Нейрогенные стволовые клетки в восстановлении функций цнс у крыс с экспериментальным ишемическим инсультом
|
|
Скачать 296.13 Kb.
|
|
На правах рукописи ВОЛКОВ АНДРЕЙ ИГОРЕВИЧ НЕЙРОГЕННЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ В ВОССТАНОВЛЕНИИ ФУНКЦИЙ ЦНС У КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ИШЕМИЧЕСКИМ ИНСУЛЬТОМ 03.01.04 – Биохимия 14.03.03 – Патологическая физиология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук МОСКВА – 2011 Работа выполнена в ФГУ «Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию ^
Официальные оппоненты:
^ ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России Защита состоится « 4 » апреля 2011 года в 14:00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.01 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1. Автореферат разослан « 3 » марта 2011 года Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Н.Г. Потешкина ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ^ Инсульт занимает первое место как причина инвалидизации и второе место в структуре общей смертности населения [Е.И. Гусев, В.И. Скворцова, Л.В. Стаховская, 2007], что указывает на его высокую социально-медицинскую значимость. Благодаря изучению свойств нейрогенных стволовых клеток (НСК) открылись новые перспективы в разработке средств лечения инсульта. В многочисленных доклинических исследованиях продемонстрировано, что имплантация НСК оказывает терапевтическое действие при экспериментальном инсульте. Среди гипотез, объясняющих этот феномен, наибольшее внимание уделяется рассмотрению роли НСК в качестве продуцентов и индукторов выделения факторов роста в окружающих тканях. Экспрессия СК терапевтических количеств факторов роста (в частности, мозгового нейротрофического фактора, BDNF) продемонстрирована in vitro [García R et al., 2004; Harms K.M.et al., 2010]. Вместе с тем нет исчерпывающих доказательств, подтверждающих подобные свойства НСК in vivo. Исходя из этого, особую актуальность имеет вопрос, в какой мере имплантация НСК может изменить уровень экспрессии BDNF в мозге и отразится ли это на течении нейродегенеративного процесса и функциональном состоянии ЦНС крыс после моделирования ишемических инсультов? ^ Исследовать влияние имплантации нейрогенных стволовых (прогениторных) клеток на функциональное состояние ЦНС, биохимические показатели дегенеративных и репаративных процессов в ЦНС (нейроспецифические белки и факторы роста) после моделирования у крыс распространенного корково-подкоркового и локального коркового ишемических инсультов. ^
Впервые показано, что имплантации крысам в большую цистерну головного мозга или в периинфарктную область препаратов клеток без стволовых (прогенитоных) свойств в качестве клеточного контроля (Фкр) в остром периоде моделирования обширного фокального и коркового локального ишемических инсультов не оказывает положительного терапевтического эффекта по показателям состояния интегральных функций ЦНС и экспрессии BDNF. Впервые установлен терапевтический эффект имплантации клеточного препарата ЭНТкр в остром периоде моделирования обширного фокального и коркового локального ишемических инсультов. Показана специфичность действия клеток ЭНТкр в сравнении с «клеточным контролем» (Фкр). Впервые применен метод анализа уровней нейроспецифических белков (НСБ) в ликворе и крови для прижизненной верификации нейропротективного эффекта клеточной терапии ишемического инсульта у крыс. Впервые установлено, что восстановление функций контралатеральной передней лапы крыс после моделирования одностороннего инсульта в зоне ее представительства в коре головного мозга крыс по методу Колб и соавт. [Kolb et al., 2007] происходит существенно лучше при моделировании упомянутого инсульта в «доминантном» (тест захвата пищи) полушарии головного мозга, чем при операциях на «субдоминантном» полушарии. ^
- трансфузия в большую цистерну головного мозга клеток ЭНТкр в острой стадии ишемическом инсульта после ОСМА у крыс приводит к существенному восстановлению нарушенных двигательных и когнитивных функций ЦНС, а также снижению концентраций в ликворе и сыворотке крови маркёров нейродегенеративного процесса - NSE и GFAP. - имплантация ЭНТкр в периинфарктную зону крысам с экспериментальным ишемическим фокальным инсультом в сенсомоторной коре мозга оказывает стойкий положительный эффект на восстановление нарушенных функций контралатеральной передней лапы, что сопровождается 4-х кратным повышением экспрессии мРНК BDNF в местах имплантации клеток ЭНТкр в сравнении с местами имплантации Фкр (клеточный контроль) и более чем 20-кратным повышением – по сравнению с периинфарктной областью без имплантации клеток.
^ проведена на совместном заседании Проблемного учёного совета по Фундаментальной и прикладной нейробиологии, с участием сотрудников отдела Фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГУ «ГНЦССП» Минздравсоцразвития, кафедры Неврологии и нейрохирургии с курсом ФУВ, кафедры Нано- и биомедицинских технологий и кафедры Патологической физиологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава. Основные положения работы представлены в периодической научной печати и докладах на научных конференциях: Всероссийские научные школы-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2009, 2010); 14 Международный конгресс по психофизиологии “The Olympics of the brain”(Санкт-Петербург, 2008); Всероссийская школа-конференция «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008); конференция с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008); 8 Международный конгресс Европейской Коллегии по нейропсихофармакологии - 8th ECNP Regional Meeting (Москва, 2005). Публикации: по материалам диссертации опубликовано 19 работ, из них 6 статей в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК. ^ Диссертация написана на русском языке, изложена на 134 страницах и состоит из введения, 4 глав (обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения) выводов, практических рекомендаций и списка публикаций по теме диссертации. Диссертация содержит 22 рисунка и 6 таблиц. Библиография включает 32 источника отечественной и 205 – зарубежной литературы. ^ Материалы и методы Эксперименты выполнены на белых беспородных крысах - самцах (n=147) с исходной массой 300 - 350 г. Условия содержание животных и манипуляции с ними соответствовали требованиям приказов № 1179 МЗ СССР от 11.10.1983 г. и № 267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., а также международным правилам «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals». Хирургические манипуляции выполняли под наркозом (кетамин 100 мг/кг, диазепам 50 мг/кг, внутрибрюшинно). Модель корково-подкоркового ишемического инсульта вследствие окклюзии средней мозговой артерии (ОСМА) воспроизводили по методу Tamura в модификации Bederson [Bederson, 1986] (n=8). Контрольным животным осуществляли «ложную» операцию (ЛОСМА) (n=6).Функциональное состояние ЦНС оценивали с помощью неврологической шкалы Menzies [Menzies, 1992], К-теста [Лебедев С.В., Петров С.В., Блинов Д.В. и соавт., 2003] и теста пассивного избегания [Borlongan, 1998] в течение 12 недель. Односторонний корковый ишемический инсульт воспроизводили в зоне представительства передней лапы по методу Kolb и соавторов [Kolb et al., 2007]. Поверхностные сосуды коры удаляли стерильным ватным тампоном вместе с мягкой мозговой оболочкой в пределах прямоугольного костного окна с координатами от брегмы +3 и -1 мм и 1.5 и 4.5 мм от средней линии. Открытую поверхность мозга укрывали лоскутом твердой мозговой оболочки, рану ушивали. Антибиотики не использовали. В группе ложного коркового инсульта воспроизводили все этапы операции, за исключением удаления сосудов (n=6). Моторику передней лапы оценивали в течение 8 недель с помощью цилиндр-теста, вибрисс-теста и теста плавания согласно [Kolb et al., 2007] с незначительными модификациями. Функциональную асимметрию полушарий головного мозга передних лап определяли с помощью теста на захват пищи левой или правой передними лапами (reaching-test). В случае если крыса пользовалась одной лапой более чем в 29 попытках из 50, ее относили к особям, характеризующимся «доминантностью» соответствующего полушария головного мозга. Крыс, захватывающих корм одной из лап в 22-28 попытках из 50, относили к амбидекстрам и в дальнейших экспериментах не использовали [Betaneur C. etal, 1991]. Для анализа влияния функциональной асимметрии мозга на восстановление функции передней лапы корковый инсульт моделировали в доминантном и субдоминантном полушариях (по 12 крыс в каждой группе). Морфологические изменения мозга оценивали во всех экспериментальных группах в конце экспериментов (от 6 до 24 крыс в различных группах). Для выявления картины морфологической динамики зоны повреждения исследовали отдельные группы крыс с ОСМА, корковым инфарктом и животных соответствующих контрольных групп через 4 и 30 суток после операций (n=4 в каждой группе). Серийные срезы мозга (12 срезов между 4,7 мм и -5,3 мм относительно брегмы) окрашивали по методу Ниссля. Рассчитывали необходимые объёмы ткани мозга. Дефицит нервной ткани определяли, вычитая из объема вещества мозга неповрежденного полушария объем вещества поврежденной гемисферы. Клеточный препарат ЭНТкр получали согласно протоколу [YuanY. 2002], НСКовч – в соответствии с [Викторов И.В., 2007]. В качестве «клеточного контроля» использовали препарат крысиных фибробластов линии «Rat2» - аллогенные клетки без прогениторных свойств. Верификацию клеточного состава ЭНТкр и НСКовч проводили иммуноцитохимическим методом с использованием первичных антител к beta-tubulin 1:300 (Millipore), О4 1:100 (Millipore), nestin 1:100 (Millipore), GFAP 1:500 (собственного производства) и вторичных антител, конъюгированных с Alexa (Invitrogen, США). Препарат Фкр оценивали по способности поглощать коллагеновые флюоресцентные наночастицы (Invitrogen, США) из раствора. Жизнеспособность клеток in vitro перед имплантацией, определяли методом окраски трипановым синим. Она составляла не менее 90%. Клеточные препараты имплантировали сразу после воспроизведения ишемии в обеих моделях инсульта с помощью шприца со стальной иглой диаметром 0,6мм, соединённого с микропомпой (Stoelting, США), закрепленного в микроманипуляторе стереотаксического аппарата (Narishige, Япония). Скорость введенияи выведения иглы – 10 мкм/сек. Крысам с ОСМА клеточные препараты (ЭНТкр (n=6), Фкр (n=7)) вводили со скоростью 5 мкл/мин в количестве 2 млн в 20 мкл раствора физиологического солевого буфера (ФСБ) в большую цистерну мозга стереотаксическим методом [Лебедев С.В. и соавт, 2004]. Животным с корковым инсультом клеточные препараты (ЭНТкр (n=6), НСКовч (n=7), Фкр (n=12) в количестве 1 млн клеток в 12 мкл раствора ФСБ имплантировали в два участка коры мозга (проксимальнее и дистальнее границы зоны деваскуляризации) по координатам: а) +3 мм от брегмы, 2.3 мм от средней линии и 2.2 мм от поверхности мозга и б) -1 мм от брегмы, 2.7 мм от средней линии и 2.2 мм от поверхности мозга. Скорость введения клеточных препаратов составила 1 мкл/мин. Выведение иглы начинали через 5 мин после окончания имплантации препаратов. Исследование жизнеспособности имплантированных клеток проводили на отдельных группах крыс с ОСМА (n=6) и корковым ишемическим инсультом (n=14). Клетки перед имплантацией метили витальным красителем СFDA SE (карбоксифлуоресцеин-диацетатсукцинимидный эфир, Invitrogen, США) в соответствии с рекомендациями фирмы изготовителя. Через 4, 7 и 16 суток животных подвергали эвтаназии, готовили серийные коронарные срезы головного мозга и исследовали их методом флюоресцентной микроскопии. Для анализа НСБ в отдельных группах крыс с ОСМА (n=8), ЛОСМА (n=6) и ОСМА+ЭНТкр (n=14) осуществляли забор крови на 7, 14 и 30 сутки из бедренной вены (объем 1000 мкл) и ликвора на 14 сутки (объем 100 мкл) - путем пункции большой цистерны мозга стереотаксическим методом [Лебедев С.В. и соавт, 2004]. Образцы сыворотки крови и СМЖ хранили при -70оС до процедуры количественного анализа в них НСБ. Концентрации NSE и GFAP в СМЖ и сыворотке крови измеряли методом sandwich ELISA по A. Voller и соавт. в модификации В.П. Чехонина с соавт. [В.П. Чехонин, Т.Б. Дмитриева, Ю.А. Жирков, 2000]. Применяли собственные иммунохимические тест-системы на основе моноклональных антител (лаборатория иммунохимии ФГУ «ГНЦ ССП Росздрава»). Концентрацию НСБ в тестируемых пробах определяли по калибровочной кривой, построенной исходя из данных многократного их определения в растворах с известной концентрацией. Концентрации NGF в образцах крови, полученных через 7, 14 и 30 суток в группах крыс с ОСМА, ЛОСМА и ОСМА+ЭНТкр и образцах ликвора, выделенных через 14 суток после ОСМА, исследовали с использованием Sandwich ELISA kit компании Chemicon (Millipore) International согласно рекомендациям производителя. Для исследования экспрессии мРНК BDNF, отдельным группам крыс сразу после удаления сосудов коры мозга, в два участка коры, проксимальнее и дистальнее границы зоны деваскуляризации, имплантировали препараты НСК (ЭНТкр, n=4 и НСКовч, n=8) и Фкр (n=8), соответственно. Координаты мест введения клеток представлены выше. Через 7 суток крыс подвергали эвтаназии введением кетамина (200 мг/кг внутрибрюшинно). В пределах зон имплантации клеток и соответствующих участков мозга без клеточной имплантации (n=4) выделяли фрагменты ткани мозга размерами 1.5х1.5х2.4 мм и немедленно помещали их в жидкий азот. Осуществляли выделение тотальной РНК из биоптатов мозга и клеточных культур ЭНТкр, НСКовч и Фкр. Реакцию обратной транскрипции осуществляли с помощью набора для обратной транскрипции Superscript II (Invitrogen) в соответствии с рекомендациями производителя. В качестве праймера использовали олиго-dT18 праймер. Эффективность обратной транскрипции оценивали постановкой ПЦР с праймерами к GAPDH с последующей визуализацией продуктов реакции в 2% агарозном геле. Оценку результатов осуществляли стандартным методом [Burns T.C. et al. 2009], характеризующим кратность увеличения уровня экспрессии гена (в нашем случае BDNF) по отношению к уровню экспрессии гена «домашнего хозяйства клетки» (GAPDH). Вычисляли по формуле:  где Е – эффективность реакции, Ct – пороговый цикл в эксперименте и контроле. Для постановки эксперимента в качестве контроля использовали усредненное значение Сt для ткани периинфарктной области мозга крысы, выделенной на 7 день после моделирования инсульта. Для анализа клеточных препаратов в качестве контроля использовали усредненное значение Сt для культуры нормальных фибробластов крысы. При статистической обработке данных использовали t-критерий Стьюдента и непараметрический анализ Манна-Уитни и Крускала-Уоллиса. ^ Выживаемость крыс в группе ОСМА и группе ЛОСМА (контроль) составила 100 % на протяжении 3 месяцев эксперимента. Крысы с инсультом существенно отставали в прибавке массы тела от контрольных животных. Относительный прирост массы тела в конце эксперимента составил в группе ОСМА 86±11г, а в группе ЛОСМА – 131 8 г (p<0,01, критерий Стьюдента). Морфологический анализ срезов мозга, проведенный на 4-е сутки после ОСМА выявил зону паннекроза, охватывающую весь бассейн средней мозговой артерии с вовлечением обширных областей сенсомоторной коры, стриатума, лимбических структур (первичной обонятельной коры, энторинальной коры) и наружной капсулы. Вокруг зоны инфаркта отмечали скопление клеток глии и лейкоцитов (глиомезодермальный вал). Через 90 суток после ОСМА отмечалось образование кисты, глиальных рубцов, деформация структур полушария, расширение бокового желудочка на стороне инфаркта, который в части случаев был соединен с кистой. У крыс с ЛОСМА морфологических изменений мозга выявлено не было. Функциональные тесты – неврологическая шкала Menzies, К-тест и тест пассивного избегания – регистрировали грубый неврологический дефицит в группе ОСМА в течение всего периода наблюдения (рис. 4). В группе ЛОСМА у 2 крыс из 6 на 3 сутки после операции регистрировались легкие функциональные нарушения в 1 балл по шкале Menzies (тоническая флексия контралатеральной передней лапы при поднятии крысы за хвост). В дальнейшем на всех сроках тестирования неврологический дефицит в этой группе не выявлялся. Морфометрический анализ показал, что дефицит вещества мозга через 3 месяца после ОСМА составляет 291 ± 34 мм3 (36% от размеров противоположного полушария мозга). Таким образом, воспроизведена модель обширного корково-подкоркового ишемического инсульта, удовлетворяющая задачам исследования по изучению влияния клеточной имплантации на интегральные функции ЦНС в течение длительного времени (не менее 3 месяцев). ^ Гибели животных после моделирования коркового инсульта и ложного инсульта в течение 2 месяцев мониторинга не было. Наблюдалась тенденция к отставанию в прибавке массы тела в группе с инсультом, составившая через 2 месяца 118±12г, по сравнению с группой ложного инсульта (126±15г), которая, однако не достигла 95% статистической достоверности (p=0,12, критерий Стьюдента). Морфологические исследования выявили формирование и последующую организацию инфаркта коры, не выходящего за пределы зоны удаления мягкой мозговой оболочки. На 4 сутки на коронарных срезах мозга, окрашенных по Нисслю, в зоне удаления мягкой мозговой оболочки визуализировась деструкция тел нейральных и глиальных клеток, дефрагментация хроматина. В периинфарктной зоне в пределах приблизительно 800 мкм от области инфаркта определялся цитоплазматический отек, гиперхромная окраска ядер клеток и гиперхромия цитоплазмы клеток пирамидного слоя. В эпицентре и по периферии инфаркта визуализировалось значительное количество клеток глии. Через 16 суток зона инфаркта четко ограничена астроглиальным валом, определяются единичные клетки с гиперхромными ядрами в периинфарктной зоне. Через 30 суток и через 8 недель визуализировались четко организованная киста, окруженная астроглиальным валом, деформация окружающих структур мозга и увеличение бокового желудочка. Размеры постинсультного дефицита вещества неокортекса, рассчитанные через 8 недель после операции, составили - 36,8±7,2 мм3. Моделирование инсульта в сенсомоторной зоне коры мозга вызвало нарушения, которые выявлялись в цилиндр-тесте, тесте плавания и вибрисс-тесте на всех сроках наблюдения (рис.1,5). В группе с ложной операцией у отдельных крыс выявлялись легкие отклонения функциональных показателей лишь в течение первых двух недель мониторинга. У крыс с инсультом в «доминантном» полушарии мозга моторика контралатеральной лапы восстанавливалась лучше, чем у животных с поражением субдоминантной гемисферы. Значимые различия между этими группами по показателям цилиндр-теста выявлялись на сроках 4-8 недель, теста «плавание» - на 6-8 неделях и вибрисс-теста - на 8 неделе мониторинга (p<0,05 - критерий Манна-Уитни с поправкой для двух пар сравнений) (рис. 1). Впоследствии всем экспериментальным животным корковый инсульт моделировали на доминантном полушарии. Результаты оценки функций у крыс с инсультом в доминантном полушарии, представленные выше, использовали в экспериментах с клеточной имплантацией в качестве контроля (рис. 5). Таким образом, воспроизведена модель фокального ишемического инсульта в коре мозга. Инсульт имеет четкие границы и вызывает нарушения функций передней лапы, детектируемые в течение не менее 8 недель. Исследован метод отбора экспериментальных групп, характеризующихся однородной динамикой восстановления моторики лапы, и основанный на учете функциональной асимметрии полушарий головного мозга. Эти особенности модели позволяют изучать влияние имплантации стволовых клеток в периинфарктую зону мозга на восстановление функций ЦНС и экспрессию BDNF в этой области мозга.  Рисунок 1. Динамика относительных показателей функций контралатеральной передней лапы в группах крыс с корковым инсультом в доминантном и субдоминантном полушариях мозга (100% - уровень показателей тестов до операции). *-достоверные отличия групп (p<0,05, критерий Манна-Уитни с поправкой для двух пар сравнений). ^ Препарат ЭНТкр включал 90% nestin +, 50% beta-III-tubulin + и 2-3% GFAP+ клеток. Препарат НСКовч - до 90% nestin +, 30% beta-III-tubulin, 2-4% GFAP+, до 2% О4+клеток. Препарат фибробластов крысы характеризовался активным поглощением коллагеновых флюоресцирующих наночастиц. Таким образом, были подтверждены прогениторные свойства ЭНТкр и НСКовч и дана функциональная характеристика клеточного препарата Фкр. ^ ЭНТкр, меченые витальным красителем CFDA, введенные в большую цистерну мозга сразу после моделирования ОСМА, обнаруживались на 4 и 7 сутки в оболочках, выстилающих цистерну (рис. 2). На 16 сутки клетки в цистерне не визуализировались. У крыс с корковым инсультом исследовали жизнеспособность ЭНТкр, НСКовч и Фкр через 4, 7, 16 и 30 суток после имплантации этих клеток в периинфарктную зону коры. На 4, 7 и 16 сутки клетки визуализировались в паренхиме мозга вблизи инъекционного трека. На 16 сутки часть меченых ЭНТкр и НСКовч формировали сеть отростков, что свидетельствует о жизнеспособности клеток и признаках их дифференцировки (рис. 3). Тем не менее, через 30 суток меченые клетки в мозге не визуализировались.  Рисунок 2. Визуализация клеток, меченых витальным красителем CFDA SE, в оболочках мозга, выстилающих cisterna magna, через 4 суток (А) и 7 суток (Б) после имплантации ЭНТкр (флюоресцентная микроскопия).  Рисунок 3. Визуализация клеток, меченых витальным красителем CFDASE, в периинфарктной зоне коры мозга через 7 суток (А, Б, В) и 16 суток (Г, Д, Е) после имплантации (флюоресцентная микроскопия). А, Г – НСКовч; Б, Д – ЭНТкр; В,Е – Фкр При анализе окрашенных по Нисслю коронарных срезов мозга, выполненных через 8 недель после имплантации, в большинстве препаратов не было выявлено компактных скоплений клеточных масс, характеризующих присутствие имплантата. Таким образом, после имплантации значительное количество клеток сохраняли жизнеспособность, что позволило приступить к исследованиям влияния имплантации клеток на функциональное состояние животных. ^ Гибели крыс в экспериментальных группах не было. Прибавка массы тела у крыс с ОСМА после имплантации Фкр и ЭНТкр, через 3 месяца составляла 91±13г и 95±10г, соответственно. Эти данные статистически не отличались от группы ОСМА без клеточной терапии (8611г) (дисперсионный анализ, p>0.05). Имплантация Фкр (клеточный контроль) не вызвала статистически достоверных отклонений функциональных показателей ЦНС от животных, которым клетки не вводились (рис. 4).  Рисунок 4. Показатели функционального состояния ЦНС у крыс с корково-подкорковым ишемическим инсультом и имплантацией клеточных препаратов. n- количество животных в экспериментальных группах; *- статистически достоверные отличия от групп ОСМА и ОСМА+Фкр (p<0,05, критерий Крускала-Уоллиса) Инфузия ЭНТкр в большую цистерну мозга оказала положительный эффект на все исследуемые функции ЦНС (рис. 4). Достоверные отличия от группы без клеточной имплантации и животных, получавших фибробласты, в выполнении теста пассивного избегания регистрировались на всех сроках тестирования, в неврологической шкале – на 3, 30, 60 и 90 сутки, в К-тесте – на 15 и 30 сутки после ОСМА. Таким образом, у крыс с ОСМА инфузия ЭНТкр в большую цистерну мозга оказала специфичный терапевтический эффект на интегральные показатели функционального состояния ЦНС: функцию памяти, неврологический статус и вращательную асимметрию. Это позволило приступить к исследованиям биохимических маркеров наблюдаемых системных изменений (определению концентраций НСБ и NGF в ликворе и крови). ^ Гибели крыс в экспериментальных группах не было. Прирост массы тела крыс в экспериментальных группах был одинаковым. Он составил в группе с инсультом без клеточной терапии, с имплантацией Фкр, ЭНТкр и НСКовч 118±12г, 116±15г, 122±9г, 126±14г, соответственно, (Р<0,01, дисперсионный анализ). Имплантация Фкр (клеточный контроль) не оказала существенного влияния на функции лапы в сравнении с контрольной группой без введения клеток (рис. 5). У крыс, которым вводили ЭНТкр (рис.5), отмечалось стойкое превышение функциональных показателей цилиндр-теста и теста плавания над соответствующими значениями в контрольных группах в течение всего периода наблюдения. Наблюдаемые отличия достигли статистической значимости в цилиндр-тесте на 1,2 и 6 неделе, в тесте плавания – на 4 и 5 неделях (p<0,05, критерий Крускала-Уоллиса), при этом уровень функционального восстановления приближался к дооперационному. По результатам вибрисс-теста подобных различий не отмечалось. В группе крыс с имплантацией НСКовч (рис.5) показатели моторики передней лапы не отличались от контролей. Таким образом, у крыс с инсультом в сенсомоторной зоне коры мозга выявлен терапевтический эффект имплантации ЭНТкр на специфические функции этой области мозга – моторику контралатеральной передней лапы. Это позволило приступить к исследованиям экспрессии мРНК BDNF в месте имплантации этих клеток в качестве предполагаемого механизма наблюдаемого эффекта. Вместе с тем у крыс с имплантацией НСКовч функциональные показатели ЦНС существенно не изменились, несмотря на близкие иммуноцитохимические характеристики этого клеточного препарата с ЭНТкр. Отражает ли уровень экспрессии мРНК BDNF различную терапевтическую эффективность ЭНТкр и НСКовч – не ивестно.  Рисунок 5. Показатели функционального состояния ЦНС (моторика передней лапы) у крыс с корковым ишемическим инсультом и имплантацией клеточных препаратов. n- количество животных в экспериментальных группах; *- статистически достоверные отличия от групп ОСМА и ОСМА+Фкр (p<0,05, критерий Крускала-Уоллиса) ^ У крыс с ОСМА размеры постинсультного дефицита вещества мозга через 90 суток после инфузии Фкр и ЭНТкр в большую цистерну мозга составляли 288±32 и 275±26 мм3 соответственно. Эти результаты статистически не отличаются от группы животных с инсультом, не получавших клеточную терапию (291±34 мм3) (дисперсионный анализ, p>0.05). У крыс с инсультом в коре мозга, размеры атрофии коры, рассчитанные через 8 недель после операции, в группах без клеточной терапии, имплантацией Фкр, ЭНТкр и НСКовч, также достоверно не различались (дисперсионный анализ, p>0.05) и составляли 36,8±7,2; 37,3±11,6; 33,4±8,1 и 36,2±12,2 мм3, соответственно. Таким образом, морфометрия дефицита нервной ткани на моделях ишемического инсульта различной тяжести не выявила существенного влияния имплантации ЭНТкр и НСКовч на этот показатель. ^ Рабочий отрезок калибровочных кривых иммуноферментного анализа NSE и GFAP составляет 2-128 нг/мл. Погрешность измерений – 1,5-2 нг/мл. Исследование уровней NSE и GFAP в ликворе и сыворотке крови крыс с ОСМА и клеточной терапией выявило, что имплантация ЭНТкр приводит к достоверному снижению уровня этих белков как в ликворе, так и в сыворотке крови (см. рис.6). В настоящем эксперименте также были воспроизведены результаты [Петров С.В., Лебедев С.В., Гурина О.И., Чехонин В.П. Иммунохимическая верификация хронизациинейродегенеративного процесса у крыс после окклюзии средней мозговой артерии. Нейрохимия. 2005. №2. С. 133-137.], свидетельствующие о повышении уровня НСБ в этих биологических жидкостях на 14 сутки после ОСМА.  Рисунок 6. Концентрации NSE и GFAP сыворотке крови и ликворе крыс с ОСМА и имплантацией ЭНТкр. n- количество животных в экспериментальных группах; *- статистически достоверные отличия от группы ОСМА (p<0,05, критерий Манна-Уитни) Таким образом, у крыс с ОСМА продемонстрировано системное влияние инфузии ЭНТкр на уровни НСБ в крови и ликворе. Вместе с тем прижизненный анализ НСБ в образцах ликвора и крови продемонстрировал большую чувствительность в регистрации степени повреждения нервной ткани, чем морфометрические исследования. ^ Рабочий отрезок калибровочных кривой иммуноферментного анализа NGF составляет 15,6 - 500 пг/мл. Погрешность измерений – 10-15 пг/мл. Исследование образцов надосадочной жидкости, полученной через 24 и 48 ч после культивации ЭНТкр в количестве 4 млн клеток в 40 мкл среды DMEM показал, что уровень NGF не превышает 15,6 пг/мл, т.е. пределов чувствительности метода. Концентрация NGF в ликворе и сыворотке крови у крыс с ОСМА и имплантацией ЭНТкр также не превышала порога чувствительности метода. Таким образом, исследование концентраций NGF в клеточном препарате ЭНТкр и образцах крови и ликвора крыс с ОСМА и инфузией ЭНТкр не увенчалось успехом в связи с недостаточной чувствительностью использованного метода ELISA. В связи с этим, нами предпринята попытка использовать более чувствительный анализ – ПЦР в реальном времени - для исследования уровня экспрессии мРНК NGF, наряду с другими факторами роста, в клеточных препаратах ЭНТкр, НСКовч, Фкр и образцах периинфарктной ткани мозга после имплантации этих клеток. Экспрессия мРНК факторов роста (NGF, BDNF, NT-3, VEGF) в клеточных препаратах ЭНТкр, НСКовч, Фкр и BDNF в образцах периинфарктной ткани мозга после имплантации этих клетокВыход тотальной РНК из клеток и тканей составил 30-50 мкг с одной пробы. Значения A260/280 лежали в диапазоне от 1,97 до 2,07. На 1,2% формалин-агарозном геле визуализировались две четкие полоски, по молекулярной массе соответствующие 18S и 28S рРНК. При постановке ПЦР реакции с ген-специфическими праймерами с использованием 1 мкл реакционной ОТ-ПЦР смеси в качестве матрицы на 2% агарозном геле визуализировались единичные четкие полоски с ожидаемой длиной 161 п.н. и 130, 137, 107, 83 п.о. для GAPDH и NGF, BDNF, GDNF и VEGF, соответственно. Уровень экспрессии мРНК NGF, BDNF, NT-3 и VEGF был минимальным и не превышал экспрессию гена GAPDH «домашнего хозяйства» клетки. Уровень мРНК BDNF в образцах периинфарктной ткани мозга через 7 суток после имплантации Фкр и НСКовч повышался в 6 и 5 раз, соответственно, тогда как имплантация ЭНТкр приводила к 23-кратному увеличению мРНК BDNF (p<0,001 в сравнении с группами Фкр и НСКовч, см рис 7). Эти данные были воспроизведены в двух сериях экспериментов. Таким образом, обнаружен феномен повышения экспрессии мРНК BDNF в зоне имплантации всех применявшихся клеточных препаратов. При этом наиболее высокая экспрессия BDNF стабильно регистрировалась у крыс, получавших ЭНТкр – клеточный препарат, оказавший терапевтический эффект у крыс с ОСМА и корковым инсультом.  Рисунок 7. Экспрессия мРНК BDNF в образцах ткани периинфарктной области (7 сутки после операции), метод ПЦР в реальном времени. *р<0,05 с группами Фкр и НСКовч Резюмируя полученные экспериментальные данные, можно отметить, что использование клеточного контроля (Фкр) позволило оценить специфичность влияния имплантации ЭНТкр на функции ЦНС у крыс с корково-подкорковым (ОСМА) и корковым ишемическими инсультами. У крыс с ОСМА обнаружен терапевтический эффект ЭНТкр на интегральные функциональные показатели ЦНС и элиминацию НСБ в ликвор и кровь. Этот результат свидетельствует о системном механизме влияния НСК на состояние животных. Для исследования паракринного эффекта НСК воспроизведена модель ишемического инсульта в сенсомоторной зоне коры мозга и проведена оценка моторики передней лапы крыс с учётом функциональной асимметрии полушарий головного мозга. Исследование эффекта аллогенного (ЭНТкр) и ксеногенного (НСКовч) препаратов НСК показало, что только имплантация ЭНТкр способствовала восстановлению моторики передней лапы. В образцах периинфарктной ткани мозга, выделенной в зонах имплантации ЭНТкр, отмечалось значительное повышение экспрессии мРНК BDNF. Полученные в работе данные могут быть использованы при разработке механизмов биологического действия стволовых клеток, доклинической оценки клеточных препаратов и других новых средств лечения инсульта, а также в учебном процессе. Выводы:
^
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям