Методические указания по количественному определению гистамина в рыбе с помощью тест-системы ридаскрин гистамин (ridascreen® histamin)
|
|
Скачать 149.53 Kb.
|
|
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА Утверждаю И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ Заместитель руководителя РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Департамент ветеринарии (Минсельхозпрод России) В.В.Селиверстов ДЕПАРТАМЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ № 13-7-2/1874 от 10.02.2000 МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГИСТАМИНА В РЫБЕ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ РИДАСКРИН ГИСТАМИН (RIDASCREEN® HISTAMIN) (производство фирмы Ар-Биофарм/R-Biopharm, Германия) 1. Область применения методики Методика предназначена для количественного определения гистамина в рыбе (скумбрия, ставрида, сайра, макрель, тунец, сельдь, шпрот, лосось и др.) с помощью тест-системы для иммунно-ферментного анализа RIDASCREEN® Histamin*. * RIDASCREEN® является зарегистрированным товарным знаком фирмы R-Biopharm, Германия 2. Краткое описание методики Пробоподготовка: Холодное центрифугирование Затраты времени: Пробоподготовка (при обработке 10-ти проб) около 1-го часа Анализ(независимо от количества проб) 2 часа Предел обнаружения: 2.5 мг/кг Сходимость результата анализа: коэффициент вариации не хуже 10 % Извлекаемость: 80 - 95% (в зависимости от концентрации гистамина) Перекрестная чувствительность: гистамин 100.00% гистидин около 0.005 % спермидин около 1.0 % путресцин около 0.2% 3. Общие положения Гистамин являются одним из биогенных аминов, образующихся в рыбе при декарбоксилировании аминокислот, в том числе, в результате деятельности бактерий. Поскольку биогенные амины принадлежат к веществам, участвующим в обмене веществ высших животных, они легко метаболизируются и поэтому обычно хорошо переносятся человеком, если их концентрация в пище находится в пределах допустимого уровня. При бактериальном загрязнении рыбы повышение уровня содержания биогенных аминов, в частности гистамина, может причинить вред здоровью потребителя. При содержании гистамина выше обычного уровня естественный механизм детоксификации аминов за счет деятельности ферментов - аминооксидаз (гистаминазы) уже не справляется. Повышенное поступление гистамина может вызвать так называемую «гистаминовую» мигрень (синдром Хортона), головную боль (невралгия Харриса, характеризующаяся болью в области глаз, лба, височной части головы, слезотечением, воспалением слизистой носа) и другие симптомы, включая тошноту, понос, испарину, повышенное выделение желудочного сока, учащение сердцебиения и снижение диастол ического (нижнего) кровяного давления. Бактерии Enterobacteriaceae, в частности колиформы, обладают высокой декарбоксилизующей активностью, причем даже при стерилизации рыбы наработка гистамина не прекращается за счет деятельности активных ферментов. Продуктами риска является в первую очередь рыба богатая гистидином, в частности скумбрия, ставрида, сайра, макрель, тунец, сельдь, шпрот, лосось и некоторые другие продукты, например, сыр, мясо, шампанское, вино, пиво и кислая капуста. Содержание гистамина в пище нормируется во всех развитых странах и является важнейшим показателем свежести рыбы. Так, например, согласно СанПиН 2.3.2.560-96 Российской Федерации содержание гистамина в рыбе не должно превышать 100 мг/кг, в Соединенных Штатах норма гистамина составляет 50 мг/кг (производители рыбных консервов контролируют сырье по норме 5 - 15 мг/кг гистамина). Традиционный фотоколориметрический метод контроля гистамина в рыбе трудоемок, занимает длительное время и характеризуется малой производительностью. В последнее время в рутинной лабораторной практике широко применяется более удобный иммунно-ферментный метод анализа (ИФА, ELISA), являющийся официальным методом контроля, принятым в странах Евросоюза (Директива 93/257/ЕЕС). 4. Нормативные ссылки Использованы ссылки на следующие нормативные документы: ГОСТ 12.1.007-76 ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие правила безопасности. ГОСТ 12.1.018-86 ССБТ. Пожарная безопасность. Электростатическая искробезопасность. Общие требования. ГОСТ 12.1.019-79 ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура средств защиты. ГОСТ 1770-74Е. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия. ГОСТ 4025-83. Мясорубки бытовые. Технические условия. ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия. ГОСТ 7269-79. Мясо. Методы отбора образцов. Органолептические методы определения свежести. ГОСТ 7328-82Е. Меры массы общего назначения и образцовые. Технические условия. ГОСТ 7702.0-74. Мясо птицы. Методы отбора образцов. Органолептические методы определения качества. ГОСТ 24104-88Е. Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия. ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры. ГОСТ 29169-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой. ГОСТ 29224-91. Термометры ртутные стеклянные лабораторные. Технические условия. ГОСТ 29227-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Общие требования. 5. Сущность метода. В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами. Планшет, входящий в состав набора RIDASCREEN® Histamin, сенсибилизирован гистамином. Анализ выполняется следующим образом. Исследуемые (стандартные) образцы и раствор, содержащий антитела к гистамину дозируются в лунки планшета. При инкубации планшета в течение определенного времени молекулы гистамина, содержащегося в пробе (в стандартном растворе) и молекулы гистамина, адсорбированные на поверхности планшета, конкурируя между собой, взаимодействуют с внесенными антителами к гистамину. После промывки планшета в лунки вносится раствор, содержащий вторичные антитела коньюгированные с пероксидазой, которые во время второй инкубации связываются комплексом гистамин - антитело на поверхности планшета. Несвязанные молекулы коньюгата удаляются при очередной промывке. В лунки затем дозируется раствор субстрата (пероксид карбамида) и раствор хромогена (тетраметилбензидин). В процессе очередной инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы коньюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются окрашенные продукты реакции. Через определенное время развития цветной реакции, в результате которой бесцветный хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый. Оптическая плотность в лунках, измеренная на спектрофотометре (ридере) при 450 нм, обратно пропорциональна концентрации гистамина в исследуемых образцах. 6. Предел обнаружения и диапазон определяемых концентраций 6.1. Предел обнаружения гистамина составляет: •2.5 мг/кг при навеске образца 2 г 6.2. Диапазон определяемых концентрация гистамина составляет: •2.5 - 202.5 мкг/л при навеске образца 2 г 7. Средства измерения, вспомогательные устройства, реактивы и материалы 7.1. Средства измерения Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104 Меры массы по ГОСТ 7328 Спектрофотометр (ридер), снабженный фильтром на 450 нм Дозаторы на 50, 100 и 250 мкл Колба мерная 2-го класса точности вместимостью 1000 мл исп. 2 по ГОСТ 1770 Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1 и 10 мл по ГОСТ 29227 7.2. Вспомогательные устройства Мясорубка по ГОСТ 4025 Центрифуга охлаждаемая с устанавливаемым ускорением 3000 д Центрифужная пробирка на 20 мл с завинчивающейся крышкой Устройство для встряхивания проб Пипетки Пастера Пробирки типа П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками Стакан химический вместимостью 100 мл по ГОСТ 25336 Воронки лабораторные типа В-36 или В-75 по ГОСТ 25336 Стеклянный бюкс (стаканчик для взвешивания) по ГОСТ 25336 Груша резиновая Холодильник бытовой 7.3. Реактивы и материалы Тест-система для иммунно-ферментного анализа RIDASCREEN® Histamin в стандартной комплектации, включая: Микротитровальный планшет на 48 лунок (6 стрипов по 8 лунок), сенсибилизированный гистамином 1 шт Комплект стандартных растворов гистамина в воде со следующими концентрациями (1 ррЬ=1мг/кг): О ppb (нулевой стандарт), 50 ppb, 150 ppb, 450 ppb, 1350 ppb, 4050 ppb, по 1.2 мл 6 х 1 шт Коньюгат антител с пероксидазой, 8 мл (красная крышка) 1 шт Антитела к гистимину, 4 мл (черная крышка) 1 шт Субстрат, содержит пероксид карбамида, 7 мл (зеленая крышка) 1 шт Хромоген, содержит тетраметилбензидин, 7 мл (голубая крышка) 1 шт Стоп-реагент, содержит 1 М раствор серной к-ты, 14 мл (желтая крышка) 1 шт Буфер, для разбавления конц. растворов коньюгата и антител, 25 мл 1 шт Твин 20 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 Дигидрофосфат натрия, дигидрат, NaH2PO4 x 2H2O Гидрофосфат натрия, безводный, Na2HPO4 Хлорид натрия, NaCI Замечания по использованию и хранению тест-системы RIDASCREEN® Histamin Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности. Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности определения. Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого набора с другим номером партии. Храните набор при температуре 2 - 8 °С. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР. Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте их в срольгированный пакет вместе с силикагелем (осушителем) и плотно закройте пакет. Поскольку стандартные растворы и раствор хромогена светочувствительны, избегайте попадания прямых солнечных лучей на флаконы с растворами. Признаки порчи реагентов: В случае окрашивания раствора хромогена не рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание раствора хромогена является признаком его порчи. В случае, если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, не превышает 0.6, это также может быть признаком порчи реагентов. 8. Требования безопасности 8.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр и вспомогательные устройства. 8.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. 9. Требования к квалификации персонала К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалиста, имеющего высшее или среднее специальное химическое образование или опыт работы в химической лаборатории, владеющего техникой иммунно-ферментного анализа и освоившего метод в процессе стажировки. 10. Условия выполнения исследований При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия: Температура воздуха 20 ± 5 °С; Атмосферное давление 84.0 - 106.7 кПа (630 - 800 мм. рт. ст.); Влажность воздуха не более 80% при температуре 25°С; Напряжение в сети 220 ± 10 В; Частота переменного тока 50 ± 1 Гц 11. Порядок отбора проб и подготовки к проведению исследований 11.1. Отбор проб осуществляют в соответствии с действующей нормативной документацией по отбору проб. Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора. 11.2. Анализ необходимо начать в день доставки пробы в лабораторию. При отсутствии такой возможности допускается хранение образцов не более чем 2 суток с момента отбора при температуре 2 - 8°С, либо 5-6 месяцев при температуре - 20°С. 11.3. Приготовление вспомогательных растворов. 11.3.1. Приготовление 0.02 М фосфатного буферного раствора ствином, рН 7.2 Взвешивают 2.3 г безводного гидрофосфата натрия, 0.62 г дигидрата дигидрофосфата натрия и 9.0 г хлорида натрия. Навески переносят в мерную колбу на 1000 мл, добавляют 1 мл твин-20 и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают. Срок хранения раствора при температуре 2 - 8°С - 4 дня. 12. Пробоподготовка 12.1. Пробу рыбы измельчают с помощью мясорубки либо другим способом. 12.2. Навеску 2 г фарша и 10 мл 0.02 М фосфатного буферного раствора с твином переносят в центрифужную пробирку на 20 мл, закрывают пробирку герметичной крышкой и энергично встряхивают в течение 30-ти минут с помощью устройства для встряхивания проб, либо вручную. 12.3. Пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют при ускорении 3000 д и температуре 4°С в течение 10 мин. 12.4. Верхний слой жира удаляется. 12.5. Часть водной вытяжки переносят в чистую пробирку на 5 мл. 12.6. Раствор разбавляют в десять раз фосфатным буферным раствором, например, переносят дозатором в чистую пробирку 100 мкп водной вытяжки, добавляют 0.9 мл фосфатного буфера и тщательно перемешивают. 12.7. Для анализа используют 50 мкп раствора. 13. Порядок проведения измерений 13.1. Предварительные замечания по проведению измерений с помощью тест-системы RIDASCREEN® Histamin. Перед использованием тест-системы доведите температуру всех реагентов до комнатной (30 - 40 минут до температуры 18-20 °С). Немедленно после использования охладите все оставшиеся реагенты до температуры 2 8°С. В процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета. Воспроизводимость результатов иммунно-ферментного анализа существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте описанной далее процедуре отмывки планшета. На всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света. 13.2. Подготовка к измерениям 13.2.1. Микротитровальный планшет, сенсибилизированный гистамином Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов. Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фолы-ированный пакет вместе с силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 - 8°С. 13.2.2. Стандартные растворы. Стандартные растворы гистамина поставляются готовыми для использования в следующих концентрациях: Стандарт 1 0 ррЬ Стандарт 2 50 ppb Стандарт 3 150 ppb Стандарт 4 450 ppb Стандарт 5 1350 ppb Стандарт 6 4050 ppb Примечание: 1 ppb = 1 мкг/кг 13.3. Процедура анализа 13.3.1. Вставьте в рамку планшета лунки в количестве, необходимом для выполнения всех запланированных определений в дубле (по 2 раза). Запишите координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов. Пример формы записи приведен на Рис.1.
Рисунок 1. Пример формы записи координат лунок перед выполнением анализа (С-стандарты, П-пробы). 13.3.2. С помощью дозатора добавьте по 50 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие пары лунок. 13.3.3. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл препарата антител (здесь и далее предпочтительно использование 8-ми канального дозатора, при этом раствор удобно отбирать из специальной ванночки или из чашки Петри). Путем осторожного постукивания по краям планшета перемешайте раствор в лунках и оставьте планшет на инкубацию в темноте в течение одного часа при комнатной температуре. 13.3.4. Вылейте жидкость из лунок, переверните рамку планшета и тщательно выбейте капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполните лунки 250 мкл фосфатного буферного раствора и снова опорожните лунки. Выбейте капельки жидкости как описано выше. Повторите процедуру промывки лунок еще два раза. 13.3.5. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл препарата коньюгата. Путем осторожного постукивания по краям планшета перемешайте раствор в лунках и оставьте планшет на инкубацию в темноте в течение получаса при комнатной температуре. 13.3.6. Промойте лунки планшета, следуя процедуре по п. 13.3.4. 13.3.7. Добавьте по 50 мкл субстрата и по 50 мкл хромогена в каждую лунку. Тщательно перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте. 13.3.6. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента и хорошо перемешайте. В течение 60-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм. 14. Обработка результатов исследования Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами делятся на среднее значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть: Средняя оптическая плотность лунки со стандартом (пробой) —————————————-————————X 100 = % поглощения Средняя оптическая плотность лунки с нулевым стандартом По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов и соответствующим значениям концентрации гистамина в мкг/кг (ppb) строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат. Калибровочная кривая должна быть почти линейна в диапазоне 150 - 1350 мкг/кг (см. Рис. 2).  Концентрация, нг/кг Рисунок 2. Калибровочная кривая, полученная для тест-системы RIDASCREEN® Histamin Концентрация гистамина в исследуемых растворах в мкг/кг (ppb) считывается по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному для этих растворов. Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать специализированное программное обеспечение, например, RIDA®Soft*. При компьютерной обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного обеспечения. Внимание: Для того чтобы вычислить концентрацию гистамина в исследуемой исходной пробе, величину концентрации гистамина, полученную по калибровочной кривой, следует умножить на соответствующий фактор разбавления. При выполнении пробоподготовки и анализа в полном соответствии с приведенной методикой фактор разбавления принимает следующие значения: Фактор разбавления для проб рыбы равен 50. 15. Интерпретация результатов исследования При контроле проб рыбы на соответствие санитарно-гигиеническим требованиям к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, принятым в Российской Федерации, найденная концентрация гистамина более 100 мг/кг (более 2000 мкг/кг по калибровочной кривой) позволяет рассматривать исследуемую рыбу как несоответствующую санитарно-гигиеническим требованиям. При меньшем содержании гистамина в рыбе найденная величина концентрации позволяет классифицировать рыбу по уровню свежести. РАЗРАБОТАНО: Представитель R-Biopharm в России и Начальник отдела лабораторной странах СНГ диагностики Департамента Директор 000 “СТАЙЛАБ” ветеринарии Минсельхозпрода России А.В.Галкин В.И. Белоусов Методика апробирована в Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории Департамента ветеринарии Минсельхозпрода России (ЦНМВЛ) и во Всероссийском научно-исследовательском институте мясной промышленности (ВНИИМП) Директор ЦНМВЛ Заведующая отделом ИФА В.А. Седов О.Н. Виткова Зав. лабораторией ВНИИМП Ю.Г. Костенко |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям