Молекулярно-генетические механизмы врожденного иммунитета на уровне слизистых оболочек при патологии инфекционного генеза 14. 03. 09 Клиническая иммунология, аллергология

^ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Всемирная организация здравоохранения ставит инфекционные заболевания на одно из ведущих мест среди главных причин смертности (после ишемической болезни сердца, инсульта и др.) [ВОЗ, 2009]. По данным ВОЗ, ежегодно в мире умирает около 51 млн. человек, треть из них – от инфекционных болезней. Инфекционные заболевания остаются актуальной проблемой не только для развивающихся, но и для благополучных стран. В Российской Федерации ежегодно регистрируют около 35 млн. случаев инфекционных болезней [Онищенко Г.Г., 2006; Пальцев М.А., 2007].

В последние годы, благодаря прогрессу таких научных дисциплин как молекулярная биология, генетика, иммунология и клеточная биология, происходит накопление знаний о механизмах развития различных инфекционных заболеваний, а также становится возможным их точная диагностика и прогнозирование. Известно, что состояние резистентности к инфекции формируется с помощью многочисленных реакций иммунной системы, основная функция которой заключается в распознавании и элиминации инфекционных агентов, а также продуктов их жизнедеятельности [Ярилин А.А., 1999; Хаитов Р.М., 2010; Ковальчук Л.В., 2010].

В последнее время все большее подтверждение получает гипотеза К. Janeway об исключительной важности системы врожденного иммунитета в защите от патогенов и в реализации начальных стадий реакций адаптивного иммунитета [Кокряков В.Н., 2006; Janeway, 2007; Лебедев К.А., 2008]. Клетки системы врожденного иммунитета распознают консервативные в эволюционном отношении молекулы, присущие одновременно большим систематическим группам микроорганизмов. Среди распознающих рецепторов системы врожденного иммунитета ключевая роль принадлежит Toll-подобным рецепторам (TLR). После взаимодействия TLR с лигандом происходит активация сигнальных путей, в результате которой продуцируются эффекторные молекулы, такие, как цитокины, противомикробные пептиды и др. При скоординированном функционировании факторов врожденного иммунитета в большинстве случаев происходит элиминация патогена. Однако гиперактивация или угнетение механизмов врожденного иммунитета в свою очередь может приводить к развитию патологического процесса [Kopp E., 2003; Назаров П.Г., 2005; Макаров О.В., 2007; Семенов Б.Ф., 2009].

Исследования по оценке патологических состояний с точки зрения функционирования молекулярных механизмов системы врожденного иммунитета фактически начались совсем недавно [Семенов Б.Ф., Зверев В.В., 2007; Ковальчук Л.В., 2007].

Общепризнано, что развитие большинства инфекций, с которыми встречается организм, начинается с проникновения патогенов через барьерные ткани, в том числе через слизистые оболочки. Известно, что слизистые, являясь физиологическим барьером, участвуют в развитии защитных реакций врожденного иммунитета в ответ на патогены, в инициации реакций адаптивного иммунитета, в формировании толерантности к комменсалам, а также в развитии патологических процессов (аллергии, острого и хронического воспаления и др.). Таким образом, в настоящее время клетки (в том числе эпителиальные) слизистых оболочек рассматриваются в качестве одного из факторов врожденного иммунитета [Хаитов Р.М., 2005; Лебедев К.А., 2008; Artis D., 2008; Coombes J.L., 2008; Семенов Б.Ф., 2009; Ярилин А.А., 2010].

Комплексное исследование вышеперечисленных процессов при патологии инфекционного генеза (урогенитальной инфекции, внутриутробной инфекции, вирусном кератите и др.) позволит приблизиться к пониманию роли механизмов врожденного иммунитета и определить тонкую грань между процессами функционирования системы врожденного иммунитета, обеспечивающими защиту организма, и процессами, приводящими в конечном итоге к развитию патологии. Выяснение роли Toll-подобных рецепторов, цитокинов и противомикробных пептидов, экспрессированных в слизистых при инфекционных заболеваниях позволит более точно провести своевременную диагностику, заблаговременно спрогнозировать характер течения заболевания, изучить патогенетические аспекты развития патологии, а также обосновать выбор адекватной терапии.

Оценка системы врожденного иммунитета слизистых оболочек с использованием современных методов молекулярной биологии и генетики даст возможность выявить маркеры внутриутробного инфицирования плода, преждевременных родов и других патологических состояний. В дальнейшим накопленный фундаментальный базис позволит научно обосновать и разработать новые подходы к выбору адекватной терапии инфекционных заболеваний с учетом индивидуальных особенностей иммунной системы.

^ Цель работы - комплексное исследование на генетическом, экспрессионном и функциональном уровнях компонентов системы врожденного иммунитета (Toll-подобных рецепторов, противомикробных пептидов, цитокинов) в слизистых оболочках организма при патологии инфекционного генеза, а также разработка на основе полученных данных прогностических и диагностических критериев течения инфекционного процесса.

^ Задачи исследования:

1. Разработать системы ПЦР в режиме реального времени для количественной оценки экспрессии генов Toll-подобных рецепторов (TLR1, TLR2, TLR4, TLR6, TLR9), противомикробных пептидов (HNP-1, HBD-1, HBD-2), цитокина (ФНО) и других молекул (NF-kB, каспазы 3, каспазы 8, ингибиторов каспаз FLIP и XIAP).

2. С помощью разработанных тест-систем на экспериментальных моделях инфекционного процесса in vitro и in vivo определить уровни экспрессии генов молекул врожденного иммунитета (TLRs, противомикробных пептидов, цитокинов).

3. Изучить изменение уровней экспрессии генов TLRs, дефенсинов и продукции цитокинов при урогенитальной инфекции (УГИ), внутриутробной инфекции (ВУИ) и преждевременных родах и определить их роль как возможных маркеров невынашивания беременности и реализации ВУИ.

4. Оценить значимость активации апоптоза в клетках плаценты, как одного из механизмов развития преждевременных родов у беременных женщин с урогенитальной инфекцией.

5. Изучить ассоциацию полиморфных маркеров, локализованных в генах TLR2, TLR4, TLR9 и HBD-1, с риском развития преждевременных родов, внутриутробного инфицирования плода.

6. Определить диагностическую значимость выявленных изменений уровней экспрессии генов TLRs, противомикробного пептида HBD-1 в клетках слизистой оболочки урогенитального тракта и продукции цитокинов у больных хроническим простатитом.

7. Изучить роль сигнального рецептора TLR9 и противомикробного пептида -дефенсина 2 в эпителиальных клетках роговицы в развитии герпетического кератита.

8. Обосновать комплексный подход к оценке TLR-опосредованных механизмов врожденного иммунитета на уровне слизистых оболочек, основанный на 1) изучении полиморфизма генов TLR и противомикробных пептидов, 2) определении уровня их экспрессии и 3) функциональной активности для выявления маркеров течения инфекционного процесса.


^ Научная новизна

- Впервые представлен комплексный подход к оценке функционирования системы Toll-подобных рецепторов, основанный на изучении: экспрессии генов TLRs, транскрипционных факторов, эффекторных молекул (цитокинов, противомикробных пептидов и др.).

- Впервые показано, что гиперэкспрессия TLR2 в эпителиальных клетках цервикального канала беременных женщин с урогенитальной инфекцией, сопровождающаяся повышенной продукцией ИЛ-8, ИФН и сниженной экспрессией HBD-1, приводит к реализации внутриутробного инфицирования плода и к преждевременным родам. Выявлены новые маркеры ранней диагностики неразвивающейся беременности, преждевременных родов, внутриутробного инфицирования плода при урогенитальной инфекции, основанные на оценке уровня экспрессии генов TLR2, HBD-1 в эпителиальных клетках цервикального канала и HNP-1-3 в сыворотке периферической крови.

- Впервые в клетках плаценты при преждевременных родах выявлен дисбаланс в экспрессии генов каспазы 3, каспазы 8 и ингибиторов апоптоза FLIP и XIAP, который заключается в повышении уровня экспрессии генов каспаз, коррелирующих с увеличенной экспрессией генов TLRs и со сниженной экспрессией генов ингибиторов каспаз.

- Впервые исследована ассоциация полиморфных маркеров Arg677Trp и Arg753Gln в гене TLR2, Asp299Gly и Thr399Ile в гене TLR4, 2848G/A в гене TLR9, G(-20)A, C(-44)G, и G(-52)A в гене DEFB1 с урогенитальной инфекцией у беременных, преждевременными родами, реализацией внутриутробного инфицирования плода. Показана ассоциация аллеля A(-20) и генотипа GG (-52) гена DEFB1 с увеличением уровня экспрессии -дефенсина 1 в эпителиальных клетках цервикального канала при выше указанной патологии.

- Впервые определены прогностические критерии иммунодефицитного состояния при хроническом простатите на основе данных о снижении уровня экспрессии TLR2 в эпителиальных клетках уретры и дисбалансе про- и противовоспалительных цитокинов в секрете простаты.

- Впервые изучены показатели системы врожденного иммунитета в конъюнктиве и роговице глаза у детей - уровень экспрессии распознающего рецептора TLR9 и противомикробного пептида HBD-2, обеспечивающего противовирусную и антибактериальную защиту тканей глаза. Установлено, что комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов приводит к нормализации экспрессии гена TLR9 в эпителиальных клетках роговицы глаза детей с древовидным герпетическим кератитом и оказывает положительный терапевтический эффект.

- Получены новые данные по межлинейным различиям в развитии вирусного кератита и экспрессии гена TLR9 в роговице мышей линий С57BL/6 и BALB/с.

- На клетках Vero изучена экспрессия генов TLR1, TLR2, TLR4, TLR9 и др. и определена функциональная активность клеток по выработке цитокинов в ответ на воздействие различных патогенов (вируса простого герпеса (ВПГ), C.albicans и др.).


Практическая значимость

Разработаны и внедрены в клиническую практику системы на основе ПЦР-РВ для определения экспрессии генов TLRs, цитокинов и противомикробных пептидов в качестве прогностических и диагностических критериев у женщин с преждевременными родами, реализацией внутриутробного инфицирования плода, а также у пациентов с хроническим простатитом и герпетическим кератитом.

С использованием разработанных систем определены маркеры риска развития преждевременных родов, внутриутробного инфицирования плода. Комплекс маркеров на основе исследования экспрессии генов TLRs, дефенсинов, продукции противомикробных пептидов и цитокинов в цервикальном канале женщин, позволяет с большей долей вероятности прогнозировать преждевременные роды и развитие внутриутробного инфицирования плода. При гиперэкспрессии TLR2 более, чем в 5 раз и снижении экспрессии HBD-1 (в 2,5 раза и более) в 70% случаев наблюдаются преждевременные роды.

Определена панель полиморфных маркеров генов-кандидатов (TLR2, TLR9 DEFB-1) реализации внутриутробного инфицирования плода, преждевременных родов, что позволяет оценить риск развития патологического процесса во время беременности.

Разработаны экспериментальные системы оценки экспрессии генов и эффекторных молекул в культурах клеток (Vero, HeLa), что позволяет исследовать действие препаратов на компоненты врожденного иммунитета.

Внедрен новый метод лабораторной диагностики определения уровня экспрессии гена сигнального рецептора TLR9 в эпителиальных клетках роговицы и конъюнктивы при герпетическом древовидном кератите у детей. Обосновано применение препарата Суперлимф в комплексной терапии герпетических кератитов у детей, позволяющей снизить уровень осложнений и добиться нормализации экспрессии TLR9.


^ Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработаны системы для определения экспрессии генов молекул врожденного иммунитета Toll-подобных рецепторов (TLR1, TLR2, TLR4, TLR6, TLR9), противомикробных пептидов (HNP-1, HBD-1, HBD-2), цитокина (ФНОa) и других молекул (NF-kB, каспазы 3, каспазы 8, ингибиторов каспаз FLIP и XIAP) и апробированы в моделях инфекционного процесса in vitro и in vivo.

2. С использованием разработанных систем определены новые маркеры ранней диагностики неразвивающейся беременности, преждевременных родов при урогенитальной инфекции, внутриутробного инфицирования плода, основанные на оценке уровня экспрессии генов TLR2, HBD-1 в эпителиальных клетках цервикального канала и на ассоциации полиморфных маркеров генов, белковые продукты которых участвуют в реакциях врожденного иммунитета. Разработана концепция развития преждевременных родов, заключающаяся в гиперактивации TLR2-опосредованного апоптоза клеток плаценты. При преждевременных родах в клетках плаценты наблюдается дисбаланс в экспрессии генов каспазы 3, каспазы 8 и ингибиторов апоптоза FLIP и XIAP.

3. Развитие хронического простатита сопровождается снижением уровня экспрессии TLR2 в эпителиальных клетках уретры и дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов в секрете простаты.

4. При изучении уровня экспрессии распознающего рецептора TLR9 и противомикробного пептида HBD-2 в клетках конъюнктивы и роговицы глаза у детей, установлено, что комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат Суперлимф) приводит к нормализации экспрессии гена TLR9 в эпителиальных клетках роговицы глаза детей с древовидным герпетическим кератитом, а также снижает частоту осложнений при указанной патологии.

5. Разработан комплексный подход к оценке TLR-опосредованных механизмов врожденного иммунитета, основанный на изучении экспрессии генов TLR (при действии различных лигандов); сигнальных молекул и транскрипционных факторов; эффекторных молекул (цитокинов, противомикробных пептидов и др.). Анализ компонентов TLR-системы проведен на уровне полиморфизма генов, экспрессии мРНК, секреции эффекторных молекул.


^ Внедрение результатов работы

Результаты исследований, представленных в диссертационной работе, внедрены в учебный процесс студентов, ординаторов и аспирантов, а также курс лекций по повышению квалификации врачей в Российской медицинской академии последипломного образования, Смоленской Государственной Медицинской Академии и Медицинском институте Орловского государственного университета.

Применение исследования экспрессии генов TLRs представлено в Патенте на изобретение №2334233: «Способ прогнозирования преждевременных родов при урогенитальной инфекции». Официальный Бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам РФ №17 «Изобретения. Полезные модели» 20.09.2008 г.

Получено положительное решение о выдачи патента на изобретение (Заявка №2009108294/15(011092), дата подачи заявки 10.03.2009 г.).

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы доложены на заседании Бюро Отделения профилактической медицины РАМН (2009), Всероссийском научном Форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург 2004, 2006, 2007, 2009), Республиканской научной конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005), Международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2005, 2007, 2010), Российском Национальном Конгрессе «Человек и Лекарство» (Москва 2005, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010), Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006), Международной конференции «Генетика в России и в мире» (Москва, 2006), V конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической аллергологии и иммунологии» (Оренбург, 2006), Четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), 6-th Parnas Conference Molecular Mechanisms of Cellular Signalling (Poland, Krakow, 2007), Конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, посвященной 120-летию Н.И.Вавилова (Киев, 2007), 8-th John Humphrey advanced summer school in immunology: Immunology and Viral Infection (Москва, 2007), VI конференции иммунологов Урала (Ижевск, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), XXVII Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology (Barcelona, Spain 2008), 6-th European Congress of Reproductive Immunology (Москва, 2008), IV Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), X Международном Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», посвященном 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д.Адо (Казань, 2009), Съезде офтальмологов России (Москва, 2009), GA2LEN/EAACI Summer Allergy School (Great Britain, Norwich, 2009), 29-th Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology (Great Britain, London, 2010).

Апробация диссертации состоялась ___ мая 2010 года на заседании Ученого совета НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано в 68 печатных работы, в том числе 19 в изданиях, рекомендованных ВАК, материалы включены в монографию «Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет» // М. :«ГЭОТАР-Медиа». – 2007 и методическое пособие «Иммунология. Практикум.» // М. :«ГЭОТАР-Медиа». - 2010.

^ Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, главы «Обзор литературы», главы «Материалы и методы», 4-х глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 392 источника, из которых 105 отечественных и 287 зарубежных. Работа выполнена на 300 страницах машинописного текста, иллюстрирована 50 рисунками и 51 таблицей.


^ ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы

В работе использованы штаммы ВПГ-1 (VR-3) и ВПГ-2 (MS), полученные из Национальной вирусной коллекции (Великобритания). До начала экспериментов вирусы прошли 5-7 последовательных пассажей на культуре клеток Vero. Инактивированные образцы Candida albicans (АТСС 885-653) любезно предоставлены профессором Л.П. Блинковой (ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН).

Для стимуляции мононуклеарных клеток и нейтрофилов использованы антигены ВПГ [Королюк М.А., 2002] и лизат Candida albicans, а также липополисахарид (ЛПС) (Sigma, США), комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов - препарат Суперлимф («Центр иммунотерапии «Иммунохелп», РФ).

Для проведения экспериментов in vitro использованы культура клеток почек зеленой мартышки - Vero (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера, г.Санкт-Петербург) и культура клеток HeLa (аденокарцинома), которая любезно предоставлена к.б.н. Т.М. Парфеновой (ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф Гамалеи РАМН). В качестве культуральной среды использована среда DMEM (ПанЭко, РФ), содержащая 10% или 2% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (PAA Laboratories GmbH, Австрия).

Модели вирусного кератита и генитального герпеса были воспроизведены на мышах линий C57Bl/6 и BALB/c, самцах и самках, весом 18-19 г. Животные были получены из питомника «Андреевка» ГУ НЦБМТ РАМН (Москва, РФ) и содержались в виварии НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (на территории 1-й Дубровской ул., д. 15).

Получение и обработку клинического материала проводили в соответствии с методическими рекомендациями «Забор, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР - диагностики» Центрального НИИ эпидемиологии МЗ РФ (2004г.). В качестве клинического материала в работе использованы соскобы эпителиальных клеток из цервикального канала, соскобы эпителиальных клеток из уретры, соскобы клеток эпителия роговицы, ткань плаценты, сыворотка или плазма периферической крови, секрет предстательной железы.

^ Характеристика клинических групп

Исследования показателей в группе беременных женщин с физиологически протекающей беременностью и в группе женщин с урогенитальной инфекцией были проведены в 2004 – 2009 гг. совместно с сотрудниками кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета (заведующий кафедрой профессор, д.м.н., заслуженный врач РФ О.В. Макаров), на базе родильного дома при городской больнице №8 ДЗ г. Москвы (главный врач А.Б. Дуленков), на базе гинекологического отделения ГКБ №55 и женской консультации при родильном доме №10 (главный врач Е.П. Озимковская) и совместно с сотрудниками кафедры иммунологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (заведующий кафедрой проф. Л.В. Ковальчук, проф каф. Л.В. Ганковская) Большая часть исследований проведена в рамках совместной темы НИР №50в в период 2007-2010 гг.

Общее количество обследуемых женщин составило 409 человек, среди них 57 небеременных женщин (у 20 из которых определялась урогенитальная инфекция) и 352 беременные женщины. Возраст всех пациенток находился в интервале от 19 до 42 лет. Беременные женщины были разделены на две группы: на первом триместре (85 женщин) и на третьем триместре (267 женщин). В основную группу на первом триместре беременности входили женщины с неразвивающейся беременностью, закончившейся выкидышем на 5 – 13 недели гестации. Гиперандрогения была выявлена у 29% женщин, хронический цервицит – 10,5%, вирусная инфекция (ВПГ-2, ЦМВ) – 7,9%, хронический двусторонний сальпингоофорит – 23,7%. Группу сравнения составляли женщины с физиологически протекающей беременностью на сроке 5-13 недель. К критериям исключения пациентов из группы сравнения относили следующие показатели: гиперандрогения, маточные кровотечения, эндокринная патология, инфекционные и воспалительные заболевания, аутоиммунная патология.

Основная группа женщин, находящихся на третьем триместре, была разделена на две подгруппы: в первую входили 83 беременные женщины с вирусной инфекцией (ВПГ-2, ЦМВ), во вторую группу - 65 беременных женщин с урогенитальной инфекцией различной этиологии. Новорожденные от 20 матерей этой подгруппы имели локальные и системные проявления внутриутробной инфекции. Вторую подгруппу составили 45 беременных, с преждевременными родами без реализации ВУИ. Группу сравнения составили 25 беременных женщин с урогенитальной инфекцией, беременность которых закончилась своевременными родами. Контрольную группу составили 94 беременных с физиологически протекающей беременностью после своевременных родов с рождением здорового жизнеспособного ребенка. У всех женщин контрольной группы была исключена урогенитальная инфекция.

Исследования клинического материала у больных с диагнозом хронический простатит были проведены в 2006 – 2008 гг. совместно с сотрудниками кафедры урологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (заведующий кафедрой член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор Е.Б.Мазо). Определение уровней экспрессии генов в клетках слизистой уретры и исследование уровня цитокинов в сыворотке периферической крови и секрете предстательной железы проводили у 55 больных хроническим бактериальным простатитом, 55 больных хроническим абактериальным простатитом и 30 здоровых добровольцев (средний возраст больных составлял 25±4 года, здоровых - 20±2,1 года). У больных хроническим бактериальным простатитом выделено и идентифицировано 19 штаммов бактерий, из которых 68,4% грамположительных и 31,6% грамотрицательных. У больных хроническим абактериальным простатитом были выявлены Сlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealiticum. При этом у 40% больных отмечена смешанная инфекция.

Молекулярно-биологические исследования проведены в 2008 – 2010 гг. на базе кафедры офтальмологии педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ Росздрава в Морозовской детской городской клинической больнице г. Москвы (заведующий кафедрой член-корреспондент РАМН Е.И.Сидоренко). Материалом исследования служили соскобы клеток эпителия роговицы, полученные от 37 детей в возрасте от 2 до 14 лет. Дети были разделены на две группы: здоровые (n=23) и с диагнозом герпетический древовидный кератит (n=14).

Методы

^ Работа с культурами клеток. Пересев клеток (Vero, HeLa) проводили на 3-4 сутки [Лацис Р.В., 2000]. Для проведения опытов использовали 96-луночные плоскодонные планшеты (COSTAR, США). В каждую лунку вносили по 200 мкл клеточной суспензии (концентрация 200 тыс. клеток в 1 мл). Через 24 ч (48ч) инкубации при 37^оС в атмосфере СО₂ в лунках формировался монослой клеток. При проведении экспериментов использовали среду DMEM с 2% ЭСТ. Для определения жизнеспособности клеток использовали 0,2% раствор трипанового синего (Serva, США) в культуральной среде (маточный раствор) и 0,75М NaCl (ОАО Красфарма). Для оценки цитотоксического и цитопатического действия использовали краситель Neutral Red (1,11мг/мл) и витальный краситель МТТ (Sigma, США).

^ Заражение культуры клеток вирусами герпеса простого. Монослой клеток заражали вирусом (ВПГ-1, ВПГ-2) в дозе 0,1 ТЦД₅₀/кл. Клетки инкубировали в культуральной среде при 37С в атмосфере СО₂ до появления вирусиндуцированного цитопатического эффекта. Через 5 суток определяли титр вируса с помощью метода Рида и Менча [Reed L., Muench H.A., 1938].

^ Заражение мышей ВПГ. Самок мышей инфицировали ВПГ-2 внутрибрюшинно (или интравагинально) вводя им по 500 мкл (100 мкл) вируссодержащего материала. Для исследований были взяты соскобы из цервикального канала через 7 и 21 дней после инфицирования.

Для создания модели вирусного кератита мышам в конъюнктивальный мешок после скарификации роговицы стерильной иглой закапывали 3 мкл вируссодержащей жидкости (титр ВПГ-1 - 10⁵ ЦПД₅₀/0,1мл). Мышам группы сравнения в конъюнктивальный мешок после аналогичной травмы закапывали 3 мкл среды RPMI-1640. Интактным животным не наносили повреждений роговицы. Для определения уровня экспрессии генов TLR9 и BD2 методом ПЦР в режиме реального времени на 1-е, 3-и и 7-е сутки после скарификации осуществляли соскоб клеток роговицы.

^ Выделение нуклеиновых кислот из клеток. Выделение ДНК проводили по известным протоколам [Херрингтон С., 1999; Sambrook J., 2001]. Для выделения РНК использовали метод кисло-фенольной экстракции, а также использовали наборы “Рибо-сорб” (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, АмплиСенс, РФ) и RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия). Полученные образцы нуклеиновых кислот хранили при температуре минус 70⁰С.

^ Реакцию обратной транскрипции (ОТ) проводили по известным протоколам [Edwards K., 2004; Dennis Y.M., 2006]. Часть реакций обратной транскрипции проведена с использованием наборов: Sensiscript RT Kit (Qiagen, Германия) и Реверта (ИЛС, РФ) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.

^ Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Праймеры и зонды для ПЦР-РВ моделированы в программе Vector NTI 8,0, в соответствии с последовательностями мРНК исследуемых генов (из базы данных GenBank), и синтезированы в фирме Синтол (РФ). Для приготовления ПЦР-смеси в реакциях использовали Hot Start Taq DNA Polymerase (СибЭнзим, РФ), Hot Start Taq DNA Polymerase (Qiagen, Германия), TaqBead HotStart Polymerase (Promega, США), а также наборы «Набор реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I (Буфер Б)» (Синтол, РФ). Для определения экспрессии гена актина, помимо имеющейся системы, использовали «Набор реактивов для обнаружения и определения кДНК β-актина человека» (Синтол, РФ). Реакцию проводили согласно рекомендациям фирмы-производителя в амплификаторе АНК-32 или АНК-16 (Институт Аналитического Приборостроения РАН, РФ) при следующей программе: 50⁰С – 2 мин., 95⁰С – 10 мин., (56 - 68⁰С– 50 секунд, 95⁰С – 15 секунд) 40 циклов. Программное обеспечение приборов АНК-16 и АНК-32 позволяет получить данные по пороговому циклу.

^ Рестрикционный анализ. Для определения полиморфных маркеров Arg677Trp и Arg753Gln в гене TLR2 использовали рестриктазу AciI (Fermentas, Литва), Asp299Gly в гене TLR4 - рестриктазу Nco-I (Fermentas, Литва), Thr399Ile в гене TLR4 - рестриктазу Hinf-I (СибЭнзим, РФ). Температурный и временной режимы реакции полностью соответствовали таковым в инструкции фирмы-производителя.

^ Выделение клеток из периферической крови. Выделение мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови здоровых доноров и больных с урогенитальной инфекцией проводили по стандартной методике с помощью одноступенчатого градиента плотности фиколл-пака (=1,077; Pharmica, Швеция) по методу A.Boyum [Boyum, 1968]. Выделения нейтрофилов (НФ) из периферической крови проводили по стандартной методике [Ковальчук Л.В., 2010].

Стимуляция и культивирование мононуклеарных клеток и нейтрофилов проводили с помощью ЛПС (100, 10, 1, 0,1 и 0,01 нг на лунку), антигенов ВПГ-1, ВПГ-2 (100 мкл вируссодержащей жидкости на лунку), препарата Суперлимф (100 мкг/ на лунку), антигенов Candida alb и др. Через 3, 6, 12, 18, 24 часа определяли цитокины в культуральной жидкости методом ИФА.

^ Иммуноферментный анализ (ELISA). Концентрацию цитокинов в культуральной жидкости, слизи цервикального канала, секрете простаты или сыворотке, плазме периферической крови определяли с помощью коммерческих ИФА наборов: ИЛ-1, диапазон измерений 0-250 пг/мл (BioSource, Бельгия), ИЛ-4 (BioSource, Бельгия), ИЛ-6 - 0-500 пг/мл (Invitrogen, США), ИЛ-8 - 0-1000 пг/мл (BioSource, Бельгия), ИЛ-10 - 0-500 пг/мл (BioSource, Бельгия), ИЛ-12 - 0-500 пг/мл (Invitrogen, США), ФНО - 0-1000 пг/мл (BioSource, Бельгия), ТФР - 0-2000 пг/мл (BioSource, Бельгия), ИФН - 0-1000пг/мл (BioSource, Бельгия) и противомикробных пептидов HNP1-3 - 0-10000пг/мл (HBT, Нидерланды) и LL-37 (HBT, Нидерланды). В данных тест-системах использовали «сэндвич»-вариант твердофазного иммуноферментного метода с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Анализ проводили по предложенной производителями (BioSource, Invitrogen, HBT) методике. Для определения оптической плотности использовали анализатор иммуноферментных реакций (Пикон, РФ).

^ Статистические методы обработки данных. Статистический анализ проводили с использованием общепринятых статистических методов [Гланц С., 1999]. Применяли компьютерную статистическую программу BioStat, а также программу Excel. В таблицах и рисунках результаты представлены в виде Х. Для сравнения групп данных использовали параметрический критерий Стьюдента (t), а также непараметрические методы статистической обработки данных (критерий Манна-Уитни). Для статистической обработки результатов по качественным признакам (полиморфным маркерам - сравнение частот аллелей и генотипов) использовали критерий χ² и точный критерий Фишера. Достоверными считались различия при p0,05.