Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов. 03. 02. 03-микробиология icon

Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов. 03. 02. 03-микробиология





НазваниеОптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов. 03. 02. 03-микробиология
страница1/6
Мазепа Владимир Николаевич
Дата22.03.2013
Размер0.73 Mb.
ТипАвтореферат диссертации
  1   2   3   4   5   6




На правах рукописи


Мазепа Владимир Николаевич


Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов.


03.02.03-микробиология


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук


Москва

2010

Работа выполнена в ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.


^ Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор Ефимов Евгений Игоревич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Несвижский Юрий Владимирович

Доктор медицинских наук, профессор Русакова Екатерина Владимировна

Доктор биологических наук, профессор Белецкий Игорь Петрович

^ Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова МО РФ

Защита диссертации состоится «_____» ______________ 20___ г. в ____ часов на заседании Диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институте эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Московский научно-исследовательский институте эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.


Автореферат разослан «____» ____________ 2010 г.


Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук О.Ю. Борисова

^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

На современном этапе для успешного выполнения приоритетных национальных проектов и правительственных программ в сфере здравоохранения, которые традиционно ориентированы на предупреждение распространения и ликвидацию актуальных и социально-значимых инфекционных заболеваний, важное значение приобретает совершенствование методов их лабораторной диагностики.

Актуальной задачей является разработка и внедрение в практическую медицину и систему эпиднадзора технологий, отвечающих следующим требованиям: высокая чувствительность, прецизионная специфичность, информативность, объективность, экспрессность, высокая производительность, универсальность (выявление различных возбудителей в любом типе клинического материала), биобезопасность для исполнителей, возможность автоматизации процесса. Полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на выявлении уникальных фрагментов геномов инфекционных агентов, соответствует данным требованиям, существенно расширяет возможности диагностики, позволяет обнаруживать некультивируемые и труднокультивируемые формы микроорганизмов (Говорун B.М.,2000; Шагинян И.А.,2000;Ребриков Д.В., 2009; Mullis K.B., 1994; Newton C.R.,1997; Farrell D.J., 2001). Универсальность метода ДНК-диагностики и автоматизация практически всех этапов анализа позволяют осуществлять одновременное выявление нескольких инфекционных агентов, способных вызывать определенный тип патологии, проводить скрининговые обследования различных контингентов населения в профилактических целях.

Несмотря на обилие публикаций, посвященных методу ПЦР и его использованию в диагностике отдельных нозологических форм, работы содержащие материалы комплексных ПЦР исследований инфекционных заболеваний, обусловленных широким спектром возбудителей, достаточно редки. Данные о частоте выявления возбудителей зачастую противоречивы, а проблемы ПЦР обследования обширных контингентов одновременно на несколько различных инфекционных агентов и определения роли и места молекулярно-биологических методов в общей системе лабораторной диагностики инфекционных заболеваний освещены недостаточно.

Широко распространенные социально значимые инфекционные заболевания, такие как острые кишечные и негонококковые урогенитальные инфекции, хеликобактериозы и вирусные гепатиты приносят значительный вред здоровью жителей России и экономический ущерб (Кишкун А.А., 2002; Козлова В.И., 2003; Шахгильдян И.В. 2003; Подколзин А.Т., 2004,). Кроме этого, хеликобактериозы и гепатиты существенно снижают продолжительность жизни, а негонококковые урогенитальные инфекции отрицательно влияют на репродуктивную функцию. Активизация и оптимизация внедрения современных технологий в диагностику этих инфекций способствует своевременному назначению этиотропной терапии, уменьшению продолжительности лечения и количества осложнений.

В связи с вышеизложенным, особую актуальность приобретают вопросы выбора наиболее значимых направлений и объектов исследования, создания и подбора тест-систем для ПЦР-диагностики, их апробации и адаптации к медицинской практике, разработки оптимальных алгоритмов применения как отдельных диагностикумов, так и сочетаний нескольких тест-систем для улучшения технологичности, повышения эффективности и уменьшения стоимости исследований.

^ Цель работы – Оптимизировать и адаптировать собственные и имеющиеся отечественные экспериментальные и коммерческие ПЦР тест-системы к решению задач диагностики острых кишечных инфекций, хеликобактерной инфекции, негонококковых урогенитальных инфекций, вирусных гепатитов; разработать стратегию и тактику использования метода ПЦР для наиболее рационального и эффективного выявления возбудителей этих заболеваний.

^ Задачи исследования:

1. Провести оптимизацию методов ПЦР-диагностики для выявления актуальных патогенов - возбудителей ОКИ, хеликобактерной инфекции, вирусных гепатитов В и С, НУГИ.

2. Разработать алгоритмы диагностики ОКИ, хеликобактерной инфекции, вирусных гепатитов В и С, НУГИ с использованием оптимизированных нами методов на основе отечественных ПЦР тест-систем.

3. Апробировать и адаптировать к практической диагностике систему молекулярно-биологических методов выявления актуальных бактериальных возбудителей ОКИ – бактерий родов Shigella, Salmonella, Yersinia, Campylobacter и генов, ответственных за патогенность энтеробактерий.

4. Оценить возможности метода ПЦР при изучении распространения бактерий ^ H. pylori у больных разных возрастных групп с различными типами гастродуоденальной патологии, а также при внутривидовом типировании и выявлении генов факторов патогенности H pylori.

5. Разработать экономичный вариант метода ПЦР для оценки вирусной нагрузки у больных вирусными гепатитами В и С, изучить особенности репликации вирусов гепатитов В, С, D, G при моно- и смешанном инфицировании, определить эффективность и значимость вертикального пути передачи вирусов гепатитов В и С в Нижегородском регионе.

6. С помощью комплексного ПЦР исследования получить новые знания о распространении и особенностях циркуляции наиболее значимых возбудителей НУГИ (U. urealyticum, M. hominis, C trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II) у взрослых и детей, и о возможной связи отдельных представителей НУГИ с формированием различных форм патологии.

7. На основе полученных новых знаний определить роль и место молекулярно-биологических методов в лабораторной диагностике НУГИ, ОКИ, хеликобактерной инфекции, парентеральных вирусных гепатитов, провести апробацию разработанных алгоритмов их диагностики в практической медицине.

^ Научная новизна работы.

Впервые в Нижегородском регионе проведено освоение и внедрение в практическое здравоохранение и систему эпиднадзора метода ПЦР. На основе многолетних системных исследований группы возбудителей актуальных инфекционных заболеваний (ОКИ, хеликобактерная инфекция, НУГИ, вирусные гепатиты) получена новая объективная информация о распространенности и особенностях циркуляции инфекционных агентов среди населения.

Разработаны оптимальные алгоритмы применения амплификационных методов для решения задач диагностики ОКИ, хеликобактерной инфекции, вирусных гепатитов, НУГИ. Определены роль и место данных технологий в общей системе диагностических исследований для наиболее рациональной и эффективной реализации последних.

Впервые разработаны экспериментальные лабораторные тест-системы для выявления бактерий рода Shigella, и генов токсинов энтеробактерий (термолабильного – LT; термостабильного - ST; шигатоксина первого типа - VT1).

Впервые установлено, что использование ПЦР при первичном обследовании больных с подозрением на ОКИ позволяет более чем в 2 раза увеличить эффективность выявления бактерий родов Shigella и Salmonella по сравнению с классическим микробиологическим исследованием.

Впервые в РФ проведен многолетний мониторинг (18 лет) клинических изолятов энтеробактерий. Установлены особенности циркуляции в Нижнем Новгороде штаммов энтеробактерий, содержащих гены факторов патогенности. Наиболее распространены варианты, имеющие оперон инвазивности (Shigella ssp., E.coli). Показано, что циркуляция токсигенных штаммов энтеробактерий нехарактерна для Нижегородского региона. Выявлены единичные случаи обнаружения гена шигаподобного токсина первого типа у представителей Shigella ssp., E. col.i Впервые выявлен факт наличия у E. coli O127 генетических структур, сходных по нуклеотидной последовательности с геном адгезии холерного вибриона.

Установлена широкая распространенность H. pylori среди больных разных возрастов с различными типами гастродуоденальной патологии в Нижнем Новгороде (частота выявления 58,9% у детей и 82,9% у взрослых). Определена распространенность токсигенных вариантов H. pylori в бактериальной популяции. Варианты сagA + составили 76,4%, а варианты vakА + - 66,0% в популяции соответственно.

Определена активность репликации вирусов у больных хроническими гепатитами В и С разных возрастов при моноинфицировании, частота выявления вирусных нуклеиновых кислот составляла 48 - 50%. Установлено, что эффективность репликации вирусов гепатитов B, C, D, G снижается при смешанном инфицировании (вирусные нуклеиновые кислоты выявлялись суммарно в 25,5 -37,0% случаев в зависимости от состава ассоциации).

Определена вероятность вертикальной передачи вирусов гепатитов В и С в Нижнем Новгороде - 12,8% и 10,0% соответственно.

Впервые изучена циркуляция наиболее распространенных в Европе генотипов вируса гепатита С (1а, 1b, 2, 3а) на территории г. Нижнего Новгорода и Нижегородской области. Показано доминирование генотипов 1b и 3а, частота их выявления несколько варьировала по годам и составляла 51,8-54,3% и 46,1-49,5% соответственно.

Исследованы особенности распространенности наиболее значимых возбудителей НУГИ – U. urealyticum, M. hominis, C trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II. Они обнаружены у 68% женщин и 40% мужчин. Показано многолетнее стабильное сохранение распределения возбудителей по частоте выявления. В течение всего периода наблюдения чаще других обнаруживались U. urealyticum (54,2% у женщин, 29,7% у мужчин)и M. hominis (25,8% у женщин, 14,5% у мужчин). Остальные виды инфекционных агентов определялись существенно реже.

На основе анализа частоты выявления возбудителей НУГИ в разных возрастных группах установлены этапы колонизации макроорганизма уреаплазмами, микоплазмами и вирусами группы гепеса. Показана связь возбудителей НУГИ с нарушениями репродуктивной функции и воспалительными процессами в различных отделах урогенитального тракта.

На клонированные фрагменты генов термолабильного токсина (LT) фактора адгезии (CFA1) и на алгоритм использования метода ПЦР для выявления возбудителей НУГИ у детей первых лет жизни получены патенты Российской Федерации № 2031948 по заявке №5016860/13; №2049822 по заявке № 92 – 012954/13; №2271003 по заявке №2003132188 соответственно.

^ Теоретическое значение работы.

Работа является одной из первых в Российской федерации, в которой рассматриваются проблемы комплексного подхода к ПЦР диагностике инфекционных заболеваний, обусловленных широким спектром возбудителей.

Предложена система адаптации отечественных ПЦР тест-систем к решению задач практической медицины и эпиднадзора, а также разработки алгоритмов рационального использования метода ПЦР в диагностике актуальных инфекционных заболеваний.

Полученные новые данные о распространенности труднокультивируемых форм возбудителей расширяют представления об эпидемиологических особенностях ОКИ, хеликобактерной инфекции, НУГИ и вирусных гепатитах.

Предложенные алгоритмы диагностики НУГИ, ОКИ, парентеральных вирусных гепатитов, хеликобактерной инфекции с применением метода ПЦР могут быть использованы в дальнейшем при разработке новых диагностических стандартов. Перечни ведущих инфекционных агентов, предложенные для одновременного выявления при комплексной ПЦР-диагностике НУГИ и ОКИ могут служить основой комплектации мультиплексных ПЦР-тест-систем с детекцией продуктов амплификации методом биочипов.


^ Практическое значение работы.

Направления исследований были выбраны в соответствии с потребностями и пожеланиями учреждений практического здравоохранения Нижегородского региона. Внедрение в практику метода ПЦР и разработка алгоритмов их применения позволили усовершенствовать клиническую диагностику и систему эпиднадзора и мониторинга за возбудителями бактериальных ОКИ, хеликобактериоза, НУГИ и вирусных гепатитов.

Оптимизация использования тест-систем , проведение одномоментного выявления наиболее распространенных инфекционных агентов, пулирование исследуемых субстратов позволили повысить эффективность выявления возбудителей, уменьшить продолжительность и стоимость исследований.


^ Основные положения, выносимые на защиту.

1. Для успешного внедрения и использования метода ПЦР в диагностике бактериальных и вирусных инфекционных заболеваний необходимо проведение стадий адаптации, оптимизации диагностикумов, определение наиболее важных и существенных аспектов, требующих привлечения ПЦР.

2. ПЦР может успешно использоваться для первичной скрининговой детекции бактериальных возбудителей ОКИ в лабораторной диагностике и санитарно-эпидемиологическом надзоре. Эффективность этиологической диагностики возрастает при одновременном выявлении ведущих инфекционных агентов: бактерий родов Shigella, Salmonella, Campylobacter и Y. enterocolitica.

3. Использование отечественных ПЦР тест-систем позволяет проводить не только первичную индикацию H .pylori, осуществлять оценку количества инфекционного агента и контролировать эффективность антихеликобактерной терапии, но и получять ряд существенных характеристик микроорганизма, таких как наличие генов факторов патогенности сagA и vakА, устойчивости к антибиотикам - макролидам без культивирования микроорганизма.

4. Наиболее значимыми направлениями использования ПЦР в решении проблемы парентеральных вирусных гепатитов является определение результативности противовирусной терапии, интенсивности репликации вирусов при и моно- и смешанном инфицировании и совершенствование профилактики вертикального пути передачи вирусов. Для этого успешно может быть использован разработанный нами экономичный полуколичественный вариант ПЦР.

5. ПЦР является основным методом детекции возбудителей НУГИ, позволяющим эффективно выявлять любой из микроорганизмов этой группы (вирусы, бактерии). Наиболее эффективно и экономически оправдано одновременное выявление у пациента пяти наиболее значимых и распространенных возбудителей: U. urealyticum, M. hominis, C trachomatis, Cytomegalovirus, Herpes simplex I/II в пуле субстратов (смеси соскобов слизистых уретры, вагины, цервикального канала у женщин; смеси соскоба слизистой уретры и осадка мочи у мужчин; смеси слюны, мочи, слезного отделяемого у детей), в которых наиболее вероятно их присутствие.


В работу вошли результаты совместных исследований с Соринсоном С.Н., Бокаревым А.А., Бруснигиной Н.Ф., Черневской О.М. ,Маховой М.А., Орловой К.А., Немовым В.В., которые представлены публикациями в соавторстве. Автор выражает огромную благодарность сотрудникам лаборатории молекулярно-генетических методов надзора за инфекционными заболеваниями, сотрудникам ЛПУ, учреждений Роспотребнадзора, практических лабораторий, принимавших участие в проведении данных исследований и внедрении их результатов.


Апробация работы.
  1   2   3   4   5   6

Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:

Похожие:

Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов. 03. 02. 03-микробиология icon3 профилактика инфекционных заболеваний. Кишечные инфекции профилактика острых кишечных инфекций

Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов. 03. 02. 03-микробиология iconМолекулярно-биологические технологии в медицинской практике: проблемы диагностического использования

Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов. 03. 02. 03-микробиология iconРекламно-информационный листок для врачей Определения генетических полиморфизмов, ассоциированных

Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов. 03. 02. 03-микробиология iconРекомендации по профилактике острых кишечных инфекций
Оки – группа инфекционных заболеваний бактериальной или вирусной природы, объединенная общей чертой...
Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов. 03. 02. 03-микробиология iconПцр основан на принципе естественной репликации ДНК. Метод полимеразной цепной реакции (пцр-диагностика)

Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов. 03. 02. 03-микробиология iconПрофилактика острых кишечных инфекций в летний период. Кишечная инфекция

Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов. 03. 02. 03-микробиология iconПрофилактика острых кишечных инфекций Санитарно-эпидемиологические правила сп 1 1117—02

Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов. 03. 02. 03-микробиология iconЭпидемиологическая характеристика и лабораторная диагностика урогенитальных инфекций, ассоциированных

Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов. 03. 02. 03-микробиология iconЦелевая программа борьбы со спид, профилактики вирусных гепатитов и внутрибольничных инфекций на

Оптимизация и комплексное использование полимеразной цепной реакции в диагностике актуальных инфекционных заболеваний на модели острых кишечных, хеликобактерной, негонококковых урогенитальных инфекций и вирусных гепатитов. 03. 02. 03-микробиология iconТематический план лекций по частной микробиологии для студентов III
В частную микробиологию. Материал и методы исследований. Общая характеристика острых кишечных инфекций....
Разместите кнопку на своём сайте:
Медицина


База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2019
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
Документы