Хама-мурад арман Хамалав молекулярно-клеточные механизмы геморрагического инсульта (в экспериментальном исследовании)
|
|
Скачать 0.72 Mb.
|
|
На правах рукописи ХАМА-МУРАД Арман Хамалав МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА (В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ИССЛЕДОВАНИИ) 14.03.03 – патологическая физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Санкт-Петербург 2011 Работа выполнена в Государственном Учреждении Российской академии наук Института физиологии им. И.П.Павлова РАН. Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Николаев Валентин Иванович доктор медицинских наук, профессор ^ доктор медицинских наук, профессор Тюкавин Александр Иванович Ведущая организация: Федеральное государственное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования Министерства обороны Российской Федерации «Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова» (ФГВОУ ВПО МО РФ) (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6) Защита состоится «….»…………….. 2011 г. в … часов на заседании Диссертационного Совета Д 208.090.03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования (ГОУ ВПО) «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6\8). С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И. П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6\8). Автореферат разослан «……»…………….2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук профессор Митрейкин В.Ф ^ Актуальность проблемы. Заболеваемость геморрагическим инсультом представляет собой значительную социально-экономическую проблему для современного общества. Летальность в остром периоде кровоизлияния составляет 40-50%, а инвалидизация пациентов достигает 75%. Геморрагический инсульт составляет 15% от всех инсультов в США и Европе и 20-30 % у населения в Азии. Последствия, тяжесть протекания заболевания и смертность от геморрагического инсульта значительно выше, чем при ишемическом инсульте. Основными этиологическими факторами геморрагического инсульта являются гипертоническая болезнь (в 80-85% случаев) (Quereshi et al., 2009; Taylor, Quereshi, 2009), врожденные и приобретенные артериальные и артерио-венозные аневризмы (O'Brien et al., 1999; Cheung, 2007; Gil-Núñez, Vivancos-Mora, 2005; Abasova, 2009; Schrader, 2009). Среди больных старше 25 лет заболеваемость и смертность увеличиваются примерно в 2-3 раза с каждым последующим десятилетием. Среди выживших до 80% пациентов остаются до конца жизни инвалидами, нуждающимися в посторонней помощи и финансовой поддержке государства, а 33% - полностью зависят от помощи окружающих и остро нуждаются в длительной и дорогостоящей медико-социальной реабилитации (Одинак, Вознюк, 2000). Геморрагические инсульты инвариантны к полу и возрасту больных, хотя с возрастом частота заболевания возрастает, но в то же время имеет место тенденция развития геморрагического инсульта у более молодых людей, у которых присутствует более двух сопутствующих заболеваний (Lee et al., 2007; Pathak, Sloan, 2009). Особенности в уровне и образе жизни и состоянии окружающей среды, (Bejot еt al., 2007), метереологические, сезонные, психоэмоциональные и циркадные ритмы (Jimenez-Conde et al., 2008) имеют большое значение в заболеваемости и смертности от геморрагического инсульта. Мозговой инсульт часто сопровождается нарушением когнитивных процессов, зрительного восприятия, наблюдаются нарушения абстрактного мышления, вербальной памяти, функции речи у подавляющего числа пациентов (60-70%) (Nys et al., 2007; Gamaldo et al., 2006). Патофизиология геморрагического инсульта, изучаемая, в основном, в моделях in vivo, описывает изменения физиологического статуса и ряда поведенческих параметров. Остается совершенно не исследованной проблема функциональной активности нервных клеток в самые ранние периоды патологии. Известно, что процесс нейродегенерации под действием возбуждающих аминокислот, связанный с нарушением работы возбуждающих глутаматных рецепторов нейронов, является ключевым механизмом инсульта (Garthwaite, 1991; Domoki et al., 2002; Bonvento et al., 2002; Aarts et al., 2003; Kang et al., 2005; Fellin et al., 2006). Однако не известно, как кровь, ее компоненты, продукты ее лизиса воздействуют на нейрональную активность, какова динамика нарушения электрогенеза нервной ткани, которая приводит к гибели нейронов, и, в конечном счете, разрушает деятельность мозга. Важно также представлять, каким образом артериальная гипертензия, которая является одним из основных факторов развития геморрагического инсульта, влияет на функционирование как механизмов электрогенеза нервных клеток мозга, так и более сложных процессов – пластических модификаций мозга. Для того, чтобы ответить на эти и другие вопросы, были проведены электрофизиологические исследования in vitro, в которых с первого момента контакта нервной ткани с кровью on-line фиксировались изменения активности нейронов, обусловленные как возбуждающими, так тормозными механизмами. Эти модели геморрагического инсульта in vitro являются единственными в настоящее время подходами, применение которых позволило не только исследовать динамику нарушений синаптической глутаматергической и ГАМК-эргической активности нейронов в мозге, но и активно воздействовать на них, используя протективные вещества, способные защитить процессы электрогенеза нервной ткани от блокады и разрушения. ^ изучение молекулярно-клеточных механизмов повреждения нервных клеток при их контакте с кровью после кровоизлияния в мозг у гипертензивных крыс линии SHR, а также усовершенствование принципов защиты и восстановления функций нервных клеток после геморрагического инсульта. ^ 1. Используя методы электрофизиологического определения амплитуд параметров фокальных потенциалов в срезах мозга выявить различия в базисных синаптических процессах при устойчивой гипертензии. Провести сравнение базисных характеристик возбуждающей глутаматергической и тормозной ГАМКергической синаптических передач в переживающих срезах обонятельной коры мозга гипертензивных крыс линии SHR и крыс линии Вистар, использованных в качестве контроля. Исследовать различия в развитии процессов научения в переживающих срезах мозга крыс этих линий. 2. Разработать надежные и воспроизводимые модели геморрагического инсульта, позволяющие регистрировать изменения параметров фокальных потенциалов in vitro на переживающих срезах обонятельной коры мозга крыс линии SHR, происходящих как в начальный момент воздействия целой аутокрови и ее отдельных фракций, так и в отставленные периоды времени. Изучить изменения параметров возбуждающей глутаматергической и тормозной ГАМКергической синаптических передач в переживающих срезах обонятельной коры мозга гипертензивных крыс линии SHR в первые часы контакта с кровью в моделях in vitro. 3. На основании данных о повреждениях синаптических механизмов при действии аутокрови определить срок oт начала действия аутокрови до того момента, когда наступает необратимая гибель нервных клеток - «терапевтическое окно». Определить длительность «терапевтического окна» в переживающих срезах мозга при воздействии на них аутокрови. 4. Исследовать динамику развития отека в срезах обонятельной коры мозга, возникающего при моделировании геморрагического инсульта под действием сгустка аутокрови. 5. Изучить роль глутаматных ионотропных и метаботропных рецепторов в развитии отека в срезах мозга при действии аутокрови. 6. Используя вовлеченность глутаматэргических и ГАМКэргических ионотропных рецепторов в нарушение механизмов работы нейронов при контакте с кровью, осуществить поиск нейропротекторов эндогенного происхождения, способных протектировать функционирование этих рецепторов при геморрагическом инсульте in vitro. 7. Разработать способ определения физиологической активности в нервной системе белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа. ^ Впервые разработаны и успешно применены в научных исследованиях 2 типа моделирования геморрагического инсульта, позволяющие исследовать молекулярно-клеточные механизмы, ответственные за повреждения нервных клеток головного мозга, опосредованные их контактом с кровью, излившейся в мозговую ткань, в ранний и поздний периоды патологического процесса (патент на изобретение № 2307396 РФ; патент на изобретение № 2340951 РФ). Выявлены протективные эффекты веществ – дипептида L-карнозина (патент на изобретение № 2360295 РФ), БТШ70 (патент на изобретение № 2359337 РФ), гепарина (патент на изобретение № 2361283 РФ), а также витамина Е (патент на изобретение № 2359272 РФ), способные уменьшать отек тканей головного мозга после повреждения. Показана роль глутаматергических и ГАМКергических синаптических рецепторов в развитии патологических процессов в нейронах ЦНС (от первых минут до 6 часов воздействия аутокрови). Впервые для геморрагического инсульта экспериментально обоснована длительность «терапетического окна», которая составляет 6-7 часов. ^ Изучение динамики нарушений биоэлектрической активности нейронов, происходящих в мозге в самые ранние сроки геморрагического инсульта, имеет не только важный теоретический интерес, но перспективно и для клинического применения. Знание механизмов формирования патологии в ЦНС при контакте нервной ткани с кровью, приводящее к прекращению синаптической деятельности нейронов, дает возможность поиска путей их регуляции или компенсации, и полученные результаты могут быть использованы в целенаправленном поиске нейропротективных средств. ^
^ Автором лично выполнен объем клинических и экспериментальных исследований. Автором сформулированы цель, задачи, научно обоснованы выводы и практические рекомендации. Кроме того, соискателем лично выполнено формирование базы данных и статистическая обработка результатов исследования. ^ Результаты работы могут быть использованы в научной практике, связанной с изучением молекулярнно-клеточных механизмов развития патогенеза инсульта на основе экспериментальных моделей и могут войти в курс преподавания по физиологии, патофизиологии, нейрофизиологии и нейрологии. Полученные данные рационально использовать в фармакологии при разработке протективных препаратов. По материалам проведенных исследований получено 9 патентов на изобретение в Федеральном Институте Промышленной Собственности РФ (ФИПС). ^ Материалы исследования изложены в 33 публикациях и материалах российских и международных конференций, 17 из которых в журналах рекомендованных ВАК РФ. Автором получено 9 патентов на изобретение, зарегистрированные в ФИПС. ^ Диссертация изложена на 584 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы, из них 127 отечественных и 1019 зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 20 таблицами и 27 рисунками. ^ Материалы и методы исследований Переживающие срезы мозга, их характеристика, приготовление и инкубация в искусственной цереброспинальной жидкости В данном исследовании была использована техника работы на переживающих срезах мозга, уникальные характеристические особенности которых обусловлены морфологической, физиологической и нейрохимической идентичностью среза целому мозгу (Mokrushin, Emelianov, 1991; 1993; Mokrushin, 2001; Pirumov et al., 2001). Срезы обонятельной коры характеризуются четко выраженным афферентным входом – латерального обонятельного тракта (ЛОТ), правильной 3-слойная внутрикорковой организацией, возможностью имитировать электрической стимуляцией ЛОТ поток афферентной импульсации в этих волокнах как в целом организме и одновременно регистрировать и анализировать различные, но взаимосвязанные нейрофизиологические процессы. Техническим преимуществом является возможность специфицировать инкубационную среду, рН, температуру, газовый состав, не требуется применение анестетиков и других чужеродных веществ и т.д. Эксперименты были проведены на переживающих тангенциальных срезах обонятельной коры мозга крыс-самцов линии SHR (виварий Института физиологии им. И.П. Павлова РАН) с устойчивой гипертензией (систолическое давление 180,0 ± 7,0 мм рт. ст.) в возрасте 4-х месяцев, весом 150-180 г. В работе использовали переживающие срезы, взятые от 290 животных. В качестве контроля были исследованы такие же срезы обонятельной коры мозга крыс линии Вистар с нормальным артериальным давлением (120,0 ± 4,0 мм рт. ст.). Артериальное давление у крыс определялось при помощи манжеты с датчиками давления, укрепленной на хвосте. Переживающий срез мозга представляет собой небольшой кусочек нервной ткани, приготовленный при помощи специальных устройств (Митюшов и др., 1986; Мокрушин, Мусящикова, 1989), размером обычно 10 х 10 мм и толщиной от 100 до 500 мкм. Животных декапитировали при помощи специального ножа – гильотины. При помощи хирургических инструментов головной мозг быстро извлекался и помещался на фильтровальную бумагу, покрывающую металлический столик, охлажденный до + 4о С. Скальпелем по средней линии, мозг рассекался на две половины, аккуратно переворачивался так, чтобы обонятельная кора была сверху. Кисточкой срез переносили во флакон с искусственной цереброспинальной аэрированной жидкостью, объемом 1 мл следующего состава (мМ): NaCl – 124; KCl – 5,0; CaCl2 – 2,6; KH2PO4 – 1,24; MgSO4 – 1,2; NaHCO3 – 3,0; глюкоза – 10; трис-HCl –23. Раствор тщательно насыщался кислородом, температура поддерживалась на уровне 37 0С, рН – 7,2 – 7,3. Осмомолярность изотонической среды составляла 308 – 310 осм/л. Длительность всей процедуры приготовления среза от момента декапитации до его помещения в среду обычно составляла 1 – 1,5 мин. После помещения среза во флакон газовую атмосферу над жидкостью со срезом заменяли на кислород, продуванием в течение 1 мин. Флакон со срезом помещали в аппарат Варбурга с частотой 120 качаний в минуту и температурой 370 С, где срез преинкубировали до его помещения в регистрирующую камеру. Инкубационную среду со срезом меняли дважды через 1 и 3 часа преинкубации с тем, чтобы удалить из среды остатки разрушенных клеток и их метаболитов, после этого срезы использовали для электрофизиологического исследования. ^ Биоэлектрическая активность нейронов в срезах определяли в электрофизиологической установке, которая включает в себя комплекс устройств и приборов, которые можно условно разделить на две части. Первая – предназначена для электростимуляции и регистрации нейрофизиологических процессов в срезах. Вторая – включает в себя комплекс приборов и устройств, для длительного сохранения нормальной жизнедеятельности срезов. Срезы помещались в специальной камере и непрерывно перфузировались инкубационной средой со скоростью 1мл/мин. Атмосферу над срезом в камере заменяли на увлажненный и подогретый кислород. Фокальные потенциалы (ФП), возникающие в указанных структурах при раздражении латерального обонятельного тракта (ЛОТ) имеют типичную конфигурацию. Начальное часто двухфазное колебание, является суммарным потенциалом действия ЛОТ (ПД ЛОТ). Этот потенциал отражает прохождение возбуждения по волокнам ЛОТ и является пресинаптическим компонентом ФП. Вслед за ним последовательно возникает комплекс постсинаптических потенциалов. Первый из них суммарный возбуждающий постсинаптический потенциал (для краткости в дальнейшем – ВПСП). Он гетерогенен и состоит из раннего и отставленного компонента. При его генерации активируются АМПА подтип глутаматных рецепторов. Он обозначается как АМПА ВПСП. Выемка положительной полярности на нисходящей фазе этой волны – быстрый ТПСП (ТПСПб). Этот потенциал отражает активацию ГАМКА рецепторов. Затем регистрируется медленная волна негативной полярности, которая генерируется НМДА рецепторами, её обозначают как НМДА ВПСП. После этого потенциала вновь развивается волна положительной полярности – медленный ТПСП (ТПСПм). Генез ТПСПм связан с активацией ГАМКБ рецепторов и кальций-зависимых калиевых токов. В работе измерялись амплитуды компонентов, составляющих ФП от изолинии до пика. Ортодромное электрическое раздражение латерального обонятельного тракта (ЛОТ) производилось стимулами прямоугольной формы, длительностью 0,1 мс, интенсивностью 1 – 3 В от стимулятора ЭСУ-1 и изолирующего блока через платиновые биполярные электроды, изолированными лаком по всей длине за исключением кончиков. Последние электролитически затачивались. Межэлектродное расстояние было 0,5 мм. В срезах регистрировались ФП при помощи стеклянных микроэлектродов, заполненных 1 М NaCl с 2 % агар-агаром, сопротивлением 1-5 мОм. Точка регистрации локализовалась в фокусе максимальной активности. При помощи шагового микроманипулятора микроэлектрод погружался на глубину 270-300 мкм от поверхности среза. Индифферентный электрод (толстая серебряная хлорированная проволока) располагался в камере в перфузионном растворе рядом со срезом. Электрические сигналы с электрода подавались на выносной блок истокового повторителя усилителя биопотенциалов (НТО). Усиленный сигнал подавался на аналого-цифровой преобразователь и далее на компьютер для оперативной регистрации и обработки сигналов. Сигнал записывался на жестком диске для последующего анализа. С помощью специально разработанной программы анализировались отдельные компоненты ФП: суммарный потенциал действия волокон ЛОТ, АМПА и НМДА – компоненты ВПСП, а также поздний ТПСПм. С тем, чтобы стандартизировать условия проведения опытов, применяли элементы управляемого эксперимента. Способы приготовления аутокрови, проведение процедуры аппликации на переживающие срезы мозга (моделирование геморрагического инсульта) и электрофизиологическое исследование Исследования с моделированием геморрагического инсульта проведены на линии спонтанно гипертензивных крыс SHR. Аутологичная кровь забиралась из сонных вен крыс в процессе приготовления переживающих срезов обонятельной коры мозга. Кровь собиралась в пенициллиновые флаконы в объеме 1 - 3 мл и к ней добавляли 10 - 30 мкл гепарина (5000 ЕД/1мл) (Россия). Все флаконы помещались в холодильник и хранились при температуре + 40 С до тестирования. Для изучения влияния компонентов крови (плазма, форменные элементы) на отдельные компоненты глутаматергической и тормозной ГАМКергической синаптических передач применяли разделение крови методом центрифугирования. С этой целью была использована центрифуга ЭЛЕКОН ЦЛМН-Р10-01 (Россия). Для отделения суммарных форменных элементов крови от плазмы использовалась скорость вращения 2000 мин–1 в течение 30 мин. Для получения фракции эритроцитов применялась скорость вращения 2500 мин–1 в течение 40 – 50 мин. Полученные отдельные фракции крови хранились в холодильнике в течение 2 – 3 час при температуре + 40 С до начала их тестирования. При этих условиях получались три фракции: «тяжелая», «средняя» и «легкая». Микроскопический анализ этих фракций показал, что «легкая» фракция представляла собой аутогенную плазму, «средняя» фракция – взвесь тромбоцитов и лейкоцитов в плазме, с небольшим количеством эритроцитов. «Тяжелая» фракция состояла, в основном, из эритроцитарной массы. При электрофизиологическом исследовании срез сначала в течение 15 – 20 мин омывали контрольной средой и в нем регистрировали ФП, вызванные электрической ортодромной стимуляцией ЛОТ (одиночные импульсы, интенсивностью 1 – 3 В, с интервалом 5 мин). Усредненная стабильная амплитуда этих ФП являлась контролем. После снятия контрольных показателей срез начинали омывать целой кровью или ее отдельными компонентами. Для определения изменений возбудимости среза в этот период в нем регистрировали ФП, возникающих при стимуляции ЛОТ электрическими одиночными импульсами с теми же параметрами, как и в контроле. Исследовали действие аутокрови при разных разбавлениях: была использована целая кровь, а также инкубационная среда, с содержанием крови 30, 20, 10, 6 и 1 процента от объема. Этими растворами перфузировали срез мозга в течение 25 – 40 мин, продолжая регистрировать вызванные ФП. Подача кислорода к срезу в это время прекращалась. Затем срезы отмывали в течение 15 мин и продолжали регистрировать параметры ФП, при этом перфузию срезов осуществляли нормоксическим раствором. При изучении эффектов отдельных компонентов крови отдельные фракции аутокрови растворялись в инкубационной среде в соотношении: 50 мл среды + 1,5 мл кровь. Этим раствором перфузировали переживающий срез в течение 25 – 40 мин, продолжая регистрировать вызванную биоэлектрическую активность клеток. Исходные параметры ФП сопоставляли с их параметрами при аппликации целой, разбавленной аутокрови и отдельных ее компонентов, определяя степень повреждения механизмов электрогенеза. Сравнение исходных параметров ФП с параметрами после отмывания позволяло оценить возможность восстановления биоэлектрической активности нервных клеток в период раннего воздействия крови на нейроны (первые 40 мин). Применение другого способа моделирования геморрагического инсульта позволяло исследовать биоэлектрическую активность нейронов при контакте с кровью (сгустком крови) в срок до 7 часов. При этом срезы обонятельной коры гипертензивных крыс после приготовления помещали в стеклянные сосуды с аутокровью (без гепарина) объемом 1 мл, где они находились в течение 60 – 420 мин. В определенные интервалы времени (60, 120, 180, 240, 300 и 360 мин) срезы извлекали из аутокрови и помещали в перфузионную камеру. Срезы отмывали инкубационной средой от аутокрови и в них регистрировали ФП, вызываемые электрической стимуляцией проксимального конца ЛОТ. Сопоставляя параметры активности клеток после воздействия аутокрови с их контрольными значениями (без воздействия крови), полученными на отдельной группе срезов, определяли степень повреждения нейронов и оценивали возможность их восстановления. Для изучения возможных протективных эффекта гепарина переживающие срезы обонятельной коры мозга выдерживали с гепарином натрия (2,5 мл гепарина в концентрации 5000 ЕД /мл на 50 мл инкубационной среды) в течение 15 мин. Затем среду со срезом заменяли на аутокровь объемом 3 мл для моделирования геморрагического инсульта, в которой они находились в течение 360 мин. После этого срезы помещали в перфузионную камеру для отмывания их от аутокрови и для регистрации компонентов ФП, возникающих в ответ на электростимуляцию ЛОТ. ^ Ввиду того, что срезы мозга при нахождении в инкубационной среде и нормальной оксигенации раствора увеличивают свой вес (Митюшов и др., 1986; Brahma et al., 2000; Hrabetova et al., 2002), мы первоначально определяли набухание срезов в контрольной и нормоксической среде при 370 С в течение 360 – 420 мин и сравнили два использованных нами способа определения набухания срезов (Митюшов и др., 1986; Hrabetova et al., 2002). Различия в значениях набухания с использованием двух методов оказалось недостоверным, степень набухания срезов с использованием первого метода составляла в среднем 8,1 % и 11,2 % - второго. Поэтому в дальнейших использовали упрощенный способ, когда срезы, взятые в разные интервалы времени, обсушивались в течение 1-2 с на фильтровальной бумаге и взвешивались на торсионных весах типа ВТ-500. Процедура взвешивания занимала не более 10 с. Далее срезы вновь помещались в виалы с контрольной инкубационной средой на разные интервалы времени или в виалы, содержащие 1 мл аутокрови (без гепарина), на те же сроки потом извлекались из виал, обмывались контрольной средой, обсушивались на фильтровальной бумаге и вновь взвешивались. Набухание срезов определялось по разнице веса среза после инкубации в аутокрови и веса среза после инкубации в контрольной среде (мг). Для изучения вовлечения глутаматных рецепторов в процесс набухания (развития отека) в срезах обонятельной коры после инкубации с аутокровью были использованы специфические блокаторы АМПА глутаматных рецепторов - DNQX (6,7–dinitroquinoxaline-2,3-dione – селективный блокатор этих рецепторов), НМДА рецепторов (25 мкМ) и APV (L-(+)-2-amino-5-phosphonopentanoic acid, L-(+)-2-amino-5-phosphonovaleric acid) (50 мкМ) и метаботропных глутаматных рецепторов подтипа mGlu 1, 5 – MCPG [(+)-α-methyl-(4-carboxyphenylgycine)] в концентрации 100 мкМ (Sigma). Для этого срезы предварительно инкубировали в среде того же состава с добавлением блокаторов в течение 15 мин и далее помещали в аутокровь на определенные сроки времени. Для изучения противоотечных эффектов естественных антиоксидантов в модели геморрагического инсульта были исследованы витамины: витамин Е (альфа-Токоферол-ацетат)(0,7 мг/мл), витамин С (аскорбиновая кислота) в концентрации 1,2 мг/мл и витамина Д (акваДетрим) (0,5мл – 15000 ЕД). Кроме того, исследовали противоотечное действие L-карнозина (Sigma или Fluka) (в концентрации 5 мг на 1 мл инкубационной среды) и БТШ70 концентрации 1 мкг/мл. Для этого переживающие срезы обонятельной коры мозга выдерживали с данными соединениями в течение 30 мин, а затем помещали в аутокровь на 360 мин. Статистическая обработка осуществлялась применением методов непараметрической статистики (Гублер, Генкин, 1969) с использованием U-критерия Вилкоксона-Манн-Уитни, а также статистической компьютерной программы Excel 2003. ^ Анализ функционирования глутаматергической и гамкергической синаптических систем в обонятельной коре гипертензивных крыс в сравнении с нормотензивными крысами. Для достижения поставленных в работе задач были использованы спонтанно гипертензивные крысы линии SHR. Эти животные также используются в качестве экспериментальной модели для изучения известного клинического феномена – дефицита внимания у детей с ювенильной гипертензией. Крысы этой линии характеризуются тем, что устойчивая гипертензия у них формируется в возрасте 3 – 4 недель, и высокие показатели систолического и диастолического артериального давления стабильно удерживаются на протяжении всей жизни. Устойчивая гипертензия в значительной степени влияет на функционировании различных отделов мозга и является одной из главных причин возникновения ишемических и геморрагических инсультов мозга. В настоящей работе проведено сравнение базисных характеристик возбуждающей глутаматергической и тормозной ГАМК-эргической синаптических трансмиссий в переживающих срезах обонятельной коры мозга гипертензивных крыс линии SHR и крыс линии Вистар, использованные в качестве контроля. Кроме того, были исследованы эффекты, вызываемые аппликацией L-глутамата, а также развитие процессов научения в переживающих срезах мозга крыс этих линий. Отдельная группа срезов обонятельной коры мозга нормальных и гипертензивных крыс была использована для исследования эффектов экзогенной аппликации L-глутамата (Sigma, США) в концентрации 1 мМ, которая, как показали специально проведенные эксперименты, индуцирует небольшую, но стабильную активацию глутаматных рецепторов, не вызывая токсических реакций нервных клеток (Мокрушин и др., 2005).  ^ Были установлены различия как по активности механизмов глутаматергической возбуждающей передачи, так и по активности ГАМКБ-зависимого тормозного механизма (рис.1). По сравнению с ФП нормотензивных крыс в срезах крыс линии SHR регистрировались ФП с кратковременным АМПА компонентом ВПСП, который к тому же имел достоверно меньшую амплитуду, чем ФП нормотензивных крыс. НМДА компонент ВПСП гипертензивных крыс был в два раза меньшей амплитуды и большей длительности, чем НМДА компонент ВПСП в срезах нормотензивных крыс. Амплитуда ТПСПм в срезах гипертензивных крыс имела в два раза большую величину, и эти различия были достоверны.Рис. 1. Фокальные потенциалы, регистрируемые в срезах обонятельной коры мозга гипертензивных и нормотензивных крыс. ^ Существенной отличительной особенностью ФП гипертензивных крыс было наличие позднего негативного потенциала с амплитудой 60 мкВ, который возникал после завершения ТПСПм. Этот потенциал при действии кратковременной аноксии (1 – 2 мин) исчезал. По этой характеристике, а также по латентному периоду генерации этого потенциала и его амплитудно-временным параметрам его можно рассматривать как проявление активности глиальных клеток обонятельной коры. Следует отметить, что в срезах нормотензивных крыс такой потенциал не регистрировался. Эти данные свидетельствуют о значительном возбуждении при гипертензии не только нейронов, но и глии. ^ . В обонятельной коре мозга основным возбуждающим медиатором является L-глутамат. Были проанализированы реакции отдельных компонентов глутаматергической синаптической передачи на аппликацию L-глутамата в концентрации 1 мМ в срезах гипертензивных и нормотензивных крыс. Аппликация L-глутамата на срезы нормотензивных крыс сопровождалась небольшим увеличением амплитуды АМПА ВПСП (без изменения его длительности), и возрастанием, как амплитуды, так и длительности НМДА ВПСП. Эти реакции свидетельствуют о нормальной чувствительности АМПА и НМДА подтипов глутаматной синаптической передачи к натуральному медиатору в нервной системе нормотензивных крыс. В срезах гипертензивных крыс реакции ФП на аппликацию ^ -глутамат вызывал снижение амплитуды, как АМПА, так и НМДА компонентов ВПСП глутаматергической передачи. Причем НМДА ВПСП “отделялся” от АМПА ВПСП глубокой выемкой, появление которой указывает на активацию прямого торможения в кортикальных структурах, опосредуемого активацией ГАМКА механизмов (Мокрушин, 1997). Кроме того, сам НМДА ВПСП “делился” на две части, что, вероятно, свидетельствует об активации двух разных популяций НМДА рецепторов, ответственных за генерацию НМДА ВПСП. Более того, такие изменения профилей НМДА ВПСП могут указывать на то, что для гипертензивных крыс используемая концентрация экзогенного L-глутамата становится избыточной. Полученные факты доказывают, что чувствительность АМПА и НМДА подтипов глутаматных рецепторов в срезах гипертензивных крыс на естественный медиатор снижена по сравнению с чувствительностью глутаматных рецепторов в срезах нормотензивных крыс, то есть развивается десенситизация этих рецепторов. По-видимому, мозг гипертензивных крыс имеет более низкий потенциал для трансляции сигналов по глутаматергическим структурам, по сравнению с мозгом нормотензивных крыс. Следовательно, протекание процессов научения и, вероятно, формирования памяти у гипертензивных крыс будет ухудшаться. М. Лехохла и соавторы (Lehohla et al., 2001) обнаружили, что поглощение ионов кальция кортикальными нейронами в срезах мозга SHR крыс было меньшим, чем в срезах мозга крыс линии Вистар. Эти данные подтверждают наши результаты об ухудшении функционирования НМДА рецепторов в мозге гипертензивных крыс. Однако впоследствии было выявлено, что аппликация агониста НМДА рецепторов – ^ -аспартата, сопровождалась одинаковыми трансмембранными потоками кальция в кортикальных нейронах у крыс обеих линий (Lehohla et al., 2004), что указывает на одинаковый уровень функционирования НМДА рецепторов в обеих линиях крыс, тогда как аппликация глутамата в наших экспериментах сопровождалась снижением активности этих рецепторов. Более того, в отличие от наших данных аппликация глутамата на срезы префронтальной коры мозга SHR крыс индуцировала большую активацию АМПА рецепторов, по сравнению с нормотензивными крысами (Russel, 2001), а в наших экспериментах такое воздействие приводило к снижению активности этих рецепторов. Такие противоречия могут быть объяснены тем, что на начальной стадии развития гипертензии негативные изменения функционирования АМПА и НМДА рецепторов еще не являются необратимыми. Нестабильностью возникающих отрицательных изменений в деятельности нейрональных структур можно объяснить факт выделения в равных количествах глутамата и ГАМК из синапсов кортикальных нейронов в мозге крыс линии SHR и линии Вистар. Однако с возрастом негативные проявления функций НМДА как, очевидно, и других рецепторов, стабилизируются. Молекулярной основой таких нарушений, как можно полагать, являются изменения в экспрессии и обмене отдельных белковых компонентов рецепторных структур. НМДА рецептор является тетрамерным белковым комплексом, состоящим из нескольких субъединиц. Установлено, что экспрессия главных субъединиц НМДА рецепторов оказалась сниженной в кортикальных структурах крыс линии SHR по сравнению с этими же мозговыми структурами крыс линии Вистар. Причем с возрастом отмечается тенденция к дальнейшему снижению экспрессии главных субъединиц НМДА комплекса в мозге у крыс линии SHR по сравнению с линией Вистар (Edwards et al., 2004). ТПСПм в срезах мозга SHR крыс также изменялись под действием экзогенного L-глутамата. Амплитуда этих потенциалов снижалась в два раза и достоверно сокращалась их длительность по сравнению с таковыми у нормотензивных крыс. Эти факты можно интерпретировать как развитие десенситизации глутаматных рецепторов, локализованных на вставочных тормозных интернейронах, обеспечивающих генерацию ТПСПм. Активность глиальных клеток, измеряемая по наличию и амплитуде позднего негативного потенциала, в ответ на аппликацию L-глутамата возрастала на 105 % по сравнению с изменением активности этих клеток на электрическую стимуляцию без действия глутамата. Это, безусловно, указывает на то, что активация глиальных клеток направлена против глутаматной эксайтотоксичности, развивающейся в мозге гипертензивных крыс. При отмывании срезов от L-глутамата наблюдалось восстановление параметров АМПА ВПСП и достоверное увеличение на 75 % амплитуды и длительности НМДА ВПСП. Вместе с тем амплитуда ТПСПм не восстанавливалась, а сохранялась такой же, как и при действии L-глутамата, что, вероятно, свидетельствует о необратимом нарушении функционирования части ГАМКБ-эргических тормозных нейронов. Активность глиальных клеток при отмывании снижалась на 87 %, что, вероятно, говорит об обратимости нарушений. Все это свидетельствует о важной роли глии в сохранении устойчивости нервной ткани. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям