Для студентов факультета ветеринарной медицины Составители : Д. А. Васильев в. Ю. Луговцев ульяновск 2005
|
|
Скачать 1.31 Mb.
|
^
Примерней план занятия (2 ч) 1. Контрольный опрос. 2. Объяснения преподавателя. 3. Самостоятельная работа студентов: демонстрация физиологического раствора; фосфатного буфера; набора флуорохромов; препаратов для вирусоскопии. 4. Подведение итогов занятия. 5. Задание к следующему занятию. ^ При проведении занятия в качестве материала для приготовления препаратов можно использовать любой, полученный от животных, куриных эмбрионов или культур клеток, инфицированных вирусом, с которыми работают сотрудники кафедры. Ввиду дефицита учебного времени демонстрацию и некоторые объяснения преподавателя можно совмещать с окрашиванием препаратов. Вопросы домашнего задания 1. Репродукция вирусов. 2. Метод иммунофлуоресценции и его варианты. ЗАНЯТИЕ 5. Люминесцентная микроскопия. Метод иммунофлуоресценции Цель занятия: ознакомиться с различными вариантами метода иммунофлуоресценции, применяемыми в вирусологической практике. ^ препараты-отпечатки с любым вирусным антигеном, соответствующие антивирусные флуоресцирующие сыворотки, флуоресцирующие сыворотки против глобулинов кролика, комплемент морской свинки, дистиллированная вода. физиологический раствор, пробирки с резиновыми пробками, пастеровские пипетки, пипетки на 1 и 5 мл, влажная камера, фильтровальная и черная бумага, предметные и покровные стекла, забуференный глицерин, нефлуоресцирующее иммерсионное масло, люминесцентный микроскоп, таблицы по теме, диапозитивы. ^ Метод иммунофлуоресценции впервые был предложен Альбертом Кунсом в 1942 году. Данный метод для ранней диагностики инфекционных заболеваний животных в ветеринарии начал изучать П.И.Притулин в 1955 году. Принцип данного метода заключается в том, что антитела, предварительно соединенные с флуорохромами, сохраняют способность вступать в специфическую связь с гомологичным антигеном. Образующийся комплекс антиген-антитело обнаруживают под люминесцентным микроскопом по характерному свечению благодаря присутствию в нем флуорохрома. В качестве красителя антител наиболее часто применяют ФИТЦ — флуоресцеина изо-тиоцианат (зеленое свечение) и РСХ — родамина сульфохлорид (красное свечение). Метод иммунофлуоресценции сочетает в себе специфичность серологических реакций и морфологического метода исследования. Его применяют для: 1) индикации, идентификации вирусов и вирусных антигенов в различных объектах; 2) выяснения локализации вирусов при изучении патогенеза инфекции; 3) определения местонахождения нормальных и иммунных глобулинов; 4) уточнения антигенного родства вирусов и др. Одно из главных преимуществ метода иммунофлуоресценции перед другими серологическими реакциями состоит в том, что при его применении значительно сокращается время и не требуется большой массы антигена. При использовании строго специфических, хорошо оттитрованных сывороток можно весьма точно поставить диагноз. Различают два основных способа диагностического применения метода иммунофлуоресценции: прямой и непрямой. При использовании прямого, или одноступенчатого метода для идентификации различных вирусных антигенов применяют соответствующие флуоресцирующие антитела диагностических сывороток, непосредственно обрабатывая ими препараты из исследуемого материала. При непрямом, или двухступенчатом, способе антиген вначале обрабатывают гомологичными нефлуоресцирующими антителами (1-ая ступень) затем для обнаружения последних, а вместе с ними и искомого антигена, применяют соответствующую им флуоресцирующую сыворотку против антител-глобулинов животного определенного вида: кролик, бык и т.д. (2-ая ступень). Кроме того, вирусный антиген может быть соединен с антисывороткой и комплементом (1-ая ступень), а затем обработан флуоресцирующей сывороткой против комплемента (2-ая ступень, принцип РСК). Непрямой способ более чувствительный, так как каждое антитело 1-ой ступени, применяемое для выявления антигена, многовалентно и может присоединить к себе несколько флуоресцирующих антител 2-ой ступени. Соответственно повышается и сила свечения искомых антигенов. В качестве объектов исследования можно использовать препараты-отпечатки и мазки, гистосрезы, культуры клеток и т.д. Предметные стекла должны быть тонкими, чистыми, обезжиренными, бесцветными и не иметь царапин. Для итого их промывают в нейтральных детергентах, прополаскивают в дистиллированной воде и сохраняют в спирте или смеси спирта с эфиром. П ^ репараты-отпечатки и мазки готовят следующим образом. Патологический материал помещают в металлическую ванночку, прижигают сверху раскаленным металлическим шпателем, вырезают из этого участка стерильным скальпелем небольшой кусочек и поверхностью разреза 2-3 раза прикасаются к предметному стеклу (отпечаток) или проводят по нему (мазок).  Препараты из культур клеток получают на покровных стеклах, предварительно вложенных в пробирки, где развивается клеточный пласт (монослой). Затем их отмывают физиологическим раствором от питательной среды, высушивают и фиксируют. При этом выбирают такой фиксатор, который не приводит к растворению вирусных антигенов и не нарушает их иммунологической специфичности. Чаще всего для этих целей применяют чистый ацетон, охлажденный до минус (10...15) °С, метиловый или этиловый спирт. Фиксируют препараты 10...15 мин. В таком состоянии их можно хранить долго. При использовании прямого метода на препарат наносят 1-2 капли антивирусной флуоресцирующей сыворотки в рабочем разведении. Продолжительность окрашивания — 30 мин. Для предупреждения высыхания препараты помещают в большие чашки Петри с ватными тампонами, смоченными водой (влажная камера). Затем их тщательно промывают физраствором, можно водопроводной водой. Препараты подсушивают и микроскопируют. При применении непрямого метода препарат вначале обрабатывают 30 мин во влажной камере антивирусной специфической сывороткой. Сыворотку смывают водопроводной водой. На подсушенные препараты наносят на 30 мин флуоресцирующую сыворотку против глобулинов того вида животных (кролика, быка, лошади и т.д.), на которых получена специфическая сыворотка против данного антигена. Затем препараты промывают, подсушивают и микроскопируют. При обработке препаратов с применением комплемента (2-ой вариант непрямого метода) вначале наносят смесь нефлуоресцирующей сыворотки с комплементом, а потом — антикомплементарную флуоресцирующую сыворотку. Для каждого этапа предусмотрена 20...30 минутная экспозиция во влажной камере помещенной в термостат. Препараты хорошо промывают, высушивают и просматривают под микроскопом. В ходе самостоятельной работы студентов необходимо 1. Ознакомиться с набором флуоресцирующих сывороток 1 наставлениями по их применению. 2. Обработать препараты прямым методом иммунофлуоресценции. 3. Просмотреть приготовленные препараты в микроскопе I зарисовать в тетрадь. Примерный план занятия (2 ч) 1. Контрольный опрос. 2. Объяснения преподавателя. 3. Самостоятельная работа студентов: а) демонстрация набора флуоресцирующих сывороток; б) положительных препаратом Ауески, ПГ-3 и др. 5. Подведение итогов занятия. 6. Задание к следующему занятию. Методические указания При проведении занятия в качестве материала для приготовления препаратов можно использовать любой, полученный от животных, куриных эмбрионов или культур клеток, инфицированных вирусом, с которым работают сотрудники кафедры. При отсутствии таких возможностей можно пользоваться живыми вакцинами, которыми заражают культуру клеток Флюоресцирующие сыворотки к возбудителям болезни можно найти в диагностических наборах, выпускаемых биопромышленностью. С учетом дефицита отведенного времени демонстрацию I объяснения преподавателя можно совмещать с периодом окрашивания препаратов (20...30 мин). Вопросы домашнего задания 1. Общая характеристика и биологические особенности онкогенных вирусов. 2. Принципиальная схема устройства электронного микроскопа. 3. Техника приготовления препаратов для электронной микроскопии. ЗАНЯТИЕ 6. Электронная микроскопия вирусов Цель занятия: ознакомиться с устройством и основными принципами работы электронного микроскопа, техникой приготовления препаратов для электронно-микроскопического исследования. ^ : электронный микроскоп, альбомы с микрофотографиями различных вирусов, таблицы, диапозитивы. Краткие теоретические сведения Электронная микроскопия — один из важных методов индикации и идентификации вирусов и диагностики вирусных инфекций. Важное преимущество этого метода перед другими — быстрота получения ответа и возможность дифференциации вирусов по их морфологии. Предпосылкой для конструирования электронного микроскопа явилось установление возможности использования вместо света потока электронов. Кроме того, было выяснено, что магнитные поля с осевой симметрией, являясь для потока электронов фокусирующими, действуют как настоящие линзы в обычном световом микроскопе. Это и дало возможность получить изображение объектов при использовании потока электронов. Первый электронный микроскоп был сконструирован в Германии в 1932 г. М.Кнолем и Э.Руска. В нашей стране электронные микроскопы начали создавать в 1937 г. В 1939-1947 г.г. появились их первые заводские образцы, изготовленные с учетом исследований С.Л.Пупко, Н.Г.Сушкина, М.Лебедева. Электронная микроскопия позволяет непосредственно (виэуально) выявлять вирусные частицы в различных материалах, Дифференцировать их по форме, размеру и ультраструктуре. Одна из основных характеристик различных микроскопов — их разрешающая способность. Это наименьшее Расстояние между двумя объектами, которые воспринимаются глазом раздельно. Величина эта математически выражается следующим образом:  где d — расстояние; λ — длина волны; n— показатель преломления среды между линзой и объективом, α - угол половины апертуры объектива линзы. | Если вместо символов поставить их числовые значения, то для светового микроскопа получим d = 2 мкм. Как видно из формулы, только уменьшение длины волны может существенно увеличить разрешающую способность микроскопа, так как другие величины изменяются лишь в небольших пределах. Известно, что пучок электронов обладает волновыми свойствами, а длина волны — переменная величина, зависящая от ускоряющего напряжения. Известно также, что электронным пучком можно управлять с помощью магнитного поля. Эти факты и легли в основу конструкции электронного микроскопа, разрешающая способность которых к настоящему времени достигла 0,1...0,2 нм. Схематически электронный микроскоп может быть изображен в виде металлического цилиндра, в котором создан вакуум. В этом цилиндре (колонна микроскопа) последовательно сверху вниз расположены вольфрамовая нить (катод), металличеcкая пластина с отверстием посередине (анод), ряд магнитных линз, между которыми находится держатель объекта, люминесцирующий экран и фотографическая пластинка. Магнитные линзы представляют собой катушки содержащие несколько тысяч витков проволоки, через которые пропускают ток. Проходящий через катушку ток создает концентрическое магнитное поле, с помощью которого фокусируется электронный пучок. Ток в несколько сот мкА, проходящий через вольфрамовую нить, нагревает ее, и атомы металла испускают электроны (эмиссия электронов), которые стремятся сконцентрироваться на вершине нити, образуя электронное облачко. Высокое отрицательное напряжение, приложенное к нити, обусловливает большую разность потенциалов, возникающую между ней и заземленной пластиной анода. Она и ускоряет движение электронов по направлению к аноду. Часть электронов проходит через отверстие в его центре (центральная апертура) и образует электронный пучок, направляющийся вниз по колонне микроскопа. Электронный пучок, сфокусированный первой магнитной линзой (конденсорной), освещает объект. Когда объект введен в колонну микроскопа, он оказывается на пути электронного пучка. При этом происходит взаимодействие электронов с объектом, часть их будет рассеиваться тяжелыми атомами объекта и выбиваться из общего электронного пучка. Большая часть электронов пройдет через объект без отклонения и вызовет свечение люминесцентного экрана в точках попадания электронов. Совокупность темных и светлых точек на экране создает изображение. Если ввести в колонну микроскопа необработанные вирусные частицы, то на экране появятся лишь размытые пятна. Контрастирование достигается в том случае, когда близлежащие области в исследуемом объекте обладают хорошо выраженной разностью электронных плотностей. Поскольку биологические объекты состоят из веществ с малым атомным номером (водорода, углерода, азота, кислорода и др.), то разность их электронных плотностей недостаточна для получения удовлетворительного изображения, при исследовании таких объектов приходиться искусственно повышать их электронную плотность. В этом и состоит одна из процедур подготовки образца для исследования его в электронном микроскопе. ^ . При отсутствие на кафедре электронного микроскопа необходимо иметь схему его устройства и работы. На занятиях надо иметь набор электронных микрофотографий вирусов. Вопросы домашнего задания.
ЗАНЯТИЕ 7. Культивирование вирусов путем заражения развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) Цель занятия: изучить анатомию развивающихся куриных эмбрионов, ознакомиться с методами заражения их вируссодержащим материалом. ^ : куриные эмбрионы, вируссодержащий материал (например, вирус осповакцины), шприцы, короткие и длинные иглы, подставки для РКЭ, овоскопы или осветители ОИ-19, пробойники и глазные пинцеты в баночке со спиртом, вата, 0,5%-ная настойка йода, стерильный парафин в пастеровских пипетках, стерильные покровные стекла или стеклянные колпачки, лейкопластырь, чашки Петри, спиртовки, простые карандаши, стерильные тампоны, таблицы по теме. ^ Куриные эмбрионы как живая система вошли в вирусологическую практику в 30-х годах XX века. Их использование расширило спектр культивируемых в лаборатории вирусов и позволило более успешно решать стоящие перед вирусологией задачи. Объясняется это тем, что РКЭ имеют ряд преимуществ перед другими живыми системами: 1) это закрытая живая система. Скорлупа и подскорлупная оболочка надежно защищают эмбрион от бактериального заражения; 2) у РКЭ высокая чувствительность к широкому спектру вирусов (недостаточное развитие защитных механизмов); 3) РКЭ — легкодоступный объект; 4) РКЭ — экономичная живая система, не требующая ухода и кормления; 5) РКЭ не образуют антител в ответ на заражение. Куриные эмбрионы используют в вирусологии для: 1) обнаружения в патматериале активного вируса или первичного выделения вируса. Эффективно выделяют и культивируют на куриных эмбрионах вирусы, вызывающие заболевания у птиц, а также некоторые вирусы млекопитающих; 2) поддержания вирусов в условиях лаборатории; 3) титрования вирусов; 4) накопления вируса для лабораторных исследований и получения вакцин; 5) реакции нейтрализации, как тест-объект. При отборе куриных эмбрионов для заражения вируссодержащим материалом к ним предъявляют следующие требования: эмбрионы должны быть получены из хозяйств, благополучных по инфекционным заболеваниям, скорлупа яиц должна быть непигментированной, чистой (мыть нельзя). Возраст эмбриона должен соответствовать избранному методу заражения. Строение куриного эмбриона. Обычно курица откладывает оплодотворенное яйцо, в котором зародыш находится на стадии бластулы или ранней гаструлы. При нагревании яйца до температуры, близкой к температуре тела курицы, происходит дальнейшее развитие зародыша. В период с 5-го по 12-й день инкубации куриные эмбрионы могут быть использованы для заражения вирусами. Куриное яйцо заключено в скорлупу, через ее поры совершается газообмен. Под ней лежит подскорлупная (белковая) оболочка. Это своеобразная буферная система между содержимым яйца и скорлупой. Подскорлупная оболочка в тупом конце яйца разделяется на два листка, между которыми образуется воздушная камера (пуга). Непосредственно под подскорлупной оболочкой находится хорион-аллонтоисная оболочка (ХАО — сосудистая оболочка), которая формирует аллонтоисную полость, заполненную жидкостью. На 11-12-й день развития количество ее достигает 6...7 мл. Тело зародыша лежит в яйце эксцентрично, спиной ближе к скорлупе, голова направлена в сторону воздушной камеры. Зародыш погружен в амниотическую жидкость, заполняющую амниотическую полость, сформированную из амниотической оболочки. Количество амниотической жидкости к 10-11-му дню развития эмбриона составляет в среднем 1 мл. Зародыш пуповиной связан с желтком, который располагается эксцентрично. Этот резервуар питательных веществ имеет наибольший объем в начале инкубации, а по мере развития зародыша он уменьшается. Кроме того, в полости РКЭ находится белок, покрытый оболочкой, являющийся питательным материалом для эмбриона . Размножение вирусов возможно во всех структурах эмбриона, имеющих клеточное строение, к которым относятся зародыш, ХАО и желточный мешок. Накопление вирусов происходит в тех же структурах, но целый ряд их может накапливаться в аллантоисной и в амниотической жидкостях, образуя практически готовую суспензию вирусов. Заражение в ту или другую область эмбриона проводится в период ее максимального развития, когда количество чувствительных клеток будет наибольшим. В процессе инкубации меняются размеры зародышевых структур, что во многом объясняется их функциональным назначением и определяет оптимальные для заражения возраст эмбриона. Так, желточный мешок, как резервуар питательных веществ, имеет наибольший объем в начале инкубации, а затем, после 12-го дня, по мере развития зародыша, он уменьшается. Заражают в желточный мешок с 5-го по 7-ой день инкубации. Амниотическая полость, являясь буферной средой развития зародыша, покрывает его уже на 5-й день инкубации. Среднее количество жидкости к середине периода инкубации составляет около 1 мл. Для заражения в амниотическую полость используют эмбрионы в возрасте 6-10 дней. Аллантоисная полость служит для сбора продуктов обмена, в ней скапливаются мочекислые соли, фосфорные и азотистые соединения. В процессе роста и развития зародыша аллантоисная жидкость приобретает кислую реакцию. Максимальных размеров аллантоисная полость достигает на 9-12-ый день развития эмбриона, поэтому заражение в нее проводят преимущественно на 9-11-й день инкубации. Хорион-аллантоисная оболочка богата кровеносными сосудами, которые, тесно прилегая к внутренней поверхности пористой скорлупы, насыщаются кислородом и снабжают им тело зародыша, выполняя функцию органа дыхания эмбриона. Максимального развития ХАО достигает на 11-13 день. Заражение на хорион-аллантоисную оболочку проводят на 10-12 день инкубации. Подготовка РКЭ для заражения. Эмбрионы доставляют из инкубатора, не допуская охлаждения в пути. В лаборатории их инкубируют в термостате при 37 °С и 60... 70% влажности. Для этого в термостат помещают открытые широкогорлые сосуды с водой. Эмбрионы ставят в специальные штативы воздушной камерой вверх. Поступившие в лабораторию РКЭ овоскопируют и отмечают простым карандашом границу воздушного пространства (пуги), тело и головку эмбриона, безсосудистую зону. Эти отметки служат ориентиром при выборе места введения вируссодержащего материала. При овоскопировании определяют жив зародыш или погиб. Зародыш, проявляющий активные движения при хорошей кровенаполненности сосудов ХАО, считается живым. Заражение проводят в боксе. Рабочее место должно быть хорошо освещено. Перед началом работы стол дезинфицируют спиртом, поджигая его на столе. Готовят следующие инструменты и принадлежности: комочки ваты для дезинфекции поверхности скорлупы, 0,5%-ную настойку йода, пробойники, шприцы, иглы, парафин в пипетках, подставки для эмбрионов. После этого рабочий стол в течение 1 ч облучают УФ-лучами. Способы, заражения. Существует ряд способов заражения эмбрионов. При любом из них скорлупу яйца над местом введения материала обрабатывают спиртом, обжигают, затем обрабатывают слабым раствором йода и вновь обжигают. Одним из распространенных в вирусологии способов является заражение на хорион-аллантоисную оболочку. Оно применяется в тех случаях, когда, вирус хорошо размножается в клетках этой оболочки (поксвирусы — вирусы оспы, осповакцины, эктромелии; герпесвирусы — вирус ларинготрахеита; онкорнавирусы — вирус лейкоза кур и др.) Для этой цели используют 11-14-дневные РКЭ. Техника заражения сводится к следующему. В центре воздушной камеры снимается часть скорлупы и в результате обнажается подскорлупная оболочка. Ее приподнимают и удаляют — обнажается прозрачная, блестящая, красная, пронизанная кровеносными ссудами хорион-аллантоисная оболочка. На нее пипеткой наносят вируссодержащий материал в дозе 0,1-0,2 мл. После этого окошечко в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, стеклянным колпачком или лейкопластырем, края заливают стерильным парафином. Заражение в аллантоисную полость наиболее часто применяют при культивировании тех вирусов, которые размножаются в клетках эпителия (орто- и парамиксовирусы, онкорнавирусы, герпесвирусы и др.). Вирус при этом поступает в аллантоисную жидкость, накапливаясь в ней в высоких концентрациях (вирус гриппа). Возраст куриных эмбрионов должен быть 10-11 суток. Вируссодержащий материал можно вводить двумя способами. 1. Делают прокол в скорлупе над центром воздушной камеры. Через отверстие шприцем с короткой иглой, который держат в вертикальном положении, вводят материал (0,1...0,2 иногда 0,5 мл) на 2-3 мм ниже границы воздушной камеры. Затем отверстие в скорлупе заливают стерильным парафином или закрывают лейкопластырем. 2. Делают два прокола — первый в скорлупе над воздушной камерой, второй — над безсосудистой зоной. Через второе отверстие с помощью шприца вводят материал (0,1...0,2 мл) прямо в аллантоисную полость. Для того, чтобы жидкость не выливалась обратно, через первое отверстие пипеткой с резиновой грушей отсасывают воздух, затем оба отверстия заливают парафином. Заражение в амниотическую полость — самый эффективных метод выделения ряда орто- и парамиксовирусов. При этом способе вирус размножается в органах и тканях эмбриона. Для заражения обычно используют 6...11-дневные эмбрионы. Следует отбирать такие эмбрионы, у которых зародыши близко расположены к воздушному пространству. Существует два способа введения материала в амнион. 1. Скорлупу над воздушной камерой удаляют и в образовавшемся окне глазным пинцетом осторожно отслаивают 1...1,5 см подскорлупной оболочки. Через обнажившийся участок хорион-аллантоисной оболочки тем же пинцетом делают прокол в направлении к эмбриону в том месте, где нет сосудов. Далее захватывают амниотическую оболочку и осторожно извлекают часть ее наружу через образовавшееся отверстие в хорион-аллантоисной оболочке. В складку амниотической оболочки с помощью шприца вводят вируссодержащий материал в дозе 0,05...0,2 мл. Отверстие в скорлупе закрывают стеклянным колпачком или лейкопластырем, края заливают стерильным парафином. Это так называемый открытый способ (метод окна). 2. В центре воздушной камеры производят прокол скорлупы. Через образовавшееся отверстие иглу шприца вводят на 8...1,2 см ниже границы воздушной камеры. Под легким давлением игла проникает в амниотическую полость, куда и вводят 0,1...0,2 мл материала. После заражения отверстие в скорлупе яаливают стерильным парафином. Это закрытый способ заражения в амниотическую полость. Заражение в желточный мешок используют для культивирования поксвирусов - вирусов группы оспы, орта- и парамиксо-вирусов (вирусы гриппа, болезни Ньюкасла, возбудитель орнитоза и др.). Для заражения в желточный мешок пригодны 5…6-дневные эмбрионы. В скорлупе над воздушной камерой делают прокол, наклоняют яйцо в направлении местонахождения эмбриона и вводят длинную иглу шприца на глубину 2,5...4,5 см от поверхности скорлупы, наклоняя ее в сторону, противоположную эмбриону. Доза вируссодержащего материала 0,2...0,5 мл. Методы заражения РКЭ при диагностике ряда вирусных инфекций представлены в табл.2. Таблица 2. Использование РКЭ для культивирования вирусов
Заражение эмбрионов всегда сопровождают следующие контроли: а) на спонтанную возможность заражения. В термостат ставят несколько эмбрионов, с которыми не проводили никаких манипуляций; б) на токсичность материала. РКЭ заражают фильтратом исследуемого патологического материала после уничтожения в нем вирусов автоклавированием; в) контроль жидкости, в которой разводили вируссодержащий материал (раствор Хенкса, физиологический раствор и пр.). Для исследования вируссодержащего материала и контролей используют не менее 4-х эмбрионов (чаще 5-7). Инфицированные и контрольные эмбрионы помещают в термостат или инкубатор для дальнейшей инкубации при 35...37 °С и относительной влажности 60...70%. Эмбрионы ежедневно овоскопируют, погибших помещают в холодильник (4-6 °С) на 2...3 ч, а затем вскрывают. В ходе самостоятельной работы студентов необходимо
2. Отобрать жизнеспособные и развитые РКЭ. 3. Отметить простым карандашом на скорлупе границу воздушной камеры, местонахождение эмбриона и безсосудистую зону. 4. Заразить РКЭ на хорион-аллантоисную оболочку, в желточный мешок, аллантоисную и амниотическую полости. Примерный план занятия (2 ч)
2. Объяснения преподавателя. 3. Демонстрация организации рабочего места; овоскопирования и подготовки куриных эмбрионов, заражения; отработки технических приемов заражения РКЭ всеми способами; строение вскрытого эмбриона. 4. Самостоятельная работа студентов: а) овоскопирование двух куриных эмбрионов; б) подготовка к заражению; в) отработка техники заражения всеми методами на одном курином эмбрионе; г) заражение 9-дневного эмбриона вирусом ньюкаслской болезни (штамм "В" или "Н") в аллантоисную полость, подписывание его; д) заражение 11-дневного куриного эмбриона вирусом оспы голубей (кур) на ХАО. 5. Подведение итогов занятия. 6. Задание к следующему занятию. ^ По теме целесообразно провести два занятия с интервалом в несколько дней с тем, чтобы студенты могли вскрыть зараженные ими эмбрионы. Рекомендуется использовать для заражения вирус ньюкаслской болезни, штамм "В", который в максимальных титрах накапливается к 5-му дню инкубации, не вызывая гибели эмбриона. Овоскопирование удобнее проводить в затемненной комнате. Студенты работают в марлевых масках, которые после каждой группы стирают и стерилизуют. Вопросы домашнего задания 1. Взаимодействие вирусов в условиях смешанных инфекций 2. Методы вскрытия РКЭ, отбор вируссодержащего материала 3. Получение эмбриональной жидкости для постановки капельной РГА. 4. Патологоанатомические изменения в РКЭ. 5. Цель пассирования вирусов на РКЭ. ЗАНЯТИЕ 8. Вскрытие куриных эмбрионов Цель занятия: ознакомиться с техникой вскрытия зараженных куриных эмбрионов, патологоанатомическими изменениями и методикой приготовления эмбрионального экстракта и постановки капельной РГА. ^ металлические подставки для куриных эмбрионов, зараженные эмбрионы, физиологический раствор, овоскопы или осветители ОИ-19, стерильные пенициллиновые флаконы и резиновые пробки №14 или 14,5, чашки Петри, глазные ножницы и пинцеты в стаканчиках со спиртом, предметные стекла, 0,5%-ная настойка йода, 5%-ная взвесь эритроцитов кур, пастеровские пипетки, эмалированная кастрюля, вата, спиртовки, таблицы по теме. ^ Куриные эмбрионы при заражении вируссодержащим материалом не всегда погибают, поэтому их следует выдержать определенное время в термостате или в лабораторном инкубаторе (обычно 5...10 суток, срок зависит от вида вируса). Перед вскрытием их на 2...3 ч помещают в холодильник при 4...6 °С. При охлаждении кровеносные сосуды сокращаются, что предупреждает кровотечение и возможность адсорбции вирусов на эритроцитах в процессе вскрытия эмбриона и отбора вируссодержащего материала. Затем скорлупу в месте воздушной камеры обрабатывают 70%-ным спиртом, обжигают на пламени, снова обрабатывают 0,5%-ной настойкой йода и опять обжигают. Чтобы получить аллантоисную и амниотическую жидкости, скорлупу стерильными ножницами обрезают на 2...3 мм выше границы воздушной камеры. Яйцо слегка наклоняют, удаляют оставшуюся подскорлупную оболочку и через прокол в хорион-аллантоисной оболочке пастеровской пипеткой, избегая повреждения сосудов, отсасывают 6...10 мл прозрачной аллантоисной жидкости. После этого пинцетом захватывают эмбрион, пастеровской пипеткой прокалывают амниотическую оболочку и отсасывают амниотическую жидкость (0,5...1,5 мл). Эмбрион при этом необходимо передвигать, чтобы не закупоривалась пипетка. Далее ножницами по кругу (граница воздушной камеры) подрезают хорион-аллантоисную оболочку, удаляют этот ее участок и все содержимое эмбриона извлекают в чашку Петри. Оставшуюся хорион-аллантоисную оболочку помешают в стерильную чашку Петри, тщательно расправляют и макроскопически исследуют на темном фоне. Для этого чашку Петри устанавливают на черную бумагу. Затем отделяют эмбрион, разрезают оболочку желточного мешка, освобождают ее от желтка, промывают физиологическим раствором и также помещают в отдельную чашку Петри. Материал, взятый из куриных эмбрионов, обязательно проверяют на присутствие бактерий путем высева на МПА, МПБ. Следует иметь в виду, что патологоанатомические изменения зависят от вида вирусов и метода заражения РКЭ. Наиболее характерные изменения локализуются на хорион-аллантоисной оболочке: воспалительные очаги — непрозрачные, бело-серого цвета, часто округлой формы; перламутровые бляшки с некротическим центром; кровоизлияния . На теле и голове зародыша, оболочке желточного мешка могут быть кровоизлияния, застойные явления в сосудах лапок и крыльев, в некоторых случаях — отставание в росте ("карликовость"), скручивание и отечность. Иногда отмечается увеличение печени кровоизлияния на ее поверхности. Для быстрого обнаружения гемагглютинирующего вируса в исследуемой эмбриональной жидкости (содержимое аллантоисной и амниотической полостей) ставят капельную реакцию гемагглютинации. Для необходимо иметь 5%-ную взвесь эритроцитов кур на физиологическом растворе, предметное или часовое стекло и пастеровские пипетки. Техника постановки данной реакции сводится к следующему. На поверхность предметного стекла наносят каплю исследуемой жидкости и каплю 5%-ной взвеси эритроцитов кур и перемешивают. В положительном случае реакция наступает через 3...5 мин. Если в жидкости находится гемагглютинирующий вирус, то при взаимодействии его с эритроцитами образуется агглютинат (происходит агглютинация эритроцитов), а надосадочная жидкость становится прозрачной. Если вирус отсутствует или не обладает гемагглютинирующими свойствами, эритроциты остаются во взвешенном состоянии, жидкость остается мутной. При выделении и культивировании вирусов на куриных эмбрионах, как правило, проводят несколько (не менее 3) быстро следующих один за другим пассажей. Это позволяет исключить токсичность исследуемого материала, способствует адаптации вируса, повышению его вирулентности и более интенсивному проявлению патологоанатомических изменений в эмбрионах. Для каждого последующего пассажа используют патологический материал предшествующих, обязательно определяют титр (концентрацию) вируса. ^ 1. Проовоскопировать зараженные и контрольные РКЭ. 2. Вскрыть РКЭ, собрать вируссодержащий материал, изучить патологоанатомические изменения на теле эмбриона, хорион-аллантоисной оболочке (фиксация в 10%-ном растворе формальдегида), оболочке желточного мешка. 3. Поставить капельную РГА. Примерный план занятия (2 ч) 1. Контрольный опрос. 2. Объяснения преподавателя. 3. Демонстрация: организации рабочего места для вскрытия эмбриона и получения от него вируссодержащего материала; патологических изменений, капельной РГА. 4. Самостоятельная работа студентов: а) вскрытие куриных эмбрионов, зараженных вирусом ньюкаслской болезни, отсасывание аллантоисной и амниотической жидкостей, постановка капельной РГА; б) вскрытие куриных эмбрионов, зараженных вирусом оспы, подсчет количества оспин на ХАО. 5. Подведение итогов занятия. 6. Задание к следующему занятию. ^ Для заражения эмбрионов рекомендуется использовать вирус Ньюкаслской болезни, штамм В поскольку он накапливается в максимальных титрах к 5 дню инкубации, не вызывая гибель эмбрионов. Содержащийся в аллантоисной жидкости вирус в капельной РГА образует крупные хлопья эритроцитов. Для отработки метода заражения на ХАО удобно использовать вирус оспы голубей, штамм Нью-Джерси. Гибели эмбрионов он не вызывает, но на ХАО образует довольно крупные "оспины". Для пробивания в скорлупе отверстий могут быть изготовлены пробойники из нержавеющей стали. Если их нет, можно использовать инъекционную иглу, вколотую в резиновую пробку. Парафин, предварительно расплавленный, засасывают в пастеровские пипетки, а затем расплавляют на спиртовке, закрывая отверстия в скорлупе. Вопросы домашнего задания 1. Природа и происхождение вирусов. Основные свойства вирусов, отличающие их от бактерий и других микроорганизмов.
3. Культивирование вирусов в культуре клеток. 4. Подготовка лабораторной посуды. 5. Вода, солевые растворы и питательные среды, применяемые в вирусологической практике. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
отлично
1
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям