Для студентов факультета ветеринарной медицины Составители : Д. А. Васильев в. Ю. Луговцев ульяновск 2005
|
|
Скачать 1.31 Mb.
|
|
ЗАНЯТИЕ 9. Принципы культивирования вирусов в культуре клеток ^ ознакомиться с общими сведениями о культурах клеток, солевыми растворами и питательными средами, рецептурой их приготовления, отработать технику подготовки необходимой посуды при получении культуры клеток. ^ среда 199, 5%-ный гемогидролизат, 0,5%-ный гидролизат лактальбумина, 0,25%-ный раствор трипсина, раствор Хенкса, 7,5%-ный раствор соды на бидистиллированной воде, раствор версена, бычья сыворотка и другие среды, смонтированная для стерилизации посуда, пипетки, резиновые пробки, таблицы по теме. ^ Культура клеток — это клетки тканей различных органов многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма (in vitro). При этом в пробирках или матрасах образуется клеточный монослой. Культуру клеток практически можно получить из любого органа или ткани человека или животного (взрослого или эмбриона). Однако, лучше это удается сделать из эмбриональных органов, так как их клетки еще слабо дифференцированы и обладают более высокой потенцией роста. Методика культивирования клеток особенно успешно стала развиваться после 40-х годов текущего столетия. Этому способствовало открытие Эндерсома с сотрудниками (1949), которые продемонстрировали способность вирусов к репродукции в кусочках тканей и клетках in vitro, открытием Дулъбекко и Фогт (1952) методики трипсинизации тканей и получение однослойных культур клеток, открытием Станфорда, в лаборатории Эрла, методики непрерывного культивирования клеток. Главными нововведениями, упростившими культивирование клеток и способствовавшими распространению метода клеточных культур, были: 1) использование антибиотиков» не повреждающих животные клетки, но предотвращающих загрязнение культур бактериями; 2) получение из карциномы человека линии клеток (HeLa), способных неопределенно долго расти in vitro и восприимчивых к большому числу различных вирусов человека (Gey et al„ 1952; Scherer et al., 1955); 3) разработка Иглом (Eagle, 1960) простой питательной среды, поддерживающей размножение клеток многих типов; 4) усовершенствование методов получения клонов из единичных клеток млекопитающих (Puck et al., 1957). Наличие клеточных культур и метода количественного определения вирусов путем подсчета образуемых ими бляшек в равной степени стимулировало развитие двух аспектов вирусологии. Во-первых, в результате клинических и эпидемиологических исследований были открыты сотни новых вирусов — так много, что некоторые из них до сих пор не удалось связать с какими-либо известными болезнями (Jackson, Muldoon, 1975). Во-вторых, создалась возможность производства вакцин в промышленных масштабах. К началу 1960-х годов только против полиомиелита было вакцинировано несколько сотен миллионов человек, и теперь во всех странах заболеваемость полиомиелитом резко снизилась. В клеточных культурах были получены и другие вирусные вакцины, например противокоревая, и после успеха профилактики полиомиелита они получили широкое применение. Методы получения вирусов в больших количествах оказались полезными и для общей вирусологии, они облегчили очистку вирусов. В вирусологической практике наиболее широко применяют однослойные культуры клеток. Последние, в зависимости от исходного материала, подразделяют на первичные (получают непосредственно из органов животных и человека) и перевиваемые (адаптируют первичные культуры к условиям жизни в пробирке). Их получают путем обработки кусочков тканей ферментами (трипсин). Последние распадаются на клетки, которые и выращивают в виде одного слоя (монослоя) на внутренней поверхности стекла. В вирусологической практике применяют следующие культуры клеток. 1. Первичные. Их готовят непосредственно перед применением (для длительного культивирования они не пригодны). Их можно получить из различных органов и тканей человека и животных. Однако, лучше это удается сделать из эмбриональных органов. Чаще всего используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы эмбрионов или молодых животных. После соответствующей подготовки их измельчают на кусочки размером 1...2 мм и обрабатывают трипсином (такие культуры называют первичнотрипсинизированными). Затем полученную взвесь клеток разливают по пробиркам или в другую посуду, заливают питательной средой, инкубируют в термостате и получают монослой клеток. Обычно он формируется через 3...5 дней. Скорость формирования зависит от вида ткани, возраста животного, качества питательной среды, посевной концентрации клеток и других факторов. Питательную среду меняют по мере ее загрязнения продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохраняет жизнеспособность в течение 7...21 дня. Из первичных клеток можно получить субкультуры путем снятия их со стекла раствором версена (или смесью версена и тринсина) и ресуспендирования в новой питательной среде. Субкультуры получают от 2-5 пассажей и очень редко до 8-10. Последующие пассажи приводят к изменению морфологии клеток и их гибели. 2. Перевиваемые. Это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях их поддерживают путем пересевов из одного сосуда в другой при условии замены питательной среды. Получают перевиваемые клетки из первичных культур клеток с повышенной активностью роста путем длительных пересевов в определенном режиме культивирования. Эта работа проводится в течение многих месяцев. Полагают, что механизм происхождения перевиваемых клеток — результат их генетической изменчивости. Клетки перевиваемых культур имеют одинаковую форму, гетероплоидный набор хромосом (у первичных культур он диплоидный), стабильны в условиях роста в пробирке, некоторые из них обладают онкогенной активностью. Последнее свойство ограничивает их использование при производстве вакцин. Перевиваемые клетки можно получить как из здоровых тканей животных, так и из опухолевых. Примеры таких клеток: ВНК-21 (почка новорожденного хомячка); ППТ (перевиваемая почка теленка); ППО (перевиваемая почка овцы); НеLа — (раковая опухоль шейки матки женщины); Нер-2 (карцинома гортани человека); Нер -3 (лимфоидная карцинома человека) и др. 3. Диплоидные. По сути дела это перевиваемые культуры с двойным (правильным) набором хромосом. В первых 50-60 пассажах такие культуры остаются диплоидными и их широко используют для решения ряда теоретических и практических задач биологии (приготовление биопрепаратов для человека, выделение онковирусов и др.). Они весьма жизнеспособны, не подвержены морфологическим изменениям, свободны от спонтанного вирусоносительства и т.д. Работа с культурой клеток требует абсолютной стерильности, тщательной подготовки посуды и соответствующих питательных сред. Подготовка посуды. Качество посуды имеет важное значение для успешного культивирования клеток вне организма. Лучшей является посуда из боросиликатного или натриевого стекла. Посуда должна быть чистой, обезжиренной, не обладать токсическим действием, абсолютно стерильной. Предложено много способов обработки посуды и в каждой лаборатории выбирают наиболее подходящий из них. При культивировании клеток особенно большие требования предъявляют подготовке и стерилизации посуды, пробок и других материале Во многих случаях неправильная их мойка и стерилизация служат причиной неприкрепления клеток к стеклу или быстрой генерации клеточного монослоя. При обработке посуды необходимо учитывать высокую чувствительность клеток к токсическому действию солей тяжел металлов. Одним из обязательных условий успешной работы клетками является высокое качество воды. Для ополаскивав посуды используют дистиллированную, а лучше бидистиллированную воду. Обычно всю посуду, как новую, так и бывшую в употреблении (БУ), помещают в мыльный раствор, а инфицированную — мыльно-феноловый (1% мыльной эмульсии + 5% фенола) на сутки. Затем посуду моют теплой водой и обрабатывают по следующей методике. Погружают на 3 ч в раствор хромпика (на 1л концентрированной серной кислоты добавляют 80 г двухромов кислого калия КзСг207); раствор должен быть желтоват коричневого цвета, если он приобретает зеленое окрашивание значит хромовая кислота восстановилась и раствор непригоден для использования. После обработки в хромпике посуду 5 ч промывают в проточной водопроводной воде, ополаскивают в нескольких сменах дистиллированной воды, сушат, монтируют стерилизуют 1,5...2 ч в сушильном шкафу (170...180 °С). Посуда БУ обрабатывают хромпиком в течение 1 ч и стерилизуют при аналогичных условиях. Пипетки после работы собирают в банки с дезинфицирующим раствором и выдерживают в них не менее суток, затем удаляют ватные прокладки, промывают хромпиком, водопроводной дистиллированной водой, помещают на некоторое время 96°-ный этиловый спирт, высушивают, монтируют и стерилизую в сушильном шкафу 1,5...2 ч при 170-180 °С. ^ содержат токсические для клеток вещества. Для удаления их моют в теплой воде щетками, прополаскивают водопроводной водой, кипятят в 2%-ом растворе NаОН течение 3 мин, снова прополаскивают водопроводной водой, 5 мин кипятят в 1,8%-ном растворе НС1, ополаскивают водопроводной водой, три раза дистиллированной, сушат на воздухе, монтируют и стерилизуют в автоклаве 1 ч при 0,15 МПа). Пробки БУ автоклавируют и 1 ч кипятят, моют щетками, прополаскивают водопроводной водой, один раз дистиллированной, кипятят в течение часа в дистиллированной воде, 3 раза прополаскивают в дистиллированной воде, высушивают, монтируют, стерилизуют в автоклаве. Инструменты кипятят в дистиллированной воде и погружают в стакан со спиртом (стакан должен находиться в боксе). Перед каждой манипуляцией их прожигают на спиртовке. ^ Для культивирования клеток большинство питательных сред готовят на сбалансированном солевом растворе, для которого необходимы высокоочищенные препараты, так как следы ряда примесей (свинец, ртуть и другие тяжелые металлы) токсичны для клеток. Солевые растворы готовят на бидистиллированной воде. Они обеспечивают сохранение рН, осмотического давления в клетках, соответствующую концентрацию необходимых неорганических веществ. Лучшими из них являются растворы Хенкса и Эрла. Эти растворы — обязательный компонент любой питательной среды. ^ На 1 л бидистиллированной воды берут NаС1 — 8,0 г, КСl — 4,0 г, MgSO4 • 7Н2О — 2,0 г, СаС12 — 1,4 г, КН2Р04—0,6 г, глюкозы — 10 г, 0,2%-го фенолрота— 4,0 мл, Nа2НР04 — 0,6 г. ^ на 1 л бидистиллированной воды добавляют— NаС1 — 6,8 г, КС1— 0,4 г, СаС12—0,2г, MgSO4 —0,1 г, NaH2PO4—0,125 г, NaHCO3—2,2 г, глюкозы— 1,0г. Для определения в солевых растворах и питательных средах концентрации водородных ионов (рН) применяют индикатор феноловый красный (0,002%). Он не оказывает токсического воздействия на клетки и вирусы. При сдвигах рН в щелочную сторону растворы принимают красно-малиновую окраску, в кислую— желтую. При нейтральном значении рН (7,2...7,4) цвет среды оранжево-красный. Для регулирования рН солевых растворов и питательных сред используют 7,5%-ный раствор бикарбоната натрия NaHCO3 и 3% -ный раствор уксусной кислоты СН3СООН. Эти растворы готовят на бидистиллированной воде, стерилизуют кипячением и хранят в холодильнике при 4...6 °С не более месяца. Чтобы получить однослойную культуру клеток, применяют протеолитические ферменты, разрушающие цитоплазматические мостики между клетками. К таковым относятся трипсин, панкреатин, папаин и др. Наиболее часто используют трипсин в виде 0,25%-ного раствора на фосфатном буфере. Хранят его в замороженном состоянии 6...8 месяцев. При пересеве перевиваемых клеток с целью отделения их от стекла используют версен (натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты). Он оказывает на клетки более легкое действие, чем трипсин. Механизм действия заключается в том, что он вступает в реакцию со стеклом, образуя промежуточное соединение, которое механическим путем отделяет клетки друг от друга. ^ Различают искусственные (полусинтетические и синтетические) и естественные питательные среды. Естественные питательные среды — это биологические жидкости (сыворотка крови, эмбриональный экстракт, асцитическая жидкость, коровья амниотическая жидкость, тканевые экстракты и др.). Питательные среды из естественных компонентов применяют редко, главным образом для выращивания вновь изолированных тканей в начале культивирования и для поддержания очень прихотливых тканей животных. К полусинтетическим питательным средам относят гемогидролизаты, гидролизат лактальбумина, аминопептид и др. Лучшей искусственной питательной средой является синтетическая среда 199. Она содержит 60 компонентов: 10 аминокислот, 17 витаминов, 8 минеральных солей, 10 компонентов, входящих в состав нуклеиновых кислот и др. Кроме того, среды подразделяются на ростовые и поддерживающие. Ростовые применяются в 1-ой фазе культивирования клеток. Они богаты питательными веществами и способствуют активному размножению клеток (например, 5%-ый гемогидролизат + 10% бычьей сыворотки). Поддерживающие среды применяют во 2-ой фазе культивирования клеток — после заражения культуры клеток вирусами. Они поддерживают жизнеспособность клеток. Из поддерживающих сред обычно исключают сыворотку. Для уничтожения микрофлоры перед использованием в среды добавляют пенициллин (100 ЕД/мл), стрептомицин (50 ЕД/мл), тетрациклин (100 ЕД/мл), устанавливают рН 7,2...7,4; в ростовые среды, кроме того, вносят 10% бычьей сыворотки. В ходе самостоятельной работы студентов необходимо: 1. Ознакомиться с солевыми растворами и питательными средами, рецептурой их приготовления. 2. Отработать технику подготовки посуды для стерилизации; 3. Провести регулировку рН в одном из растворов, питательной среде (раствор Хенкса, 0,5%-ный гемогидролизат или др.). Примерный план занятия (2 ч)
Методические указания На занятии необходимо иметь набор солевых и прочих растворов, питательных сред. Очень хорошо демонстрировать фиксированные препараты культур клеток или диапозитивы с последующей их зарисовкой в рабочую тетрадь. Вопросы домашнего задания 1. Патогенез вирусных инфекций. 2. Получение первично-трипсинизированных культур клеток. 3. Техника подсчета и разлива клеток. ЗАНЯТИЕ 10. Получение первично-трипсинизированных культур клеток из развивающихся куриных эмбрионов Цель занятия: ознакомиться с техникой получения первичных культур клеток методом трипсинизации. ^ специально обработанная для выращивания клеток посуда, чашки Петри, колба для трипсинизации, центрифужные пробирки, пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 мл, стерильные резиновые пробки, раствор Хенкса или Эрла, 0,25%-ный раствор трипсина, питательная среда для культур клеток, стерильная сыворотка КРС, пенициллин, стрептомицин, 7,5%-ный раствор соды, 3%-ный раствор уксусной кислоты, центрифуга, магнитная мешалка, стерилизатор с инструментами (ножницы глазные прямые и изогнутые, пинцеты анатомические), спиртовки, подставки для яиц, сливная чашка, кювета со льдом, овоскопы или осветители ОИ-19, 2-3 эмбриона 7...10 дневного возраста. ^ РКЭ вначале овоскопируют, на скорлупе отмечают границу воздушной камеры. Её поверхность обрабатывают спиртом и обжигают. Стерильными ножницами срезают скорлупу на 2...3 мм выше границы воздушной камеры, Разрывают подскорлупную и хорион-аллантоисную оболочки, асептически извлекают эмбрион и помещают его в чашку Петри. Затем у эмбриона удаляют лапки, крылья, голову и обязательно внутренние органы. Оставшуюся часть (кожно-мышечный мешок) промывают буферным раствором Хенкса с антибиотиками. После трехкратного отмывания эмбрион измельчают ножницами на кусочки размерами 2...3 мм. Измельченную ткань 3 раза отмывают в растворе Хенкса с антибиотиками от слизи и элементов крови и переносят в колбу для трипсинизации. Ткань в колбе заливают двойным объемом 0,25%-ного раствора трипсина, подогретого до 37 °С, и вносят стерильный магнит. Колбу ставят на магнитную мешалку. Раствор трипсина и механическое воздействие вращающегося магнита способствуют растворению межклеточного вещества, разделению клеток и переходу отдельных из них в раствор. Первый этап трипсинизации продолжается 3...5 мин. Затем отделившиеся клетки вместе с трипсином сливают в центрифужные пробирки и помещают в кювету со льдом, чтобы ограничить дальнейшее воздействие трипсина на клетки. К оставшейся ткани добавляют вторую порцию трипсина, и колбу снова помещают на магнитную мешалку. Скорость вращения регулируют так, чтобы не наступало вспенивания содержимого колбы. Трипсинизацию проводят 3-4 раза, до полного истощения ткани, которое определяют по белесоватому оттенку кусочков и их разбуханию. После окончания трипсинизации полученную взвесь клеток 10...15 мин подвергают центрифугированию при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок клеток ресуспензируют в питательной среде (1:10), подогретой до 37 °С, и сливают в колбу через 3-4 слойный марлевый фильтр. После перемешивания суспензии клеток берут две ее пробы по 0,5 мл. К каждой из них добавляют по 0,5 мл 0,1%-го кристаллвиолета в 0,1N растворе лимонной кислоты. После перемешивания каплю суспензии помещают в счетную камеру Горяева и подсчитывают клетки, имеющие хорошо заметное ядро и неповрежденную цитоплазму. Клетки подсчитывают не менее как в трех больших квадратах камеры. Из полученных данных находят среднее арифметическое. Количество клеток в 1 мл определяют по формуле а х 4000 х б Х = -------------------- в где а — среднее количество клеток в малом квадрате; б — степень разведения; в — количество подсчитанных малых квадратов. Точный подсчет клеток необходим, поскольку качественный монослой можно получить лишь при определенной оптимальной посевной дозе. В соответствии с результатами подсчета к суспензии добавляют необходимое количество питательной среды, чтобы в 1 мл содержалось 250...300 тыс. клеток. К питательной ростовой среде добавляют 10% бычьей сыворотки и антибиотики — пенициллин, стрептомицин, тетрациклин (по100ЕД/мл), устанавливают рН 7,2...7,4. Для культивирования клеток в каждую пробирку засевают 1-15 мл суспензии; во флаконы емкостью 100 мл — 20 мл, 250 мл— 40 мл, 1л — 100 мл клеточной взвеси. Флаконы и пробирки плотно закрывают стерильными резиновыми пробками. На пробирках восковым карандашом проводят продольную черту, укладывают их чертой вверх ящики с наклонным дном (угол 6°) и помещают в термостат при 37 °С. Клетки фиксируются на внутренней поверхности пробирки. Через 24...48 ч образуется сплошной слой клеток, располагающихся 1 один ряд (монослой). В ходе самостоятельной работы студентов необходимо 1. Отобрать хорошо развитые куриные эмбрионы в возрасте 7...10 дней. 2. Вскрыть эмбрионы и получить кожно-мышечный мешок. 3. Провести трипсинизапию кожно-мышечной ткани куриного эмбриона. 4. Провести центрифугирование и подсчет клеток в камере Горяева. 5. Подготовить взвесь клеток в ростовой питательной среде в концентрации 200 тыс./мл, используя результаты подсчета 1 камере Горяева и рекомендуемую выше формулу. 6. Провести разлив клеточной взвеси по пробиркам. Примерный план занятия (2 ч) 1. Контрольный опрос. 2. Объяснения преподавателя. 3. Демонстрация преподавателем каждого этапа трипсинизации. 4. Самостоятельная работа студентов: подготовить рабочее место для трипсинизации; подготовить куриные эмбрионы для трипсинизации; провести трипсинизацию, получить суспензия клеток необходимой концентрации и разлить ее по пробиркам. 5. Подведение итогов занятия. 6. Задание к следующему занятию. ^ При выполнении трипсинизации студентов делят на 2 подгруппы (в зависимости от наличия на кафедре материальных средств). Самая главная подготовка к этому занятию — обеспечение стерильной посудой, инструментами, средами, растворами которые должны быть заранее подготовлены. При отсутствия условий регулярного получения культур клеток можно приготовить фиксированные препараты. Для этого надо предварительно получить культуру клеток в пробирках, отмыть клетки раствором Хенкса и залить 70°-ным спиртом. Такие препараты могут сохраняться много месяцев при комнатной температуре. Главное, что обеспечивает успех получения первичных культур клеток, — это полная стерильность инструментов, посуды и материала, а также сохранение стерильности при манипуляции с ними. Вопросы домашнего задания
ЗАНЯТИЕ 11. Перевиваемые культуры клеток Цель занятия: ознакомиться с некоторыми перевиваемыми клетками {НеLа, С-18, амниона человека и др.), культурой диплоидных клеток, техникой заражения культуры клеток вируссодержащим материалом, изучить формы цитопатогенного действия (ЦПД). ^ пробирки с культурами первично-трипсинизированных и перевиваемых клеток в норме и 1 после заражения с признаками ЦПД вируса, подставки для пробирок, пастеровские и градуированные пипетки, микроскопы, раствор версена, бычья сыворотка, 7,5%-ный раствор соды, пенициллин, стрептомицин, тетрациклин, поддерживающие среды, вируссодержащий материал, таблицы по теме, диапозитивы. ^ Одним из методов получения перевиваемых клеток является отбор клеток первичной культуры с повышенной активностью роста. Отбор осуществляют при регулярной смене среды. Для поддержания отобранных клеток в жизнеспособном состоянии , питательную среду каждые 3...4 дня заменяют свежей. Обычно работа по получению перевиваемых клеток продолжается в течение многих месяцев. В результате подбора специальных питательных сред, режима культивирования удается адаптировать отдельные клетки к определенной питательной среде и перевивать их очень долго. Клетки, которые приобрели способность к длительному пассированию вне организма, получили название перевиваемых. Таким образом, перевиваемые клетки — это такие клетки, которые перевиваются из одного сосуда в другой при условии замены питательной среды с сохранением потенциальной возможности к дальнейшему размножению. К перевиваемым клеткам из нормальных тканей относят: штамм L (мышиные фибропласты, 1943), СОЦ (из сердца обезьяны циномольгус, 1957), С-18 (из эмбриональной почки поросенка, 1960), ФК (фибробласты крысы, 1954) и др. Перевиваемые клетки из опухолевой ткани включают: НеLа (клетки рака шейки матки женщины, 1952), Нер-2 (клетки карциномы гортани человека, 1955), Нер-3 (клетки лимфоиднов карциномы человека, 1955) и др. Разновидностью перевиваемых клеток являются диплоидные клетки. Это морфологически однородные культуры, стабилизированные в процессе культивирования in vitro, имеющие ограниченный срок жизни (не более 50 пассажей), сохраняющие правильный диплоидный набор хромосом, свойственный исходной ткани, свободные от посторонних вирусов и микробов и не обладающие онкогенной активностью. Необходимо отметить, что для некоторых зоопатогенных вирусов наиболее употребимы определенные виды перевиваемых клеток (табл.2), например, ВНК-21 для вируса ящура, РК-15— для вируса чумы свиней, диареи крупного рогатого скота, ПЭК - для вируса ринотрахеита, ТБ — для вируса герпеса и т.д. Поэтому ряд видов культур клеток надо уметь сохранять в условиях лаборатории. Основным способом длительного сохранения перевиваемых клеток является их глубокое замораживание (до минус 70 °С) в присутствии глицерина, сыворотки крови с последующим хранением ампул в жидком азоте (минус 196 °С). Все это способствует длительному (до 5...6 месяцев) сохранению клеток. Перевиваемые клетки имеют следующие преимущества перед первично-трипсинизированными: 1. Они обычно не загрязнены посторонней микрофлорой, как это часто наблюдается в первичных культурах. 2. Большинство их обладает более широким спектром чувствительности к вирусам, чем соответствующие первичные культуры. Это зависит от происходящих в них физиологических изменений. 3. Для изготовления перевиваемых клеток требуется меньше средств и труда по сравнению с приготовлением первичных культур. 4. Эти клетки чаще, чем первичные культуры, используются для выделения вирусов из материалов, содержащих бактерии, поскольку менее чувствительны к высоким концентрациям антибиотиков (результат адаптации при пассировании в питательной среде с антибиотиками). 5. Для перевиваемых клеток характерна вирусологическая стерильность (отсутствие спонтанного вирусоносительства). Вместе с тем, перевиваемые клетки имеют и ряд недостатков, которые в известной степени ограничивают их применение. Они склонны к малигнизации, т.е. злокачественному перерождению, независимо от происхождения, требуют постоянного пассирования с использованием свежей среды, подвержены неспецифической дегенерации (изменяется морфология и снижается чувствительность к вирусам). Таблица 3. Характеристика основных свойств перевиваемых линий клеток, полученных из органов различных животных
Перевивание клеток производят в следующем порядке: 1. ^ Растущие клетки довольно прочно прикрепляются к поверхности стекла под слоем питательной среды. Снять их можно механическим путем (соскабливанием). Однако, это грубый прием, ведущий к значительному повреждению клеток. Чаще применяют 0,02%-ный раствор версена. Диспергирующее действие версена объясняется связыванием им двухвалентных катионов, в частности магния и кальция, т.е. тех ионов, которые способствуют прикреплению клеток к стеклу и обеспечивают целостность клеточной культуры. Под действием версена клетки отделяются от стекла, округляются и образуют взвесь. Из сосудов с развившимся клеточным монослоем сливают питательную среду, добавляют 0,5...1 мл подогретого до 37° (раствора версена и выдерживают в термостате 20...30 мин при периодическом покачивании. 2. Отделение клеток. Взвесь клеток в версене помещают в центрифужные пробирки и центрифугируют при 800...1000 об/мин в течение 7...10 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок клеток ресуспендируют в небольшом количестве питательной среды. Подсчет клеток проводят в камере Горяева так же, как и при получении первичных культур. 3. ^ После подсчета исходную клеточную взвесь разводят ростовой питательной средой до необходимой концентрации. Приготовленную взвесь вносят при помешивании на магнитной мешалке или пипетированием в пробирки или матрасы и закрывают резиновыми пробками. Посевная доза клеток 1 пробирки 80... 100 тыс/мл, матрасы, флаконы — 25...30 тыс/мл . На пробирках восковым карандашом проводят продольную черту (чертой кладут вверх), засеянные клетки культивируют в термостате при 37 °С в течение 3...4 суток до образования сплошного монослоя. Полученный монослой сохраняет при 37 °С жизнеспособность в течение 5...10 суток в зависимости от вида клеток и состава питательной среды. В течение этого срока клетки можно отделить от стекла, подвергнуть транспортировке или использовать для длительного хранения. Транспортируют клеточные культуры чаще всего авиапочтой в герметически закрытых сосудах. При этом следует избегать резких колебаний температуры, особенно замерзания или перегревания. По мере старения клеток производят пассаж - переносят их в пробирки со свежей питательной средой. ^ Для заражения вируссодержащим материалом отбирают пробирки с наличием сплошного клеточного монослоя, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Питательную среду удаляют, и в каждую пробирку вносят по 0,1...0,2 мл вируссодержащего материала, подлежащей исследованию, и оставляют ее в наклонном положении. После 30...60 мин контакта материала с клетками в пробирки добавляют1…1,5 мл поддерживающей (без сыворотки) среды. Для каждой пробы вируссодержащего материала используют не менее четырех пробирок (4-6) с культурой клеток. Каждое исследование сопровождают контролями: а) контроль монослоя в норме (4-6 пробирок). В этом случае из пробирок удаляют ростовую питательную среду и заменяют ее поддерживающей; б) контроль монослоя, инфицированного эталонными штаммами вирусов (4-6 пробирок). При этом пробирки с культурой клеток заражают известными (эталонными) вирусами; в) контроль монослоя, контактировавшего с экстрактом аналогичной ткани, не зараженной вирусом. Для этого берут незараженную ткань, аналогичную той, где предполагается наличие вируса. Из нее готовят материал и заражают 4-6 пробирок с культурой клеток. Все пробирки помещают в ящик с наклонным дном (угол 6°) так, чтобы монослой оказался под питательной средой (чертой вверх) и инкубируют в термостате при 37 °С. Клетки ежедневно микроскопируют под малым увеличением микроскопа (объектив х8 или х10), сравнивая культуры, зараженные вирусом, с контрольными. ^ При взаимодействии вирусов с клетками в последних наблюдаются различные морфологические изменения, которые обусловливаются рядом факторов, особенно степенью чувствительности клеток культуры к вирусу и условиями среды. Контакт вирусов с восприимчивыми клетками сопровождается острой или латентной инфекцией и неопластической трансформацией последних. При инфекции отмечаются деструктивные изменения в зараженных клетках, часто приводящие к их гибели. Все морфологические изменения, возникающие под воздействием вируса, называют цитопатическим действием (эффектом), сокращенно ЦПД (ЦПЭ). При латентной инфекции репродукция вируса в зараженных клетках не приводит их к гибели, и внешне они не отличаются от нормальных (не зараженных). Первоначальный этап взаимодействия вирусов с клеткой — это изменение некоторых звеньев обмена веществ, которые можно выявить определенными гистохимическими реакциями. Одним из ранних проявлений такого взаимодействия является увеличение размеров ядра (дезинтегративное набухание). Эта реакция неспецифична, поскольку она не зависит от биохимического состава и размера вирусов, их биологических свойств. Данное явление характерно для вирусов, вызывающих как острую, тек и хроническую инфекцию. Второй этап — специфический. Одна из его особенностей — проявление характерного ЦПД вируса. При этом некоторые вирусы (аденовирусы и др.) поражают ядра клеток, другие — цитоплазму (вирус гриппа и др.), третьи же разрушают и ядро, и цитоплазму. При исследовании под микроскопом клеточного монослоя отмечают следующие морфологические изменения при остров инфекции: а) округление клеток. Они принимают шаровидную форму, отделяются от стекла и свободно плавают в культуральной жидкости; б) появление в цитоплазме пораженных клеток мелкой зернистости; в) увеличение в размерах этой зернистости и появление внутриклеточных включений; г) очаговые скопления округлившихся клеток в виде гроздьев винограда; д) образование гигантских многоядерных клеток — симпластов, синцитиев; е) появление в монослое клеток "стерильных пятен", т.е. участков без клеток; ж) полное "сползание" клеток со стекла. При латентной инфекции вирус в клетках размножается, но не вызывает их видимого разрушения. Клетки остаются жизнеспособными, однако интенсивность клеточного деления понижается, со временем изменяется их морфология. При неопластической трансформации у пораженных клеток образуются плотные фокусы трансформации различной величины и формы белого цвета. ^ 1. Просмотреть под микроскопом монослой первичнотрипсинизированных и перевиваемых клеток в норме (не зараженных вирусом). 2. Отработать методику заражения клеточного монослоя вируссодержащим материалом. 3. Изучить формы ЦПД вирусов в клеточном монослое под микроскопом, на таблицах и слайдах. Примерный план занятия (2 ч) 1. Контрольный опрос. 2. Объяснения преподавателя. 3. Демонстрация методики заражения культур клеток; основных форм ЦПД (на фото, слайдах, препаратах). 4. Самостоятельная работа студентов. 5. Подведение итогов занятия. 6. Задание к следующему занятию. Методические указания Для занятия необходимо иметь: а) заранее полученные культуры клеток (куриные фибробласты в норме и зараженные вирусом). Эти культуры будут использованы студентами как для изучения форм ЦПД и нормы клеток, так и для постановки реакции гемадсорбции; б) фиксированные окрашенные микро. препараты культур клеток в норме и с различными формами ЦПД. При отсутствии регулярного получения культур клеток можно приготовить фиксированные препараты. Для этого надо получить культуру клеток. В пробирках с хорошим монослоем слить среду, отмыть клетки раствором Хенкса и залить 70°-ным спиртом. Такие препараты могут сохраняться много месяцев при комнатной температуре и быть использованы студентами для изучения клеток в норме и с ЦПД. Вопросы домашнего задания 1. Клеточные и гуморальные механизмы противовирусного иммунитета. 2. Виды лабораторных животных и методы их заражения. 3. Правила вскрытия животных. 4. Взятие крови, получение сыворотки и плазмы, эритроцитов, лейкоцитов. ЗАНЯТИЕ 12. Заражение, культивирование вирусов в организме лабораторных животных и выделение. Цель занятия: освоить различные методы заражения и методику вскрытия трупов лабораторных животных, отработать технику взятия материала для вирусологического исследования, научиться получать различные компоненты крови. ^ лабораторные животные (кролики, белые мыши, морские свинки), шприцы и инструменты для заражения животных и взятия крови, вируссодержащий материал, трупы лабораторных животных, пенициллин, стрептомицин, стерильные инструменты для вскрытия, раствор Хенкса, пробки резиновые, пенициллиновые флаконы, стерильные марлевые салфетки, колбы с бусами, пробирки, колбочки на 50 мл, воронка, пробирки центрифужные, физиологический раствор, штативы, центрифуга, таблицы по теме. Издавна лабораторных животных применяют для индикации вирусов в патматериале, т.е. для постановки биопробы. С этой целью суспензией патматериала заражают лабораторных животных и учитывают реакцию на заражение. В вирусологической практике для диагностики бешенства ставят биопробу на мышатах, инфекционного бронхита кур — на цыплятах, ящура — на морских свинках, болезни Ауески — на кроликах и т.д. (табл.4). Таблица 4. Восприимчивость лабораторных животных к вирусам
Обычно признаки присутствия вируса в организме животного малоспецифичны и не позволяют сделать вывод о том, какой это вирус. Однако, бывают случаи, когда биопроба сопровождается характерной клинической картиной, специфичной для определенного заболевания. Тогда положительная биопроба позволяет сделать вывод не только о присутствии вируса в патматериале, но и его видовой принадлежности. Например, при зуде у кролика на месте введения патматериала, расчесов и разгрызаний — заражение вирусом болезни Ауески. В настоящее время лабораторных животных используют для: 1) обнаружения вируса в патматериале; 2) первичного выделения вируса из патматериала; 3) накопления вирусной массы; 4) поддержания вируса в активном состоянии; 5) титрования вируса; 6) в качестве тест-объекта в реакции нейтрализации; 7) получения гипериммунных сывороток. При выполнении биопробы необходимы лабораторные животные различных видов — белые мыши, крысы, хомяки, морские свинки, хорьки, собаки, обезьяны, кролики, куры. Лабораторные животные должны быть получены из хозяйства, благополучного по инфекционным и инвазионным заболеваниям; они должны быть клинически здоровыми и иметь достаточный вес; во внимание обязательно принимают возраст животных (в некоторых случаях к вирусу наиболее чувствительны новорожденные, в других — можно использовать взрослых). Животных перед заражением выдерживают в карантине 2...3 недели. За ними проводят клинические наблюдения и лабораторные исследования для исключения инфекционных и инвазионных болезней. Помещение, где содержатся животные, должно иметь отдельный изолированный вход, достаточно света, хорошую вентиляцию. Животных, зараженных вирусами, необходимо содержать в отдельном помещении. ^ Метка является непременным условием использования животных в эксперименте. На клетке укрепляют бирку с надписью (номер экспертизы, количество зараженных животных, дату заражения и другие сведения). Существуют и способы индивидуальной метки. Для крупных животных и кур используют металлические бирки со штампованным номером. Их надевают на корень уха (кроликам), вставляют в ушную раковину по типу серьги (морским свинкам), надевают на ногу (курам). Для метки белых мышей и крыс чаще всего применяют нанесение цветных пятен на непигментированную шерсть. Насыщенный раствор пикриновой кислоты лучше других красителей удерживается на шерсти и коже животных. Цветные метки ставят в местах, соответствующих определенному порядковому номеру животного. Так, если его тело разделить условно на три продольные части (левый бок, спина, правый бок), то нанесение цветных меток начинают с левого верхнего угла, т.е. лопатки; это будет соответствовать 1. Двигаясь назад, левый бок соответствует 2, левое бедро — 3, далее затылок — 4, спина — 5, область репицы — 6, правое плечо — 7, правый бок — 8, правое бедро — 9. Используя два цвета красителей, можно дать одним из них обозначения единиц, другим — десятков. Исследуемым материалом рекомендуется заражать сразу нескольких животных разными способами, но с учетом тропизма вируса. Поскольку при первичном заражении животное может не заболеть, через 5...7 дней здоровых на вид животных убивают, а их органы используют для заражения следующей группы животных. Обычно делают обычно три "слепых" пассажа. Вируссодержащий материал может быть введен лабораторным животным различными методами. Выбор метода заражения определяется тропизмом вируса. Зная тропизм, материал вводят в органы, содержащие чувствительные к этому вирусу клетки. Например, вирус гриппа вводят интраназально, вирус бешенства — интрацеребрально. Применяют следующие методы заражения. ^ вируссодержащий материал вводят под кожу в область спины. Доза его для крыс— 0,5 мл, морских свинок— 3 мл, белых мышей — 0,2 мл. Если нужно ввести большее количество материала, то жидкость инъецируют в разные места под задний конец спины или в различных направлениях. ^ исследуемый материал вводят в мышцу бедра (у кур — в грудную мышцу). Доза для мышей 0,25 мл, крыс— 0,5...1 мл, морских свинок — 2 мл, кроликов — 5 мл, кур — 3 мл. ^ тонкую острую иглу вводят под острым углом в складку кожи, предварительно освобожденную от волос. В результате инъекции должен образоваться пузырек. Доза вируссодержащего материала для всех животных 0,1...0,2 мл. ^ на предварительно подготовленной (освобожденной от шерсти) продезинфицированной коже скарификатором делают царапины, затем каплями наносят вируссодержащий материал и втирают стеклянным шпателем, этот метод широко используют при работе с вирусами оспенной группы Внутрибрюшинное заражение: животное фиксируют в вертикальном положении головой вниз. Для инъекции используют затупленные иглы. Кожу, мышечную стенку и брюшину забирают в складку и прокалывают их иглой под прямым углом до ощущения пустоты — показатель проникновения иглы в брюшную полость. Дозы вируссодержащего материала: мышам— 1 мл, крысам— 2 мл, морским свинкам— до 5 мл, кроликам— до 10 мл, овцам и козам — 50...100 мл. ^ исследуемый материал мышам и крысам вводят в хвостовую вену, кроликам — в ушную, курам — в вену крыла, более крупным животным — в яремную вену, морским свинкам— 1...2 мл непосредственно в сердце. У мышей и крыс хвост надо предварительно погрузить на 5...10 мин в теплую воду (48...50 °С). Иглу вводят под острым углом в боковую вену эадней трети хвоста. Дозы материала: для мышей — 1 мл, крыс — 2 мл, кроликов — до 5 мл, для кур — до 10 мл. ^ стерильной пипеткой в носовое отверстие вносят каплю исследуемого материала, которую животные при вдохе аспирируют в легкие. Материал не должен содержать высокодисперсных частиц. Наркоз должен быть глубоким, противном случае у животного возникает чихательный рефлекс материалом инфицируется окружающая среда. Дозы: для мышей— 0,03...0,05 мл, крыс— 0,05...0,1 мл, морских свинок и кроликов —до 2 мл. Внутримозговое заражение: мышей и крыс заражают под наркозом, так и без него. Введение вируссодержащего материала осуществляют на расстоянии 1...2 мм от точки пересечения средней линии черепа с линией, соединяющей углы глаз. Место укола дезинфицируют раствором йода или спиртом. Используют туберкулиновый шприц с тонкой иглой, на которую надета резиновая муфта так, чтобы срез иглы был целиком открыт. Мышь фиксируют левой рукой, оттягивая кожу к затылку. Материй вводят постепенно в дозе: для мышей — 0,025...0,03 мл, для крыс — 0,05...0,1 мл. Кроликов и морских свиной, заражают путем прокола кости в области подглазничной борозды. Кожу при этом смещают от середины к борозде, чтобы она после инъекции, приняв естественное положение, закрыла отверстие в черепе. Иглу при инъекции держат наклонно по отношению к средней линии, исключая тем самым попадание ее в глазницу. Доза материала 0,3...0,5 мл. После заражения животные должны быть помещены в клетки, на которые навешивают этикетки с указанием вируса или номера экспертизы, количества зараженных животных, даты заражения. В рабочем журнале записывают номер экспертизы исследуемого материала, количество и характеристику зараженных животных, их маркировку, метод введения и дозу вируса. За животными устанавливают наблюдение, обращая внимание на их внешний вид, подвижность, прием пищи и т.п. Следует отметить, что гибель животных в первые дни после заражения может быть связана с травмой или токсическим действием исследуемого материала. В последующие дни после заражения, ведут ежедневные наблюдения за животными, контролируя их клиническое состояние. Так, при размножении вируса в клетках респираторного тракта наблюдаются кашель, хрипы, одышка, при размножении вируса в клетках мозга — судороги, парезы, параличи и т.д. Однако, клинические признаки большей частью носят неспецифический характер и на этом этапе исследований нет возможности прийти к заключению, какой именно вид вируса вызвал заболевание. Для этого необходимо провести идентификацию обнаруженного вируса с помощью серологических реакций. ^ Трупы животных, павших от экспериментальной инфекции, немедленно вскрывают и проводят патологоанатомическое исследование. Если зараженное животное не погибло, его убивают в момент максимального и. проявления симптомов болезни или, при их отсутствии, на 3..8...10 день после заражения. Убить животное рекомендуется избыточной дозой наркоза, а также путем разрыва спинного мозга. Для вскрытия необходимо применять только стерильные инструменты: скальпели, прямые и изогнутые ножницы, ножницы для костей, пинцеты, пастеровские пипетки. Инструменты подбираются так и в таком количестве, чтобы в процессе вскрытия можно было часто менять. Основной принцип при вскрытии — к трупу животного можно прикасаться только инструментами или защищенными руками. Мелких лабораторных животных (мыши, крысы, морские свинки, цыплята) при этом прикалывают иголками в распростертом виде к доске или кювете с парафином, покрытыми клеенкой. Можно, использовать специальные столики (рис.49), снабженные соответствующими фиксирующими приспособлениями. Они должны быть прикрыты клеенкой и установлены в больших кюветах. Перед вскрытием труп животного дезинфицируют: мелких животных погружают в 2,5%-ный раствор фенола на 10...15 мин, крупных - опрыскивают дезраствором. Вскрытие проводят со строгими соблюдением асептики и личной профилактики. Разрез кожи делают по белой линии живота. Кожу препарируют и оттягивают в стороны. Коленные складки и подмышечные ямки обнажают для исследования лимфатических узлов. После этого труп животного дезинфицируют повторно, меняют инструменты и вскрывают брюшину и грудную полости. Разрез делают так, чтобы не повредить желудок и кишечник. Затем удаляют мышцы живота и брюшину, обнажая при этом сердце, почки, печень, селезенку и снова меняют инструменты. В зависимости от заболевания у трупа асептически берут патматериал. Чаще всего это кусочки паренхиматозных органов, кровь, ткани головного и спинного мозга, различные транссудат и экссудаты, моча и др. Материал помещают в стерильную посуду и замораживают. В обязательном порядке проводится посев на сахарные МПА и МПБ в целях исключения бактериальной флоры. После вскрытия и взятия материала труп, остатки корма, подстилку подвергают автоклавированию или сжигают. ^ Взятие крови у мышей проводят после их наркоза. Для этого используют пол-литровую стеклянную банку с крышкой, в которую кладут клочок ваты, вливают небольшое количество эфира для наркоза, помещают туда мышь и закрывают крышкой. Наркоз продолжают до тех пор, пока мышь потеряет способность удерживаться на ногах. Затем препаровальными иглами ее прикалывают к доске брюшком вверх, дезинфицируют поверхность живота раствором карболовой кислоты и делают продольный разрез. Отпрепаровывают кожу, создавая емкость, возле передней лопатки. Стерильными глазными ножницами перерезают сосуды под лопаткой. Кровь вытекает в емкость, образованную складкой кожи, ее отсасывают стерильной пипеткой и переносят в небольшую пробирку. Таким образом можно получить 0,5...1 мл крови. ^ На край уха свинки скальпелем наносят насечки или прокалывают ступни. Для предупреждения быстрого свертывания крови ушную раковину покрывают тонким слоем парафина. Так удается получить небольшое количество крови. Кровь у морских свинок берут также и пункцией сердца. Животное при этом фиксируют животом вверх. Место введения иглы— область второго межреберья, 1...1,5 см от конца мечевидного отростка. На этом месте удаляют шерсть и дезинфицируют кожу; отступая от левого края грудины на 2 мм, вертикальным уколом прокалывают грудную клетку. Если игла попала в полость желудочка сердца, то кровь поступает в шприц (10 мл). Из сердца у крупных свинок можно получить 10...12 мл крови. После взятия крови морской свинке необходимо ввести такой же объем физиологического раствора. ^ можно проводить из надреза наружной вены уха. Для этого выщипывают шерсть в районе прохождения сосуда и поверхность уха смазывают ксилолом. Лезвием бритвы или скальпелем делают надрез вены. Таким путем можно получить до 30...35 мл крови. После взятия крови животному вводят подкожно физиологический раствор, по объему в 2 раза превышающий объем взятой крови. ^ Кровь после взятия около часа выдерживают в теплом месте (30...35°С), затем сгусток ее обводят металлической палочкой (отделение сгустка от стенок сосуда) и ставят на ночь в холодильник. Сыворотку отсасывают пипеткой с помощью груши, переносят в стерильный сосуд, фильтруют через асбестовые фильтры "СФ" и консервируют (метриолят натрия, тимол, азид натрия и др.). ^ Вначале готовят дефибринированную кровь. Для этого в стерилизованную сухим паром толстостенную банку со стеклянными бусами берут кровь и постоянно встряхивают, не давая ей свернуться. По окончании кровопускания банку с бусами продолжают встряхивать еще 10 мин. Полученную таким образом дефибринированную кровь фильтруют через 2 слоя марли в центрифужные пробирки, центрифугируют 10...15 мин при 1500..-2000 об/мин, плазму крови отсасывают пипеткой, к осадку эритроцитов доливают физиологический раствор, хорошо все перемешивают и снова центрифугируют. Эритроциты от сыворотки отмывают не менее трех раз до получения прозрачной надосадочной жидкости и до использования сохраняют в холодильнике (3—5 дней). Дополнительно в качестве стабилизирующих растворов от предотвращения свертывания крови можно использовать трилон Б, лимоннокислый натрий, гепарин и др. ^ Кровь берут в стеклянную пробирку, в которую предварительно наливают 5%-ный раствор трилона Б из расчета 8 капель на 10 мл крови. Кровь хорошенько перемешивают. Затем отбирают 3 мл крови с антикоагулянтом и добавляют к ней цитратный гемостабилизатор (тринатрий цитрат — 13,2 г, лимонная кислота — 4,8 г, глюкоза— 5,0 г, дистиллированная вода до 1 л) в количестве 1/7 объема, т.е. 0,4 мл. Этим добиваются подкисления крови до рН 6,5 для предотвращения агрегации лейкоцитов с тромбоцитами и гранулоцитами. Для удаления эритроцитов кровь обрабатывают гипотоническими растворами. Хорошие результаты дает 0,83-0,84%-ный раствор хлористого аммония, способный лизировать эритроциты, не разрушая лейкоциты. Раствор готовят на трис-НС1-буфере рН 7,6 или дистиллированной воде, фильтруют и добавляют к крови в соотношении 9:1. Лизис эритроцитов наступает в течение 2...3 мин. Более эффективны свежеприготовленные растворы, подогретые до 37 °С. После лизиса эритроцитов суспензию центрифугируют при 500 об/мин в течение 5 мин так, чтобы осели лейкоциты, а тени эритроцитов и комплексы гемоглобина остались в надосадочной жидкости, которую сливают. Лейкоциты отмывают 2 раза раствором Хенкса и используют в дальнейшей работе. ^ 1. Отработать методику заражения под кожу (белая мышь, морская свинка), внутривенно (кролик), внутрибрюшинно (белая мышь). 2. Освоить методику вскрытия трупов зараженных лабораторных животных (белая мышь, морская свинка). 3. Освоить методы получения крови и ее компонентов. Примерный план занятия (2 ч) 1. Контрольный опрос. 2. Объяснения преподавателя. 3. Демонстрация приемов фиксации животных; методов экспериментального заражения кроликов и белых мышей; методов умерщвления лабораторных животных: техники вскрытия трупов лабораторных животных; техники получения крови от лабораторных животных. 4. Самостоятельная работа студентов. 5. Подведение итогов занятия. 6. Задание к следующему занятию. Методические указания Из лабораторных животных удобнее использовать кроликов белых мышей, которые по сравнению с морскими свинками более выносливы, но, в противоположность белым крысам, не агрессивны. Животных используют только для отработки методов их экспериментального заражения, применяя стерильный физраствор. При вскрытии белых мышей их помещают в кювету на слой воска, поверх которого кладут лист бумаги. Прикрепляют труп мыши препаровальными иглами. После вскрытия труп заворачивают в эту же бумагу и переносят в автоклавную. Вопросы домашнего задания 1. Противоопухолевый иммунитет. 2. Понятие о титре, цель и методы титрования вирусов. ЗАНЯТИЕ 13. Принципы титрования вирусов и антисывороток Цель занятия: отработать различные методики титрования вирусов. ^ тексты задач по титрованию вирусов для каждого студента. Краткие теоретические сведения При работе с вирусами постоянно возникает необходимость определения его количества в том или ином материале. Без этого невозможны экспериментальное заражение вирусами живых лабораторных систем, производство вакцин и диагностических препаратов, оценка активности противовирусных вакцин, получение иммунных сывороток и др. Титр вируса — это количество вирусных частиц в единице объема материала. Однако, количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых единицах (объем, масса), поэтом прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности (инфекционные единицы). В практике нашли применение два типа единиц количества вируса: 1) инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемые вирусами и оцениваемые по единичному эффекту; 2) инфекционные единиц 50%-го действия вирусов на чувствительные живые объекты. ^ локальных повреждений. Из локальных повреждений, вызываемы вирусами, известны бляшки в зараженных культурах клеток (островки мертвых клеток в слое живых) и оспины — некротические узелки на ХАО куриных эмбрионов. В этих случаях говорят о бляшкообразующих единицах (БОЕ) и оспинообразующих единицах (ООЕ). Одна БОЕ равна дозе вируса, способной образовать одну бляшку, а одна ООЕ — одну оспину. Методика определения сводится к следующему. Точными объемами исследуемого вируссодержащего материала заражают несколько культур клеток в матрасах или куриных эмбрионов в ХАО. Затем подсчитывают количество бляшек в каждом матрасе и количество оспин в каждом курином эмбрионе. Рассчитывают среднее арифметическое. Оно точно равно количеству БОЕ или ООЕ вируса. Поскольку объем заражающей дозы точно известен, нетрудно рассчитать, сколько БОЕ или ООЕ приходится на единицу объема вируссодержащего материала. Это и будет титром вируса в материале. Например, вируссодержащим материалом в разведении 10-3 заразили 5 эмбрионов и получили 10, 13, 6, 9 и 10 оспин. Среднее арифметическое суммы составит 9,6. Титр вируса в ООЕ определяют по формуле: а 9,6 Т= --------- = ------------- = 48 000 ООЕ / 0,2 мл V n 0,2 х 10-3 где а— среднее количество подсчитанных оспин; V— объем вируссодержащего материала, использованного для заражения; п — степень разведения вируссодержащего материала. Следовательно, исходя из наших расчетов, в 0,2 мл вируссодержащего материала в разведении 10-3 содержится 48000 ООЕ. Этот пример титрования вирусов является упрощенным, так как он не учитывает случаев высокой концентрации вируса в материале, при которой бляшки или оспины могут сливаться между собой, и их невозможно будет сосчитать. Обычно счету поддаются бляшки и оспины, количество которых не превышает 50 на матрас или ХАО. Поскольку титр вируса в исследуемом материале обычно не известен (он подлежит определению),то неизвестно, в каком разведении надо брать материал для заражения, чтобы избежать слияния бляшек или оспин. В этом случае готовят десятикратные разведения вируссодержащего материала (10-1, 10-2, 10-3 и т.д.) и каждым разведением заражают равные группы культур клеток или куриных эмбрионов Подсчитывают количество бляшек или оспин, рассчитывают среднее арифметическое. Титр вируса находят, по формуле: a1 + a2 + … +an T = ------------------------------------ V ( n1 + n2 + … + nn ) Метод титрования вирусов в БОЕ дает наиболее достоверные данные об их концентрации, но могут возникнуть технические трудности, связанные с получением и подсчетом бляшек. Что касается оспин, то их использование для титрования ограничивается довольно немногочисленными вирусами, способными образовывать узелки на ХАО куриных эмбрионов. ^ Наиболее универсальным является метод определения титра вируса в единицах 50%-го инфекционного действия. По этому методу за единицу количества вируса принимают такую его дозу, которая способна вызывать инфекционный эффект у 50% зараженных объектов. Она обозначается как ЭД50— эффективная 50%-ная доза. Число таких доз вирусов в единице объема материала и есть его титр в данном материале. Но, в зависимости от вида объекта и характера его поражения, название эффективной дозы может изменяться. Если виру вызывает гибель зараженных лабораторных животных, титр обозначают символом ЛД50 (летальная доза 50% использованных для заражения животных). Если же вирус вызывает только определенные признаки болезни, титр обозначают ИД50 (инфекционная доза для 50% зараженных животных). При титровании в куриных эмбрионах и гибели их титр обозначают как ЭЛД50 (эмбриональная летальная доза); при учете лишь патологоанатомических изменений в курином эмбрионе — ЭИД50 (эмбрион-инфицирующая доза); в случае проявления ЦПД в культуре клеток — ТЦД50 (тканевая цитопатическая доза). Титр вируса выражают в количестве инфекционных доз приходящихся на единицу объема. Например, 103.48 ТЦД50/0.2мл; 104.5 ЕИД50/0.2мл; 107.45 ЛД50/0.2 мл. Титрование вирусов по 50%-му инфекционному действию - наиболее универсальный прием, пригодный практически для любого вируса, если подобрать к нему живую систему (тест-объект). Однако, этот метод довольно трудоемкий, длительный и требую статистических расчетов. В настоящем практикуме мы приводим два метода титрования вирусов по 50%-му эффекту. 1. ^ основан на принципе кумуляции (накопления). Предполагается, что если чувствительные объекты погибают после заражения небольшими дозами вируса, они обязательно погибнут и при введении им более концентрированных и наоборот, объекты, остающиеся в живых после введения вируссодержащего материала в небольшом разведении, не погибнут, если их заразить этим же материалом в максимальном разведении. Принцип кумуляции позволяет искусственно увеличивать число исследуемых объектов и тем самым повысить точность эксперимента. При определении титра вируса по Риду и Менчу поступают следующим образом. Из исследуемой суспензии готовят ряд последовательных десятикратных разведений вируссодержащего материала (10-1, 10-2, 10-3, ..., 10-10). Делают это по двум причинам: а) удобство в расчетах; б) инфекционное действие вируса убывает прямо пропорционально его разведению. Вируссодержащим материалом в каждом разведении заражают группу чувствительных объектов (в каждой группе не менее 4-6) с целью удобства статистической обработки. За зараженными объектами устанавливают регулярное (не реже одного раза в сутки) наблюдение и фиксируют результат. Изменения в первые 48 ч после заражения трудно признать результатом действия вируса, особенно в высоком разведении, их считают неспецифическими и в расчет не принимают. В табл.5 представлена схема титрования вируса. Вируссодержащий материал использован в 8 разведениях, каждым разведением заражено 4 животных (доза 0,2 мл). При заражений вируссодержащим материалом в разведении 10-7 не наблюдалось гибели животных, следовательно, летальность здесь равна 0, и выживших мышей будет 4. Но к ним надо прибавить животных, оставшихся живыми после введения вируссодержащего материала в разведениях 10-6, 10-5 и т.д. Таким образом, кумулятивное число выживших животных при заражении вируссодержащим материалом в разведении 10-7 окажется равным 12. Активностью вируссодержащего материала в разведении 10-8 пренебрегаем, так как эффект в данном случае аналогичен таковому при исследовании вируссодержащего материала в разведении 10-7. Рассуждая подобным образом, находим значение кумулятивной летальности. Оно составляет при разведении вируссодержащего материала 10-2 12 животных. Показания, полученные при использовании вируссодержащего материала в разведении 10-1, по той же причине можно во внимание не принимать. Вируссодержащий материал в разведении, давшем эффект выше 50%, обозначают буквой ^ процент летальности соответственно — b и a. Расчет производят по формуле: где В - доза вируса, дающая эффект более 50%; А — доза вируса, дающая эффект менее 50%; b, а — эффект дозы соответственно В и А, % ; d — интервал между двумя соседними дозами. |
отлично
1
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям