Гибридизационно-флуоресцентная пцр-тест система с гарантией достоверности результата обнаружения ДНК вируса гепатита в в крови доноров и пациентов лпу. Н. А. Федоров, А. А. Ёлов, Е. Г. Черкасов, Е. Б. Жибурт

Скачать 113.65 Kb. Название Гибридизационно-флуоресцентная пцр-тест система с гарантией достоверности результата обнаружения ДНК вируса гепатита в в крови доноров и пациентов лпу. Н. А. Федоров, А. А. Ёлов, Е. Г. Черкасов, Е. Б. Жибурт Дата конвертации 20.03.2013 Размер 113.65 Kb. Тип Документы

Содержание Флуоресцентно-гибридизационная тест-система для обнаружения ДНК вируса гепатита В в крови Обеспечивается полная документированность результатов при меньших затратах

Гибридизационно-флуоресцентная ПЦР-тест система с гарантией достоверности результата обнаружения ДНК вируса гепатита В в крови доноров и пациентов ЛПУ. Н.А. Федоров, А.А. Ёлов, Е.Г. Черкасов, Е.Б. Жибурт Центр крови Минздрава России По данным ВОЗ в мире инфицировано вирусом гепатита В более 2 миллиардов людей (1, 2), и потому остаточный риск передачи этого вируса через компоненты донорской крови несколько выше по сравнению с вирусом гепатита С и ВИЧ. Прямое и быстрое определение вирусной ДНК с гарантией лимита детекции необходимо также и для точной диагностики вирусного гепатита В, и для выявления носительства этого вируса. К настоящему времени получены убедительные данные о необходимости генамплификационного тестирования ДНК HBV в дополнение к тестированию на HBsAg крови доноров и пациентов, поскольку не все генотипы этого вируса выявляются в ИФА. Так, по данным японского Красного Креста (3), с 1.02.2000 по 15.10.2001 в результате NAT-тестирования 11 миллионов серонегативных на HBsAg донаций было выявлено 181 донация положительная на ДНК HBV. Последующее ретестирование этих 181 донаций на HBsAg системами ИФА и CLIA (хемолюминесцентным иммунологическим методом) дало соответственно 96 (53%) и 76 (42%) отрицательных результатов. Второй пример касается необходимости тестирования на ДНК HBV пулов плазмы для фракционирования (4). В результате тестирования 200 пулов плазмы NAT-системой «in house» с лимитом детекции 116 МЕ/мл и COBAS Ampliscreen NAT-системами с лимитом детекции 37 МЕ/мл была выявлена ДНК HBV в тех же самых 2 пулах (1%). NAT-ретестированию должна подвергаться не только вся кровь, негативная на HBsAg, но и все доноры и больные с положительными результатами на HBsAg-тестирование, поскольку до 70% таких людей не содержат ДНК HBV. В результате этого такие люди будут избавлены от страха вирусного гепатита В и необходимости его лечения, а Мир получит основание снизить предполагаемое количество HBV-инфицированных (более 2 миллиардов) в 2-3 раза, которое по данным ВОЗ превышает. В условиях российской действительности до настоящего времени дополнительные NAT-тестирования крови на ДНК HBV пока возможны только посредством электрофоретической детекции продукта амплификации и без контроля чувствительности на основе стандартного положительного образца плазмы. Для широкомасштабного скрининга доноров крови и пациентов на ДНК HBV такая технология не может быть применена. Только после того как совсем недавно в России стали производиться флуоресцентно-гибридизационные ПЦР-тест системы на ДНК HBV и другие патогены, появилась возможность начать такие тестирования на ДНК HBV как во всей службе крови, так и в ЛПУ. Необходимое условие - комплектация таких наборов калиброванным и вирусобезопасным HBV-стандартом для гарантии достоверности получаемого результата. Внедрение флуоресцентно-гибридизационной ПЦР-тест системы на HBV и другие патогены стало возможным благодаря широкодоступному флуоресцентному детектору продуктов ПЦР «Джин» фирмы «ДНК-технология», что не только дешевле, так как исключается большое дорогостоящее оборудование для электрофореза и видео-компьютерной детекции, но и позволяет исключить основной источник ложно-положительных ПЦР-результатов за счет рассеивания ампликонов при вскрытии пробирок. В развитых странах донорская кровь подвергается дополнительному NAT-генотестированию на вирусные патогены с обязательным установлением лимита детекции по международному стандарту или его национальному аналогу. Центр крови Минздрава России начал работу по калибровке материала, содержащего ДНК HBV, по международным NAT-стандартам ВОЗ. Цель работы – дать возможность учреждениям службы крови России получили возможность оценивать лимит детекции NAT-скрининга донорской крови как при использовании ПЦР-наборов с электрофоретической детекцией, так и с флуоресцентно-гибридизационной детекцией продукта ПЦР. В противном случае результаты NAT-скрининга будут сомнительными, независимо от любых характеристик ПЦР-набора и рекомендаций его производителей. Сравнение результатов ПЦР-тестирования ДНК HBV при помощи гибридизационно-флуоресцентной тест системы на HBV в десятикратных разведениях международного стандарта на ДНК HBV с концентрацией 6,25106 геном-эквивалентов/мл (табл.1) и в десятикратных разведениях вируссодержащей криоплазмы (табл.2) позволило установить исходный титр последней как 3108 геном-эквивалентов/мл. Эта вируссодержащая плазма была стабилизирована бактерицидным агентом азидом натрия и в течение года хранилась при –20 оС, +4 оС и при +20 оС. Титр ДНК HBV при этих температурах хранения практически не изменился, что хорошо согласуется с данными других авторов о высокой стабильности ДНК HBV при указанных температурах (5, 6). Для исключения инфекционной опасности такого стандартного материала в 3 микропробирки, содержащие по 100 мкл её разведений в 100, 1000 и 10000 раз плазмой здорового донора, добавляется 400 мкл лизирующего раствора. В том же соотношении, что и при выделении ДНК и РНК из плазмы или крови в соответствии с методикой однопробирочной экстракции нуклеиновых кислот (7) и инструкцией, содержащейся в прилагаемом проспекте нашей ПЦР-тест системы. Заключение: Гибридизационно-флуоресцентная ПЦР-тест система на ДНК вируса гепатита В, созданная в Центре крови Минздрава России, в сочетании с калиброванным и стабилизированным бактерицидными агентами контрольным материалом, содержащим ДНК HBV, позволяет с гарантией достоверности обнаруживать HBV в серонегативных донациях и в крови пациентов, а также разделять HBsAg-положительных людей на содержащих HBV в крови и не содержащих HBV в крови. Все этапы исследования производятся в обычных ПЦР-лабораториях, оснащенных приборами и реагентами отечественного производства. Литература. HBV Fact Sheet WHO/2004, Rev. October 2000 Maddrey W.C. Hepatitis B – an important public health issue//Clin. Lab.- 2001- Vol. 47.-P. 51-55 Minegishi K., Yoshikawa A., Kishimoto S. et al. Superiority of minipool nucleic acid amplification technology for hepatitis B virus over chemiluminescence immunoassay for hepatitis B surface antigen screening// Vox Sang.- 2003.- Vol. 84.- N4.- P.287-291 Pisani G., K. Cristiano, G.M. Bisso et al. HBV DNA in plasma pools for fractionation// Transfusion.- 2003.- Vol. 43.- N12.- P. 1763-1764 Saldana J., Gerlich W., Lelie N. et al. An international collaborative study to establish a WHO international standard for hepatitis B virus DNA nucleic acid amplification techniques// Vox Sang.- 2000.- Vol. 80.- P.63-71 Lee D.H., Li L., Andrus L., Prince A.P. Stabilized viral nucleic acids in plasma as alternative shipping method for NAT// Transfusion.- 2002.- Vol. 42, N4.- P. 409-413 Федоров Н.А., Ёлов А.А., Суханов Ю.С., Жибурт Е.Б. Генамплификационное (NAT) тестирование крови и других материалов на патогены и мутации.- М.: Полиграфсервис, 2003.- 210 с. Разведения HBV Referenzplasma "Giessen 1/1" 6.25x106 GE/ml Пробирка Образец Результат Специфика ВК       19,9* 13,7* Специфика ВК 1 1:10 + 7,0 3,1 2 1:100 + 6,3 1,7 3 1:1000 - 2,7 1,5 4 разбавитель - 2,0 3,6 6/фон фон фон 1,0 1,2 7/фон фон фон 1,0 1,0 *Нормировочныезначения Разведения HBV-содержащей плазмы донора № 327731 Пробирка Образец Результат Специфика ВК       84,0* 54,5* Специфика ВК 1 1:10 + 15,9 2,1 2 1:100 + 15,5 2,0 3 1:1000 + 10,8 2,4 4 1:10000 + 5,4 2,3 5 1:100000 + 4,7 3,2   разбавитель - 1,9 3,6 6/фон фон фон 1,0 1,2 7/фон фон фон 1,0 1,0 * Нормировочные значения ПРОСПЕКТ ^ Флуоресцентно-гибридизационная тест-система для обнаружения ДНК вируса гепатита В в крови Содержит аналог международного стандарта. В Центре крови Минздрава России создана тест-система, позволяющая определять ДНК вируса гепатита В методом ПЦР с обнаружением продукта по флуоресценции гибридизованного с ним зонда с использованием простого специализированного флуориметра «Джин» фирмы «ДНК-технология». Для регулярного контроля лимита детекции к тест-системе прилагается стабилизированный стандарт ДНК HBV – калиброванный по международному стандарту ВОЗ. Как и при ПЦР в реальном времени (генодиагностика нового поколения, пока еще требующая очень дорогой аппаратуры), флуоресцентный сигнал обусловлен расщеплением в ходе ПЦР зонда типа TaqMan. Применение зондов с пониженной фоновой флуоресценцией («молекулярных бакенов») позволяет получать достоверные результаты путем простой флуориметрии после ПЦР. Благодаря этому созданная тест-система обладает следующими преимуществами: Процесс обнаружения продукта ПЦР проходит без вскрытия пробирки, что исключает рассеивание этих продуктов – основной источник ложноположительных результатов ПЦР. Анализ может проводиться в обычной клинической лаборатории – специальные требования к организации ПЦР-лаборатории оказываются необязательными. По сравнению с обычной электрофоретической детекцией продуктов ПЦР намного снижены трудоемкость и длительность анализа. Флуориметрия после ПЦР в течение 2-3 минут заменяет не менее чем получасовой электрофорез и всю работу по приготовлению гелей. ^ Обеспечивается полная документированность результатов при меньших затратах, чем при электрофорезе с видеокомпьютерной регистрацией, проведение которого требует комплекта оборудования в 2-3 раза более дорогостоящего, а также дополнительного расхода агарозы и других материалов. Возможность регистрации флуоресценции разного цвета позволяет, как и во всех современных генодиагностических тест-системах, применять ДНК внутреннего контроля для достоверности отрицательных результатов анализа. Флуоресценция зонда на патоген и зонда на ДНК внутреннего контроля регистрируются в одной пробе одновременно (см. пример). Пример. Результат анализа разведений контрольного ДНК HBV-содержащего материала с концентрацией 2,8108 ГЭ/мл, прилагаемого к данной тест-системе. Образец: степень разведения ДНК HBV-содержащего контроля Результат Специфика ВК с ВК пецифика 1:100 + 14,9 3,0 1:1000 + 10,2 5,4 1:10000 + 5,2 6,3 1:100000 + 4,4 7,2 Разбавитель - 1,8 7,6 Фон фон 1,0 1,2 Фон фон 1,0 1,0 * Нормировочные значения 88,5* 57,3* Указанные разведения были проанализированы в соответствии с приведенной инструкцией. Величины флуоресценции в канале патогена (специфика) и внутреннего контроля (ВК) нормированы к фоновой флуоресценции амплификационной пробирки, содержащей воду под защитным слоем парафина в тех же объемах, что и реакционная смесь при ПЦР-анализе. Тест-система включает в себя готовые к работе амплификационные пробирки с компонентами ПЦР и флуоресцентными зондами под слоем парафина и набор реагентов для однопробирочного выделения ДНК из плазмы крови (патент РФ № 2134871, ТУ 9398-423-47621885-00). Общая продолжительность анализа не превышает 3 часов. Прилагается контрольный образец – стабилизированный аналог международного стандарта на вирус гепатита В и плазма-разбавитель. Для установления лимита детекции проводится анализ серии разведений контрольного образца разбавителем. Гибридизационно-флуоресцентная ПЦР-тест система, созданная в Центре крови Минздрава России на ДНК вируса гепатита В, в сочетании с откалиброванным и стабилизированным бактерицидными агентами стандартом ДНК HBV, позволяет с гарантией достоверности обнаруживать HBV в серонегативных донациях и в крови пациентов, а также разделять HBsAg-положительных людей на содержащих HBV в крови и не содержащих HBV в крови. Все этапы исследования производятся в обычных ПЦР-лабораториях, оснащенных приборами и реагентами отечественного производства.

---

Ваша оценка:

Похожие:

	Удк 619: 616-07 Метод выделения ДНК и тест-система пцр в реальном времени для диагностики лейкоза		Тест на выявление рнк вируса гепатита С; тест окончательно подтверждает или опровергает инфекцию
	Пцр основан на принципе естественной репликации ДНК. Метод полимеразной цепной реакции (пцр-диагностика)		Энджерикс Впредставляет собой очищенный основной поверхностный антиген вируса гепатита в (HBsAg),
	«алгоритм лабораторной диагностики вирусного гепатита с у доноров крови» 14. 00. 46 клиническая лабораторная		Определение концентрации ДНК neisseria gonorrhoeae с помощью количественной пцр «в рельном времени»
	Автореферат разослан 2011 г Более 350 млн человек во всем мире являются носителями вируса гепатита в и более 170 млн носителями...		Тест на Leishmania infantum применяется для качественного обнаружения антител класса IgG в крови
	Об установлении перечня заболеваний и состояний, при которых сдача крови и ее компонентов противопоказана, Ноября 2010 года «О донорстве крови и ее компонентов» и подпункта 1 пункта 7 Положения о Министерстве...		Инструкция по медицинскому освидетельствованию доноров крови, плазмы, клеток крови

Разместите кнопку на своём сайте:
Медицина

---