Молекулярные механизмы дизрегуляции апоптоза лимфоцитов при персистентных вирусных инфекциях 14. 00. 16 патологическая физиология 03. 00. 25 гистология, цитология, клеточная биология
|
|
Скачать 0.65 Mb.
|
|
На правах рукописи Жукова Оксана Борисовна молекулярные механизмы дизрегуляции апоптоза лимфоцитов при персистенТНЫХ вирусНЫХ ИНФЕКЦИЯХ 14.00.16 – патологическая физиология 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Томск - 2006 Р  абота выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»^ доктор медицинских наук Рязанцева Наталья Владимировна доктор медицинских наук, Новицкий Вячеслав Викторович профессор, академик РАМН, Заслуженный деятель науки РФ ^ доктор медицинских наук, профессор Федорова Татьяна Сергеевна доктор медицинских наук, профессор, Якобсон Григорий Семенович академик РАМН доктор медицинских наук, профессор, ^ член-корреспондент РАМН Ведущая организация: Государственное учебно-научное учреждение факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, г. Москва Защита состоится «___»____________2006 г. в ______ часов на заседании диссертационного совета Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете (634050, г. Томск, ул. Московский тракт, 2) С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета (634050, Томск, пр. Ленина, 107) Автореферат разослан «___»___________2006 г. У  ченый секретарьдиссертационного совета Суханова Г.А. ^ Актуальность проблемы. Вирусные инфекции являются важной медико-биологической проблемой. Их значимость во многом обусловлена повсеместной распространенностью и возрастающей частотой хронизации инфекционного процесса [Погодина В.В. и соавт., 1986; Tremoloda F. et al., 1991; Okoth F.A., 1996; Sharara A.L. et al., 1996; Серов В.В., Мухин Н.А., 2000; Антонов П.В., Цинзерлинг В.А., 2001]. Несмотря на постоянно расширяющийся объем знаний о причинах развития хронических инфекций, нерешенным остается вопрос о механизмах, приводящих при одном и том же возбудителе к разным исходам болезни – выздоровлению, бессимптомному носительству, трансформации в прогредиентную хроническую форму с соответствующими осложнениями (в случае вирусного гепатита – цирроз и злокачественные новообразования печени; при клещевом энцефалите - параличи и парезы). В связи с этим внимание исследователей все чаще обращается на состояние иммунной системы организма, являющейся одной из основных (наряду с нервной и эндокринной) систем, участвующих в формировании стратегии функционирования организма в новых условиях [Нургалиев Д.Ж., Омарова К.О., 2002]. К числу фундаментальных механизмов регулирования функционирования системы иммунитета относится апоптоз. Под апоптозом понимают физиологическую форму гибели клеток, основная функция которой заключается в уравновешивании эффекта клеточной пролиферации, элиминации поврежденных, функционально неполноценных и инфицированных клеток [Ярилин А.А. и соавт., 2000; Барышников А.Ю., Шишкин А.В., 2002]. Апоптоз является одним из ключевых процессов поддержания клеточного гомеостаза, который контролируется и регулируется многочисленными факторами. Прежде всего это внеклеточные сигнальные молекулы, запускающие и реализующие программированную гибель клеток (молекулы семейства фактора некроза опухоли (TNF), некоторые цитокины), рецепторы к этим молекулам (Fas-R, TNF-RI, TCR-CD3), внутриклеточные мессенджеры (NO, Ca2+, цАМФ, цГМФ), протеинкиназы, протеинтирозинкиназы, сериновые протеазы (семейства ICE и Mch), стимуляторы апоптоза (Bax, Bcl-ХS, Bad, Bak), ингибиторы апоптоза (Bcl-2, Bcl-XL и др.), эндонуклеазы и другие [Проскуряков С.Я. и соавт., 2000; Montag D. et al., 2000; Schachner M., 2000; Лушников Е.Ф. и соавт., 2001; Скулачев В.П., 2001; Leist M., Jaattela M., 2001; Fensome A.C., Rodrigues-Lima F., 2003]. В последнее время стало ясно, что с позиции апоптоза можно объяснить формирование хронического инфекционного процесса, в том числе и вирусной природы, поскольку дисбаланс между пролиферативной активностью клеток и программированной клеточной смертью ведет к патологическим изменениям органов и тканей. Однако эта проблема лишь недавно привлекла к себе должное внимание исследователей. Было установлено, что при вирусных инфекциях сосуществуют факторы, индуцирующие и ингибирующие программированную клеточную смерть [Zychlinsky A., 1993; Владимирская Е.Б. и соавт., 1997; Маянский А.Н. и соавт., 1997; Буеверов А.О. и соавт., 2000; Roy D.J et al., 2000; Belanher C. et al., 2001; Bellows P.S. et al., 2002; Hay S., Kannourakis G., 2002]. Предполагается, что главным способом киллинга вирусинфицированных клеток являются рецепторный и перфорин-гранзимовый механизмы индукции апоптоза [Tanaka M. et al., 1998]. Кроме того, инфекционный процесс сопровождается усилением продукции активных кислородных радикалов, запускающих гибель клеток по митохондриальному пути [Ehrmann I.Ir. et. al., 2000]. Следствием вирусиндуцированного повреждения ДНК являются р53-опосредованные реакции развития апоптоза [Zhang Y. et al., 2002]. В целом исследования последних лет показали, что, несмотря на достигнутые успехи, до настоящего времени не сформированы четкие представления о молекулярных механизмах дизрегуляции апоптотической гибели иммунокомпетентных клеток крови при инфекционной патологии. В связи с этим возникает необходимость проведения комплексной оценки состояния путей регуляции апоптоза лимфоцитов периферической крови в условиях длительной персистенции разных видов вирусов с учетом клинических особенностей инфекционного процесса, что, вероятно, позволит получить новые данные фундаментального характера о ведущих механизмах и ключевых молекулярных мишенях нарушения процесса программированной гибели клеток при хронических вирусных инфекциях. Цель исследования: выявить роль и молекулярные пути модуляции апоптоза лимфоцитов периферической крови в патогенезе персистентных вирусных инфекций. Задачи исследования: 1. Выявить общие закономерности и особенности реализации программированной гибели лимфоцитов крови у пациентов с персистентными инфекциями, вызванными вирусами клещевого энцефалита, гепатита В и С. 2. Определить чувствительность лимфоцитов крови у пациентов с персистентными вирусными инфекциями к апоптогенным стимулам различных механизмов действия in vitro. 3. Дать комплексную характеристику состояния Fas- и TNF-опосредованного рецепторного, митохондриального и р53-зависимого путей регуляции апоптоза лимфоцитов крови при персистентных инфекциях, вызванных вирусами клещевого энцефалита, гепатита В и С. 4. Установить ключевые молекулярные механизмы дизрегуляции программированной гибели лимфоцитов крови у пациентов с хроническим вирусным гепатитом В, С и В+С, хронической антигенемией вируса клещевого энцефалита. Научная новизна. Впервые с привлечением широкого комплекса современных культуральных, иммунологических и молекулярно-биологических методов исследования освещены молекулярные механизмы реализации программированной гибели лимфоцитов периферической крови при персистентных вирусных инфекциях. Установлено, что нарушение реализации программированной гибели лимфоцитов является одним из звеньев иммунопатогенеза вирусных инфекций, вызванных возбудителями клещевого энцефалита, гепатита В и С. Показано, что дисбаланс клеточного звена иммунитета при персистентных вирусных инфекциях сопряжен с ингибированием апоптоза лимфоцитов у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С и микст-инфекцией В+С, со стимулированием апоптотической гибели – у пациентов с длительной антигенемией вируса клещевого энцефалита. Получены фактические данные, указывающие на дискоординированость вступления в процесс апоптоза CD8+-лимфоцитов, что определяет характер иммунологических расстройств. Выявлена повышенная чувствительность лимфоцитов, полученных от пациентов с персистентными вирусными инфекциями, к апоптоз-модулирующим факторам с различными механизмами действия (глюкокортикостероидные гормоны, ингибиторы ДНК-топоизомеразы, дефицит сывороточных ростовых факторов) in vitro по сравнению с нормой, что свидетельствует об истощении резервного потенциала клеток. При персистенции вирусов клещевого энцефалита и гепатита В, С увеличивается содержание Fas-положительных лимфоцитов периферической крови. Готовность лимфоцитарных клеток к индукции процесса апоптоза наиболее выражена при бессимптомном носительстве антигена вируса клещевого энцефалита и у пациентов с хроническим гепатитом С слабовыраженной степени активности. Продемонстрировано нарушение реализация TNFα-опосредованного пути программированной гибели лимфоцитов крови при хроническом вирусном гепатите В, С и В+С вследствие изменения функционирования рецепторного аппарата клетки (снижения уровня презентации мембран-ассоциированного TNF-RI на фоне увеличения продукции его растворимой формы). Впервые выявлено, что для длительной антигенемии вируса клещевого энцефалита, хронического гепатита С и В+С характерно стимулирование митохондриального пути апоптоза лимфоцитов крови. Установлено, что персистентное течение вирусных инфекций сопровождается явлениями цитогенетической нестабильности лимфоцитов крови, проявляющейся структурными хромосомными аберрациями и снижением активности системы эксцизионной репарации ДНК клеток, что свидетельствует о нарушении р53-зависимого механизма программированной клеточной гибели. Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные фундаментального характера раскрывают новые патофизиологические аспекты персистентных вирусных инфекций. Показана значимая роль дизрегуляции апоптоза иммунокомпетентных клеток крови в механизмах формирования длительной персистенции возбудителей клещевого энцефалита, гепатита В и С. Выявлены ключевые молекулярные мишени нарушения процесса программированной гибели клетки при хронических вирусных инфекциях. Основные положения исследования могут служить основой для разработки молекулярной технологии воздействия на сигналпередающие пути реализации апоптоза иммунокомпетентных клеток с целью проведения персонализированной патогенетически обоснованной коррекции иммунных нарушений и своевременной профилактики угрожающих жизни пациентов осложнений. Положения, выносимые на защиту:
Апробация и реализация работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на 5-м Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2002), Международном симпозиуме «Успехи современного естествознания» (Сочи, 2002), VI Российском съезде «Врачей инфекционистов» (Санкт-Петербург, 2003), Второй международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, 2004), Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004, 2005 гг.), Третьем российском конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем» (Москва, 2004), Всероссийской конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2004), Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Новосибирск, 2004), 6-ой Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2005), V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием к 100-летию со дня рождения А.Г. Панова «Современное состояние проблемы нейроинфекций» (Санкт-Петербург, 2005), ХII Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005), Международном конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке» (Томск, 2006), 6-ой Восточно-сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием «Клинико-эпидемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения» (Красноярск, 2006), Съезде неврологов Сибирского федерального округа (Ярославль, 2006), Российском медицинском форуме с международным участием «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006). Основные положения и выводы диссертационной работы используются в лекциях по патологической физиологии (разделы «Патофизиология инфекционного процесса», «Патофизиология иммунной системы», «Патофизиология клетки») и микробиологии (разделы «Рабдо- и арбовирусы», «Возбудители гепатитов») для студентов 2-3 курсов лечебного и педиатрического факультетов, а также в лекционном курсе по инфекционным болезням для студентов 5 курса лечебного и педиатрического факультетов Сибирского государственного медицинского университета. В работе приводятся результаты исследований, поддержанных Советом при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ по проблемам «Молекулярные механизмы нарушения структуры, метаболизма и функции клеток крови при патологии» (НШ-1051.2003.4) и «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток крови при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы» (НШ-4153.2006.7), а также результаты научно-исследовательских работ «Молекулярные механизмы предрасположенности и резистентности организма человека к персистентным бактериальным и вирусным инфекциям» РИ-112/001/158 (Государственный контракт от 05.09.2005 г. № 02.445.11.7110), «Идентификация молекулярных мишеней управления апоптозом клеток при вирусных инфекциях» РИ-19.0/001/011 (Государственный контракт от 26.11.2005 г. № 02.442.11.7004) и «Молекулярные и клеточные основы управления реактивностью системы крови при актуальных заболеваниях инфекционной природы» 2006-РИ–112.0/001/384 (Государственный контракт от 09.06.2006 г. № 02.445.11.7419) в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы». Публикации. По материалам диссертации опубликовано 60 работ, 18 из которых – в центральных рецензируемых журналах, одна монография в соавторстве. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 273 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы, включающего 462 источника, из которых 176 отечественных и 286 иностранных. Работа иллюстрирована 51 таблицей и 28 рисунками. ^ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В настоящей работе представлены результаты комплексного обследования 244 человек (161 мужчина и 83 женщины в возрасте от 18 до 50 лет) с длительной антигенемией вируса клещевого энцефалита (TBEV), хроническими вирусными гепатитами В, С и В+С. Пациенты находились на стационарном лечении и диспансерном учете в инфекционном отделении госпитальных клиник ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава, в терапевтическом отделении МЛПУ «Медико-санитарная часть «Строитель» г. Томска», гастроэнтерологическом отделении Томской областной клинической больницы и инфекционном отделении МЛПУ «Городская больница №3 г. Томска». Набор клинического материала осуществлялся при непосредственном участии зав. кафедрой инфекционных болезней ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава, д.м.н., профессора А.В. Лепехина, зав. кафедрой терапии ФПК и ППС ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава, д.м.н., профессора Э.И. Белобородовой, профессора кафедры неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава д.м.н. Н.Г. Жуковой и доцента кафедры госпитальной терапии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава к.м.н. Е.В. Белобородовой. Обследование проводилось до назначения специфической противовирусной и иммунокоррегирующей терапии. Контрольной группой служили 80 здоровых доноров с аналогичными характеристиками по полу и возрасту. Клинически и анамнестически у всех обследованных лиц были исключены инфекционные заболевания другой этиологии, обострение хронических воспалительных процессов, аутоиммунные, наследственные и психические болезни, а также злоупотребление алкоголем и прием гепатотоксических лекарств. В зависимости от этиологического фактора и ведущей органной патологии наблюдавшиеся пациенты были разделены на две группы. Первую группу составили 72 человека с антигенемией TBEV, ко второй – были отнесены 172 пациента с хроническим вирусным гепатитом. Диагноз клещевого энцефалита (рубрика А84.0 МКБ-10) у обследованных пациентов в острый период заболевания верифицировался на основании данных эпидемиологического анамнеза, оценки неврологического статуса, определения уровня специфических антител к антигену вируса клещевого энцефалита методами непрямой реакции гемагглютинации и иммуноферментного анализа, обнаружения вирусной РНК методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР), а также результатов инструментального исследования. В зависимости от особенностей клинических и лабораторных проявлений клещевой нейроинфекции была выделена группа из 53 пациентов с длительным (более 6 месяцев после острого периода инфекционного процесса) бессимптомным носительством антигена TBEV. У лиц, отнесенных к данной группе, при наличии в крови вирусной РНК клиническая картина начального периода заболевания практически редуцировалась. Вторую группу составили 19 больных с остаточными проявлениями нейроинфекции в виде цереброгенной астении и антигенемии TBEV (более 6 мес после острого периода заболевания). Основными клиническими проявлениями патологии были стойкий астено-вегетативный синдром, упорные головные боли, бессонница, снижение инициативы и памяти. В неврологическом статусе выявлялись рассеянные органические микрознаки: слабость конвергенции, легкий центральный парез мимической мускулатуры, анизорефлексия глубоких брюшных рефлексов. Из вегетативных расстройств обращали на себя внимание бледность кожных покровов, гипергидроз дистальных отделов конечностей, повышенная общая потливость. У лиц, отнесенных к данной клинической категории, в течение 6-8 мес после острого периода на фоне резидуальной неврологической симптоматики в крови обнаруживались РНК и антиген TBEV, а также повышенный уровень специфического IgG. В программу обследования были включены 172 пациента, страдающих вирусным гепатитом В, С и В+С (по МКБ-10 рубрики В18.0 – хронический вирусный гепатит В с δ-антигеном, В18.1 – хронический вирусный гепатит В без δ-антигена, В18.2 – хронический вирусный гепатит С, В18.8 – другой хронический вирусный гепатит). Все пациенты представляли собой группу риска по инфицированию возбудителями гепатита В (HBV) и С (HCV) (в анамнезе были оперативные вмешательства с переливанием крови, лечебные инъекции многоразовыми шприцами, лечение и удаление зубов, эпизоды наркомании, сексуальные и тесные бытовые контакты с больными вирусными гепатитами, работа с препаратами крови и больными у медицинских работников). Давность заболевания составляла от 1 года до 16 лет (в среднем 5±2 года). Диагноз хронического вирусного гепатита основывался на наличии клинико-инструментальных симптомов (гепато-, спленомегалии) и клинико-лабораторных синдромов (холестаза, цитолиза, мезенхимально-воспалительного синдрома). Этиологическая верификация диагноза проводилась путем выявления в крови ДНК HBV, РНК HCV (метод ПЦР), серологических маркеров HBV (Hbe-антиген, HBs-антиген, анти-Hbcor IgM, анти- Hbcor суммарные) и HCV (анти-HCV Ig к cor, С-протеину, неструктурным белкам NS-3, NS-4, NS-5, анти-HCV IgM). С целью морфологического подтверждения диагноза и определения степени активности воспалительного процесса с использованием гистологического индекса активности по A. Knodell [1981] и стадии фиброза по U. Desmet [1995] всем пациентам проводилась пункционная биопсия печени по Mengini. На основе данных морфологического анализа полученного биопсийного материала выделяли минимальную (1–3 балла), слабовыраженную (4–8 баллов), умеренную (9–13 баллов) и выраженную степени активности воспалительного процесса (более 13 баллов). В соответствии с классификацией, принятой Всемирным конгрессом гастроэнтерологов в Лос-Анжелесе [1994], были выделены следующие клинические группы: 1) больные хроническим гепатитом В умеренной степени активности – 30 человек; 2) больные хроническим гепатитом В слабовыраженной степени активности – 19 человек; 3) больные хроническим гепатитом С умеренной степени активности – 31 человек; 4) больные хроническим гепатитом С слабовыраженной степени активности – 42 человека; 5) больные хроническим микст-гепатитом В+С слабовыраженной степени активности – 22 человека; 6) больные хроническим микст-гепатитом В+С умеренной степени активности – 28 человек. Анализ клинической картины у больных хроническими вирусными гепатитами умеренной степени активности показал, что наиболее часто выявлялся астено-вегетативный синдром (87,8%). Диспепсический синдром (непереносимость жирной пищи, тошнота, горечь во рту, изжога, метеоризм) встречался у 65,9% пациентов. Синдром холестаза (желтушное окрашивание кожи и склер, зуд, билирубинемия) чаще обнаруживался у больных хроническим гепатитом С (45,2%), чем у пациентов с хроническими гепатитами В (30,0%) и В+С (28,6%). В большинстве случаев гепато- и спленомегалия, выявленные физикально, подтверждались результатами ультразвукового исследования. При анализе биохимических показателей крови ведущим был синдром цитолиза (64,3%). Пациенты, объединенные в группу с хроническим гепатитом слабовыраженной степени активности, характеризовались отсутствием клинической симптоматики поражения печени, нормальными значениями биохимических показателей. Из серологических маркеров HBV- и HCV-инфекции у них выявлялись HBs-антиген и анти-HCV IgG соответственно. Эпизодически они получали курсы общеукрепляющей терапии. Трудовая деятельность не страдала. У пациентов с длительной вирусной персистенцией и у здоровых доноров проводили комплексное исследование особенностей реализации апоптоза лимфоцитов периферической крови, включавшее оценку иммунофенотипического и цитогенетического статуса лимфоцитов, сравнительный анализ вовлеченности в спонтанный и активационный апоптоз разных субпопуляций лимфоцитарных клеток, исследование чувствительности лимфоцитов к стимуляторам программированной клеточной гибели с различными механизмами действия в условиях in vitro, определение состояния рецепторного, митохондриального и р53-опосредованного путей проведения апоптогенного сигнала. Распределение обследованных пациентов по группам в соответствии с использованными методами исследования представлено в таблице 1. Материалом исследования являлась венозная кровь обследованных лиц, взятая утром до приема пищи и стабилизированная гепарином (25 Ед/мл). Определение количества лимфоцитов периферической крови проводили стандартными гематологическими методами [Козинец Г.И., Макаров В.А., 1997]. Лимфоциты выделяли по методу Дж. Натвиг и соавт. [1980]. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови по CD-маркерам (CD3, CD4, CD8, CD22, CD56) проводили иммуноцитохимическим методом [Тотолян А.Н. и соавт., 2002]. Результаты выражали в процентных и абсолютных значениях. Выделенные в стерильных условиях на градиенте плотности мононуклеары периферической крови культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах в объеме 200 мкл. В лунки вносили суспензию клеток (2∙105 на лунку), а также полную культуральную среду без митогена, состоящую из 90% RPMI-1640 («Вектор-Бест», Новосибирск), 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», Санкт-Петербург), 0,3 мг/мл L-глутамина, или полную культуральную среду с добавлением 10 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) («Difco», Германия) для активации лимфоцитов. Клетки инкубировали в течение 18 ч при температуре 37 °С и 5% СО2. После отмывания клетки суспендировали (1∙106 в 1 мл) в аннексиновом буфере, содержащем аннексин V, меченный FITC, и через 15 мин подвергали проточной цитофлуориметрии. Анализ образцов клеточных суспезий проводили на проточном цитометре Epics XL («Beckman Coulter», Франция) с аргоновым лазером (длина волны 488 нм) на основе определения параметров малого углового светорассеяния (FSC), характеризующего размер клетки, бокового светорассеяния (SSC), характеризующего цитоплазматические и мембранные особенности клетки, и зеленой флуоресценции (флуоресцеин изотиоцианат – FITC – 530 нм). Проводился гейтинг исследуемой популяции клеток в координатах FSC и SSC. Затем данную популяцию клеток анализировали на наличие флуоресценции на основе гистограммы. Использовали автоматическое программное обеспечение и методы сбора и анализа данных с высоким разрешением (1024 канала) (рис. 1). Для дифференцированной оценки реализации апоптоза CD4+- и CD8+-лимфоцитов после культивирования мононуклеары отмывали и окрашивали 5 мкл стандартных моноклональных антител (МКАТ) к CD4 и CD8, меченных фикоэритрином (РЕ) («Caltag», США), в течение 30 мин. Затем клетки еще раз отмывали и ресуспендировали (106 в 1 мл) в аннексиновом буфере («Caltag», США), содержащем FITC-меченный аннексин V. После 15 мин инкубации клетки подвергали двуцветной цитофлуометрии [Ярилин А.А. и соавт., 2000]. Таблица 1 ^ с использованными методами исследования
 б а Рис. 1. ^ цитофлуориметрии (окрашивание аннексином V-FITC) а – принцип автоматического выделения гейта лимфоцитов по показателям малоуглового (FSC) и бокового (SSC) светорассеивания; б – одномерная гистограмма интенсивности флуоресценции в гейте лимфоцитарных клеток по FL-1-каналу (слева от оси – несветящиеся клетки, справа – аннексин V-FITC-положительные лимфоциты) В рамках диссертационной работы проводили оценку реализации апоптотического процесса лимфоцитов периферической крови у пациентов с носительством антигена TBEV, HBV и HCV, а также у здоровых доноров in vitro в условиях инкубации лимфоцитарных клеток с модуляторами апоптоза. Для этого в лунки планшета вносили суспензию выделенных мононуклеаров крови (2·105 на лунку), а также чистую среду RPMI-1640 без эмбриональной телячьей сыворотки, т.е. в отсутствии ростовых факторов, или полную культуральную среду с добавлением дексаметазона (“KRCA”, Словения) в концентрации 10-4 моль/мл, либо с добавлением этопозида (“Rhone-Poulenc Rorer”, Франция) в концентрации 10-6 моль/мл. Клетки инкубировали в течение 18 ч при температуре 37 ºС и 5% СО2. Затем с помощью ФИТЦ-меченного аннексина V методом проточной лазерной цитометрии регистрировали апоптоз как указано выше. Приготовление препаратов для хромосомного анализа лимфоцитов проводили по методу P.S. Moorhead et al. 1960. Для оценки цитогенетического эффекта определяли общее количество аберраций и весь их качественный спектр в соответствии с критериями мутагенного воздействия [Бочков Н.П. и соавт., 1972; Carrano A. V., Natarajan A. T., 1988]. Полученные результаты выражали в процентах. Количество лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор (CD95), оценивали иммуноцитохимическим методом [Тотолян А.Н. и соавт., 2001] с использованием набора реагентов фирмы «Novocastra» (Великобритания). Для определения экспрессии мембранной формы рецептора к фактору некроза опухоли-α I типа (TNF-RI) (CD120) лимфоцитами интактную и ФГА-стимулированную культуры клеток инкубировали с МКАТ к TNF-RI, меченными FITC («Immunotech», Франция), в течение 30 мин согласно протоколу фирмы производителя. С помощью проточного цитометра анализировали наличие зеленой флуоресценции FITC в гейте лимфоцитарных клеток. Определение концентрации TNF-α и растворимого рецептора TNF-α (sTNF-RI) в супернатантах интактной и ФГА-стимулированной культур мононуклеаров осуществляли методом твердофазного иммуноферментного «сэндвичевого» анализа по инструкции, предлагаемой производителем («Procon», Россия и «Biosurce», США, соответственно). Измерение оптической плотности полученных растворов проводили на микропланшетном фотометре Multiscan EX («ThermoLabSystems», Финляндия) при длине волны света 450 нм. Изменение величины потенциала мембраны митохондрий (Δψm) клеток определяли с использованием набора «MitoScreen» («BD Pharmigen», США), ключевым реагентом которого является флуорохром 5,5’,6,6’-тетрахлоро-1,1’,3,3’-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианин йодид (JC-1). Окрашенные JC-1 лимфоциты анализировали на проточном цитометре Epics XL («Beckman Coulter», Франция), определяя процентное содержание клеток в гейтах неапоптотических (FL-2- и FL-1-свечение) и апоптотических клеток (FL-1-свечение). Активность эксцизионной системы репарации ДНК лимфоцитарных клеток исследовали методом сцинтилляционной радиометрии [Дубинин Н.П., Засухина Г.Ф., 1975]. Измерение радиоактивности (имп/с) проводили на сцинтилляционном счетчике «Mark III» (США). Рассчитывали индекс стимуляции системы ДНК-репарации. Результаты выражали в условных единицах (усл. ед.). Полученные в ходе исследования данные обрабатывали методами вариационной статистики. При анализе имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (критерий Шапиро–Вилка). Для нормально распределенных выборок вычисляли средневыборочные характеристики: среднее арифметическое (Х), среднее квадратичное отклонение (σ), ошибку среднего (m). Для выборок, распределение которых отличалось от нормального, рассчитывали медиану (Ме), первый и третий квартили (Q1, Q3). В случае отсутствия согласия данных с нормальным распределением для оценки различий между зависимыми выборками применялся непараметрический критерий Вилкоксона. Для оценки достоверности различий независимых выборок, не подчиняющихся критерию нормального распределения, использовали ранговый критерий Манна–Уитни. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05 [Лакин А.В., 1989]. С целью обнаружения связи между исследуемыми показателями проводили корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r). Методом множественной регрессии были рассчитаны коэффициенты β, определяющие степень зависимости между исследуемыми показателями [Боровиков В.П., 2001]. Сравнение многомерных группировок производили с помощью дискриминантного анализа с использованием алгоритма пошагового отбора информативных признаков. Статистическую значимость полученных дискриминантных функций оценивали с помощью λ-критерия Уилкса [Гланц С., 1999]. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям