«маркеров»
|
|
Скачать 161.3 Kb.
|
|
Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации ФГУ Национальный научный центр наркологии Государственный контракт № 06\224 от "07" мая 2008г. «УТВЕРЖДАЮ» Председатель секции по наркологии РАМН Директор ФГУ ННЦ наркологии Росздрава, Член-корр. РАМН, профессор ____________________Н.Н. Иванец «__» ______ 2008 г. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АЛЛЕЛЬНЫХ И ГЕНОТИПИЧЕСКИХ ВАРИАНТОВ ГЕНА КАТЕХОЛ-О-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ (КОМТ) В КАЧЕСТВЕ МАРКЕРОВ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ЗЛОУПОТРЕБЛЕНИЮ ПСИХОАКТИВНЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ ------------------------------------------ Методические рекомендации МОСКВА 2008 Аннотация Методические рекомендации посвящены выявлению генетических «маркеров» - предикторов зависимости, для выявления лиц с высоким биологическим риском развития зависимости от ПАВ. Основой предрасположенности к злоупотреблению ПАВ и наркологическим заболеваниям являются индивидуальные, генетически детерминированные характеристики дофаминовой (ДА) нейромедиаторной системы мозга. В этой связи варианты структуры (полиморфные локусы) генов, контролирующих ДА нейромедиацию, могут являться патогенетическими маркерами высокого риска развития болезней зависимости. Одним из важнейших звеньев этой нейрохимической системы является фермент катехол-О-метил-трансфераза КОМТ (СОМТ, EC2.1.1.6), важный участник биотрансформации дофамина по пути образования метилированных продуктов, ключевой модулятор дофаминергической и норадренергической нейромедиации. Известно, что активность КОМТ варьируется в пределах популяции, существуют высоко- и низкоактивные формы, которые определяются функциональным полиморфизмом V158M (gtg->atg) в экзоне 3 гена КOMT, приводящим к замене аминокислоты в структуре белка. Один из вариантов полиморфизма - аллель L (аминокислота метионин, low acitivity) связывают со сниженной активностью фермента , второй- H ( аминокислота валин, high activity) обеспечивает высокую активность фермента. Предлагается использование аллельных и генотипических вариантов гена КОМТ в качестве маркера предрасположенности к злоупотреблению психоактивными веществами (ПАВ). Выявление факта носительства определенных аллелей и генотипов по полиморфному локусу гена КОМТ свидетельствует о высоком риске развития зависимости от ПАВ и считаться показанием к проведению комплекса профилактических мероприятий в отношении наркологических заболеваний у конкретного индивидуума. Разработанный метод использования аллельных и генотипических вариантов полиморфизма гена КОМТ в качестве маркеров предрасположенности к развитию зависимости от ПАВ может быть рекомендован для специально организованных кабинетов на базе наркологических диспансеров, где врач и сотрудники лаборатории могут проводить медико-генетическое консультирование населения и решать задачи ранней диагностики и профилактики лиц с врожденной предрасположенностью к злоупотреблению ПАВ. Методические рекомендации предназначены для врачей психиатров-наркологов, врачей общей практики, профилактической и семейной медицины и научных работников. Авторы: академик РАМН, профессор И.П. Анохина, вед. научный сотрудник к.м.н А.О. Кибитов, вед. научный сотрудник к.м.н. Воскобоева Е.Ю., вед. научный сотрудник к.б.н. Бродянский В.М. научный сотрудник Чупрова Н.А., научный сотрудник Смирнова Е.В. ^
ВВЕДЕНИЕ Накапливается все больше фактов, свидетельствующих, что среди общей популяции населения имеется категория лиц с врожденной склонностью к злоупотреблению алкоголем или наркотиками. Как правило, это группа лиц из отягощенных алкоголизмом или наркоманией семей, которую относят к группе высокого риска. Именно эта категория лиц пополняет ряды наиболее тяжелых больных наркологическими заболеваниями и требует особых мер профилактики. Остро стоит вопрос о необходимости идентификации этой группы с целью проведения комплекса мероприятий ранней профилактики с включением общих социально-психологических и воспитательно-образовательных программ для всего населения и специальных программ для лиц с предрасположенностью к развитию наркологических заболеваний. В связи с этим особое значение приобретает поиск генетических «маркеров» - предикторов зависимости, для выявления лиц с биологической наследственной предрасположенностью к злоупотреблению ПАВ и , как следствие, с высоким биологическим риском развития зависимости от ПАВ. Роль наследственных факторов в патогенезе зависимости от психоактивных веществ (ПАВ) хорошо известна. Многие авторы говорят о существовании генетической предрасположенности к зависимости от ПАВ, выявление признаков которой является важнейшей задачей молекулярной генетики наркологических заболеваний. Известны факты "накопления" алкоголизма в семьях, показано повышение риска заболевания алкоголизмом и наркоманиями в семьях с отягощенной наследственностью. Согласно данным классической генетики, злоупотребление алкоголем передается по наследству ориентировочно в 38%, в то время как потребление психостимулянтов и опиатов проявило наследственный характер от 11 до 45%. В тоже время, природа и механизмы наследования предрасположенности, а также условия ее проявления в виде фенотипических (клинических) признаков зависимости от ПАВ остается неясной. Классическими стали близнецовые исследования, которые выявили высокую конкордантность по алкоголизму как у монозиготных (до 70%), так и у дизиготных (до 45%) близнецов. Высокая конкордантность обнаружена также у близнецов по употреблению некоторых наркотических препаратов. Наиболее убедительно роль генетических факторов в развитии заболевания демонстрирует изучение алкоголизма на модели приемных детей, где генотип детей обеспечивали биологические родители, а среду – приемные. Показано, что дети, рожденные биологическими родителями, больными алкоголизмом, и воспитанные в приемных семьях, имеют повышенный риск (до 32 раз по данным разных авторов) развития алкоголизма по сравнению с детьми, рожденными здоровыми родителями и воспитанными приемными родителями. Приведенные данные клинико-генеалогических исследований указывают на определяющую роль врожденной предрасположенности в развитии наркологических заболеваний. Подтверждением значимой роли врожденных генетически обусловленных особенностей индивидуума в предрасположенности к злоупотреблению ПАВ служат многочисленные экспериментальные исследования, проведенные на животных. Так, в популяции различных лабораторных животных (крысы, мыши, обезьяны) выявляются особи с различной степенью склонности к потреблению ПАВ и формированию зависимости. В условиях свободного выбора среди общей популяции животных часть особей предпочитает употребление алкоголя и других наркотических веществ, а другая часть отвергает. При скрещивании животных с однотипной мотивацией получены чистые инбредные животные с врожденной склонностью (высокой или низкой) к потреблению ПАВ. Эти факты, несомненно, доказывают наличие генетического контроля склонности к потреблению ПАВ. Анализ данных медицинской генетики по изучению характера наследования предрасположенности к зависимости на примере алкоголизма приводит к выявлению сложного типа наследования, не подчиняющегося менделевским принципам, что характерно для полигенных мультифакториальных заболеваний. Очевидно, что, в наследование предрасположенности к зависимости от ПАВ вовлечено несколько генов или, что более вероятно, генных ансамблей. Нейрохимической основой феномена зависимости от ПАВ является хроническая дисфункция дофаминовой нейротрансмиттерной системы мозга, в первую очередь затрагивающая систему подрепления. Предполагается существование единого центрального патофизиологического механизма становления и поддержания зависимости от ПАВ на уровне системы подкрепления, детерминированного генетически. Этот процесс, по-видимому, не зависит от конкретного вида ПАВ, обеспечивает глубокие нейрохимические изменения у будущего больного еще до встречи с ПАВ, и определяет биологическую базу собственно предрасположенности. Клинические проявления зависимости от ПАВ выступают в качестве сверхсложного «мозаичного» фенотипа (фенотипа зависимости), определяемого многовариантным взаимодействием генов, прежде всего дофаминовой нейротрансмиттерной системы. Можно предполагать значительную генотипическую гетерогенность предрасположенности к зависимости от ПАВ, что обуславливает необходимость расширения поиска от одного двух генов-кандидатов к целостной системе генетических детерминант. Значительная фенотипическая (клиническая) гетерогенность болезней зависимости от ПАВ в сочетании с генетической гетерогенностью диктует необходимость функционального подхода к поиску генов-кандидатов, вовлеченных в этиопатогенез зависимости. Таким образом, наибольший интерес представляют гены, контролирующие дофаминовую нейротрансмиттерную систему. Ранее мы показали, что полиморфные локусы ряда генов дофаминовой нейромедиаторной системы (гены дофаминовых рецепторов, дофамин-бета-гидроксилазы (ДБГ), тирозингидроксилазы (ТГ) выступают значимыми элементами генотипического профиля зависимости от ПАВ. Одним из важнейших звеньев этой нейрохимической системы является фермент катехол-орто-метил-трансфераза (СОМТ, EC2.1.1.6), важный участник биотрансформации дофамина по пути образования метилированных продуктов. KOMT является ключевым модулятором дофаминергической и норадренергической нейротрансмиссии. Известно, что активность КОМТ варьируется в пределах популяции, существуют высоко- и низкоактивные формы, которые определяются функциональным полиморфизмом V158M (gtg->atg) в экзоне 3 гена КOMT, приводящим к замене аминокислоты в структуре белка . Один из вариантов полиморфизма - аллель L (аминокислота метионин,low acitivity) связывают со сниженной активностью фермента , второй- H ( аминокислота валин, high activity) обеспечивает высокую активность фермента. Недавно сообщалось, что низкоактивный аллель вносит вклад в развитие алкоголизма с поздним началом у мужчин. может вносить вклад в этиологию психических заболеваний, включая и алкоголизм. Так как эйфория, индуцированная этанолом, ассоциирована с быстрым высвобождением дофамина в лимбических областях, предполагается, что субъекты, которые наследуют аллель, кодирующий КОМТ вариант с низкой активностью, должны иметь относительно низкий уровень инактивации дофамина, и, следовательно, иметь более высокую предрасположенность к развитию зависимости от алкоголя. Таким образом, ген, контролирующий работу КОМТ, может являться одним из ключевых в "генном ансамбле", вовлеченном в этиопатогенез зависимости от ПАВ. Развитие методов молекулярной биологии сделали возможным изучение генетики полигенных заболеваний путем прямого анализа структуры ДНК больного, в частности, изучение вариабельности структуры ДНК в определенных локусах того или иного гена, называемых локусами полиморфизма. Как правило, в популяции встречаются несколько вариантов структуры полиморфных локусов. Широко применяемые «ассоциативные» исследования направлены на поиск статистической связи между частотами встречаемости того или иного варианта полиморфизма в выборке больных по сравнению с контрольной выборкой здоровых субъектов. Обнаружение такой связи, или ассоциации, между определенным видом полиморфизма и той или иной патологией, может служить подтверждением вовлечения гена, несущего полиморфный локус, в патогенез и течение болезни. В связи с важной ролью фермента КОМТ в механизмах регуляции ДА системы и, как следствие, возможной ролью в этиопатогенезе зависимости от ПАВ, предлагается использование аллельных и генотипических вариантов гена КОМТ в качестве маркеров предрасположенности к зависимости от ПАВ. В целях выявления связи факта носительства того или иного аллеля и генотипа по гену КОМТ с предрасположенностью к нарпкологическим заболеваниям, были проведены исследования репрезентативных выборок больных алкоголизмом и героиновой наркоманией с различной плотностью семейной отягощенности по наркологическим заболеваниям и с различными вариантами течения зависимости. В клинической и профилактической практике метод может использоваться с целью ранней профилактики зависимости от ПАВ, определения наиболее вероятного типа течения и прогноза наркологического заболевания. Описанные лабораторные методы не имеют противопоказаний и предназначены для выявления маркеров различной природы с целью выяснения степени риска развития зависимости от ПАВ. ^ 1. Молекулярно-генетическое исследование (генотипирование) Основной используемый лабораторный метод – метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). В качестве источника ДНК для анализа используется венозная кровь в количестве 1-5 мл (отбирается в стерильную пробирку с раствором ЭДТА). Возможно использование соскоба буккального эпителия. Хранение образцов осуществляется при -20О С. Необходимо территориально разделять отдельные стадии проведения анализа, размещая их в разных помещениях:
Оснащение ПЦР-диагностической лаборатории. Помещение для пробоподготовки:
Пост-ПЦР-помещение:
ДНК выделяется из клеток цельной крови методом фенол-хлороформной экстракции. Для выявления конкретных аллелей изучаемых генов используется метод генотипического анализа ДНК с применением олигонуклеотидных праймеров в условиях ПЦР. В основе генодиагностики наследственных заболеваний лежит метод ПЦР. Его суть состоит в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. Реакция осуществляется с помощью фермента taq-полимеразы. На каждом цикле амплификации, синтезированные ранее фрагменты, вновь вступают в реакцию амплификации. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК, что делает возможным регистрацию и анализ наработанной ДНК с помощью электрофореза. Для создания стартовых блоков, необходимых для работы ДНК-полимеразы, используют затравки, представляющие собой специально синтезированные олигонуклеотиды, называемые праймерами. Длина амплифицируемого участка обычно составляет несколько сот пар нуклеотидов. Выбор в качестве амплифицируемого участка ДНК уникального фрагмента гена обеспечивает специфичность ПЦР-анализа. ^ 1. Рекомендуемый дизайн олигонуклеотидных праймеров: COMT 1 5’- GCT ACT CAG CTG TGC GCA TG-3’ COMT 2 5’- CTG ACA ACG GGT CAG GCA TG-3’ 2. МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ: ПЦР фрагмента экзона 3 гена СОМТ с последующим рестрикционным анализом.
РЕСТРИКТАЗА: Fat I (^CATG) + есть сайт узнавания для Fat I, т.е. M(atg) (А/А = +/+, фрагменты 95, 20, 16 вр) - нет сайта узнавания для Fat I, т.е. V(gtg) (G/G = -/-, фрагменты 115, 20, 16 вр)
^ По результатам генотипирования устанавливается генотип данного индивидуума (пациента) по полиморфному локусу V148M гена КОМТ. Возможны 3 варианта генотипа: LL, LH, HH. В целях выявления связи носительства аллелей и генотипов по полиморфному локусу V148M гена КОМТ с предрасположенностью к развитию зависимости от ПАВ, мы провели масштабное исследование распределения вариантов этого полиморфизма у больных алкоголизмом и героиновой наркоманией с различной плотностью семейной отягощенности по наркологическим заболеваниям и разными вариантами течения болезней зависимости. Семейная отягощенность по наркологическим заболеваниям, а в особенности плотность отягощенности - количество кровных родственников больного, страдавших болезнями зависимости, является весомым и клинически подтвержденным признаком высокой биологической предрасположенности и повышенного риска к развитию зависимости. Вероятно, что среди больных героиновой наркоманией значительно меньше лиц с биологической предрасположенностью к зависимости от ПАВ. Это подтверждают наши данные о большем количестве неотягощенных пациентов в этой группе. Высокая наркогенность героина, видимо, также приводит к заболеваемости лиц без либо с невысоким уровнем предрасположенности. По этим причинам, дальнейший анализ связи вариантов полиморфизма гена КОМТ с клиническими признаками зависимости от ПАВ мы проводили среди больных алкоголизмом. ^ В основе зависимости от ПАВ лежит патологическое влечение к ПАВ, одним из проявлений которого является уровень эйфорического эффекта, особенно при первых приемах ПАВ. Мы сделали попытку оценить возможную связь аллельных и генотипических вариантов по полиморфному локусу гена КОМТ с уровнем этого эффекта. Исследования проводились в группе больных алкоголизмом. Оказалось, что среди лиц, отмечавших негативную реакцию на первые приемы алкоголя, обнаружено превалирование генотипа L/L против контроля и тенденция на границе значимости к превалированию аллеля L . Отмечено снижение частоты генотипа НН среди больных с нейтральной реакцией. ^ Из клинической практики известна взаимосвязь между семейной отягощенностью по алкоголизму и тяжелым, злокачественным течением алкоголизма, как правило с ранней манифестацией. Раннее начало алкоголизма, в частности выражающееся в формировании алкогольного абстинентного синдрома (ААС) в очень молодом возрасте, часто встречается среди лиц с наследственной отягощенностью по наркологическим заболеваниям и считается плохим прогностическим признаком. Заболевание в этом случае протекает тяжело, практически без ремиссий и часто описывается как отдельный подтип -"биологический" алкоголизм, подчеркивается биологическая предрасположенность к развитию зависимости. На основе анализа распределения возраста формирования ААС среди изученного контингента больных, мы выделили две группы с противоположными значениями этого клинического параметра: с ранним началом (возраст формирования ААС до 23 лет) и поздним началом (после 35 лет). Возрастные критерии разделения общей группы больных совпадают с клиническими наблюдениями. Третью (промежуточную) группу составили больные, у которых ААС сформировался в возрасте от 24 до 34 лет. Эффективность такого подхода при изучении генетики сложных признаков неоднократно доказана многочисленными исследованиями. Оказалось, что среди больных с ранним началом алкоголизма выявлена тенденция к превалированию генотипа L\L против контроля . Среди больных с промежуточным возрастом манифестации алкоголизма обнаружено достоверное превалирование аллеля L и тенденция на границе значимости к превалированию генотипа L\L . Таким образом, по совокупности проявлений признаков предрасположенности к зависимости от ПАВ, можно обрисовать клинический "портрет" носителей различных аллелей и генотипов по гену КОМТ и предложить шкалу для интерпретации факта носительства маркера биологической предрасположенности. ^ Аллель L. У носителей этого аллеля имеется значительная вероятность наличия высокой плотности отягощенности по наркологическим заболеваниям, первично высокий высокий уровень влечения к ПАВ, обуславливающий развитие зависимости даже при нейтральной или негативной реакции на первую пробу ПАВ (алкоголя). Развитие зависимости прогредиентное, но не злокачественное. Достоверный маркер предрасположенности. Аллель Н. Не выявлено связи с отягощенностью, уровнем влечения к ПАВ и динамикой развития зависимости. ^ . Генотип LL. Средняя плотность отягощенности, при, как правило,ранней манифестации болезни зависимости, несмотря на нагативную реакцию на ПАВ при первых приемах. Достоверный маркер предрасположенности. Генотип HH. Небольшая вероятность отягощенности, не связан с эйфорическим эффектом ПАВ и динамикой заболевания. ^ Генотип LH. Нейтральный маркер. В результате интерпретации выявленного генотипа у конкретного пациента (индидуума) делается вывод о вероятности наличия и степени выраженности биологической врожденной предрасположенности к развитию зависимости от ПАВ и прогноз варианта развития болезни. Как известно, наличие предрасположенности не является детерминирующим фактором, однозначно приводящим к манифестации заболевания. Предрасположенность все же необходимо считать необходимым, но не достаточным условием для развития заболевания. Таким образом, для выявления предрасположенности и определения степени риска развития зависимости от психоактивных веществ молекулярно-генетические методы исследования могут быть использованы наряду с клинико-генеалогическими, клиническими, экспериментально-психологическими и нейрофизиологическими методами исследования. Учитывая полигенную природу алкоголизма и наркомании, предполагающей участие нескольких генов и их возможное взаимодействие, рекомендуется с большой осторожностью относиться к интерпретации обнаружения того или иного «аллеля риска» и рассматривать данные генодиагностики только в комплексе с результатами клинических, психологических и нейрофизиологических исследований. Для выявления механизма реализации наследственной предрасположенности к злоупотреблению ПАВ необходимо использование ряда клинических, клинико-генеалогических, нейрохимических, молекулярно-генетических и других методов исследования. Необходимо подчеркнуть, что в силу полигенной природы и мультифакториального характера зависимости от ПАВ, не может существовать единственного маркера для диагностики предрасположенности к – это всегда комплекс маркеров, причем состав его может варьировать у различных субъектов. Более того, ряд маркеров может быть универсальным для зависимости от разных видов ПАВ, что, скорее всего, отражает общность центральных механизмов этиопатогенеза зависимости. Ряд других маркеров, более специфичных для алкоголизма или наркомании, вероятно связаны с особенностями разных видов ПАВ на нейрохимические системы. Как видено из наших данных, некоторые аллельные и генотипические варианты соответствуют определенному типу течения зависимости, что позволяет говорить о генотипической гетерогенности такого сложного комплексного заболевания как зависимость. Работы по поиску маркеров предрасположенности к наркоманиям и алкоголизму продолжаются, и поэтому, возможно, что в будущем появятся некоторые новые показатели. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям