологов, 7-10 июня 2005 (г. Москва); Международной конференции «Фундаментальные науки – биотехнологии и медицине», 3-7 сентября 2006 (г. Новосибирск); Международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков» 19-20 мая 2006 (г. Алматы, Казахстан); 23rd IUSTI-Europe Conference on Sexually Transmitted Infections and HIV/AIDS, 11-14 октября 2007 (г. Дубровники, Хорватия); VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Генодиагностика инфекционных болезней - 2007» 28-30 ноября 2007 (г. Москва); 11th IUSTI World Congress, 9-12 ноября, 2009 (г. Кейптаун, Южная Африка); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика -2010», 24-26 ноября 2010 (г. Москва); 20th EADV Congress, 20-24 ноября 2011, (г. Лиссабон, Португалия); Всероссийской научной конференции «Фундаментальная медицина: от науки к технологиям», 15-16 декабря 2011 (г. Санкт-Петербург); XII Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов, 26-26 июня 2012 (г. Москва) Публикации По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ, в том числе 5 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. ^ Диссертация представлена на 154 страницах, включая 38 рисунков, 16 таблиц, список литературы и приложения. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов с выводами. Список использованной литературы включает 41 отечественных и 139 зарубежных источников. ^ Материалы и методы исследования Материалы: Оценку специфичности разработанных методик использовали штаммы и клинические изоляты из коллекции ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии следующих микроорганизмов: Trichomonas tenax, Trichomonas foetus, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, Gardnerella vaginalis, Atapobium vaginae, Candida albicans, Candida glabrata, Candida krusei, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Dientamoeba fragilis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Gardia intestinalis, Gardia lamblia, Haemophilus durcei, HSV 1,2, Pentatrichomonas hominis, Streptococcus agalactiae, Treponema pallidum. Исследовано 13376 биологических образцов (84% женщин и 16% мужчин) полученных от пациентов Центра молекулярной диагностики при ФБУН ЦНИИ эпидемиологии. Для проведения исследования по определению диагностической эффективности методов микроскопии и культурального посева мы использовали биологический материал от 199 женщин и 11 мужчин, у которых была обнаружена ДНК T.vaginalis. Молекулярно-биологическое исследование (ПЦР и НАСБА) биологического материала включает три последовательных технологически связанных между собой этапа: экстракцию и очистку нуклеиновых кислот, собственно постановку и проведение реакции амплификации и детекцию продуктов амплификации. Для экстракции ДНК и РНК T.vaginalis из биологического материала и культуры клеток, использовали серийно выпускаемые наборы реагентов ДНК-Сорб-АМ (производства ФБУН ЦНИИ эпидемиологии, Роспотребнадзора – № ФСР 2007/00183 от 13 июля 2009г) и NucliSens Isolation Reagents (Биомерье, Франция) соответственно. Наборы реагентов основаны на модифицированной методике аффинной сорбции на силикагелевом сорбенте по Boom R. (Boom R., et al., 1990). В результате процедуры экстракции получается высокоочищенный препарат нуклеиновых кислот, свободный от ингибиторов реакции амплификации. Экстракцию проводили согласно инструкциям производителей. Для проведения дизайна праймеров и зондов были выполнены множественные выравнивания и сравнительный анализ фрагментов генов у широкого спектра микроорганизмов, полученных из компьютерной базы данных Национального центра биотехнологической информации GenBank (NCBI - The National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.nih.gov). Анализ последовательностей и выбор области посадки праймеров проводили с помощью компонента AlignX программного пакета Vector NTI Advance 11.0. Выбор праймеров (оценку наличия или отсутствия праймеров димеров, образования петель, температуру плавления и т.д.) оценивали с помощью компонента Primer Select v.4.03 программного пакета DNAStar. Специфичность выбранных праймеров и зондов проверялась с использованием поисковой программы для нуклеотидных и белковых последовательностей BLAST Национального центра биотехнологической информации (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Олигонуклеотиды были синтезированы на автоматизированном олигонуклеотидном синтезаторе АСМ-1000 по амидофосфитной схеме согласно рекомендациям производителя. Очистку праймеров флуоресцентно-меченных зондов проводили методом гель-электрофореза и обращено-фазовой ВЭЖХ. Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием процедуры «горячего старта». Детекцию продуктов амплификации проводили с помощью электрофореза и гибридизационно-флуоресцентного анализа. Для проведения ПЦР с электрофоретической детекцией использовали амплификатор Терцик («ДНК-технология», Россия). Для проведения ПЦР в реальном времени – RotorGene 6000 («Corbett Research», Австралия). При разработке методики НАСБА для выявления T.vaginalis мы использовали «Базовый набор «NucliSens» («bioMerieux», Франция) включающий в себя комплект реагентов для экстракции РНК из клинического материала (лизирующий раствор, отмывочный раствор, сорбент Silica и элюирующий буфер) и комплект реагентов для проведения амплификации (солевые компоненты, дНТФ, комплекс ферментов в виде лиофилизированной гранулы с AMV- обратной транскриптазой, Т7 РНК-полимеразой, РНКазой Н и необходимые для их растворения компоненты). Реакцию амплификации НАСБА проводили на анализаторе «NucliSens EasyQ» («bioMerieux», Франция) и на приборе RotorGene 6000 («Corbett Research», Австралия). Для получения РНК-защищенных контролей (ms2-фагов) проводили клонирование целевых фрагментов ДНК в экспрессирующие плазмидные вектора, содержащие регуляторные элементы бактериофага Т7 и необходимые структурно-функциональные элементы ms2-фага по сайтам рестрикции BamHI и KpnI. Экспрессия РНК, содержащей данные конструкты и упаковка в фаговые частицы в составе генома ms2-фага происходила после трансформации плазмидным вектором соответствующего штамма E.coli (Sambrook J., et al., 2001). Каждый из полученных рекомбинантных векторов с клонированным участком содержал фрагмент гена gag ВИЧ, что позволило измерить концентрацию РНК с использованием количественного набора «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor» версии 1.5 фирмы Хоффманн-Ла Рош (Швейцария). Для получения ДНК-защищенных контролей (лямбда фагов) проводили клонирование целевого фрагмента ДНК в вектор λgt10 по сайту рестрикции EcoRI. Копийность клонированного препарата ДНК оценивали методом лимитирующих разведений с использованием программы Quality (Rodrigo A.G., et al., 1997). Микроскопическое исследование на T.vaginalis проводили двумя методами – микроскопией нативного препарата и микроскопией фиксированного препарата, окрашенного способом Романовского-Гимзе. Процедуры выполнялись согласно установленным в лабораторной практике протоколам, в соответствие с методическими рекомендациями (Соколовский Е.В., и соавт., 2010). Для проведения культурального исследования использовали питательную среду СВТ (НИИЭМ имени Пастера, СПб), среду питательную для выделения трихомонад (ООО НПО Диагност-Мед, Омск), основу агара Трихомонас (Himedia, Индия). Все среды готовили и использовали в соответствии с инструкцией производителей. Так же в исследование была включена среда СВТ с добавлением суспензии клеточной культуры L-41, поддерживаемая постоянными пассажами на многокомпонентных питательных средах 199 и 2МЕМ в соотношении 1:1 (ФГУП «ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН», Москва). Для подсчета клеток трихомонад использовали камеру Горяева (Слюсаренко Т.П., 1984). Для проведения реакции циклического секвенирования были использованы наборы реагентов фирмы Applied Biosystems (США): Big Dye ® Terminator v1.1 Sequencing Standard Kit. Разделение меченых фрагментов ДНК осуществляли с помощью автоматического секвенатора Applied Biosystems ABI Prism 3100. Статистическую обработку полученных результатов осуществляли с помощью программы SPSS 11.5 for Windows. Вычисляли следующие параметры: коэффициент корреляции Спирмена, коэффициент вариации, коэффициент регрессии. Количественные показатели представлены в виде среднего и ее стандартной ошибки, медианы. Для графического представления был использован программный пакет Microsoft Office Excel. ^ Разработка методики выявления ДНК T.vaginalis на основе метода ПЦР в реальном времениНа сегодняшний день, за рубежом, существует большое количество так называемых «in house» ПЦР методик, направленных на выявление ДНК T.vaginalis, каждая из которых имеет свои недостатки, затрудняющие их использование в клинической лабораторной диагностике. Для одних методик характерна большая длина амплифицируемого фрагмента, для других – недостаточное число циклов амплификации, для всех методик характерно отсутствие горячего старта и отсутствие ВКО для исключения ложноотрицательных результатов исследования. В главе 3 диссертации описана разработка методики с высокими показателями аналитической чувствительности и специфичности, в которой мы учли все недостатки перечисленные выше. На первом этапе нами был выполнен поиск генов-мишеней для проведения амплификации, удовлетворяющих следующим условиям: присутствие в данном гене консервативных участков, не подверженных мутагенезу, а также уникальность структуры данной последовательности ДНК в отношении T.vaginalis, не встречающаяся в клетках других организмов. В результате проведенного анализа в качестве мишени нами были выбраны повторяющиеся генетические элементы ДНК в геноме T.vaginalis (Trichomonas vaginalis repeated DNA target for PCR identification, GenBank: L23861), использование которых в качестве мишени в методиках, предложенных за рубежом, позволило добиться высокой диагностической чувствительности. Кроме того, данная мишень высокоспецифична для влагалищной трихомонады, и не обнаружена в геномах других простейших, включая близкородственные виды трихомонад – T.tenax, T.gallinae и Pentatrichomonas hominis (Paces J., et al., 1992). Проведя анализ последовательности были выбраны области гибридизации праймеров и специфического флуоресцентно-меченного зонда (ФМ-зонда). Выбранные праймеры (TvG1/TvG2) и специфический ФМ-зонд (Tv-12М) комплементарны геномной ДНК всех представителей вида T.vaginalis. Длина мишень-специфической области праймеров TvG1 и TvG2 составила 27 и 26 оснований соответственно. GC состав праймеров TvG1 и TvG2 составил 45% и 50% соответственно. Размер фрагмента, фланкированного парой праймеров TvG1 и TvG2 составил 237 п.о.. При проведении оптимизации условий для повышения выхода ПЦР продукта число циклов программы амплификации было выбрано равным 45 при температуре отжига равной 600С. Для предотвращения появления неспецифических продуктов реакции амплификации использовали методику «горячего старта». Детекция продуктов амплификации в разрабатываемой методике происходила непосредственно в процессе реакции в режиме реального времени. Для ПЦР в реальном времени помимо праймеров в ПЦР-смесь добавляются ФМ-зонды, которые при появлении специфического продукта амплификации гибридизуются с ним, вызывая увеличение уровня флуоресцентного сигнала. Для эффективной и специфичной работы зонда его температура плавления должна быть на 5-10 градусов выше, чем температура плавления праймеров (Livak K.J, et al., 1995). Для разработанного нами ФМ-зонда Tv-12M характерна высокая температура плавления и наличие вторичной структуры при которой флуорофор находиться в непосредственной близости к гасителю, что позволяет увеличить специфичность методики, а также ее запас прочности (рисунок 1). Длина мишень-специфической области 26 оснований, GC состав – 58,6%, расчетная температура плавления зонда Tv-12M составляет 670С и превышает температуру плавления праймеров TvG1 и TvG2 на 9 и 7 градуса соответственно. На 5`-конце присутствует флуорогенная молекула Fam, а 3`-конец ковалентно связан с гасителем BHQ1. Для стандартизации всех этапов молекулярно-биологического исследования и для достижения высокого качества метода в условиях клинико-диагностической лаборатории необходимо использование контрольных образцов. Их разработка, подбор рабочих концентраций и условий испльзования является необходимой процедурой для корректной работы методики. В отличие от методик, предложенных за рубежом (Riley D.E., et al., 1992; Kengne P., et al., 1994; Shaio M.F., et al., 1997; Madico G., et al., 1998; Mayta H., et al., 2000) и методики, представленной в работе Мустафиной Г.Р. (Мустафина Г.Р., 2010), в разработанной нами методике используются несколько контрольных образцов и реакций, таких как ВКО, ПКО, «К-» и «К+», позволяющих использовать ее в клинико-диагностических лабораториях. Данные образцы и реакции позволяют контролировать каждый из этапов ПЦР-исследования – от экстракции нуклеиновых кислот до анализа результатов, что способствует достижению максимальной достоверности анализа. Для контроля реакции амплификации нами был разработан положительный контрольный образце (ПКО), который, после определения его концентрации, мы использовали для оценки аналитической чувствительности методики, которую проводили на двукратных разведениях полученного препарата в 10 повторах каждое (таблица 1). Аналитическая чувствительность методики на полученном препарате ПКО составила 5х102 коп/мл. Проверку аналитической специфичности методики проводили на штаммах и клинических изолятах из коллекции ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии. Перекрестных реакций с другими микроорганизмами, получено не было.  Рис. 1 Структура ФМ-зонда Tv-12M Таблица 1 Определение аналитической чувствительности ПЦР с использованием рекомбинантного препарата ДНК ПКО T.vaginalis
Для контроля эффективности экстракции ДНК и возможного ингибирования реакции ПЦР в методике используется универсальный неконкурентный внутренний контрольный образец (ВКО) размером 230 п.о. (раствор фаговых частиц бактериофага лямбда GT67, содержащих клонированную генно-инженерную конструкцию с искусственной нуклеотидной последовательностью, негомологичной известным микроорганизмам и вирусам), который добавляется в каждый образец при экстракции нуклеиновых кислот, что позволяет контролировать все этапы ПЦР анализа. ^ В качестве альтернативного МАНК для диагностики T.vaginalis была выбрана реакция транскрипционной амплификации НАСБА, направленная на выявление РНК T.vaginalis. Для данной реакции показана большая аналитическая чувствительность в сравнении с ПЦР для выявления C.trachomatis в связи с выбором в качестве мишени 16S рРНК (Chan A.B., et al., 1999; Morré S.A., et al., 1999). Разработка методики проводилась на основе «Базового набора «NucliSens» («bioMerieux», Франция). Первая задача, которую нам необходимо было решить – это выбор подходящей мишени для амплификации. Основным обстоятельством для выбора в качестве мишени именно 18S рРНК послужило то, что в клетке содержится не менее 10 тыс. молекул рРНК. В прокариотических клетках (например, E.coli) содержится порядка 20 тыс. молекул рРНК (Lewin B., 1997), в то время как в эукариотических клетках, к которым относиться T.vaginalis, их может быть значительно больше. Данная особенность выбранной мишени дает возможность добиться высокой аналитической чувствительности у разрабатываемой методики. Вторым обстоятельством является то, что РНК является менее стабильным материалом и быстрее разрушается. Это дает предпосылки для использования РНК в качестве маркера для контроля эффективности проведенной терапии (Morre S.A., et al., 1996; McKillip J.L., et al., 1998). Для разработки специфических праймеров и ФМ-зонда был проведен сравнительный анализ генов 18S рРНК у широкого спектра микроорганизмов, включая представителей семейства Trichomonadidae, на основе информации GenBank и определен участок высокоспецифичный для T.vaginalis. «Прямой» праймер для реакции НАСБА имел характерную особенность: 5`-концом праймера TvNSB-2-T7 являлась последовательность промотора в виде полимеразы Т7 РНК, которая состояла из 25 нуклеотидов, необходимых для работы РНКазы Н, участвующей в реакции НАСБА. За последовательностью промотора Т7 РНК следовала цепь нуклеотидов, которая комплементарна последовательности РНК-мишени, имела длину в 21 основание, содержала GC в объеме 47,6%. «Обратный» праймер TvNSB-2R идентичен последовательности РНК-мишени, имел длину 22 основания, содержал GC в объеме 50%. Длина последовательности амплифицируемой РНК-мишени, фланкированной выбранными нами праймерами TvNSB-2-T7 и TvNSB-2R, составила 174 п.о. Детекция продуктов амплификации НАСБА, по аналогии с ПЦР, происходила в режиме реального времени. В реакции НАСБА используется формат ФМ-зондов «molecular beacons», так называемые «молекулярные маячки» (ММ), которые добавляются в амплификационную смесь вместе с праймерами. ММ состоит из последовательности зонда с двумя короткими фланкирующими последовательностями, комплементарными друг другу (arm-последовательности). На 5`-конце присутствует флуорогенная молекула, тогда как 3`-конец ковалентно связан с гасителем (рис 2) (Tyagi S., et al., 1996). В реакции NASBA обе комплементарные arm-последовательности гибридизируются и придают ММ форму, при которой гаситель находится в непосредственной близости к флуорофору и поглощает испускаемое флуорофором свечение. В присутствии мишени внутренняя последовательность ММ, образующая петлю, гибридизуется с ней, зонд «раскрывается», в результате чего флуорофор и гаситель удаляются друг от друга, а испускаемый флуорофором свет регистрируется прибором. Преимуществом ММ является то, что они способны дифференцировать отличия между мишенями отличающихся только одним нуклеотидом (Bonnet G., et al., 1999). Одно из главных условий, которое должно соблюдаться при выборе ММ – это отсутствие любых дополнительных вторичных структур. Для исследования возможности появления вторичной структуры, определения свободной энергии (ΔG) и температуры плавления вновь образованного ММ мы использовали программу для работы со свернутыми ДНК Mfold (Zuker M., 2003). Свободная энергия (ΔG) должна быть в пределах от -2,5 до -4,5 и температура плавления шпильки должна быть равной 60-70оС. Таким образом, в гетерологической области гена 18S рРНК нами была выбрана последовательность GGACTGCGAGCCTGAGAGG, которая может быть использована для конструирования ММ (рисунок 3):  Рис 2. Схема последовательности «молекулярного маячка».  Рис. 3 Последовательность, находящаяся в гетерологической области фрагмента гена 18S рРНК для конструирования ММ. Для выбранной последовательности был сконструирован ММ TvNSB-Z3 (рисунок 4) не имеющий других вторичных структур кроме заданной, с ΔG –3,9 и Tm=66,8оС. На 5`-конце зонда присутствует флуорогенная молекула Fam, а на 3`-конец ковалентно связан с гасителем BHQ1. Оценку эффективности работы методики и подбор условий амплификации проводили на рекомбинантном препарате РНК T.vaginalis, который включал в себя фрагмент гена 18S рРНК фланкированный праймерами TvNSB–2R/TvNSB-2-T7. Установленный согласно рекомендуемым протоколам порог положительного результата разработанной методики составил 1,2 у.е. флуоресценции. В нашем исследовании мы добились 3-5 кратного превышения порогового уровня флуоресцентного сигнала на низких концентрациях мишени (Таблица 2). Для стандартизации условий лабораторного исследовании с использованием реакции транскрипционной амплификации НАСБА в разработанной нами методике, по аналогии с ПЦР, используются несколько контрольных образцов и реакций, таких как ВКО, ПКО, «К-» и «К+», позволяющих использовать ее в клинико-диагностических лабораториях.  Рис. 4. Схема ФМ зонда TvNSB-Z3 Таблица 2. Проверка эффективности методики с выбранными праймерами и ММ на рекомбинантном препарате РНК фрагмента гена 18S рРНК T.vaginalis в различных концентрациях (в у.е. флуоресценции)
В разрабатываемом наборе реагентов мы использовали экзогенный конкурентный ВКО, который представляет собой молекулу РНК, фланкированную сегментами, специфичными к 18S рРНК T.vaginalis и доступными для распознавания праймерами, применяемыми для амплификации РНК данного возбудителя. Т.е. ВКО амплифицируется с теми же праймерами, которые используются для амплификации РНК-мишени в одной реакции амплификации. В ходе детекции ампликоны ВКО отделяются от ампликонов РНК-мишени с помощью ММ, который гибридизуется на область, не являющуюся частью РНК-мишени. Разработанный нами ВКО РНК T.vaginalis представляет собой генно-инженерный продукт. В качестве матрицы для наработки ампликона для клонирования использовали конструкт (рисунок 5) из олигонуклеотидов, два из которых содержали сайты рестрикции BamH1 и KpnI, необходимые для последующего клонирования. Особенностью данного конструкта является то, что гибридизационная область ФМ-зонда ICNSBNG-Z уникальна, т.е. изменена нами таким образом, чтобы не быть комплементарной последовательности 18S рРНК T.vaginalis, а также другим нуклеотидным последовательностям, опубликованным в GenBank. Зонд ICNSBNG-Z имеет длину 27 оснований, GC состав 45%, отсутствуют вторичные структуры, кроме заданной, расчетное значение свободной энергии ∆G полученной структуры равно -2.8, и температура плавления шпильки 61оС. На 5`-конце зонда присутствует флуорогенная молекула Rox, а 3`-конец ковалентно связан с гасителем BHQ2 (рисунок 6).  Рис. 5 Схема генно-инженерного конструкта РНК ВКО. F – флуорофор, Q – гаситель.  Рис. 6 Структура ФМ-зонда ICNSBNG-Z для детекции ВКО Оценку аналитической чувствительности методики НАСБА проводили на двукратных разведениях рекомбинантного препарата РНК T.vaginalis, которая составила 50-100 копий для РНК ПКО (таблица 3). Далее, мы проводили оценку степени конкуренции в процессе ко-амплификации фрагментов ПКО и ВКО (моделирование положительного клинического образца с низким содержанием возбудителя). Было установлено, что при минимальном содержании РНК ПКО T.vaginalis в образце, равном 100 копий в реакцию (1×105 коп/мл), конкуренция отсутствует при содержании РНК ВКО в количестве 100-300 копий в реакцию (1-3×105 коп/мл). Вследствие этого рабочую концентрацию ВКО, добавляемую при экстракции, мы определили равной 1×105 коп/мл. Проверку аналитической специфичности методики проводили на штаммах и клинических изолятах из коллекции ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии. Перекрестных реакций с другими микроорганизмами, получено не было. Таблица 3 Определение аналитической чувствительности реакции НАСБА с использованием рекомбинантного препарата РНК ПКО T.vaginalis
В разработанной методике в качестве положительного контроля мы использовали фрагмент гена 18S рРНК клонированный в λ-фаг и содержащий T7 промотор. Т.е. данный ПКО представляет собой промежуточный продукт реакции НАСБА – кДНК с двуспиральной областью Т7-промотора, необходимой Т7 РНК-полимеразе для производства транскриптов РНК, которые выступают в качестве матрицы для дальнейшей амплификации. Таким образом, нами была разработана методика, основанная на технологии НАСБА в реальном времени, содержащая одну пару праймеров и 2 ММ – для выявления РНК T.vaginalis и РНК ВКО. Зонд для детекции продукта амплификации T.vaginalis на 5`-конце содержит флуоресцентный краситель FAM, а для детекции ВКО использовали зонд, содержащий краситель ROX. Для контроля всех этапов проведения анализа помимо отрицательных контролей выделения и амплификации были разработаны рекомбинантные препараты ДНК ПКО, содержащий Т7-промотор, и РНК ВКО. ^ Важнейшей характеристикой лабораторного метода является диагностическая чувствительность (ДЧ) – показатель, отражающий долю случаев выявленной инфекции среди обследованных инфицированных лиц. ДЧ в свою очередь в значительной степени определяется аналитической чувствительностью метода минимальным количеством возбудителя, обнаруживаемым лабораторным тестом. Чем выше аналитическая чувствительность методики, тем выше его ДЧ. Для более полного и объективного представления о возможностях тех или иных лабораторных методов следует иметь их количественно охарактеризованные аналитические характеристики. ^ В исследовании использовали эталонный штамм T.vaginalis B-7140 из государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск». Штамм поддерживался постоянными пассажами на свежей питательной среде СВТ. Для эксперимента использовали культуру клеток T.vaginalis, находящуюся в логарифмической фазе роста и при микроскопическом исследовании которой, в среде обнаруживались только подвижные клетки классической морфологии. Концентрацию трихомонад в культуре определяли методом прямого подсчета клеток в камере Горяева. Далее из полученной суспензии клеток готовили последовательные десятикратные разведения таким образом, чтобы расчетное количество простейших в последней пробирке было менее одной клетки на 1 мл физиологического раствора, а общий объем каждого разведения составил 2мл. Из каждого разведения брались аликвоты, которые параллельно исследовали с помощью микроскопии (нативного и окрашенного препарата), культурального посева и методиками на основе ПЦР и НАСБА согласно установленным для каждого из них протоколам (n=3). Схема эксперимента представлена на рисунке 7.  Рис. 7 Схема модельного эксперимента по установлению аналитической чувствительности методов выявления T.vaginalis При проведении микроскопического исследования на T.vaginalis исходные препараты клеточной суспензии и первое разведение просматривали в 10 полях зрения. Для последующих разведений, вследствие уменьшения количества трихомонад, проводили просмотр 100 полей зрения. При культуральном исследовании учет результатов проводили через 48 часов для малых разведений (1,45х106 и 1,4х105 кл/мл), через 96 ч для больших разведений (1,45х104 и 1,4х103 кл/мл) и через 168 ч – для сверх больших разведений (1,45х102 и меньше кл/мл). Определение ДНК и РНК T.vaginalis проводили методами ПЦР и НАСБА согласно разработанным методикам. Оценивая результаты двух методик микроскопии, следует отметить, что при высокой (более 106 в 1 мл) концентрации клеток T.vaginalis в исходном образце обеими методиками было выявлено достаточное содержание клеток в каждом поле зрения микроскопа и для интерпретации результатов достаточно было анализа не более 10 полей зрения. При микроскопическом исследовании аликвот из разведения с концентрацией 105 кл/мл приходилось просматривать гораздо больше полей зрения, и не в каждом из них обнаруживались клетки трихомонад. Разведение клеточной суспензии до 104 кл/мл привело к тому, что при анализе 100 полей зрения было обнаружено всего несколько клеток простейшего при микроскопии нативного препарата. Таким образом, установленной нами аналитической чувствительностью микроскопического метода в условиях чистой культуры T.vaginalis, следует считать значение более 105 кл/мл, а при исследовании биологического материала от пациентов эта величина может быть больше. При проведении культурального исследования нами были получены следующие результаты: при высокой концентрации клеток простейших в разведении (более 105 кл/мл) после 2 суток инкубации на исследованных питательных средах во всех полях зрения микроскопа было зафиксировано более 200 клеток трихомонад. При уменьшении концентрации клеток простейших в разведении до 104 кл/мл через 4 суток культивирования на питательных средах были выявлены единичные подвижные клетки T.vaginalis не в каждом поле зрения микроскопа. При содержании простейших в исследуемом разведении 103 кл/мл, было зафиксировано не более 1 клетки не в каждом поле зрения микроскопа только для среды СВТ через 4 суток культивирования. Дальнейшая инкубация образцов не приводила к увеличению содержания клеток, и через 7 суток от начала культивирования. При культивировании на питательной среде СВТ+L-41, даже если концентрация клеток простейших в разведении составляла 102 кл/мл, в каждом поле зрения микроскопа насчитывалось свыше 200 простейших. Минимальная концентрация простейших в разведении, при которой наблюдался рост на среде СВТ+L-41, составила 14 кл/мл. Таким образом, установленная нами аналитическая чувствительность культурального метода с использованием серийно производимых сред составила более 104 кл/мл, а при культивировании T.vaginalis в питательной среде СВТ в присутствии клеточной линии L-41 аналитическая чувствительность составила не менее 14 кл/мл. При исследовании с использованием методик на основе ПЦР и НАСБА в реальном времени были получены такие же значения аналитической чувствительности, что и для питательной среды СВТ в присутствии клеточной линии L-41 – воспроизводимое при троекратных тестированиях обнаружение ДНК и РНК T.vaginalis, которая составила не менее 14 кл/мл. В результате проведенного исследования было установлено, что среди методов выявления T.vaginalis, наибольшей аналитической чувствительностью обладают методы амплификации нуклеиновых кислот ПЦР и НАСБА, а наименьшей аналитической чувствительность – микроскопические методы. Аналитическая чувствительность культурального метода с использованием бесклеточных питательных сред была выше, чем у метода микроскопии, но уступала методам амплификации ДНК и РНК. При использовании питательной среды с добавлением клеточной линии L-41 аналитическая чувствительность составила не менее 14 кл/мл, что соответствует чувствительности методов ПЦР и NASBA. Таблица 4 Результаты выявления T.vaginalis разными методами в разведениях культуры
^ На сегодняшний день в РФ для выявления T.vaginalis в биологическом материале из урогенитального тракта отсутствуют нормативные документы, регламентирующие использование МАНК при лабораторной диагностике трихомониаза. По данным зарубежных исследователей диагностика трихомониаза с помощью ПЦР обладает высокой диагностической чувствительностью (93-98,7%) по сравнению и с микроскопией (50-64,9%), и с культуральным методом (73-89,2%) (Ryu J.S., et al., 1999; Nye M.B., et al., 2009; Shaio M.F., et al., 1997). Но в нашей стране метод ПЦР для установления диагноза трихомониаза применяется реже других методов лабораторной диагностики, и микроскопическое исследование является преобладающим методом при установлении диагноза трихомониаза (Фриго Н.В., и соавт., 2008). Вследствие этого, мы решили определить диагностическую эффективность методов микроскопии и культурального посева на основе установленных нами значений их аналитической чувствительности. Для определения концентрации T.vaginalis в биологическом материале нами была разработана методика количественного определения возбудителя в образце методом ПЦР в реальном времени. Вследствие того, что для получения нуклеиновых кислот, необходимых для проведения ПЦР-исследования, мы используем сорбентный метод экстракции, все примеси, характерные для клинического материала, из раствора вымываются и не оказывают влияние на конечный результат (Boom R., et al., 1990). Поэтому данная методика может использоваться для определения концентрации T.vaginalis в биологическом материале, полученном от пациентов. В качестве мишени для ПЦР амплификации нами был выбран ген Ca2+ АТФазы (Meade J.C., et al., 1997), который представлен в геноме T.vaginalis в 1 копии. Благодаря однокопийности мишени становится возможным определение концентрации T.vaginalis в исследуемом материале с учетом 1 копия = 1 ГЭ = 1 клетка. Фрагмент, размером 186 п.о., фланкированный выбранными праймерами TVCA-1 и TVCA-2 и включающий в себя область ФМ-зонда TVCA-Z был клонирован в λ фаг – λ-gt10 для последующего создания ДНК-стандартов. ДНК стандарты готовили путем разведения данного рекомбинантного препарата ДНК. В методике используются три количественно охарактеризованных ДНК стандарта, добавляемых в каждую реакцию амплификации, что позволяет построить по ним калибровочную прямую и определить концентрацию возбудителя в каждом исследуемом образце. При сравнении на разведениях клеточной культуры методики количественного определения возбудителя в образце методом ПЦР в реальном времени (ГЭ/мл) с методикой прямого подсчета клеток в камере Горяева (кл/мл) было получено почти полное совпадение значений концентраций (рисунок 8). Полученные результаты позволяют нам соотносить значения аналитической чувствительности выраженные в кл/мл со значениями, выраженными в ГЭ/мл.  Рис. 8 Графическое представление сопоставления значений концентраций T.vaginalis полученных при использовании двух количественных методик Для проведения исследования по определению диагностической эффективности методов микроскопии и культурального посева нами было исследовано 13376 биологических образцов, из которых у 210 (199 женщин и 11 мужчин) была обнаружена ДНК T.vaginalis с помощью разработанной нами методики ПЦР в качественном формате на повторяющиеся генетические элементы ДНК T.vaginalis. В каждом из образцов мы определяли концентрацию трихомонад с помощью разработанной нами методики количественного определения ДНК T.vaginalis с помощью ПЦР в реальном времени. В проведенном ранее исследовании мы установили значения аналитической чувствительности лабораторных методов выявления T.vaginalis, которые составили: для микроскопии – 105 ГЭ/мл, для культурального посева с использованием бесклеточных питательных сред – 104 ГЭ/мл и для методов амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР и НАСБА) с использованием разработанных нами методик 14 ГЭ/мл. Результаты проведенного нами количественного исследования показали, что концентрация ДНК T.vaginalis в биологическом материале, полученном от пациентов, варьирует от 100 до 2,8×107 ГЭ/мл. Медиана концентрации составила 1,9×104 ГЭ/мл. При этом в 57,1% образцов концентрация ДНК T.vaginalis составила менее 105 ГЭ/мл (что соответствует значению аналитической чувствительности микроскопического метода, рис. 9А); в 39,5% — менее 104 ГЭ/мл (значение аналитической чувствительности культурального метода, рис. 9Б). Более низкая концентрация возбудителя у ряда пациентов при трихомониазе может быть причиной также более низкой диагностической чувствительности методов микроскопии и культурального посева. С учетом значений аналитической чувствительности разных методов лабораторной диагностики трихомониаза установлено, что при использовании разработанных методик на основе МАНК T.vaginalis выявляется дополнительно в 57,1% и 39,5% биологических образцов, в которых концентрация возбудителя достоверно ниже, чем аналитическая чувствительность микроскопического и культурального методов соответственно.  Рис. 9 Распределение значений концентраций ДНК T.vaginalis в биологических образцах (n=210) и оценка диагностической эффективности традиционных методов исходя из значений их аналитической чувствительности: А) Метода микроскопии (МС); Б) Культурального метода (КМ). ВЫВОДЫ
^
^
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям