Казахский национальный университет имени аль-Фараби
|
|
Скачать 2.33 Mb.
|
|
3.4 Характеристика взаимодействия микроРНК с генами мишенями С помощью программы UNAFold.3.7 (http: // dinamelt.bioinfo.rpi.edu) были построены 2D структуры мРНК 13 генов мишеней микроРНК (ABCC2, ABCG2, ALCAM, APC, AXIN1, BAX, CDH1, FLCN, MLH3, MMP2, PTPN12, SRC, TP53). На вторичной структуре мишеней была изучена характеристика взаимодействия микроРНК с мРНК-мишенью. Как показано на рисунке 2, микроРНК взаимодействует с неспаренными нуклеотидами мРНК с 5' или 3'конца микроРНК. Это позволяет разрушить уотсон-криковское взаимодействие в 2D структуре мРНК для образования взаимодействия между микроРНК и мРНК. Неспаренные нуклеотиды мРНК служат затравкой для образования связи между микроРНК и мРНК. Из приведенных примеров видно, что затравкой может быть как 5' так и 3'конец микроРНК. В сайте для miR-21* в мРНК гена ALCAM затравкой служит взаимодействие 5’конца микроРНК с неспаренными нуклеотидами вторичной структуры мРНК (рисунок 9). А в сайте взаимодействия miR-1279 с мРНК гена ALCAM затравкой образования связи служит взаимодействие между 3‘концом микроРНК со свободными нуклеотидами мРНК (рисунок 9). Так как программа RNAhybrid предсказывает сайты на основе вторичной структуры мишени и микроРНК было обнаружено, что во всех изученных случаях микроРНК взаимодействует с неспаренными нуклеотидами вторичной структуры мишени.  Копмлементарные участки представлены непрерывной чертой, ондонуклеотидные мисматчи точкой, несколько некомплементарных нуклеотида в сайте связывания точкой-тире. ^ Как видно из примеров генов CDH1 и ALCAM одна мРНК может связываться с несколькими микроРНК с высоким уровнем комплементарности (рисунки 9 и 10). Если микроРНК связываются с одной областью мРНК, то они конкурируют за область взаимодействия. miR-1587 и miR-4507 взаимодействуют в одном сайте с мРНК CDH1, то есть сайты перекрываются и конкурируют за мишень мРНК (рисунок 10). Тогда как в других мРНК есть сайты связывания для нескольких микроРНК в разных областях мРНК. Например, сайты связывания для miR-21* и miR-1279 в мРНК гена ALCAM (рисунок 9).  Комплементарные участки представлены непрерывной чертой, ондонуклеотидные мисматчи точкой, несколько некомплементарных нуклеотида в сайте связывания точкой-тире. ^ Из рассмотренных 63 сайтов в мРНК 13 генов 27% 5'-доминантных сайтов, 43% сайтов с центральным доминированием, 30% 3'-доминантных сайтов. На рисунках 9, 10, 11 можно найти сайты всех трех видов. Взаимодействия miR-21*:ALCAM, miR-1587:CDH1, miR-4508:FLCN1 являются сайтами с доминирующим 5'-концом микроРНК. Сайты miR-212:MMP2, miR-4472:ABCG2 являются сайтами с доминированием центрального участка микроРНК (рисунок 11). К 3'-доминирующим сайтам относятся сайты следующих пар: miR-1279:AlCAM, miR-4507:CDH1. Несмотря на то, какая часть микроРНК вносит больший вклад в энергию взаимодействия из рассмотренных примеров видно, что в основном затравкой для образования связи между микроРНК и мРНК служит 5' конец микроРНК. По итогам исследования была опубликована одна публикация [346].  Копмлементарные участки представлены непрерывной чертой, ондонуклеотидные мисматчи точкой, несколько некомплементарных нуклеотида в сайте связывания точкой-тире. ^ Изучение распределения сайтов микроРНК в зависимости от длины микроРНК показало, что основная доля сайтов приходится на микроРНК длиной 22 нуклеотида. Пять микроРНК с длинной 16 нуклеотид не имеют сайтов связывания при установленных критериях взаимодействия. Из рисунка 12 видно, что микроРНК с короткой длиной имеют большое количество сайтов. Это связано с длиной микроРНК, потому что для отбора сайтов для микроРНК длиной 17 нуклеотид энергия гибридизации должна составлять 82,5% от максимальной энергии гибридизации, а для микроРНК длиной 27 нуклеотид 70%. Для длинных микроРНК критерий отбора были выше, так как основной задачей исследования было определение сайтов с высокой комплементарностью. Поэтому микроРНК с длиной выше 22 нуклеотид при установленных критериях имеют ограниченное количество сайтов. Только 10% сайтов составляют микроРНК с длиной от 23 до 27 нуклеотидов. Максимальное количество сайтов приходится на микроРНК длиной 22 нуклеотида, что соответствует отношению количества межгенных микроРНК. Р  исунок 12 - Распределение сайтов связывания в зависимости от длины микроРНК^ В следующем этапе исследования сайты, которые были найдены при помощи программы RNAhybrid, были сравнены с сайтами, которые предсказывает программа TargetScan 6.2 (www.targetscan.org). Отличительной особенностью сайтов отобранных нами по программе RNAhybrid является их высокая комплементарность во всей области взаимодействия, ранее ни в одной исследовательской работе не было показано наличие таких сайтов. Поэтому мы хотим проверить эффективность предсказывания сайтов с высокой комплементарностью с помощью программы TargetScan. Программа TargetScan разработана группой ученых под руководством Давида Бартела из Howard Hughes медицинского университета Америки и признана одной из широко используемых программ с низким уровнем предсказания ложно позитивных сайтов взаимодействия микроРНК [15]. Сравнения проведено для сайтов связывания микроРНК с мРНК генов CDH1, GSK3B, MLH3, MTHFR, PTPN12, SMAD4, SRC, TP53, ZEB1. В таблице 14 представлены сайты связывания микроРНК предсказанные программой RNAhybrid и TargetScan. Все сайты, которые имеют хоть одну Г:У пару в сайте связывания не предсказываются программой TargetScan. В таблице жирным шрифтов помечены сайты без Г:У пар в 'seed' районе, которые определены в одной области мРНК мишеней, но за счет специфических свойств алгоритма программы TargetScan не определена биологическая значимость этих сайтов. То есть комплементарность сайтов взаимодействия, которая в описанных сайтах близка к полной. Для сайтов между miR-1285:TP53, miR-4663:ZEB1, miR-4732-3p:GSK3B, miR-4710:GSK3B, miR-4711-3p:PTPN12 программа TargetScan не определила комплементарные пары в 3'конце микроРНК. Определение сайта микроРНК в мРНК гена TP53, во всех остальных сайтах, представленных в таблице 14, программа TargetScan не нашла сайты, которые ранее были предсказаны программой RNAhybrid и предлагает свои варианты сайтов в другой области мРНК. В базе TargetScan все сайты в зависимости от филогенетической консервативности подразделены на три группы: сайты консервативные у позвоночных, сайты консервативные у млекопитающих, сайты с низкой консервативностью. Все сайты, представленные в таблице 14, получены из он-лайн базы TargetScan, определены как сайты с низкой консервативностью. То есть экспериментально биологическая значимость этих сайтов в регуляции генов мишеней будет определяться в последнюю очередь, так как первый критерий для отбора сайтов для экспериментальных исследований основан на филогенетической консервативности сайтов. Некоторые канонические сайты с высокой комплементарностью не предсказываются с помощью программы TargetScan. В таблице 15 представлены несколько сайтов, которые не были найдены при помощи программы TargetScan. Анализ структуры канонических сайтов выявил, что сайты с некомплементарными нуклеотидами мишени ко второй и третьей позиции 5'конца микроРНК (SMAD4:miR-1972; TP53:miR-2392) не определяются данной программой. Программа находит только канонические сайты: 5’-доминантный канонический сайт, сайт с 5’-доминантной seed областью и 3’-компенсаторным сайт (рисунок 6). Можно сделать вывод, что локализация seed является одним из основных критериев отбора сайтов в алгоритме программы TargetScan. Во вторых, сайты с очень высокой уровенью комплементарности, но с Г:У парами в seed области не определяются данной программой (SMAD4:miR-1268, SRC:miR-302f). Исходя из этого можно сделать вывод, что наличие Г:У пар в seed области также является критерием отбора. Все эти данные свидетельствуют о преимуществе разработанной в нашей лаборатории методики отбора сайтов связывания. Методика позволяет отобрать сайты взаимодействия микроРНК с высоким уровнем комплементарности, то есть близких по свойствам к siRNA. Таблица 14 - Сайты предсказанные RNAhybrid и TargetScan
Продолжение таблицы 14
Таблица 15 - Потенциальные сайта не найденные программой TargetScan
Используя выравнивание 3'UTR мРНК разных организмов, представленной в базе TargetScan, изучена филогенетическая консервативность сайтов связывания микроРНК локализованных в 3'UTR. Для семи мРНК были обнаружены сайты, предсказанные обеими программами в одной области мРНК мишени, но программа TargetScan во всех случаях не смогла показать все комплементарные пары в сайте взаимодействия. Для всех этих сайтов была изучена консервативность сайтов микроРНК среди различных видов. Если программой TargetScan определяется консервативность «seed» области (от 2 по 8 нуклеотид 5'конца микроРНК), мы изучили консервативность всей последовательности сайта, чтобы проверить уникальность таких сайтов для человека. В таблице 16 представлены данные по консервативности сайтов в 3'UTR. Для трех изученных сайтов выявлена консервативность в одном геноме, во всех случаях для Pаn troglodytes (шимпанзе): GSK3B - miR-4732-3p, MTHFR - miR-1260, TP53 - miR-1285. Другие три сайта консервативны в двух геномах (у шимпанзе и кролика или у шимпанзе и галаго: CCND1 – miR-4487, PTPN12 – miR-4711-3p, ZEB1 – miR-4663. Сайт для miR-4710 в гене GSK3B был консервативен у шимпанзе, макаки-резуса и кролика. То есть, все эти сайты имеют низкую консервативность и не уникальны для генома человека. Таблица 16 - Консервативность сайтов в 3'UTR
^ На следующем этапе исследования сайты, предсказанные программой RNAhybrid, были сравнены с сайтами, которые предсказывает программа miRanda v3.3a. Как было показано в обзоре, miRanda v3.3a является программой, основанной на уровне комплементарности в „seed” области. Сайты предсказанные этой программой представлены в базе данных www.microrna.org. Сайты, предсказанные miRanda v3.3a отбираются по параметру score, минимальное требование 120. Далее сайты отбираются по скору, вычисленному по алгоритму mirSVR (support vector regression). Минимальное требование для отбора 6mer (2-7 нуклеотиды) seed с одной Г:У парой или одним мисматчем. Таблица 17 – Сайты, предсказанные RNAhybrid и miRanda с лучшим параметром score
Для сравнения сайтов была использованы сайты, локализованные в кодирующей области. На он-лайн ресурсе представлены только сайты, расположенные в 3'нетранслируемой области мРНК. Для поиска сайтов была использована локальная программа miRanda v3.3a. Были изучены сайты связывания локализованные в CDS мРНК 14 генов мишеней (ABCC2, APC, AXIN1, BAD, DLC1, FLCN, FZD7, KIT, KLF12, MET, MLH1, MLH3, MMP2, MMP9). В таблице 17 представлены сайты, которые по программе miRanda имеют лучшее значение score для изученной микроРНК в каждой из мРНК мишеней. Данные свидетельствуют, что обе программы могут предсказывать с одинаковой эффективностью все канонические (6-8mer seed – 2-8 нуклеотиды, без Г:У пар) и неканонические сайты. Таблица 18 - Сайты предсказанные программами RNAhybrid и miRanda
Отбор сайтов в программе miRanda основан на значении Score, который зависит от количества комплементарных нуклеотидов в сайте и наличия комплементарных пар в seed области. Поэтому некоторые сайты с высоким значением энергии гибридизации и уровнем комплементарности, но большим количеством Г:У пар и с наличием неспаренных нуклеотидов в “seed” области имеют низкое значение score. Все сайты, представленные в таблице 18, имеют не лучшее значение score для этих микроРНК, то есть существуют сайты с более высоким значением score для этих пар (микроРНК-мРНК), но более низким значением энергии гибридизации и уровнем комплементарности. Как показало исследование, miRanda может находить все потенциальные сайты, которые ранее были предсказаны программой RNAhybrid. Как упоминалось выше сайты, предсказанные программой miRanda, размешены на сайте www.microrna.org Центра Вычислительной Биологии (The Computational Biology Center at Memorial Sloan-Kettering Cancer Center). Все сайты, предсказанные программой miRanda, далее отбираются по алгоритму mirSVR, который вычисляет свой score для каждого сайта в зависимости от экспрессии микроРНК и мРНК мишени. Таблица 19 – Сайты, представленные на сайте www.microrna.org
На следующем этапе изучена доступность сайтов в базе www.microrna.org, предсказанных программой miRanda. Для этого был проведен поиск 11 сайтов, расположенных в 3’UTR. Выявлено, что сайт miR-3180-5p в мРНК CCND1, сайт miR-1285 в мРНК CDH1, miR-378b в мРНК MLH3 не представлены он-лайн базе из-за низкого показателя mirSVR score. Сайты для miR-4487, miR-4665-5p, miR-4663, miR-4710, miR-4732-3p, miR-4711-3p нет в базе, потому что эти микроРНК не включены на данный момент в базу данных. База www.microrna.org предлагает сайты взаимодействия для 1100 микроРНК, некоторые из межгенных микроРНК на данный момент не обработаны по программе miRanda и не входят в базу данных. Из одиннадцати сайтов предсказанных RNAhybrid (таблица 14), только два сайта для miR-1260 в мРНК MTHFR, miR-1285 в мРНК TP53 представлены в базе www.microrna.org (таблица 19). В заключении можно сделать вывод, что miRanda предсказывает сайты с одинаковой эффективностью, но большинство из этих сайтов не доступны в базе данных www.microrna.org. Эти данные свидетельствуют о значимости наших исследований в обнаружении в геноме человека сайтов с высоким уровнем комплементарности. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям