Изучение апоптоза лимфоцитов крови при профаллергодерматозах 14. 00. 50. Медицина труда

Актуальность проблемы

Профессиональный аллергический дерматоз - заболевание кожи, имеющее в силу широкой распространенности и медицинских последствий заметное социально-экономическое значение. Наиболее часто профаллергодерматозы регистрируются у рабочих строительных и металлообрабатывающих профессий, когда причиной заболевания являются металлы-сенсибилизаторы, входящие в состав цемента и различных легированных сталей [Н.Ф. Измеров и др., 1993; И.В. Яцына и др., 2004; Н.И. Измерова, 1994]. К сожалению, существующие методы профилактики и лечения не всегда оказываются эффективными в борьбе с этим заболеванием. Такая ситуация требует разработки новых подходов к лечению и профилактике профаллергодерматозов, что заставляет нас обратиться к детальному изучению патогенеза.

В соответствии с современными представлениями, аллергическое кожное воспаление при профаллергодерматозах представляет собой клеточно-опосредованную реакцию, ключевую роль в которой играют Т-лимфоциты [Van Loveren H. et al., 1983; Robert K. et al., 1999]. Известно также, что апоптоз лимфоцитов является важнейшим регулятором количественного и качественного состава популяции лимфоцитов и во многом определяет баланс субпопуляций, соответствующий нормальному функционированию иммунной системы. Изменения процессов апоптоза отдельных субпопуляций лимфоцитов могут носить адаптационный характер, но зачастую приводят к развитию заболеваний [C.B. Thomson, 1995].

Исследования роли апоптоза в патогенезе различных иммунообусловленных заболеваний в основном имеют своей целью выявление изменений апоптоза иммунокомпетентных клеток и клеток-мишеней при различных формах патологии, раскрытие механизмов активации и реализации апоптоза и выявление его патогенетического значения. Такие исследования проводились при аутоиммунных заболеваниях - системной красной волчанке, ревматоидном артрите, различных иммунодефицитных состояниях, включая апластические лимфопении, СПИД [Новиков и др.,1996; Ярилин и др.,1996; Krammer P.H. et. al., 1994]. Большую группу заболеваний, связанных с нарушениями апоптоза, составляют онкологические заболевания. Исследования апоптоза лимфоцитов при воспалительной аллергопатологии проводились в основном на модели бронхиальной астмы [Ohta K. et al., 1999; Vingola A. M., 1999].

Роль нарушений процессов апоптоза как функции поддержания гомеостаза иммунной системы в патогенезе поражений кожи, в том числе от воздействия металлов-сенсибилизаторов, изучена недостаточно.

Цель работы: изучить апоптоз лимфоцитов крови и его значение в механизмах патогенеза у больных профаллергодерматозами от воздействия металлов-сенсибилизаторов.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. 
   Методами люминесцентной микроскопии и проточной цитофлюориметрии, оценить уровень апоптоза лимфоцитов крови у больных профаллергодерматозами от воздействия металлов-аллергенов.
   
2. 
   Методом проточной цитофлюориметрии оценить циркулирующую субпопуляцию лимфоцитов, тропных к коже (CLA+) и ее апоптоз.
   
3. 
   Дать характеристику цитохимических параметров свободнорадикальных процессов, энергетической активности цитоплазматических структур лимфоцитов крови у обследованного контингента, сопоставить с показателями апоптоза лимфоцитов.
   
4. 
   Провести сопоставление показателей апоптоза лимфоцитов с клинической картиной, данными цитохимических исследований, а также оценить роль апоптоза лимфоцитов крови при профаллергодерматозах от воздействия металлов-аллергенов.
   
5. 
   Оценить эффективность лечения больных профаллергодерматозами от воздействия металлов-аллергенов по данным показателей апоптоза лимфоцитов крови.
   

Научная новизна работы:

• 
  С помощью разработанного комплекса клинико-лабораторных методов впервые показана роль апоптоза лимфоцитов крови в патогенезе профаллергодерматозов.
  
• 
  Впервые дана оценка циркулирующей субпопуляции лимфоцитов, тропных к коже (CLA+) – основных эффекторных клеток кожного воспаления крови у больных профессиональными аллергодерматозами и выявлена взаимосвязь количества этих клеток, распространенности и выраженности кожных клинических проявлений.
  
• 
  Показана значимость определения показателей апоптоза лимфоцитов и содержания тропных к коже лимфоцитов для оценки тяжести заболевания и эффективности лечения профаллергодерматозов на разных стадиях заболевания.
  

Практическая значимость работы:

Определение показателей апоптоза лимфоцитов методами люминесцентной микроскопии и проточной цитофлюориметрии – в совокупности с содержанием CLA+ лимфоцитов, может быть использовано для характеристики тяжести заболевания при обследовании больных профаллергодерматозами и оценки эффективности лечения.

Материалы исследований легли в основу:

1. 
   Проекта методических рекомендаций «Клинико-лабораторная оценка нуклеолярного аппарата и апоптоза лимфоцитов крови при профессиональном воздействии вредных химических и физических факторов».
   
2. 
   Проекта программы послевузовской профессиональной подготовки (образовательная программа, учебная программа, тестовые задания) по специальности «клиническая лабораторная диагностика» (шифр – 040107) (клиническая ординатура, 3456 часов).
   

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на конференции клинического отдела по изучению клинико-патогенетических основ профессиональных и производственно-обусловленных заболеваний НИИ медицины труда РАМН (11.10.2006). Материалы диссертации представлены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005); на IV Всероссийском конгрессе «Профессия и здоровье» (Москва, 2005); на 28-ом Международном конгрессе по медицине труда (Милан, Италия, 2006); на заседаниях Ученого Совета ГУ НИИ медицины труда РАМН (Москва, 2005, 2006).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объем и структура работы: Диссертация изложена на 110 страницах, состоит из введения, 4 глав, выводов. Иллюстрирована 20 таблицами, 10 рисунками. Список использованной литературы включает 25 отечественных и 188 зарубежных источников.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. 
   Апоптоз лимфоцитов крови усиливается при профаллергодерматозах и является важной частью патогенетической картины заболевания.
   
2. 
   Апоптоз лимфоцитов крови связан с изменениями клеточных энергетических процессов и генерацией свободных радикалов.
   
3. 
   Показатели апоптоза лимфоцитов крови и содержания в крови субпопуляции лимфоцитов тропных к коже могут быть использованы для лабораторной диагностики профаллергодерматозов и оценки эффективности терапии.
   

^ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для выполнения настоящей работы в условиях стационара ГУ НИИ МТ РАМН было обследовано 60 человек - пациентов отделения дерматологии и профилактики заболеваний кожи, страдающих различными формами профаллергодерматозов. 15 пациентов, страдающих профаллергодерматозами, были обследованы в динамике (до и после лечения в стационаре). Контрольную группу составили 22 человека, не имевших клинических и лабораторных признаков каких-либо аллергических и/или воспалительных заболеваний.

Всем обследованным пациентам по результатам клинико-лабораторного обследования был поставлен диагноз профессиональной экземы или дерматита. В соответствии с санитарно – гигиенической характеристикой условий труда, все они подвергались воздействию соединений металлов-сенсибилизаторов – хрома, никеля, кобальта, входящих в состав производственных материалов. Стаж работы составлял не менее 10 лет. Большинство пациентов - работники строительных профессий - маляры-штукатуры, бетонщики, отделочники, плиточники. Работа других пациентов связана с обработкой металла – токари, слесари. Всем пациентам по результатам клинико-лабораторного обследования, включавшего определение сенсибилизации к соединениям металлов, был поставлен диагноз профессиональной экземы или дерматита от воздействия металлов – сенсибилизаторов.

В соответствии с результатами анализа данных клинического обследования (историй болезни), все обследованные пациенты были разделены на две группы в соответствии с тяжестью клинических проявлений - с распространенностью дерматологических признаков аллергодерматоза.

Первую группу (20 человек) составили пациенты, имевшие клинически выраженные распространенные кожные проявления аллергогодерматоза. В группе было 9 женщин и 11 мужчин в возрасте от 37 до 63 лет, (в среднем 49,09 лет), со стажем работы в профессии от 13 до 32 лет.

Вторую группу (40 человек) составили пациенты, имевшие ограниченное распространение кожных поражений, которые локализовались на верхних конечностях (преимущественно кистях и предплечьях). В этой группе было 24 женщины и 16 мужчин, в возрасте от 34 до 65 лет, (в среднем 49,42 лет), со стажем от 17 до 37 лет.

В настоящей работе был использован клинико-лабораторный комплекс исследования, включающий гематологические, цитохимические методы, исследование апоптоза лимфоцитов методами люминесцентной микроскопии и проточной цитометрии.

Проведенные гематологические исследования включали количественную, морфологическую и функциональную оценку клеток периферической крови. Пробы капиллярной крови обследованных групп были исследованы при помощи гематологического счетчика НЕМА-screen 10. Проводился подсчет форменных элементов в обследованных группах, морфологическое исследование клеток крови и подсчет лейкоцитарной формулы по общепринятой методике.

Апоптоз лимфоцитов крови оценивался двумя методами: люминесцентно-микроскопическим и проточно-цитометрическим.

Для выявления апоптических лимфоцитов люминесцентно-микроскопическим методом в крови обследованных, лимфоциты прижизненно окрашивались флюоресцирующим ДНК-красителем акридиновым оранжевым, позволяющим хорошо визуализировать морфологию хроматина клеток. Для апоптоза характерны конденсация хроматина, пикноз ядра и оранжевая люминесценция ядер. Ядра интактных клеток светятся зеленым. Метод отличается простотой постановки, относительной дешевизной, малой инвазивностью (основывается на исследовании капиллярной крови). Метод позволяет количественно оценить апоптоз всей популяции лимфоцитов крови.

Проточно-цитометричесий метод детекции апоптозных клеток основан на маркировании клеток с нарушениями ассиметрии цитоплазматической мембраны маркером Annexin V с одновременным иммунофенотипированием лимфоцитов антителами к CD3 и CLA для выявления соответствующих субпопуляций. Применение проточного цитофлюориметра предоставляет возможности точной и детальной оценки апоптоза лимфоцитов каждой выбранной субпопуляции лимфоцитов отдельно. Метод обладает достаточной для целей исследования чувствительностью – способен обнаруживать единичные клетки в состоянии апоптоза, и обеспечивает высокую достоверность исследования за счет обработки значительного количества клеток (порядка 2 х 10⁴) из каждой пробы.

Кроме оценки апоптоза среди всей популяции циркулирующих Т-лимфоцитов, нами проведена оценка количества и апоптоза циркулирующей субпопуляции Т-лимфоцитов, положительной по маркеру CLA. Для этого выделенные лимфоциты в отдельных пробирках помечались моноклональными антителами CLA-FITC и исследовались аналогичным образом.

Для оценки функционального состояния лимфоцитов использованы показатели ферментов митохондрий – сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и α-глицерофосфатдегидрогеназы (α-ГФДГ), определяемые по методу Р.П. Нарциссова (1969).

Для оценки системы «свободные радикалы-антиоксидантная защита» использованы показатели спонтанного НСТ-теста и активности миелопероксидазы. Функциональную активность лейкоцитов, их способность продуцировать активные формы кислорода оценивали по бессубстратному восстановлению нитросинего тетразолия до формазана (НСТ-тест по методу Park и соавт., 1987). Активность миелопероксидазы нейтрофилов определяли по методу Sato (1962).

Для лабораторной оценки общей воспалительной и аллергической реакции использовали показатели щелочной и кислой фосфатазы нейтрофилов.

Для оценки аллергической и воспалительной реакции крови определяли активность щелочной фосфатазы и кислой фосфатазы нейтрофилов методом азосочетания по Goldberg и Barka (1962).

В качестве лабораторного теста, выявляющего сенсибилизацию к соединениям Cr,Ni,Co, использован стимулированный НСТ-тест (Л.А.Иванова, 1991).

Полученные результаты обрабатывали с использованием приемов описательной и вариационной статистики. С целью индивидуальной оценки данных различных показателей проводили внутригрупповой анализ частоты встречаемости измененных показателей, выходящих за пределы значений контрольной группы. Для определения наличия и установления достоверности различий анализируемых показателей в сравниваемых группах, с учетом размера выборки и распределения данных, применялся непараметрический U - тест для двух независимых выборок по Манн-Уитни. Различия считали статистически достоверными при значениях р<0,05. Для обнаружения связей между различными измеренными показателями вычислялись коэффициенты корреляции Спирмена (r). Связи считали достоверными при р<0,05. Расчеты проводили с использованием специализированного статистического программного пакета SPSS.


^ СОБСТВЕННЫЕ НАБЛЮДЕНИЯ

Результаты гематологического обследования.

В рамках наших исследований было выполнено определение показателей морфологического состава крови обследованных. Результаты показывают, что изменения большинства гематологических показателей (количества клеток крови и морфологического состава) носят неярковыраженный характер. (Таблица 1). Так, показатели красной крови (эритроцитов, гемоглобина) оставались в пределах нормальных значений у всех обследованных. Статистически достоверных отличий этих показателей в группах пациентов с профаллергодерматозами по сравнению с контрольной группой выявить не удалось.

Анализ количественных показателей лейкоцитов крови позволил выявить отклонения некоторых параметров от нормы и группы контроля, характерные для профаллергодерматозов. Так, наблюдается достоверное увеличение показателя эозинофильных лейкоцитов крови у пациентов с профаллергодерматозами. Повышенное количество эозинофилов отмечалось в 2 группах пациентов, в группе 1 до 0,20±0,033, и до 0,22±0,021 во 2 группе, при 0,18±0,004 в норме (p<0,05). Также обращает на себя внимание увеличение в группах пациентов с профаллергодерматозами количества базофильных лейкоцитов, до значений 0,1±0,011 в первой и 0,07±0,008 во 2 группе, при норме 0,018±0,008, (p<0,05). Повышение количества эозинофилов и базофилов закономерно, свидетельствует об аллергическом характере патологического процесса. Результаты анализа встречаемости измененных показателей лимфоцитов свидетельствуют об их снижении у значительной доли пациентов с аллергодерматозами (у 30% лиц 1 группы и 35% лиц 2 группы).

Таблица 1.

Гематологические показатели в группах обследованных. (M±m)

ГРУППЫ	Гемоглобин (г/л)		Эритроциты (х 1012/л)		Лимфо-циты (х 109/л)	Нейтро-филы (х 109/л)	Эозино-филы (х 109/л)	Базо-филы (х 109/л)	Моноциты (х 109/л)
	М	Ж	М	Ж
1. Распространенные формы, n = 20	140,64± 6,1	132,15±6,4	4,44± 0,28	4,2± 0,23	2,32± 0,24	4,06± 0,21	0,20± 0,033 *	0,1± 0,011*	0,54± 0,073
2. Локальные формы, n = 40	141,63±3,14	136,15± 3,29	4,56± 0,14	4,1± 0,11	2,24± 0,14	3,71± 0,11	0,22± 0,021 *	0,07± 0,008 *	0,42± 0,041
Нормы показателей	149,7± 0,42	127,2± 0,47	4,7± 0,35	4,14± 0,017	1,955± 0,02	3,96± 0,058	0,129± 0,012	0,018± 0,004	0,352± 0,036

*Достоверные отличия, Р<0,05


Результаты определения содержания субпопуляций общих Т-лимфоцитов

(CD3+) и тропных к коже лимфоцитов (CLA+).


Результаты количественной оценки методом проточной цитометрии циркулирующих субпопуляций лимфоцитов - общих Т-лимфоцитов (CD3+) и тропных к коже лимфоцитов (CLA+) представлены в таблице 2.


Таблица 2.

Содержание CD3+ и CLA+ лимфоцитов в группах обследованных. (M±m)

ГРУППЫ	Содержание СD3+ лимфоцитов		Содержание CLA+ лимфоцитов
	Абс. содержание (х 109/л)	%	Абс. содержание (х 109/л)	%
^ 1.Распространенные формы, n = 20	1,65±0,20	69,73±2,87	0,17*±0,02	7,14*±0,67
^ 2.Локальные формы, n = 40	1,62±0,12	71,15±1,88	0,12±0,01	5,50±0,39
Контроль, n = 22	1,80±0,12	74,95±1,60	0,10±0,01	4,54±0,36

*Различия достоверны при Р<0,05.


Результаты показывают, что с увеличением тяжести заболевания наблюдается тенденция к снижению количества Т-лимфоцитов.

Результаты определения в периферической крови CLA+ лимфоцитов показывают, что их содержание у здоровых лиц (контрольная группа), не имевших воспалительных поражений кожи, находится в пределах 4,54±0,36% от всей популяции циркулирующих лимфоцитов. Абсолютное количество CLA+ лимфоцитов в крови обследованных контрольной группы в среднем составляет 0,10±0,01 х10⁹ клеток /л. У пациентов 1 группы (распространенные формы профаллергодерматоза) содержание CLA+ лимфоцитов достоверно повышается, и достигает средних значений 7,14±0,67%, абсолютный показатель – 0,17±0,02 х10⁹ клеток /л., (р<0,05) У пациентов 2 группы (локализованные формы аллергодерматоза) 5,50±0,39% или 0,12±0,01х10⁹ клеток /л являются CLA – положительными, однако достоверного отличия показателей 2 группы пациетов от контрольной группы не выявлено.

Анализ встречаемости измененных показателей демонстрирует, что в 1 группе с распространенными формами профаллергодерматоза 57,1% обследованных характеризуются повышенными показателями содержания CLA+ лимфоцитов в крови. В то же время случаев с пониженными показателями в этой группе не отмечено. Во 2 группе 33,3% обследованных продемонстрировали повышенные показатели, доля пониженных составила 3,3%. В контрольной группе по 13,6 % обследованных продемонстрировали повышенные и пониженные показатели. Выявленный характер распределения лиц с увеличенными показателями по группам пациентов показывает, что увеличение показателей CLA+ лимфоцитов у пациентов связано с тяжестью заболевания и отражает активность патологического процесса в коже.


Результаты исследования апоптоза лимфоцитов крови.

Результаты определения апоптоза всей популяции лимфоцитов крови люминесцентно-микроскопическим методом представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Содержание апоптических лимфоцитов по данным люминесцентно-микроскопического исследования. (M±m)

ГРУППЫ	Содержание апоптических лимфоцитов, %
^ 1.Распространенные формы, n = 20	4,98±0,42*
2.Локальные формы, n = 40	3,12±0,38*
Контроль, n = 22	2,10±0,31

*Различия достоверны при Р<0,05.


Как видно из таблицы 3, по данным люминесцентно-микроскопического исследования лимфоциты пациентов с распространенными формами аллергодерматозов подвергаются апоптозу в большем количестве, чем лимфоциты здоровых лиц. У пациентов с локальными формами апоптоз лимфоцитов также повышен по сравнению с контролем.

Для оценки стабильности индивидуального уровня спонтанного апоптоза нами проведены специальные исследования, в ходе которых у 5 человек контрольной группы произведено 3 определения апоптоза лимфоцитов крови методом проточной цитометрии с интервалом 2 недели. При этом только у 1 обследованного отклонения показателей апоптоза от первоначально установленного значения превышали ±1/2 величины (результаты 3 измерений: 2,2% - 3,4% - 2,9%), у остальных обследованных – не более 1/2 величины. Такая стабильность индивидуального уровня спонтанного апоптоза позволяет использовать его показатели в лабораторно-клинической практике, в том числе для оценки эффективности лечения.

Результаты проточно-цитометрической оценки апоптоза субпопуляций циркулирующих лимфоцитов (общих Т- и тропных к коже) представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Показатели апоптоза CD3+ и CLA+ лимфоцитов в группах обследованных. (M±m)

ГРУППЫ	Апоптоз СD3+ лимфоцитов		Апоптоз CLA+ лимфоцитов
	Абс. содержание (х 109/л)	%	Абс. содержание (х 106/л)	%
^ 1.Распространенные формы, n = 20	0,063±0,010*	5,34±0,36*	0,74±0,13*	7,08±0,99
^ 2.Локальные формы, n = 40	0,041±0,0045*	3,38±0,28*	0,53±0,12*	6,80±0,75
Контроль, n = 22	0,035±0,021	2,68±0,0044	0,45±0,088	7,85±0,76

*Различия достоверны при Р<0,05.


Как показывают результаты, наиболее подвержены спонтанному апоптозу в циркуляторном русле Т-лимфоциты пациентов с распространенными формами профаллергодерматоза (1 группа). Эти пациенты демонстрируют уровень апоптоза достоверно повышенный по сравнению с показателями контрольной группы и пациентов с локализованными формами профаллергодерматоза (2 группа). Пациенты 2 группы также отличаются от «здоровых» увеличенным апоптозом Т-лимфоцитов, однако в этом случае различия не столь значительны.

Анализ встречаемости измененных показателей выявил, что в 1 группе (распространенные формы) у 85,71% пациентов апоптоз Т-лимфоцитов превышал значение 4,13%. Сниженных показателей в 1 группе не наблюдалось. Во 2 группе (локализованные формы) у 23,68% отмечено повышение апоптоза, снижения в этой группе также не выявлено ни у одного пациента. В контрольной группе по 18,18% обследованных продемонстрировали повышенный и пониженный уровень апоптоза лимфоцитов. Таким образом, прослеживается прямая зависимость апоптоза лимфоцитов от тяжести заболевания – обширности поражения кожи.

Обращают на себя внимание статистически достоверные различия абсолютных показателей апоптоза CLA+ лимфоцитов. С увеличением содержания этих клеток в крови при заболевании относительные показатели их апоптоза остаются на прежнем уровне, что, фактически, означает увеличение их апоптоза. Хотя при сравнении относительных показателей апоптоза CLA+ лимфоцитов в обследованных группах статистически достоверных межгрупповых различий не выявлено, однако мы видим, что CLA+ лимфоциты подвергаются спонтанному апоптозу в большей степени, чем общие Т-лимфоциты обследованных той же группы.


Результаты цитохимических исследований.

В рамках настоящих исследований особый интерес представляют данные о показателях ферментов энергетического метаболизма - сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и α-глицерофосфатдегидрогеназы (α-ГФДГ) в лимфоцитах. Процессы апоптоза тесно связаны с энергетикой клетки, с функцией и состоянием митохондрий. Показатели СДГ и α-ГФДГ в группах обследованных представлены в таблице 5.

Таблица 5.

Показатели СДГ и а-ГФДГ лимфоцитов в группах обследованных. (M±m)

ГРУППЫ	СДГ лимфоцитов, (ед.акт.)	α -ГФДГ лимфоцитов, (ед.акт.)
^ 1.Распространенные формы, n = 20	19,27± 0,95*	16,35± 1,24*
2.Локальные формы,n = 40	17,24± 0,71*	14,73± 0,71*
Контроль, n = 22	13,43± 0,73	10,21± 0,69

*Достоверные отличия от контроля, Р<0,05


Результаты показывают, что у пациентов с профаллергодерматозами 1 и 2 групп наблюдается увеличение активности СДГ по сравнению с контрольной группой – 13,4+0,73 ед.акт. В 1-ой группе показатель активности СДГ составил 19,27+0,95 ед.акт., во 2 группе – 17,24+0,71 ед.акт. Аналогичные изменения в обследованных группах были выявлены при анализе активности α-ГФДГ. Активность α-ГФДГ по сравнению с контролем – 10,2+0,69 г ед.акт. была достоверно повышена в 1-ой группе – 16,35+1,24 ед.акт., и во 2 группе – 14,73+0,71 ед.акт.. При этом активность как α-ГФДГ, так и СДГ в 1 и 2 группе превышала показатели контрольной группы.

Активность СДГ была повышена у 28,57% пациентов 1 группы, 21,05% пациентов 2 группы и 4,55% лиц контрольной группы. α-ГФДГ была повышена у 64,29% пациентов 1 группы, 44,74% пациентов 2 группы и 18,18% лиц контрольной группы.

Известно, что циркулирующие лимфоциты различаются по активности энергетических ферментов, т.е. популяция лимфоцитов неоднородна (Л.А.Иванова, 1991). Для более детального определения и количественной характеристики различных по активности СДГ и α-ГДФГ субпопуляций лимфоцитов был проведен подсчет процентного соотношения лимфоцитов каждого обследованного, характеризующихся высокими или низкими значениями СДГ и α-ГФДГ в каждой пробе. Высокими или низкими считали значения, отклоняющиеся от средних показателей в большую или меньшую сторону на величину более двух среднеквадратичных отклонений (Урбах, 1963). Детальное «поклеточное» исследование активности энергетических ферментов позволило разделить популяцию циркулирующих лимфоцитов на 3 субпопуляции: с низкой, средней, и высокой активностью СДГ и а-ГФДГ. Распределение лимфоцитов по активности СДГ и а-ГФДГ представлено в таблице 6.

Таблица 6.

Распределение лимфоцитов по активности энергетических ферментов.

ГРУППЫ	СДГ (ед.акт.)			a-ГФДГ (ед.акт.)
	<9	средн.	>31	<6	средн.	>27
	% лимфоцитов
^ 1.Распространенные формы, n = 20	7,27*	81,67*	11,06*	10,08*	77,17*	12,75*
^ 2.Локальные формы,n = 40	14,35*	78,26*	7,39	11,04*	77,44*	11,52*
Контроль, n = 22	3,02	91,74	5,24	4,01	88,35	7,64

*Достоверные отличия от контроля, Р<0,05


Обращает на себя внимание возрастание доли лимфоцитов с высокими показателями ферментов по мере увеличения тяжести заболевания. Так, у пациентов в группе с распространенными формами профаллергодерматоза, в среднем 11,06% и 12,75% лимфоцитов продемонстрировали высокую активность СДГ и а-ГФДГ соответственно, а в контрольной группе – только 5,24% и 7,64%. Пациенты в группе с локальными формами профаллергодерматоза демонстрируют средние значения (7,39 и 11,52) содержания лимфоцитов с аномально высокой активностью ферментов. Доля лимфоцитов с низкой активностью СДГ и а-ГФДГ в 1 группе составила 7,27% и 10,08 % соответственно, в контроле 3,02% и 4,01%.

Для оценки системы «свободнорадикальные поцессы – антиоксидантная защита» представляют интерес результаты спонтанного НСТ-теста и активности миелопероксидазы нейтрофилов.

Во всех группах обследованных пациентов с профаллергодерматозами был достоверно повышен по сравнению с контролем спонтанный НСТ-тест. Средний показатель в контроле составлял 11,2+0,46 ед. Спонтанный НСТ-тест был наиболее высоким в группе больных с распространенным профаллергодерматоза (1 группа) 20,79+1,26 - ед. В группе 2 (локальные формы профаллергодерматоза) он составил 14,5+1,96 ед., Достоверные различия между этими двумя группами по данному показателю выявлены не были.

Изучение активности миелопероксидазы нейтрофилов показало ее достоверное угнетение в группах пациентов с профаллергодерматозами по сравнению с контролем. У пациентов 1 группы активность миелопероксидазы составила 1,58+0,04 ед. ак., у пациентов 2 группы – 1,94+0,03 ед. ак., а в контроле – 2,1+0,03 ед. ак.

Анализ показателей активности щелочной и кислой фосфатазы в группах обследованных показал, что активность кислой фосафатазы была повышена у всех пациентов с профаллергодерматозами обеих групп (100% наблюдений), в контроле – в 22,73% случаев, что является проявлением сенсибилизации. Активность щелочной фосфатазы нейтрофилов была повышена у 50% пациентов 1 группы, у 73,68% пациентов 2 группы и 13,64% лиц контрольной группы, что является проявлением воспалительного процесса при профаллергодерматозах.


Корреляционный анализ результатов исследований.

Результаты корреляционного анализа связи исследованных показателей с тяжестью заболевания подтверждают выявленные ранее зависимости. Так, отмеченные увеличения в группах пациентов с профаллергодерматозами показателей апоптоза CD3+ лимфоцитов и количества CLA+ лимфоцитов достоверно положительно коррелируют с тяжестью заболевания(r=0,510, r=0,300 соответственно). Так же подтверждается тенденция к снижению количества CD3+ лимфоцитов у пациентов (отрицательная корреляция, r= -0,189). Положительная достоверная корреляция тяжести заболевания с результатами спонтанного НСТ-теста (r=0,399) свидетельствует о сопутствующей активации свободнорадикальных процессов, а достоверная отрицательная корреляция с показателями МП (r=-0,568) - о возрастании напряжения механизмов антиоксидантной защиты у пациентов. Энергетические ферменты лимфоцитов – СДГ и α-ГФДГ положительно коррелируют с тяжестью заболевания (r=0,259, r=0,198), что может свидетельствовать об общей активации метаболизма лимфоцитов при профаллергодерматозах, нарастающей с распространенностью поражений кожи.

Таким образом, корреляционный анализ подтверждает результаты наблюдений и характер зависимостей, выявленных у пациентов с профаллергодерматозами.


Оценка эффективности терапии аллергодерматозов на основе анализа показателей апоптоза лимфоцитов крови и содержания CLA+ субпопуляции лимфоцитов.

Для лабораторной оценки эффективности лечения нами по результатам анализа исследованных показателей были выбраны два, представляющиеся наиболее информативными - апоптоз Т-лимфоцитов (CD3+) и содержание тропных к коже лимфоцитов (CLA+). Изменения этих индикаторных показателей в динамике лечения патогенетически обоснованы, т.к. именно Т-лимфоциты играют ключевую роль в развитии и поддержании воспалительных изменений кожи при профаллергодерматозах. Связь этих показателей с клинической картиной заболевания, его тяжестью, математически подтверждается результатами корреляционного анализа.

Обследовано 15 пациентов с профессиональными аллергодерматозами от воздействия металлов – сенсибилизаторов, проходивших лечение в клинике ГУ НИИ МТ РАМН. Всем обследованным в стационаре были поставлены диагнозы распространенной экземы или дерматита в стадии обострения. Пациенты получали комплексное лечение, включавшее системные антигистаминные препараты и местные средства, в том числе глюкокортикоидной природы. Срок лечения не превышал 30 (14-28) дней. Забор крови для исследований проводился при поступлении (до лечения) и выписке (после лечения).

По результатам клинического излечения пациенты были разделены на 2 группы. В 1 группу (10 человек) включены больные, у которых удалось достичь клинического излечения. Эти пациенты по окончании лечения характеризовались значительным регрессом или полным исчезновением клинических симптомов кожного воспаления – инфильтрации, эритемы, зуда, высыпаний. Вторую группу (5 человек) составили пациенты, у которых излечения кожного процесса не наступило. На коже этих пациентов, несмотря на проведенное лечение, сохранялись признаки воспаления различной выраженности.

Результаты оценки апоптоза лимфоцитов крови и субпопуляции CLA+ лимфоцитов представлены в таблицах 7 и 8.

У всех обследованных при поступлении обнаружено повышение показателей апоптоза CD3+ лимфоцитов и содержания CLA+ лимфоцитов в крови, соответствующее распространенности и тяжести поражений кожи.

Таблица 7.

Показатели апоптоза CD3+ лимфоцитов до и после лечения, (M±m).

ГРУППЫ	Содержание апоптических СD3+ лимфоцитов
	^ До лечения		После лечения
	Абс. содержание (х 109/л)	%	Абс. содержание (х 109/л)	%
^ 1.Пациенты с полным клиническим излечением, n = 10	0,0686±0,0135*	6,01±0,39 *	0,0388±0,0129	3,02±0,34
^ 2.Пациенты без клинического излечения, n = 5	0,0629±0,0451*	5,64±0,67 *	0,0597±0,0416*	4,81±0,58 *
Контроль, n = 22	0,035±0,021	2,68±0,0044	0,035±0,021	2,68±0,0044

*Достоверные отличия от контроля, Р<0,05


Как следует из анализа полученных результатов оценки апоптоза, у 80% пациентов 1 группы (с достигнутым излечением) после лечения апоптоз CD3+ лимфоцитов снижается с первоначально повышенных значений и достигает значений контрольной группы. У 20% пациентов апоптоз лимфоцитов остается повышенным по сравнению с контролем, хотя также снижается по сравнению с первоначальным значением. У пациентов 2 группы (не излеченных) распределение изменений апоптоза лимфоцитов было следующим: у 2 пациентов (40%) – снижение с первоначальных значений, не достигающее уровня контрольной группы, у 3 пациентов (60%) значимых изменений (выходящих за пределы погрешности измерений и индивидуальной вариабельности) не обнаружено, т.е. уровень апоптоза остался повышенным на прежнем уровне.

Результаты оценки CLA+ субпопуляции лимфоцитов демонстрируют ту же направленность изменений после лечения, что и апоптоз CD3+ лимфоцитов. Эти показатели изменяются однонаправлено и совместно. У 70% пациентов 1 группы первоначально повышенное содержание в крови CLA+ лимфоцитов после лечения уменьшилось, и приблизилось к значениям контрольной группы, хотя достигло их только в 50% случаев. У 30% пациентов 1 группы (излеченных) после лечения не выявлено достоверного снижения CLA+ лимфоцитов в крови. У пациентов 2 группы (не излеченных) в 80% случаев (4 из 5) достоверного снижения первоначально повышенных CLA+ лимфоцитов не обнаружено, у 1 пациента снижение наблюдалось, однако «контрольные» значения не были достигнуты.

Таблица 8.

Содержание CLA+ лимфоцитов в крови до и после лечения, (M±m).

ГРУППЫ	Содержание CLA+ лимфоцитов
	До лечения		После лечения
	Абс. содержание (х 109/л)	%	Абс. содержание (х 109/л)	%
^ 1.Пациенты с полным клиническим излечением, n = 10	0,20±0,07*	8,13±0,72*	0,13±0,06	5,72±0,83
^ 2.Пациенты без клинического излечения, n = 5	0,18±0,08*	7,74±1,05*	0,17±0,08*	7,11±1,19*
Контроль, n = 22	0,10±0,01	4,54±0,36	0,10±0,01	4,54±0,36

*Достоверные отличия от контроля, Р<0,05


Как следует из анализа результатов, снижение апоптоза CD3+ лимфоцитов с первоначально повышенных значений после лечения наблюдается у подавляющего большинства клинически излеченных больных, а у неизлеченных снижение менее выражено или отсутствует. Результаты лечения пациентов с клиническим излечением можно признать удовлетворительными, а проведенную терапию – эффективной, что выразилось в виде угасания воспалительной реакции в коже и снижения апоптоза лимфоцитов. У неизлеченных пациентов терапия оказалась недостаточно эффективной, и заметного снижения показателей апоптоза не произошло.

Таким образом, спонтанный апоптоз лимфоцитов крови может рассматриваться в качестве лабораторного показателя, отражающего снижение активности воспалительного процесса в коже вследствие проводимого лечения – при условии, что у пациента отсутствует иные заболевания воспалительной, аллергической или другой иммунной природы.

Определение содержания в крови CLA+ лимфоцитов до и после лечения может служить для оценки эффективности терапии на уровне клеточного патогенетического звена профаллергодерматозов. CLA+ лимфоциты – эффекторные клетки кожных иммунных реакций, и их определение позволяет специфически оценить интенсивность воспалительных явлений в коже. Как видно из результатов, после эффективного лечения и регресса кожных проявлений в большинстве случаев происходит снижение первоначально повышенных CLA+ лимфоцитов. Однако снижение наблюдается не у всех клинически излеченных пациентов, что может свидетельствовать о готовности клеточного звена к рецидиву кожного воспаления при повторном воздействии сенсибилизирующего фактора или без такового. У пациентов с продолжающимся кожным воспалением заметного снижения CLA+ лимфоцитов крови не регистрируется, следовательно, терапевтическое воздействие на это звено оказалось недостаточным.

По нашему мнению, для наиболее полной и специфичной оценки эффективности лечения, целесообразно одновременное определение как показателей спонтанного апоптоза лимфоцитов, отражающих общий уровень активации лимфоцитарного звена, так и показателей содержания CLA+ лимфоцитов, дающих возможность специфически определить эффективность воздействия на эффекторное звено кожного воспаления и, возможно, спрогнозировать вероятность возникновения рецидива или обострения профаллергодерматоза.

Проведенные исследования позволили решить задачи, поставленные при планировании настоящей работы. Применение современных высокотехнологичных методов изучения клеток и клеточных популяций в совокупности с хорошо известными и надежными клинико-лабораторными методами позволило получить новые данные о важном иммунорегуляторном элементе патогенеза аллергических дерматозов от воздействия соединений металлов-сенсибилизаторов – апоптозе лимфоцитов.

Ведущая роль в воспалении кожи при аллергодерматозах принадлежит Т-лимфоцитам, мигрирующим из кровеносного русла в зону воздействия антигена. В процессе примирования и активации наивных лимфоцитов в лимфоузлах дермы они синтезируют необходимый для миграции из кровяного русла в кожу аппарат. Нами установлено, что при развитии профаллергодерматоза количество тропных к коже (CLA+) лимфоцитов увеличивается, хотя эти лимфоциты подвергаются апоптозу в крови в большей степени, чем общие Т-лимфоциты тех же обследованных. Это, вероятно, объясняется явлением активационно-индуцированного апоптоза, так как именно эта субпопуляция лимфоцитов наращивается и активируется при аллергодерматозах. Процесс апоптоза тесно связан с энергетикой клетки, определяемой функциями митохондрий. С одной стороны, апоптоз - активный процесс, требующий энергозатрат. С другой – изменения в митохондриях в ходе апоптоза приводят на определенных этапах к остановке синтеза АТФ, снижению энергетики клетки. Известная ранее и подтвержденная нашими исследованиями гетерогенность популяции лимфоцитов по параметрам энергетики (субпопуляции с низкой и высокой активностью энергетических ферментов) может указывать на динамические изменения энергетики клетки, связанные как с реализацией ее эффекторных функций (активация – высокая энергетика, предрасположенность к апоптозу), так и с прохождением необратимых стадий апоптоза (угасание энергетического обмена). Общее увеличение активности СДГ и α-ГФДГ во всех обследованных группах пациентов с аллергодермаиозами указывает на общее повышение функциональной активности лимфоцитов при кожном воспалении, что укрепляет нас в предположении о связи увеличения апоптоза с активацией клеток. По нашему мнению, патогенетическая роль спонтанного апоптоза лимфоцитов крови при аллергодерматозах состоит в выполнении функции защитного механизма, призванного ограничить агрессию активированных цитотоксических лимфоцитов по отношению к клеткам кожи.

В целом по результатам исследований можно сформулировать следующие выводы.


ВЫВОДЫ

1. 
   Апоптоз лимфоцитов крови достоверно усиливается у пациентов с профаллергодерматозами от воздействия металлов-сенсибилизаторов, и составляет по данным люминесцентной микроскопии 3-5% и проточной цитофлюориметрии 3,5-5,5% от всей популяции циркулирующих Т-лимфоцитов (в контроле –2,10 и 2,68 % соответственно).
   

2. 
   Содержание в крови тропных к коже (CLA+) лимфоцитов – основных эффекторных клеток кожного воспаления – и апоптоз этих клеток увеличиваются при профаллергодерматозах. Показатели содержания CLA+ лимфоцитов и их апоптоза положительно коррелируют с тяжестью заболевания – обширностью поражений кожи.
   

3. 
   У пациентов с профаллергодерматозами наблюдается увеличение энергетической активности лимфоцитов, что по данным цитохимических исследований проявляется увеличением митохондриальных ферментов (показателей СДГ и а-ГФДГ), и отражает активированное состояние лимфоцитов и их предрасположенность к апоптозу.
   

4. 
   В патогенезе аллергодерматозов апоптоз лимфоцитов крови носит характер защитного механизма, ограничивающего количество активных лимфоцитов, повреждающих кератиноциты.
   

5. 
   Определение показателей апоптоза лимфоцитов методами люминесцентной микроскопии и проточной цитофлюориметрии – в совокупности с содержанием CLA+ лимфоцитов, может быть использовано для характеристики тяжести заболевания при обследовании больных профаллергодерматозами и оценки эффективности лечения.
   

^

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. 
   Ткач А.В. Изучение апоптоза лимфоцитов крови при профаллергодерматозах. //Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». – Суздаль, 2005 . – С. 410.
   

2. 
   Иванова Л.А., Рубцова Н.Б., Горизонтова М.Н., Стаценко Ю.В., Ткач А.В. Иммуногематологические и цитогенетические эффекты при воздействии электромагнитных полей СВЧ у профессиональных пользователей ПЭВМ и аппаратами сотовой связи. IV Всероссийский конгресс «Профессия и здоровье»: Сб. тезисов. – М., 2005. – С. 79.
   

3. 
   Ткач А.В., Иванова Л.А., Измерова Н.И. Апоптоз лимфоцитов крови и профессиональные аллергические дерматозы. IV Всероссийский конгресс «Профессия и здоровье»: Сб. тезисов. – М., 2005. – С. 613.
   

4. 
   Ткач А.В., Иванова Л.А., Измерова Н.И., Стаценко Ю.В. Современные представления о клеточных механизмах патогенеза профессиональных аллергических контактных дерматитов. // Медицина труда и промышленная экология. – 2006 . - №7.- С. 23-27.
   

5. 
   Tkach A., Ivanova L, Stacenko J. Peripheral blood lymphocytes apoptosis in occupational contact dermatitis. // 28-th International Congress on Occupational Health. Milan, Italy, 2006. – P.573.
   

6. 
   Измерова Н.И., Иванова Л.А., Чикин В.В., Поповкина С.В., Богачева Н.А., Ткач А.В., Стаценко Ю.В. Современные особенности развития и проявлений профессиональных аллергодерматозов. //Актуальные проблемы медицины труда. Сборник трудов института. Под редакцией академика РАМН Н.Ф. Измерова. М., 2006. – С. 377-390.
   

7. 
   Иванова Л.А., Измерова Н.И., Ткач А.В., Стаценко Ю.В., Рубцова Н.Б., Плюхин А.Е. Новые клеточные технологии в клинике основных форм профессиональных заболеваний (патогенез, диагностика, лечение, профилактика). //Актуальные проблемы медицины труда. Сборник трудов института. Под редакцией академика РАМН Н.Ф. Измерова. М., 2006. – С. 479-491.