Иммунологические и молекулярно-биологические
|
|
Скачать 438.1 Kb.
|
|
На правах рукописи ЗОТОВА Мария Александровна ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ПЕРСИСТИРУЮЩЕГО ТЕЧЕНИЯ ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Челябинск – 2011 Работа выполнена в Научно-исследовательском институте иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». ^
^
^ НИИ экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г.Пермь Защита состоится «30» июня 2011 года в ______ часов на заседании диссертационного совета Д 208. 117. 03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Автореферат разослан « » ___________ 2011г. ^ диссертационного совета, доктор медицинских наук Латюшина Л.С. Общая характеристика работы Актуальность исследования. На сегодняшний день папилломавирусная инфекция (ПВИ) является актуальной социально-значимой проблемой. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) число инфицированных за последние десять лет увеличилось более чем в 10 раз, достигнув 23,5% [Белокриницкая Т.Е. и др., 2005; Козаченко В.П. и др., 2009]. Чрезвычайно важной представляется проблема ПВИ в связи с онкогенным потенциалом вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого риска, который признан этиологическим агентом рака шейки матки (РШМ) [WHO, 2006]. Несмотря на высокую распространенность и онкогенный потенциал ВПЧ, высокий процент самопроизвольного регресса ПВИ свидетельствуют о том, что инфицирование является необходимым, но недостаточным условием для возникновения РШМ. По данным литературы, главным фактором риска развития неопластической патологии является персистенция онкогенных типов ВПЧ [Кузнецова Ю.Н. и др., 2009; Manavi M. et al., 2008; Castle P.E., 2009; Carcopino X. et al., 2011]. Считается, что канцерогенез является следствием “персистентных инфекций ВПЧ высокого риска” продолжительностью более 6 месяцев [Современные подходы…, 2009; Вакцины для профилактики…, 2011; Woodman C.B. et al., 2007; Koshiol J. et al., 2008; Bhat P. et al., 2011]. Тем не менее, понятие “персистирующая инфекция” – это только условное определение и не включает никакого функционального критерия, который бы опирался на молекулярные события, необходимые для развития канцерогенеза, вызванного ВПЧ. И хотя в настоящее время данный термин широко используется, крайне необходимо дифференцировать клинически значимые фазы течения инфекций ВПЧ высокого риска на основе молекулярных показателей [Doeberitz M. K., 2009]. Большую важность приобретают исследования, направленные на поиск вирусологических маркеров, ответственных за развитие персистирующего течения. В настоящее время, в качестве таких вирусологических факторов рассматриваются инфекция, вызванная онкогенными типами ВПЧ, а также несколькими типами вируса одновременно, высокая вирусная нагрузка, повышенная экспрессия онкобелков Е6 и Е7 ВПЧ, сверхэкспрессия циклин-зависимых киназ p16INK4a и другие [Мынбаев О.А. и др., 2009; Вакцины для профилактики…, 2011]. Клинические наблюдения, а также данные экспериментальных исследований свидетельствуют о ведущей роли иммунной системы в контроле возникновения, течения и исхода ПВИ [Баткаев Э.А., Рюмин Д.В., 2003, Роговская С.И., 2005; Stanley M., 2006]. Поскольку ВПЧ эпителиотропен, особо важное значение имеет состояние факторов местной защиты органов репродуктивного тракта. Несмотря на многочисленные исследования роли местного иммунитета в защите от ВПЧ, недостаточно изучены механизмы действия клеточных и гуморальных компонентов мукозального иммунитета на формирование персистенции данного вируса. Учитывая тот факт, что персистенция ВПЧ высокого риска является ключевым событием в малигнизации клеток, изучение факторов, инициирующих этот процесс, и, следовательно, способствующих реализации онкогенного потенциала ВПЧ определяет актуальность настоящего исследования. ^ Установление иммунологических, молекулярно-биологических особенностей транзиторного и персистирующего течения папилломавирусной инфекции и выявление маркеров персистенции вируса папилломы человека высокого риска. ^
^ Впервые установлен широкий спектр генотипов ВПЧ высокого риска при транзиторном и персистирующем течении ПВИ длительностью 6 и 12 месяцев. Показано преобладание ВПЧ 16 типа независимо от течения и длительности ПВИ. Впервые установлено, что транзиторное течение ассоциировано с ВПЧ 52 типа и инфицированием 1 типом вируса. Персистирующее течение ПВИ характеризуется высокой частотой встречаемости микстинфекции ВПЧ высокого риска и моноинфекции ВПЧ 16 типа. Установлено, что при персистирующем течении ПВИ длительностью 12 месяцев в разном проценте случаев определяются 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типы ВПЧ высокого риска, в то время как при транзиторном течении ПВИ не установлено случаев инфицирования 35 типом ВПЧ, при персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев – 39 и 58 типами ВПЧ. Впервые проведена комплексная оценка иммунологических факторов цервикальной слизи в зависимости от длительности персистенции ВПЧ высокого риска. Выявлены общие закономерности изменений факторов местного иммунитета, сопровождающие наличие ВПЧ высокого риска в цервикальном канале обследованных женщин: снижение активности, интенсивности фагоцитоза и фагоцитарного числа нейтрофилов, увеличение активности лизосомальных ферментов нейтрофильных гранулоцитов и уровня ИЛ-2. Установлено, что персистирующее течение ПВИ длительностью 6 месяцев характеризуется снижением лизосомальной активности нейтрофилов и повышением концентрации IgG на фоне высоких уровней ИФН-α и ИФН-γ в цервикальной слизи относительно транзиторного течения ПВИ. Персистирующее течение ПВИ длительностью 12 месяцев сопровождается снижением интенсивности фагоцитарных реакций нейтрофилов, дефицитом ИНФ-α и повышенными концентрациями sIgA, IgA и IgМ в цервикальной слизи. Впервые получены данные по показателям вирусной нагрузки в зависимости от длительности персистенции ВПЧ высокого риска. Установлено влияние вирусной нагрузки на факторы локального иммунитета репродуктивного тракта женщины, определяющее развитие и длительность персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины. Впервые с помощью бинарной логистической регрессии определены маркеры риска развития и длительности персистирующего течения ПВИ. ^ Полученные данные расширяют представление о роли генотипа, концентрации вируса папилломы человека высокого риска и факторов местного иммунитета цервикальной слизи в развитии и длительности персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины. На основании комплексного молекулярно-биологического и иммунологического исследования оперделены основные маркеры, определяющие риск развития и длительность персистенции ВПЧ высокого риска в репродуктивном тракте женщины. ^
^ Результаты исследований внедрены в клиническую практику женской консультации МУЗ ГКБ № 2 г.Челябинска, в лабораторную диагностику НИИ иммунологии ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава, в педагогическую практику кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики, кафедры акушерства и гинекологии № 2 ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава. ^ Основные положения диссертации доложены, обсуждены и опубликованы на: VI Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2007); VII итоговой научно-практической конференции молодых ученых Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, 2009); VII Российской конференции иммунологов Урала (Архангельск, 2009); Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009); VIII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге - 2009» (Санкт-Петербург, 2009); II-ом Ежегодном конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010); VIII Российской конференции иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010); межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии – междисциплинарные проблемы» (Санкт-Петербург, 2010); VII Всероссийской научно-практической конференции c международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010); 4-ой Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» (Пермь, 2010). Публикации По теме диссертации опубликовано 24 научные работы, в том числе 9 из перечня изданий, рекомендованных ВАК РФ. ^ Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего работы 155 отечественных и 77 иностранных авторов. Диссертация изложена на 145 страницах компьютерного текста и включает 12 таблиц, 4 рисунка. ^ Материалы и методы исследования Для решения поставленных задач в период с 2008 по 2010 гг. на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории и Научно-исследовательского института иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» было проведено обследование 152 женщин с наличием ВПЧ высокого риска в цервикальном канале, являющихся пациентками амбулаторно-поликлинического приема женской консультации МУЗ ГКБ № 2 г.Челябинска. Критериями включения пациенток в данное исследование являлись: папилломавирусная инфекция, подтвержденная методом ПЦР; возраст — от 18 до 45 лет; первая фаза менструального цикла. Критерии исключения: беременность; экcтрагенитальные заболевания в стадии декомпенсации; инфекционные заболевания в стадии обострения; хламидийная, цитомегаловирусная и герпетическая инфекции урогенительного тракта; опухолевая патология. Для установления факта персистенции ВПЧ высокого риска всем женщинам проводили повторное ВПЧ-тестирование (выявление, дифференциация и количественное определение ВПЧ высокого риска) методом ПЦР через 6 и 12 месяцев после первичного обнаружения вируса. На основании полученных данных ретроспективно все пациентки были разделены на 3 группы: 1 группу составили 68 пациенток с отрицательными результатами ВПЧ-тестирования через 6 и 12 месяцев после первичного выявления ВПЧ высокого риска (транзиторное течение ПВИ), 2 группу – 32 женщины с персистирующим течением ПВИ, у которых вирус выявлялся через 6 месяцев и не выявлялся через 12 месяцев после первичного обследования (персистирующее течение ПВИ длительностью 6 месяцев), в 3 группу вошли 52 женщины с положительным ВПЧ-тестом через 6 и 12 месяцев после первичного обследования (персистирующее течение ПВИ длительностью 12 месяцев). Контрольную группу составили 32 женщины без ВПЧ высокого риска, клинико-морфологических изменений на шейке матки и иной гинекологической патологии. В группы с транзиторным и персистирующим течением ПВИ длительностью 6 и 12 месяцев вошли женщины с эктопией шейки матки, хроническим цервицитом и их сочетанием, цервикальной интраэпителиальной неоплазией (ЦИН) I степени и без клинико-морфологических изменений на шейке матки и иной гинекологической патологии. Диагноз выставлен акушерами-гинекологами женской консультаций МУЗ ГКБ № 2 на основании анамнестических, клинических и по показаниям кольпоскопического и морфологического методов исследования. Все пациентки с папилломавирусной инфекцией находились под наблюдением лечащего врача-гинеколога и по показаниям получали лечение в соответствии с установленной патологией. Средний возраст обследованных женщин составил 26,07±0,46 лет. Исследуемые группы были сопоставимы по возрасту и клиническим характеристикам. Материалом для молекулярно-биологического исследования послужили соскобы эпителиальных клеток цервикального канала. Выявление и дифференциация ВПЧ высокого риска 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типов проводили с помощью тест-системы «АмплиСенсÒ ВПЧ ВКР генотип-FL» производства ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора, г.Москва. Количественное определение ДНК ВПЧ высокого риска проводили с помощью тест-системы «АмплиСенсÒ ВПЧ ВКР скрин-титр-FL» производства ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора (г.Москва). Результаты концентрации ДНК ВПЧ выражались в lg (ВПЧ на 100 тыс. клеток человека) и оценивались следующим образом: вирусная нагрузка менее 3 – малозначимая, от 3 до 5 – значимая и более 5 – повышенная. Исследования проводили методом ПЦР в режиме реального времени на приборе «Rotor-Gene» 6000 («Corbett Research», Австралия). Для оценки иммунологических показателей у женщин исследовались цервикальная слизь, в которой определяли: - общее количество лейкоцитов, абсолютное и относительное содержание жизнеспособных нейтрофилов, показатели функциональной активности нейтрофилов с оценкой фагоцитарных реакций и содержания лизосом (Фрейдлин И.С., 1986), кислородозависимый метаболизм в НСТ тесте (Маянский А.Н., Виксман М.К., 1979). - концентрации иммуноглобулинов A, M, G (IgA, IgM, IgG) определяли с помощью тест-систем ООО «Хема» (г.Москва), секреторного IgA (sIgA) - тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск) методом ИФА. - определение уровней ИНФ-α, ИНФ-γ, ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10, РАИЛ-1, ФНО-α проводили методом ИФА с использованием тест-систем ООО «Цитокин»(г. Санкт-Петербург). Результаты оценивали с помощью пакетов «Statistica 6.0» и MedCalc 10.2.0.0 с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±m). Анализ количественных признаков производился с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Оценка качественных показателей осуществлялась с помощью критерия χ2 и точного критерия Фишера. Связь между исследуемыми показателями оценивали с помощью ранговой корреляции Спирмена. Для оценки диагностической эффективности молекулярно-биологических параметров и иммунологических показателей цервикальной слизи и построения математических моделей использовали бинарную логистическую регрессию. Во всех случаях различия, связи и зависимости считали статистически значимыми при р<0,05. ^ Анализ частоты встречаемости генотипов ВПЧ высокого риска показал преобладание ВПЧ 16 типа как в группе с транзиторным течением ПВИ, так и в группах с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 и 12 месяцев (табл.1). Полученные нами результаты согласуются с данными мировых исследований о высокой распространенности ВПЧ 16 типа в популяции [Евстигнеева Н.П., 2007; Видяева И.Г. и др., 2008; Современные подходы…, 2009; Munoz N. et al., 2004; Bosh F.X. et al., 2008]. При персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев наравне с ВПЧ 16 типа выявлялся ВПЧ 52 типа. Характерной особенностью персистирующего течения ПВИ длительностью 12 месяцев было снижение частоты встречаемости ВПЧ 52 типа относительно как группы с транзиторным течением ПВИ, так и группы с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев. Аналогичные результаты получены Е.А. Золотоверхой и соавт. (2007), в работе которой не было обнаружено ВПЧ 52 типа при персистирующем течении ПВИ. Вероятно, инфицирование 52 типом ВПЧ ассоциировано с элиминацией, либо с краткосрочной персистенцией ВПЧ высокого риска. У женщин с персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев в разном проценте случаев встречались все 12 определяемых типов ВПЧ высокого риска, тогда как при транзиторном течении ПВИ не выявлялся ВПЧ 35 типа, при персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев – ВПЧ 39 и 58 типов. Характеризуя частоту встречаемости количества типов ВПЧ высокого риска в исследуемых группах необходимо отметить, что при персистирующем течении ПВИ длительностью 6 и 12 месяцев достоверно чаще выявлялась микстинфекция ВПЧ высокого риска (инфицирование 2 и более генотипами вируса) по сравнению с транзиторным течением ПВИ (р=0,04 и р<0,001, соответственно). Наши данные согласуются с результатами других исследователей, которые в своих работах пришли к выводу, что инфицирование несколькими типами ВПЧ снижает скорость элиминации и обеспечивает менее благоприятный прогноз течения ПВИ [Евстигнеева Н.П., 2009; Современные подходы…, 2009]. Анализ частоты встречаемости типов ВПЧ высокого риска при моноинфекции (инфицирование 1 генотипом вируса) показал, что персистирующее течение ПВИ длительностью 6 месяцев характеризовалось высокой частотой встречаемости ВПЧ 51 типа по сравнению с транзиторным течением ПВИ (р=0,03). При персистирующем течении ПВИ длительностью 12 месяцев отмечена наиболее высокая частота инфицированности моноинфекцией ВПЧ 16 типа относительно групп с транзиторным и персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев (р<0,001 и р=0,004, соответственно). Таблица 1 Распределение генотипов ВПЧ высокого риска у женщин с транзиторным и персистирующим течением папилломавирусной инфекции
Примечание: n - количество типоспецифических сигналов, р1-3 - достоверные отличия показателей группы с персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев от показателей группы с транзиторным течением ПВИ, р2-3 - достоверные отличия показателей группы с персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев от показателей группы с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев. По данным литературы, моноинфекция ВПЧ, в особенности высокоагрессивного 16 типа, является неблагоприятным прогностическим фактором течения инфекционного процесса [Евстигнеева Л.А., 2008; Yamada T. et al., 1997; Nielsen A. et al., 2010]. Отраженное в некоторых работах предположение о повышенном риске развития персистенции в случае инфицирования ВПЧ 16 типа нашло подтверждение в нашей работе. Интересно отметить, что при персистирующем течении ПВИ длительностью 12 месяцев в виде моноинфекции выявлялось только 4 генотипа ВПЧ - 16, 31, 33 и 58 типы. Учитывая, что большая часть определяемых нами типов ВПЧ персистировали в кооперации, можно предположить, что способность к персистенции одного типа должна определяться его наиболее мощными функциональными особенностями, позволяющими выработать высокую степень адаптации к иммунной системе организма-хозяина. Характеризуя типовой состав микстинфекции ВПЧ высокого риска, установлено, что особенностью персистирующего течения ПВИ длительностью 12 месяцев была низкая частота встречаемости ВПЧ 52 типа по сравнению транзиторным и персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев (р=0,02 и р=0,02, соответственно). ВПЧ 18 типа во всех исследуемых группах обнаруживался только в кооперации с другими генотипами ВПЧ высокого риска. Изучение биологических особенностей транзиторного и персистирующего течения ПВИ в нашем исследовании показало, что лидирующую позицию независимо от исхода ПВИ занимал ВПЧ 16 типа. При этом транзиторное течение было ассоциировано с ВПЧ 52 типа и инфицированием 1 генотипом вируса, в то время как персистирующее течение ПВИ характеризовалось высокой частотой встречаемости микстинфекции ВПЧ высокого риска и моноинфекции ВПЧ 16 типа. В то же время, в большинстве случаев, как при транзиторном, так и при персистирующем течении ПВИ, определялись одни и те же генотипы вируса. Вероятно, для понимания этого факта необходимо более детальное изучение каждого генотипа вируса, так как в некоторых исследованиях показано, что разные внутритиповые варианты ВПЧ, определяемые на основании генетического полиморфизма, различаются по своей способности вызывать персистирующую инфекцию [Xi L.F. et al., 1995; Villa L.L. et al., 2000; Gagnon S. et al., 2004]. Таким образом, молекулярное генотипирование ВПЧ высокого риска является эффективным методом установления факта персистенции вируса, что имеет большое практическое значение для своевременного предотвращения прогрессирования патологических изменений цервикального эпителия и развития необратимой неопластической трансформации. Тем не менее, только тип вируса не является определяющим в развитии персистенции, и существуют другие факторы, влияющие на исход ПВИ. В качестве одного из них рассматривается вирусная нагрузка ВПЧ высокого риска [Stanley M., 2003; Song S.H. et al., 2006]. Исследование показателей вирусной нагрузки ВПЧ высокого риска в изучаемых группах женщин показало, что средняя концентрация вируса при транзиторном течении ПВИ была 3,26±0,32 lg ВПЧ на 105 клеток, что сочеталось с преобладанием в этой группе случаев малозначимой нагрузки (41,2%). У женщин с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев средний показатель вирусной нагрузки был достоверно выше (5,64±0,22 lg ВПЧ на 105 клеток, р<0,001), а повышенная вирусная нагрузка встречалась чаще, чем в группе с транзиторным течением ПВИ (р<0,001). При этом малозначимая вирусная нагрузка в данной группе не обнаружена. При персистирующем течении ПВИ длительностью 12 месяцев средняя концентрация вирусной ДНК определялась на уровне 4,28±0,33 lg ВПЧ на 105 клеток, что выше по сравнению с группой транзиторного течения ПВИ (р=0,04), но ниже относительно персистирующего течения ПВИ длительностью 6 месяцев (р=0,001). При этом преобладала вирусная нагрузка от 3 до 5 lg ВПЧ на 105 клеток, а частота встречаемости повышенной снижалась по сравнению с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев (р<0,001). Полученные результаты свидетельствуют о том, что высокая вирусная нагрузка может способствовать персистенции вируса, но не всегда является признаком неблагоприятного исхода ПВИ. В нашем исследовании в группе с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев, несмотря на повышенную вирусную нагрузку ВПЧ высокого риска у пациенток в итоге произошла элиминация вируса, но для этого потребовалось больше времени по сравнению с группой транзиторного течения ПВИ. Особенности жизненного цикла ВПЧ определяют ведущую роль факторов локального иммунитета в процессах инфицирования и, самое главное, вероятности последующего развития заболевания (элиминация или персистенция ВПЧ) [Современные подходы…, 2009; Stanley M., 2009; Bhat P. et al., 2011]. При изучении иммунологических показателей цервикальной слизи установлены однонаправленные изменения функциональной активности нейтрофилов как в группе с транзиторным, так и в группах с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 и 12 месяцев, характеризующиеся достоверным снижением активности, интенсивности фагоцитоза и фагоцитарного числа нейтрофилов, увеличением их лизосомальной активности (табл. 2). Выявленные нами изменения фагоцитарной реакции нейтрофилов отражают нарушение их поглотительной и переваривающей способностей, а также неэффективность внутриклеточной киллерной функции при ПВИ. В то же время, высокое содержание лизосомальных энзимов свидетельствует об активности и способности нейтрофилов к реализации кислороднезависимой биоцидности, направленной на уничтожение вируса [Цыганкова О.В., 2009]. Таблица 2 Количество и функциональная активность нейтрофилов цервикальной слизи у обследованных женщин, М ± m
Примечание к таблицам 2-4: n - количество обследованных женщин, р - достоверные отличия показателей женщин с ПВИ от показателей практически здоровых женщин, р1-2 - достоверные отличия показателей группы с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев от показателей группы с транзиторным течением ПВИ, р1-3- достоверные отличия показателей группы с персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев от показателей группы с транзиторным течением ПВИ, р2-3 - достоверные отличия показателей группы с персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев от показателей группы с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев. В группах с транзиторным и персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев установлено повышение общего количества лейкоцитов и абсолютного содержания жизнеспособных нейтрофилов относительно группы контроля. В то время как в группе с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев эти изменения были на уровне тенденции. Вероятно, полученные данные отражают активацию воспалительного процесса при ПВИ, так как ключевым этапом в защите организма от внедрения антигена является выход нейтрофилов из кровяного русла к месту инвазии микроорганизма для решения свои эффекторных задач [Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 2000; Долгушин И.И и др., 2009]. Отличительной особенностью группы с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев по сравнению с транзиторным течением ПВИ стало снижение лизосомальной активности нейтрофилов. По нашему мнению это обусловлено массивной антигенной нагрузкой в данной группе, что приводит к истощению функциональных гранул нейтрофилов. При персистирующем течении ПВИ длительностью 12 месяцев зарегистрировано снижение интенсивности фагоцитоза нейтрофилов по сравнению с транзиторным течением ПВИ. Изучение гуморальных факторов цервикальной слизи (табл.3) показало, что при персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев организм реагировал подключением гуморальных факторов иммунитета, которое проявлялось в увеличении уровня IgG - важнейшего иммуноглобулина, определяющего завершенность и эффективность иммунного ответа [Семенов Д.М. и др., 2008] и, в итоге, способствующего элиминации ВПЧ из организма. В то время как персистирующее течение ПВИ длительностью 12 месяцев характеризовалось повышенными концентрациями sIgA, IgA и IgМ. Таблица 3 Показатели гуморальных факторов иммунитета цервикальной слизи у обследованных женщин, М ± m
При изучении цитокинового профиля цервикальной слизи (табл.4) установлено повышение экспрессии ИЛ-2 во всех исследуемых группах, что свидетельствует об активации иммунокомпетентных клеток в ответ на ПВИ [Кетлинский С.С., Симбирцев А.С., 2008]. Транзиторное и персистирующее течении ПВИ длительностью 6 месяцев характеризовались однонаправленными изменениями уровней цитокинов, что выражалось в повышении концентрации ИФН-α и ИФН-γ в цервикальной слизи. Повышенная экспрессия интерферонов в группах с транзиторным и персистирующим течение ПВИ длительностью 6 месяцев свидетельствует о работе противовирусных механизмов, а ИФН–γ, выступая в качестве провоспалительного цитокина, обеспечивает запуск цитокинового каскада, направленного на формирование очага воспаления с привлечением эффекторных клеток. При персистирующем течении ПВИ длительностью 12 месяцев нами зарегистрирован дефицит ИНФ-α в цервикальной слизи. На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что при персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев угнетение нейтрофильного звена иммунитета цервикальной слизи в условиях повышенной вирусной нагрузки обусловливает персистенцию ВПЧ высокого риска, но ее срок ограничивается, благодаря запуску IgG-иммунного ответа на фоне повышенной экспрессии ИНФ-α и ИНФ-γ. Тогда как в группе женщин с персистирующем течением ПВИ длительностью 12 месяцев дефицит ИНФ-α, который может быть обусловлен как нарушениями в функционировании иммунной системы женщины, так и способностью ВПЧ высокого риска подавлять синтез интерферонов и работу интерферон-сигнальных путей, способствует длительной персистенции ВПЧ. При этом, высокие уровни sIgA, IgA и IgМ, обеспечивающие первую линию иммунной защиты слизистых оболочек [Карамов Э.В. и др., 2008; Кишкун А.А., 2009], по нашему мнению, сопровождают вирусоносительство, сдерживая чрезмерную агрессивность свободных вирусов. Таблица 4 Уровни цитокинов цервикальной слизи у обследованных женщин, M±m
Помимо определения изменений количественных параметров, одной из существенных характеристик функционирования иммунной системы является баланс взаимосвязей ее компонентов [Кологривова Е.Н. и др., 2005; Петленко С.В. и др., 2010]. По данным литературы, активация и вовлечение в процесс тех или иных механизмов иммунного ответа, а, следовательно, и исход инфекционного процесса, определяется не только степенью патогенности возбудителя, но и его количеством [Железникова Г.Ф., 2006; Новиков Д.К., Новиков П.Д., 2009; Devi P.U. et al., 2009; Faust H. et al., 2011]. В нашей работе исследуемые группы отличались по показателям вирусной нагрузки ВПЧ высокого риска. В связи с этим, для установления влияния количества ДНК ВПЧ на механизмы иммунного ответа был проведен корреляционный анализ между уровнем вирусной нагрузки ВПЧ высокого риска и показателями местного иммунитета в исследуемых группах. Анализ взаимосвязей показал, что во всех исследуемых группах установлены связи вирусной нагрузки преимущественно с иммуноглобулинами и цитокинами цервикальной слизи, что подтверждает ключевую роль гуморальных факторов врожденного иммунитета в реализации процессов пролиферации, дифференцировки и активации иммунокомпетентных клеток при включении противовирусного иммунитета. Учитывая полученные данные, следующим этапом мы проанализировали взаимосвязи между уровнями цитокинов, как основных регуляторов иммунного ответа, и другими иммунологическими показателями цервикальной слизи. При сопоставлении результатов корреляционного анализа вирусной нагрузки и цитокинов с иммунологическими факторами цервикальной слизи мы установили, что в группе с транзиторным течением ПВИ концентрация вирусной ДНК коррелировала с sIgA и ИФН-γ (рис.1). В свою очередь sIgA и ИФН-γ связаны с уровнем ФНО-α, который является одним из ключевых цитокинов в реализации противовирусного иммунного ответа, а также в регуляции интенсивности воспаления и эффективности иммунной защиты [Рязанцева Н.В. и др., 2006; Зима А.П. и др., 2007; Кетлинский С.С., Симбирцев А.С., 2008]. В ходе дальнейшего анализа установлено, что ФНО-α чаще других был задействован в иммунологических взаимосвязях, среди которых обращают на себя внимание, с одной стороны, положительные связи ФНО-α - РАИЛ-1, ФНО-α - ИФН-γ, с другой стороны – отрицательные связи ФНО-α – ИНФ-α, ФНО-α – ИЛ-4. Полученные результаты свидетельствуют о сохранении баланса про- и противовоспалительных цитокинов у женщин данной группы. По данным литературы, ФНО-α может оказывать ингибирующий эффект на рост ВПЧ-инфицированных клеток, который усиливается действием ИФН [Семенов Д.М. и др., 2008]. Следовательно, установленная положительная взаимосвязь ФНО-α - ИФН-γ может свидетельствовать о сопряженности противовирусной активности данных цитокинов в ответ на ПВИ. Таким образом, в данной группе создаются благоприятные условия для реализации полноценного иммунного ответа, направленного на элиминацию ВПЧ высокого риска.  ИФН-γ       ИЛ-10       IgA ИЛ-2 IgG ИЛ-4 ИФН-α ИЛ-8 ИЛ-1β РАИЛ-1       ^ Рис.1. Корреляционные связи показателей в группе с транзиторным течением ПВИ Примечание для рис.1-3: ____ положительные связи, ---- отрицательные связи                        Рис.2. Корреляционные связи показателей в группе с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев При персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев установлены положительные связи между вирусной нагрузкой ВПЧ высокого риска и активностью индуцированного НСТ-теста нейтрофилов, ИЛ-2, ИФН-γ и Ig М и отрицательные связи - с лизосомальной активностью нейтрофилов, общим количеством лейкоцитов и абсолютным содержанием жизнеспособных нейтрофилов (рис.2). В свою очередь, ИЛ-2 и IgM коррелировали с уровнем ИЛ-1β, а ИФН-γ был связан с РАИЛ-1 и ИЛ-10. К тому же, взаимосвязь ИЛ-8 - РАИЛ-1, которая прослеживается во всех трех группах обследованных женщин, в данном случае меняет свое направление и становится отрицательной. Интересно обратить внимание и на взаимосвязь вирусной нагрузки с ИФН-γ, которая была отрицательной в группе с транзиторным течением ПВИ и стала положительной при персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев. ИФН-γ, обладая прямой противовирусной активностью и являясь важнейшим иммунорегулятором, усиливает синтез HLA-антигенов клетками, что приводит к ускорению процессов распознавания и переработки антигенов, активирует другие клетки иммунной системы, участвующие в элиминации патогена. Таким образом, персистирующее течение ПВИ длительностью 6 месяцев характеризовалось как увеличением корреляционных связей, так и изменением их характера по сравнению с транзиторным течением ПВИ. Учитывая, что вирусная нагрузка в группе с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев была выше порога прогрессии (более 5 lg на 105 клеток человека), увеличение количества взаимосвязей отражает напряженность и согласованную работу факторов местного иммунитета в ответ на массивную антигенную атаку, что обусловливает элиминацию ВПЧ высокого риска, но в течение более длительного времени. При анализе корреляционных связей в группе с персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев установлена только одна положительная взаимосвязь между вирусной нагрузкой ВПЧ высокого риска и уровнем Ig А, который был связан положительной корреляционной связью с ИЛ-4 (рис.3). Обращает на себя внимание отсутствие взаимосвязей IgA и ИЛ-4 с другими иммунологическими показателями цервикальной слизи. По нашему мнению снижение числа и отсутствие связанности компонентов локального иммунитета при высокой дозе антигена препятствует удалению вируса, поддерживая его персистенцию. Более того, отмечено исчезновение связей между ФНО-α и другими цитокинами и появление отрицательных связей между провоспалительными цитокинами (ИЛ1-β и ИЛ-8) и противовоспалительным ИЛ-10, для которого выявлено максимальное количество связей. По данным литературы, направленность цитокинового профиля в сторону формирования гуморального иммунного ответа при вирусных инфекциях является прогностически неблагоприятным признаком течения заболевания [Наследникова И.О. и др., 2007; Маркелова Е.В. и др., 2008; Сотниченко С.А. и др., 2009]. Поэтому, установленные нами взаимосвязи можно рассматривать как патогенетический механизм, опосредующий формирование персистенции ВПЧ высокого риска у женщин этой группы.                           Рис.3. Корреляционные связи показателей в группе с персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев Таким образом, корреляционный анализ взаимосвязей между уровнем вирусной нагрузки ВПЧ высокого риска и иммунологическими показателями цервикальной слизи показал наличие существенных различий в состоянии локальной иммунной системы женщин в зависимости от дозы антигена, что доказывает участие этого молекулярно-биологического маркера в иммунологических процессах, определяющих течение и исход ПВИ. Установленные молекулярно-биологические и иммунологические особенности исследуемых групп были использованы для выявления маркеров риска развития и длительности персистенции ВПЧ высокого риска. Построение прогностических моделей проводилось с помощью метода бинарной логистической регрессии. В качестве наиболее информативных показателей в математические модели вошли:
Модель логистической регрессии для определения риска развития персистирующего течения ПВИ длительностью 6 месяцев: ^ 5 клеток)+ (0,0008) × ИФН-α цервикальной слизи (пг/мл). Модель логистической регрессии для определения риска развития персистирующего течения ПВИ длительностью 12 месяцев: ^ Зная Логит (Р), расчитывается само значение P – вероятность отнесения пациента к группе риска:  где e - константна, равная 2,718281828. При подстановке значений указанных показателей, полученных при обследовании каждой пациентки, вычисляется значение вероятности отнесения ее к группе риска. Если Р<0,5 пациентку следует причислить к группе отсутствие риска, если P>0,5 – к группе наличие риска. Полученные результаты дают возможность использовать показатели, вошедшие в данные модели, в качестве дополнительных лабораторных маркеров риска развития персистирующего течения ПВИ, а также прогнозировать длительность персистенции ВПЧ высокого риска в репродуктивном тракте женщины. ВЫВОДЫ
^
На правах рукописи ЗОТОВА Мария Александровна ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ПЕРСИСТИРУЮЩЕГО ТЕЧЕНИЯ ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Челябинск – 2011 Отпечатано в типографии …. Подписано в печать 18.11.2011г. Формат 60×84 1/16. Гарнитура ……….. Бумага офсетная. Печать на ризографе. Объем 2 усл. п.л. Тираж 100экз. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям