Молекулярно-генетические и клинико-генотипические особенности муковисцидоза в российских популяциях 03. 00. 15 генетика
|
|
Скачать 0.9 Mb.
|
1 2
|
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР На правах рукописи Петрова Ника Валентиновна МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И КЛИНИКО-ГЕНОТИПИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МУКОВИСЦИДОЗА В РОССИЙСКИХ ПОПУЛЯЦИЯХ 03.00.15 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2009 Работа выполнена в лаборатории генетической эпидемиологии Государственного учреждения Медико-генетического научного центра РАМН, Москва
Защита диссертации состоится «_02_»_февраля_____2009 г. в _____часов на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 при ГУ Медико-генетическом научном центре РАМН (ГУ МГНЦ РАМН) по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Медико-генетического научного центра РАМН. Автореферат разослан «___»____________2008 г. Ученый секретарь Диссертационного совета Д 001.016.01, доктор медицинских наук Р.А. Зинченко ^ Муковисцидоз (МВ, CF; OMIM #219700) наиболее частое наследственное аутосомно-рецессивное заболевание среди европеоидов. Муковисцидоз обусловлен мутациями в гене CFTR, муковисцидозного трансмембранного регулятора проводимости. Белок CFTR, функционируя как цАМФ-зависимый хлорный канал, регулирует работу других хлорных и натриевых каналов и выполняет ряд иных важных функций (Riordan J.M. et al., 1989). При муковисцидозе в патологический процесс вовлекаются экзокринные железы разных систем организма: органов дыхания, системы пищеварения (поджелудочная железа, печень, желчные пути, пищеварительный тракт), а также потовые железы и урогенитальный тракт (Капранов Н.И. и др., 2004; Witt H., 2003). В настоящий момент описаны более 1500 мутаций и 250 полиморфизмов в гене CFTR (CFTR mutation database, http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/), частоты которых широко варьируют в разных этнических группах. Спектры различных мутаций и полиморфизмов гена CFTR обладают выраженной популяционной специфичностью, являясь отражением генетических процессов, формирующих популяции. Частота МВ варьирует в разных популяциях мира в весьма широких пределах (например, в Европе от 1:1800 новорожденных в Ирландии до 1:26000 новорожденных в Финляндии) (WHO, 2004). Оценки частоты MB в разных популяциях Российской Федерации (РФ) также весьма различны (от 1:4900 до 1:12000 живорождённых) (Петрова Н.В., Гинтер Е.К., 1997; Капранов Н.И., 2001; Капранов Н.И., 2006; Радионович А.М. и др., 2005; Воронин С.В. и др., 2007; Матулевич С.А., 2007; Михальчук В.В. и др., 2007; Одинокова О.Н. и др., 2007). Значительное различие спектров CFTR мутаций и частоты заболевания вносит объективные сложности в разработку протоколов проведения ДНК-диагностики МВ и проведения генетического консультирования среди населения, относящегося к разным этническим группам и проживающего в разных регионах. Клиническая картина при МВ весьма разнообразна: продолжительность жизни, спектр и тяжесть клинических проявлений значительно варьируют среди больных МВ. И хотя вариабельность клинического течения МВ несомненно обусловлена многочисленностью CFTR мутаций, а следовательно, и CFTR генотипов, но различие в течении МВ, наблюдающееся у больных, имеющих одинаковые мутации в гене CFTR, в частности, у сибсов, позволяет предполагать влияние на клиническую картину МВ других генетических факторов, отличных от гена CFTR (Ferrari M., Cremonesi L., 1996; Parad R.B. et al., 1999; McKone E.F. et al., 2006; Mekus F. et al., 2000; Vanscoy L.L. et al., 2007). В настоящее время во всем мире ведется активный поиск генов, оказывающих влияние на клинические проявления МВ. Изучается ряд генов, белковые продукты которых могут быть вовлечены в патогенетические механизмы МВ. Особое внимание уделяется генам, продукты которых вовлечены в иммунную защиту организма (Drumm M.L. et al., 2005; Salvatore F. et al., 2002; Witt H., 2003; Yarden J. et al., 2005; Garred P.et al., 2003; Thio C.L. et al., 2005; Wiertsema S.P. et al., 2006; Иващенко Т.Э., Баранов В.С., 2000; Келембет Н.А. и др., 2005; Корытина Г.Ф.и др., 2004).. Несмотря на то, что муковисцидоз интенсивно изучается на протяжении нескольких десятков лет специалистами разных направлений, в том числе и в России, интерес к проблемам этого заболевания не ослабевает. Вопросы распространенности МВ в разных популяциях и этнических группах, выявления гено-фенотипических корреляций, определения факторов, лежащих в основе вариабельности клинических проявлений, особенностей консультирования в связи с введением пресимптоматической диагностики в России не решены до конца. ^ Получение оценки частоты муковисцидоза, изучение молекулярно-генетического разнообразия гена CFTR в российских популяциях, выявление гено-фенотипических корреляций у российских больных и разработка на основе полученных результатов принципов медико-генетического консультирования. Задачи исследования:
^ :
^
^ :
^ Представляемая диссертационная работа является обобщением результатов многолетних комплексных исследований. Работа выполнена на базе лаборатории генетической эпидемиологии ГУ МГНЦ РАМН. Планирование эксперимента, обработка, анализ и обобщение материалов исследования выполнены лично автором. Автор участвовала в сборе популяционных образцов крови совместно с сотрудниками лаборатории генетической эпидемиологии и лаборатории экологической генетики ГУ МГНЦ РАМН, в сборе клинических данных о больных МВ совместно с сотрудником лаборатории генетической эпидемиологии Тимковской Е.Е. и сотрудниками научно-клинического отделения муковисцидоза д.м.н. Н.Ю. Каширской, к.м.н. Радионович А.М., к.м.н. Воронковой А.Ю. Автором создана коллекция ДНК больных МВ и их родственников. Выделение ДНК из образцов крови и ворсин хориона плодов, анализ частых мутаций в гене CFTR у 776 больных МВ, 1082 родителей, в популяционных выборках (3739 индивидов); анализ внутригенных и внегенных полиморфизмов в семьях с МВ (344 больных и 488 родителей); проведение 109 пренатальных диагностик МВ выполнены лично автором. Анализ кодирующей последовательности гена CFTR в выборке 50 пациентов методом денатурирующего гель-электрофореза проведен в Институте биогенетики (Брест, Франция); анализ полиморфизма генов-модификаторов клинической картины МВ (148 больных, гомозиготных по мутации F508del) проведен совместно с сотрудником лаборатории Тимковской Е.Е.; анализ последовательности 5’ регуляторной и промоторной области гена CFTR у 83 больных МВ и 50 здоровых индивидов методом анализа конформационного полиморфизма однонитевых фрагментов ДНК проведен совместно с сотрудниками лаборатории к.б.н. М.Ю. Скобловым и О.Н. Нурутдиновой, что оговорено в соответствующих местах текста. Статистический анализ: расчет относительных частот мутаций, расчет популяционной частоты мутации F508del, оценка частоты МВ в популяциях европейской части России, анализ гено-фенотипических корреляций у российских больных МВ, оценка возможного влияния генов-модификаторов на клиническую картину МВ у больных с одинаковым CFTR генотипом, расчет генетических рисков при наличии двух независимых факторов риска МВ в разных регионах России выполнены лично автором. ^ Результаты исследования были представлены на Европейских конференциях по муковисцидозу (в 1991, 1996, 1999, 2006, 2008 годах); на Европейских международных симпозиумах по муковисцидозу (в 1997, 2000, 2001, 2002, 2003 годах); на Европейской конференции по генетике человека (2008 г.); на 2 (4) Российском съезде медицинских генетиков (Курск, 2000 г.); на 5-ом Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург – Гастро-2003» (С.-Петербург, 2003 г.); на Всероссийской научно-практической конференции «Современные достижения клинической генетики» (Москва, 2003 г.); на Третьем съезде генетиков и селекционеров России “Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития” (Москва, 2004 г.); на Третьих антропологических чтениях к 75-летию со дня рождения академика В.П.Алексеева «Экология и демография человека в прошлом и настоящем» (Москва, 2004 г.); на V Съезде Медицинских генетиков (Уфа, 2005 г.); на VII национальном конгрессе по муковисцидозу (Воронеж, 2005 г.); на Российском Медицинском Форуме «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006 г.); на VIII Национальном конгрессе «Муковисцидоз у детей и взрослых» (Ярославль, 2007 г.); на межлабораторном семинаре ГУ МГНЦ РАМН (25 июня 2008 г.). Публикации. По теме диссертации опубликовано 74 работы из них 38 в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ. ^ Работа изложена на 305 листах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав собственных исследований и обсуждений результатов, заключения, выводов, списка цитированной литературы (401 источник, в том числе 45 отечественных и 356 зарубежных) и приложения. Иллюстративный материал содержит 68 таблиц, 43 рисунка, 33 таблицы Приложений. ^ Материалы и методы. Характеристика выборок. Больные МВ, их родители и сибсы для проведения молекулярно-генетического исследования направлялись из научно-клинического отделения муковисцидоза и научно-консультативного отдела ГУ МГНЦ РАМН, Детской Республиканской клинической больницы, Научного центра здоровья детей РАМН, региональных клинических детских больниц. Родственники больных МВ направлялись также из региональных медико-генетических консультаций. Выборка больных МВ и их родственников формировалась по мере обращения в период с 1990г. по 2007г. Объем выборки больных МВ составил 776 пациентов из 766 семей в возрасте от 0 до 39 лет. Объем выборки родителей и сибсов - 1082 человека. Более 87,4% семей проживали в европейской части России, около 12,6% - в Сибири и на Дальнем Востоке. ^ проведен у 344 больных муковисцидозом из неродственных семей и 488 их родителей. Для изучения гено-фенотипических корреляций и модифицирующего влияния ряда генов на клиническую картину МВ проанализированы истории болезни 460 детей из 776 больных МВ, находившихся на постоянном амбулаторном учете в научно-клиническом отделении муковисцидоза ГУ МГНЦ РАМН с 1991 по 2006 год, из них 122 истории болезни пациентов, проживающих в Москве. У всех больных, включенных в исследование, диагноз муковисцидоза был установлен клинически врачами научно-клинического отделения муковисцидоза ГУ МГНЦ РАМН (руководитель д.м.н., профессор Капранов Н.И.) Подтверждался диагноз потовым тестом (концентрация хлоридов более 60 ммоль/л), измерением разности электрических потенциалов на эпителии носа. Возраст обследованных больных колебался от 3 месяцев жизни до 21 года. Средний возраст составил 9,79±0,26 лет. Распределение больных по полу показало практически равное соотношение мальчиков и девочек (239 : 221; 52% : 48%). Данные для расчета массо-ростового индекса (МРИ) были доступны для 358 МВ больных. У 51,4% пациентов наблюдается отставание физического развития (МРИ<90% от должного). Измерения для оценки показателей функции внешнего дыхания (ФВД) были проведены у 307 больных. Данные микробиологического исследования мокроты были доступны у 424 больных. Данные о состоянии гепатобилиарной системы имелись по 455 больным. Цирроз печени отмечен у 15,4% пациентов, диффузный фиброз – у 9,7%. Гепатит – у 6,8%, в том числе вирусный – у 3,9% в анамнезе. Мекониальный илеус (МИ) отмечен у 4,9%, а синдром дистальной интестинальной обструкции (СДИО) – у 8,5% в анамнезе (данные по 409 пациентам). В большинстве наблюдений имела место смешанная форма МВ – 93,5%, кишечная форма в обследуемой выборке составила лишь 1,1% (5 больных), а легочная форма - 5,4 % (23 пациента). Данные доступны для 447 больных. Течение заболевания оценивалось как тяжелое у 59,4%, средне-тяжелое – у 40,4% и легкое – у 0,2% пациентов (всего оценка была возможна у 451 больного). Для анализа частот CFTR мутаций в популяциях европейской части России использован материал, собранный в ходе медико-эпидемиологических экспедиций сотрудниками лаборатории генетической эпидемиологии и лаборатории экологической генетики ГУ МГНЦ РАМН в период 1993-2007 годов. Образцы крови башкир собраны сотрудниками Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН (г. Уфа, Башкирия) в 2006-2007 годах. Материал собирался у здоровых неродственных индивидов, принадлежащих к коренному этносу вплоть до третьего поколения и являющихся уроженцами обследуемых населенных пунктов. При сборе материала были получены письменные информированные согласия. При этом заполнялась анкета с указанием мест рождения и этнической принадлежности обследуемых и их предков до третьего поколения (бабушки-дедушки). Всего исследовано 3739 здоровых индивидов. Образцы пятен крови новорожденных г. Москвы 1990 г.р. и 1995 г.р. для анализа частоты мутации F508del были любезно предоставлены А.Д.Байковым (Московский центр неонатального скрининга, ДПБ №6 г.Москвы). ^ Материалом исследования являлась ДНК, выделенная из различных источников (лейкоцитов цельной крови, пятен высушенной крови, ворсин хориона). ДНК выделяли методом ферментативного гидролиза протеиназой К с последующей очисткой высаливанием, хлороформной экстракцией и осаждением охлажденным этанолом (96%), а также с использованием наборов реактивов для выделения ДНК «Wizard Genomic DNA Purification Kit» (фирма «Promega», (USA) и DiatomTM DNA Prop (ООО «Изоген», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Анализ частых мутаций и полиморфизмов гена CFTR проводили методами ПЦР и мультиплексной ПЦР, рестрикционного анализа, гель-электрофореза, используя олигонуклеотиды, последовательности которых были опубликованы в статьях (Kerem B.-S. et al., 1989; Zielenski J. et al., 1991; Ng I.S.I. et al., 1991; Highsmith W.E. et al., 1994; Dork T. et al., 2000; Chehab F.F. et al., 1991; Rosenbloom C.L. et al., 1989; Feldman G.L. et al., 1988; Williams C. et al., 1988; Northrup H. et al., 1989; Dean M. et al., 1990). Для анализа мутаций F508del, I506del, 1677delTA, CFTRdele2,3(21kb), 2143delT, 2184insA, 394delTT, 3821delT методом мультиплексной ПЦР использовали набор праймеров, разработанный д.б.н., проф. А.В. Поляковым (лаборатория ДНК-диагностики ГУ МГНЦ РАМН). Скрининг CFTR мутаций методом электрофореза в денатурирующем градиентном геле (DGGE) и последующее секвенирование фрагментов ДНК с аномальной подвижностью проводили в лаборатории биогенетики Центра биогенетики (Брест, Франция), согласно разработанной в этой лаборатории методике (Verlingue C. et al., 1995). Поиск мутаций в промоторной и 5’ регуляторных регионах гена CFTR проводили методом конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP). Автоматическое секвенирование фрагментов ДНК с аномальной подвижностью проводили в ООО «Хеликон», Россия. Анализ мутаций и полиморфизмов генов eNOS, MBL2, TNFA, LTA, GSTM1, HFE1 проводили методами ПЦР, мультиплексной ПЦР, рестрикционного анализа и гель-электрофореза, используя праймеры, описанные в литературе (Monti L.D. et al., 2003; Zang D.L. et al., 2003; Madsen H.O. et al., 1998; Beutler E. et al., 1996; Пай Г.В. и др., 2003) . ^ Анализируемые параметры включали: пол, возраст, место проживания, проводимую терапию, время манифестации кишечного и респираторного синдрома, возраст постановки диагноза, форму заболевания, тяжесть течения, показатели ФВД (ФЖЕЛ и ОФВ1), результаты посева мокроты (наличие высева, его периодичность, существование мукоидной или гладкой формы P.aeruginosa, наличие высева St.aureus, MRSA, Al.xylosoxidans, B.сepacia, St.maltophilia), массу и рост, поражение гепатобилиарной системы и наличие в анамнезе мекониального илеуса. Для оценки массы и роста использовался массо-ростовой индекс (МРИ) определяемый по формуле: (фактическая масса/идеальная масса по росту и полу) 100%, для чего использовали перцентильные графические стандарты, полученные Национальным Центром по Статистике здоровья (National Centre for Health Statistics – NCHS), и рекомендованные Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ), в тех странах, где нет своих национальных стандартов (Zhang Z. et al., 2004). Снижение МРИ ниже 90% от возрастной нормы считалось отставанием в физическом развитии. Для оценки функции легких использовались такие основные показатели ФВД, как Форсированная Жизненная Емкость Легких (ФЖЕЛ) и Объем Форсированного Выдоха в 1 секунду (ОФВ1). Оценка степени тяжести легочной патологии проводилась с учетом показателей ФВД, данных микробиологического исследования мокроты, состояния питания и физического развития (оценивался массо-ростовой индекс), врачебной оценки тяжести течения, которая, в свою очередь, опиралась на шкалу Швахмана-Брасфильда, в модификации С.В. Рачинского и Н.И. Капранова и на оценку рентгенологической картины по шкале Криспина-Нормана. Выделялись три степени тяжести течения – тяжелое, средне-тяжелое и легкое течение. Под поражением печени подразумевалось наличие врачебного заключения об имевшемся диффузном фиброзе, холестатическом гепатите и циррозе печени. Врачебный диагноз заболеваний печени базировался на клинической картине, результатах УЗИ, данных биохимического анализа крови. Имевшееся у ряда больных вирусное поражение печени учитывали отдельно. Данную часть работы проводили совместно с сотрудниками научно-клинического отделения муковисцидоза ГУ МГНЦ РАМН (руководитель д.м.н., проф. Н.И. Капранов). ^ Статистическая оценка различий частот аллелей и гаплотипов ДНК-маркеров, а также частоты качественных признаков проводилась с использованием критериев 2, модифицированного 2, теста Фишера (Животовский Л.А., 1991). Расчет осуществляли с использованием пакета программ, составленного сотрудниками лаборатории генетической эпидемиологии д.б.н. Ельчиновой Г.И., д.б.н. Нурбаевым С.Д. Для анализа ассоциаций между мутациями и полиморфными вариантами изучаемых генов и клиническими характеристиками заболевания использован непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Оценка функции выживания в группах пациентов с разными генотипами проведена методом множительных оценок Каплана-Мейера. Для сравнения показателей выживаемости использовали критерий Вилкоксона, модифицированный по Гехану. При расчетах использовали пакет компьютерных программ Statistica 6.0. Для расчетов апостериорных вероятностей поражения новорожденного или плода МВ использовали вероятностный метод Байеса. ^ Одной из важных задач в изучении наследственных заболеваний является определение его частоты. Оценки частоты муковисцидоза в России разнятся в весьма широких пределах. Расчет частоты МВ в популяциях европейской части России проведен с использованием двух показателей: относительной доли распространенных CFTR мутаций у больных МВ и популяционной частоты данных мутаций. ^ Молекулярно-генетические исследования по муковисцидозу проводятся в лаборатории генетической эпидемиологии ГУ МГНЦ РАМН на протяжении длительного периода, начиная с 1989 года. Спектр частых мутаций гена CFTR, характерный для больных из России, был определен в результате совместного с Институтом Биогенетики (Брест, Франция) исследования всей кодирующей последовательности гена CFTR в выборке 50 пациентов в 1993-1995 годах (Verlingue C. et al., 1995), межъевропейского коллаборативного исследования распространения мутации CFTRdele2,3(21kb) (Dörk T. et al., 2000), самостоятельных работ (Петрова Н.В. и др., 1994, 1997, 2001; Петрова Н.В., 2005) с учетом данных других отечественных исследователей, анализирующих независимые от нас выборки больных (Иващенко Т.Э,, 2000; Корытина Г.Ф. и др., 2002; Голубцов В.И. и др., 2007). Для определения относительных долей частых CFTR мутаций были проанализированы 1532 мутантные хромосомы (766 неродственных больных МВ). В спектр рутинно анализируемых мутаций вошли мутации F508del, CFTRdele2,3(21kb), I507del, 1677delTA, 2143delT, 2184insA, 394delTT, 3821delT, G542X, G551D, R553X, W1282X, N1303K, E85Q, 621+1G>T, R117H, 1717-1G>A, 3849+10kbC>T, R334W, R347P, S1196X. В ряде случаев были обнаружены образцы, имеющие измененную подвижность амплифицированных фрагментов ДНК в 4, 20, 19 и 13 экзонах. При секвенировании амплифицированных фрагментов с аномальной подвижностью были идентифицированы мутации 3667insTCAA (вставка четырех нуклеотидов TCAA после положения 3667, 19 экзон) и K598ins (13 экзон, вставка трех нуклеотидов AAA после положения 1923, что приводит к вставке аминокислоты лизин после позиции 598) (каждая у одного больного в компаунде с мутацией F508del), 3944delGT (вставка двух нуклеотидов после положения 3944, 20 экзон; у двух неродственных больных, у одного в компаунде с мутацией F508del, у другого – с 3849+10kbC>T), 604insA (4 экзон, вставка нуклеотида A после положения 604; у трех неродственных больных: у двух в компаунде с мутацией F508del, у третьего – с мутацией G542X) и L138ins (4 экзон, вставка трех нуклеотидов CTA после положения 546, что приводит к вставке аминокислоты лейцин после позиции 138; у шести неродственных больных: у двух в компаунде с мутацией F508del, у двух – с мутацией CFTRdele2,3(21kb), у одного – с мутацией 2184insA, а у одного вторая мутация осталась не идентифицированной). Мутации 3667insTCAA, 3944delGT и L138ins ранее не были отмечены другими отечественными исследователями. Мутации 604insA и K598ins обнаружены впервые. Мутации L138ins и 604insA включены нами в рутинный анализ частых CFTR мутаций у российских больных МВ. На рис. 1 приведена схема распределения относительных долей обнаруженных CFTR мутаций в проанализированной выборке мутантных хромосом.  ^ не идентиф. Рис.1. Распределение относительных частот CFTR мутаций (в %) у российских больных МВ. Анализ мутаций, встречающихся у больных МВ в разных регионах России, подтверждает тенденции, прослеживающиеся в распределении CFTR мутаций в Европе: снижение относительной доли мутации F508del с северо-запада на юго-восток - у российских больных МВ относительная частота мутации F508del в среднем составляет 54,2% и колеблется от 59% на северо-западе до 47% на юге европейской части России. Второй по частоте, после мутации F508del, среди российских больных является мутация CFTRdele2,3(21kb), в среднем составляя 7,2%. Данное значение относительной частоты, самое высокое в Европе, согласуется с гипотезой о происхождении мутации CFTRdele2,3(21kb) на территории Восточной Европы среди славянских племен и проникновением ее в Западную Европу с востока. Следует отметить, что среди обследованных нами пациентов мутация CFTRdele2,3(21kb) обнаружена не только у русских, но и у пациентов с другой этнической принадлежностью: у армян, грузин, чеченцев и татар. Такие частые в мире мутации, как G542X и N1303K, обнаружены и в обследованной нами выборке, с частотами от 0,5% до 2-4% в разных регионах, что соответствует снижению встречаемости данных мутаций с удалением от средиземноморского региона. Мутации в 13 экзоне гена CFTR, 2143delT и 2184insA, являются относительно частыми мутациями среди изученных российских больных МВ, что согласуется с данными других отечественных авторов, проанализировавших независимые выборки больных МВ (Иващенко Т.Э., 2000; Корытина Г.Ф. и др., 2002; Одинокова О.Н. и др., 2006; Рукавичкин Д.В., 2007). Мутации G551D и R553X, распространенные во многих популяциях Европы, не были обнаружены ни у одного из обследованных нами больных МВ. По-видимому, эти мутации у пациентов из России являются крайне редкими, что согласуется с данными других авторов (Корытина Г.Ф. и др., 2002; Одинокова О.Н. и др., 2006; Рукавичкин Д.В., 2007), в исследованиях которых данные мутации также не были выявлены. Только в исследовании Т.Э. Иващенко мутации G551D и R553X были обнаружены у двух и одного из 815 больных, соответственно (Иващенко Т.Э., 2000). Тринадцать мутаций являются наиболее часто встречающимися у российских больных МВ (относительные частоты каждой из них превышают 0,005): F508del – 0,542, CFTRdele2,3(21kb) – 0,072, 2143delT – 0,021, W1282X – 0,020, N1303K – 0,019, 3849+10kbC>T – 0,019, 2184insA – 0,017, G542X - 0,013, 1677delTA – 0,008, 3821delT – 0,008, R334W – 0,007, L138ins – 0,006, 394delTT – 0,005, будучи диагностируемыми практически во всех изученных регионах России и суммарно составляя 75,7% от всех мутантных аллелей. Общая доля всех идентифицированных мутаций равна 77%. ^ Даже в результате изучения нуклеотидной последовательности всей кодирующей области гена CFTR доля не идентифицированных мутаций у российских больных МВ составляет не менее 20% (Verlingue C. et al., 1995). Поскольку известно, что несбалансированная экспрессия аллелей, возникающая вследствие полиморфного состояния регуляторных элементов характерна для 27% генов человека (Pastinen T. et al., 2006), а исследование этих регионов гена CFTR у российских пациентов с МВ ранее не проводилось, был осуществлен поиск возможных мутаций в 5’ -дистальной и промоторной области гена CFTR. Изучено семь регуляторных элементов, участие которых в определении уровня экспрессии гена CFTR было экспериментально доказано: cайты связывания транскрипционного фактора SP1, находящиеся в положениях -194 и -273 от точки инициации транскрипции гена (Chou J.L. et al., 1991); DHS–элемент (сайт, чувствительный к ДНКазе I) с позицией -20,9 тыс.п.н. от точки инициации транскрипции гена (Nuthall H.N. et al., 1999); CRE-элемент в положении 115 п.н. от ATG-кодона (Yoshimura K. et al., 1991; Pastinen T. et al., 2006); ССААТ-элемент в положении (-132) – (-119) н. от начала транслирующего кодона (Nuthall H.N. et al., 1999; Li et al., 1999; Pittman N. et al., 1995); сайты связывания с транскрипционным фактором Nf-kB в положениях (-1103) – (-1093) п.н. от начала инициации транскрипции гена (Brouillard F. et al., 2001) и SRE–элемент, находящийся в положении -108 нуклеотидов от сайта инициации транскрипции (René C. et al., 2005). Поиск мутаций в регуляторных элементах, участвующих в транскрипции гена CFTR, был осуществлен на выборках 83 образцов ДНК больных муковисцидозом, у которых не были найдены частые CFTR мутации (22 человека), либо была найдена только одна мутация в гене CFTR (61 пациент) (всего 105 хромосом с неизвестными мутациями), и 50 образцов ДНК здоровых индивидов. В результате проведенного SSCP-анализа в исследованных регуляторных элементах гена CFTR не было выявлено изменений подвижности фрагментов ДНК ни в одном образце. Можно предположить, что мутации в 5’ регуляторной и промоторной областях гена CFTR у российских больных, как и у пациентов в других популяциях мира, достаточно редки. ^ Для определения популяционных частот CFTR мутаций проанализированы выборки здоровых индивидов, проживающих в европейских регионах России и относящихся к пяти этносам: русские, марийцы, удмурты, чуваши, башкиры. Для каждого этноса проскринировано не менее 1000 хромосом. Методом мультиплексной ПЦР проанализированы семь CFTR мутаций: F508del, CFTRdele2,3(21kb), 1677delTA, 2143delT, 2184insA, 394delTT, 3821delT, суммарная доля которых у российских больных МВ составляет 67,3%. Регионы происхождения индивидов, размеры выборок и результаты исследования представлены в табл. 1. Таблица 1. CFTR мутации, обнаруженные в популяционных выборках.
В выборках русских из четырех регионов были обнаружены три разные мутации в гене CFTR: F508del, CFTRdele2,3(21kb) и 1677delTA, но только мутация F508del встретилась во всех регионах, поэтому у русских европейской части России возможно было оценить популяционную частоту только мутации F508del. Частоты мутации F508del в выборках русских представлены в табл. 2. При попарном сравнении частот мутации F508del во всех выборках, а также в выборках из г. Санкт-Петербурга (8/1000 хромосом) (Потапова, 1994) и г. Москвы (22/5046 хромосом) (Петрова Н.В., Гинтер Е.К., 1997) достоверные различия не выявлены. Отсутствие различий в частотах мутации F508del позволило объединить все выборки для получения более точного значения частоты мутации F508del у русских европейской части России, составившего 0,00518 (0,00398÷0,00663, при 95%-ом доверительном интервале) (табл. 2), что достоверно ниже, чем в ряде европейских популяций. Так, наибольшие значения частоты мутации F508del наблюдаются на северо-западе Западной Европы, достигая в Шотландии (Brock D.J. et al., 1998) и Дании (Brandt N.J. et al., 1994) 0,015 и 0,013, соответственно; в странах средиземноморского бассейна частота мутации F508del снижается, составляя, например, в Италии – 0,010 (Gasparini P. et al., 1999), а в Израиле (среди евреев-ашкенази) – 0,0089 (Kalman Y.M. et al., 1994). В Эстонии частота мутации F508del составила 0,0059 (Teder M. et al., 2001), это значение достоверно не отличается от полученного нами для русских европейской части России. Согласно данным Международного консорциума по муковисцидозу в Европе относительная частота мутации F508del снижается в направлении с севера-запада на юго-восток (WHO, 2004). По-видимому, так же изменяется и популяционная частота мутации F508del. Этому соответствует и значение частоты мутации F508del, полученное для коренного населения Индии (0,00209), что достоверно ниже, чем для обследованных русских популяций. Таблица 2. Частота мутации F508del в выборках русских.
В табл. 3 представлены значения частоты мутации F508del у четырех народов Волго-Уральского региона (марийцы, чуваши, удмурты, башкиры) в сравнении с русскими европейской части России. Таблица 3. Различие в частоте мутации F508del между пятью этническими группами.
Примечания: р – русские; м – марийцы; ч – чуваши; у – удмурты; б - башкиры Частота мутации F508del в выборках удмуртов, чувашей, башкир и марийцев не должна превышать 0,00530, 0,00496, 0,00458 и 0,00296, соответственно (при 95% доверительном интервале). Различия в частоте этой мутации между выборками русских и марийцев, русских и чувашей, русских и башкир достоверны (p=0,05), а русских и удмуртов достоверны только на 10%-ом уровне значимости. Таким образом, популяционная частота мутации F508del у народов Волго-Уральского региона ниже, чем у русских европейской части России и в ряде западноевропейских популяций (Brandt N.J. et al., 1994; Brock D.J. et al., 1998; Gasparini P. et al., 1999; Kalman Y.M. et al., 1994). Это может быть связано как с более низкой частотой муковисцидоза, так и различием в спектрах приводящих к муковисцидозу мутаций у автохтонного населения Волго-Уральского региона и русских европейской части России. Косвенным свидетельством в пользу этого может служить тот факт, что в работе Г.Ф. Корытиной с соавторами при обследовании больных МВ у 4 башкир, 1 чуваша и 1 удмурта мутация F508del не была обнаружена (Корытина Г.Ф. и др., 2002). Поскольку частоты выявленных мутаций в выборках Волго-Уральского региона малы, дальнейший расчет частоты МВ проведен только для популяций русских европейской части России. ^ Впервые оценка частоты муковисцидоза была получена нами в 1997 году в результате скрининга 2523 новорожденных г. Москвы на мутацию F508del и составила 1:12300 (Петрова Н.В., Гинтер Е.К., 1997). Для получения более точной оценки МВ данные по частоте мутации F508del в Ростовской, Кировской, Тверской и Псковской областях, г. Москве и г. С.-Петербурге (Потапова О.Ю., 1994) были объединены: в выборке 4347 человек (8694 хромосомы) обнаружено 45 носителей мутации F508del. Частота мутации F508del составила 0,00518 (0,00398÷0,00663, при 95%-ом доверительном интервале) (табл. 2). Относительная доля мутации F508del среди больных МВ из европейской части России равна 54,4% (0,544=708/1302). Таким образом, число всех мутантных аллелей гена CFTR в изученной выборке 8694 хромосом должно быть 83 (45/0,544), а частота всех мутантных аллелей гена CFTR (q) - 0,00955 (0,00789÷0,01145, при 95%-ом доверительном интервале; 83/8694). Тогда частота МВ (q2) в популяциях русских в Европейской части России составит 0,0000912, или 1:10965. Полученная нами оценка согласуется с предварительными результатами скрининга новорожденных на МВ в Российской Федерации, проведенного с января 2007 года по июль 2008 года (Tolstova V.D. et al, 2008): частота МВ в европейских регионах России составляет 0,0000966 (0,0000819÷0,0001145), или 1:10352 новорожденного. По-видимому, частота МВ в популяциях европейской части России ниже, чем во многих популяциях Западной Европы (1:2500-4500), но сравнима с частотами МВ в некоторых популяциях северо-восточной Европы (например, в Швеции и Финляндии, 1:7000 и 1:26000, соответственно) и в Турции (1 : 10000 новорожденных). ^ Следующим этапом работы явилась разработка протокола комплексной ДНК-диагностики МВ в российских семьях на основе полученных результатов по анализу частых мутаций и анализу полиморфизма внутригенных и внегенных маркеров гена CFTR. Он заключается в использовании методов прямой и косвенной идентификации мутантных аллелей у больных, родителей и других членов семей (рис. 2). При прямой диагностике частых мутаций идентифицируют 77% мутантных аллелей. При этом в 58% семей с МВ идентифицированы обе мутации, в 33% - одна мутация, в 9% - на обеих хромосомах мутация не определена. В двух последних ситуациях проводим косвенную диагностику с использованием внутригенных и внегенных полиморфизмов, позволяющую повысить число информативных семей не менее, чем до 95%.  Рис. 2. Схема проведения комплексной ДНК-диагностики в семьях с МВ. ^ С целью выяснения эффективности использования внутригенных полиморфизмов для диагностики МВ в семьях, где один или оба мутантных аллеля неизвестны, проведен анализ сцепления аллелей четырех внутригенных полиморфизмов IVS1CA, IVS8CA, IVS6aGATT, IVS17bCA в семьях с МВ (344 больных и 488 их родителей). Выявлено достоверное различие частот аллелей в выборках нормальных и мутантных хромосом и неравновесие по сцеплению для определенных аллелей для всех изученных внутригенных маркеров. Анализ гаплотипов также выявил достоверное различие частот гаплотипов в выборках нормальных и мутантных хромосом и неравновесие по сцеплению для определенных гаплотипов внутригенных маркеров. Наиболее частым в выборке нормальных хромосом является гаплотип 22-7-16-13 (22,5%), в выборке мутантных хромосом самыми частыми являются 21-6-17-13 (29,5%) и 21-6-23-13 (27,5%), среди нормальных хромосом обнаруженные менее чем в 3%; и гаплотип 22-7-16-13 (15,2%). В результате анализа сцепления CFTR мутаций с гаплотипами четырех внутригенных маркеров выявлены три группы мутаций, ассоциированные с определенными гаплотипами: мутации F508del, N1303K, G542X, 2143del и 394delTT – с гаплотипом 21-6-23-13; мутации CFTRdele2,3(21kb), 1677delTA, L138ins – с гаплотипом 22-7-16-13 и мутации W1282X, R334W – с гаплотипом 26-7-17-17. Мутацию F508del считают самой древней мутацией в гене CFTR: в зависимости от используемых для расчетов ДНК-маркеров ее возраст оценивают от 6000 до 35000-52000 лет назад. Большинство хромосом с мутацией F508del ассоциированы с двумя группами гаплотипов, имеющих аллели 23 и 17 маркера IVS8CA в своем составе. В исследованной нами выборке это гаплотипы 21-6-23-13 и 21-6-17-13. Предполагают, что гаплотип, ассоциированный с аллелем 23, является более древним по сравнению с гаплотипом с аллелем 17 и, возможно, исходным, на котором произошла мутация F508del. Вероятно, что появление гаплотипа, ассоциированного с аллелем 17, произошло вследствие неравного кроссинговера (Morral N. et al., 1994; Kaplan N.L. et al., 1994). Мутации N1303K и G542X также считают древними в истории человечества и произошедшими в той же исходной популяции с одинаковым генетическим составом, что и мутация F508del (Claustres M. et al., 1996; Mateu E. et al., 2002). Об этом свидетельствует и их ассоциация с древним гаплотипом 21-6-23-13. С этим гаплотипом сцеплены мутации 2143del и 394delTT, о времени происхождения которых данные в литературе отсутствуют. Но их сцепление с древним гаплотипом 21-6-23-13 может указывать на то, что источником проникновения этих мутаций на территорию Восточной Европы могла быть та же исходная популяция, с которой связано и распространение мутации F508del. Появление мутации W1282X произошло на территории Ближнего Востока относительно недавно, а проникновение и распространение ее на территорию Европы связано с миграцией популяции евреев-ашкенази (Claustres M. et al., 1996; Bobadilla J.L. et la., 2002). В большем числе случаев мутация W1282X у российских больных МВ сцеплена с гаплотипом 26-7-17-17, относительно редким как среди мутантных, так и среди нормальных хромосом. С этим же гаплотипом сцеплена и мутация R334W, что может говорить о ее проникновении на территорию России одновременно с мутацией W1282X и из одной исходной популяции. Мутация 3849+10kbC>T ассоциирована с двумя гаплотипами, различающимися по аллелям всех четырех полиморфизмов 21-6-23-13 и 26-7-17-17, что может говорить о неоднократности ее происхождения и возможном проникновении ее на территорию России из разных исходных популяций. Ассоциация мутаций CFTRdele2,3(21kb), 1677delTA, L138ins – с гаплотипом 22-7-16-13, наиболее частым среди нормальных хромосом, возможно свидетельствует об относительно недавнем происхождении данных мутаций. Мутация 2184insA сцеплена с гаплотипом 21-7-16-17, редким и на мутантных, и на нормальных хромосомах. Определение гаплотипа, сцепленного с конкретной мутацией, позволяет прояснить источник происхождения и распространения мутации в популяции, что важно при изучении спектров мутаций в разных этнических группах больных МВ, а также является дополнительным контролем при проведении ДНК-диагностики, что особенно важно для пренатальной диагностики. ^ Гетерозиготность среди носителей мутантных МВ аллелей и число информативных семей определяют эффективность полиморфизма, используемого при косвенной ДНК-диагностики в семьях с МВ (табл. 4). Таблица 4. Гетерозиготность облигатных носителей CFTR мутаций и информативность семей, отягощенных муковисцидозом, по внутригенным и внегенным ДНК-маркерам.
Примечание: H – гетерозиготность; N – число обследованных родителей; I – информативность; n – число обследованных семей. В результате анализа гетерозиготности облигатных носителей мутантных аллелей (родителей) и информативности семей по четырем внутригенным IVS1CA, IVS8CA, IVS6aGATT, IVS17bCA и пяти внегенным XV-2c, KM19, CS7, J3.11, W30 полиморфным ДНК-маркерам показано, что наиболее эффективным для косвенной диагностики МВ является полиморфизм динуклеотидных CA повторов в 1 интроне гена CFTR (IVS1CA): Для этой системы характерна максимальная гетерозиготность облигатных носителей мутантных МВ аллелей (0,79) и самое высокое число полностью информативных семей (47%) по сравнению с другими ДНК-маркерами как внутригенными, так и внегенными (табл. 4). Использование всех изученных маркерных систем наряду с типированием частых мутаций (комплексная диагностика) позволяет достигнуть полной информативности практически во всех семьях, которым необходима пренатальная диагностика МВ (табл. 5). Так при прямой ДНК-диагностике в 237 полных семьях полностью информативными оказались 151 (64%), частично информативными – 66 (28%), а неинформативными – 20 (8%) семей. Анализ полиморфных маркеров позволил достичь полной информативности во всех семьях с двумя не идентифицированными мутациями, и лишь в одной семье с одним не идентифицированным аллелем не удалось подобрать информативную систему. Т.е. в результате использованного нами протокола комплексной ДНК-диагностики полностью информативными оказались 99,5% семей. Таблица 5. Результат комплексной ДНК-диагностики в семьях с МВ.
Примечание: I – информативность; n– число семей ^ Одним из вопросов, возникающих при консультировании семей, выявленных при пресимптоматической диагностике, либо при диагностике МВ у плода является прогноз течения заболевания, в связи с этим исследование гено-фенотипических корреляций у российских больных МВ представляет значительный интерес. Большое число мутаций в гене CFTR, а, следовательно, и широкое разнообразие генотипов предопределяет трудности в выявлении гено-фенотипических корреляций. Многочисленными исследованиями показана четкая зависимость между тяжестью поражения функции поджелудочной железы и CFTR генотипом больного МВ. Мутации I, II, III классов, при которых функция хлорного канала CFTR полностью нарушена, ассоциируют с панкреатической недостаточностью, их относят к «тяжелым». Наличие в генотипе больного, хотя бы одной мутации IV, V, VI классов, при которых частично сохраняется функция белка CFTR, ассоциировано с сохранением остаточной функции поджелудочной железы, их называют «мягкими». «Мягкие» мутации доминируют над «тяжелыми» в отношении функции поджелудочной железы. Взаимосвязь же CFTR мутаций с другими клиническими симптомами МВ не столь очевидна (Zielenski J., 2000; Parad R.B. et al., 1999; Mekus F. et al., 2000). У 280 российских пациентов с двумя идентифицированными CFTR аллелями определены 22 разные мутации (две из них: 1898+1G>A и R668C выявлены в совместном исследовании (Verlingue C. et al., 1995)): 16 из них относятся к «тяжелым»; 6 – к «мягким» в соответствии с тяжестью поражения поджелудочной железы. Группу больных МВ с «тяжелыми» генотипами составили 257 пациентов с двумя «тяжелыми» мутациями – мутациями I и/или II классов; в группе с «мягкими» генотипами – 23 пациента, имеющих, по крайней мере, одну «мягкую» мутацию – мутации IV или V классов. В этих группах проведена оценка ряда клинических параметров и симптомов, характеризующих степень вовлеченности органов системы пищеварения и органов дыхания в патологический процесс. Заболевание начинается достоверно раньше у больных с «тяжелыми» генотипами (0,18±0,03 года против 1,87±0,98 года; p=0,000), и начало кишечного синдрома отмечается у этих пациентов также в более раннем возрасте (0,30±0,07 года против 3,20±1,66 года; p=0,029). Моносимптоматический дебют заболевания отмечен у 79% пациентов в группе с «тяжелыми» генотипами и у 71% больных в группе с «мягкими» генотипами (p=0,52). Но у больных с тяжелыми генотипами заболевание достоверно чаще дебютирует кишечным синдромом (66% в группе «тяжелые» против 29% в группе «мягкие»; p=0,008), тогда как у больных с «мягкими» генотипами достоверно чаще дебютом являются поражения бронхолегочной системы (42% в группе «мягкие» против 13% в группе «тяжелые»; p=0,0095). Показано, что легочные симптомы преобладают в клинической картине больных с «мягкими» генотипами: так частота больных с изолированной легочной формой заболевания достоверно выше в этой группе (24% против 1,6%; p=0,0002), тогда как такие осложнения органов пищеварения, как мекониальный илеус и синдром дистальной интестинальной обструкции (синдром непроходимости дистального отдела кишечника) наблюдаются только в группе с «тяжелыми» генотипами (6,5% и 7,4%, соответственно), а поражения печени являются более частыми у больных с «тяжелыми» генотипами по сравнению с пациентами с «мягкими» генотипами (30,8% против 9,1%; p=0,056). Бронхолегочные нарушения, приводящие к снижению показателей функции внешнего дыхания (ФВД), начинаются раньше у больных с «тяжелыми» генотипами в связи с более ранней колонизацией органов дыхания патогенной микрофлорой (P.aeruginosa), что в свою очередь обусловливает значительно более раннее ухудшение нутритивного статуса по сравнению с больными, имеющими, по крайней мере, одну мягкую мутацию (табл. 6). Таблица 6. Средний возраст клинических проявлений МВ у больных с «тяжелыми» и «мягкими» генотипами.
Примечание: В скобках представлен диапазон значений, целыми числами – объем выборок. Показана корреляция между CFTR генотипом и продолжительностью жизни, рассчитанной как функция выживания методом множительных оценок Каплана-Мейера: в течение всего периода наблюдения в группе с «мягкими» генотипами оценка выживаемости выше, чем в группе с «тяжелыми» генотипами (согласно тесту Вилкоксона, обобщенному Геханом, z=-2,38, p=0,017). К концу периода наблюдения (35 лет) кумулятивная доля выживших составляет 44,4% в группе с «мягкими» генотипами и около 11% в группе с «тяжелыми» генотипами. Наблюдаемые различия клинической картины у больных из разных групп согласуются с гипотезой о разной чувствительности разных тканей к нарушениям проводимости хлорного канала CFTR. Легочная ткань более чувствительна к степени потери функции белка CFTR по сравнению с тканями органов пищеварительной системы, по крайней мере, поджелудочной железы. Поэтому у больных, имеющих, по крайней мере, одну «мягкую» мутацию, в первую очередь наблюдаются поражения со стороны бронхолегочной системы, а поражения органов пищеварения начинаются позже и отмечаются реже и, возможно, протекают в более мягкой форме, чем у больных с «тяжелыми» генотипами. Итак, анализ гено-фенотипических корреляций при делении генотипов на «тяжелые» и «мягкие» в соответствии со степенью дефекта хлорного канала, зависящего от молекулярных последствий CFTR мутаций, позволил выявить ряд закономерностей в исследованной выборке российских больных МВ, свидетельствующих о более мягком течении и благоприятном прогнозе заболевания у больных, имеющих, по крайней мере, одну мутацию IV и/или V класса по сравнению с больными, имеющими две мутации I и/или II классов. ^ Следующим этапом исследования явилось изучение возможных генов-модификаторов клинической картины МВ, т.к. на практике известно, что даже у больных с одинаковыми генотипами наблюдаются различия в течении заболевания. В настоящее время для не менее 20 разных генов предполагается участие в модуляции выраженности тех или иных симптомов при МВ. Для анализа были выбраны 5 генов (eNOS, TNFA, LTA, MBL2, GSTM1), продукты которых задействованы в процессах иммуномодуляции, воспалительной реакции и детоксикации ксенобиотиков, а также ген HFE1 (гемохроматоза), для которого в ряде исследований показана ассоциация с частотой мекониального илеуса (табл. 7). Таблица 7. Изученные полиморфизмы генов возможных модификаторов клинических проявлений муковисцидоза.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 2
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям