Казахский национальный университет имени аль-Фараби
|
|
Скачать 2.33 Mb.
|
|
3.7 Изучение филогенетической консервативности сайтов, предсказанных RNAhybrid Aacttg caaacaaaggagca |
|
^ На следующем этапе мы хотим проверить достоверность сайтов на основе консервативности сайта среди близкородственных и филогенетически далеких видов. В предыдущей части исследования мы говорили, что по данным выравнивания TargetScan, сайты микроРНК в 3'UTR сохраняются в 1-2 видах, то есть имеют низкую консервативность. На данном момент появились работы, которые показали эффективность действия сайтов микроРНК с низким уровнем консервативности [347]. То есть консервативность не является абсолютным критерием отбора функциональных сайтов. В нашем исследовании мы описываем сайты взаимодействия в 5'UTR, CDS, 3'UTR. Поэтому в этой главе будут рассмотрена консервативность сайтов микроРНК, которые находятся в кодирующей части мРНК, что является новизной этой работы. Значимым отличием нашей работы от известных работ является проверка консервативности полной последовательности сайта микроРНК. Тогда как в основном проверяется только консервативность 'seed' области сайта. Второе отличие в методе изучения консервативности. В основном проводят выравнивание мРНК мишеней разных видов. В нашем исследовании мы проводили идентификацию сайта на основе аминокислотной последовательности. Как известно одна микроРНК может действовать на несколько генов мишеней и на один ген несколько микроРНК. На основе филогенетической консервативности генов мы постараемся проверить два этих утверждения. miR-1279 имеет сайты связывания в мРНК генов PTPN12, ZEB1, MSH6. Сайт связывания в в мРНК гена PTPN12 является каноническим сайтом с полной комплементарностью в 'seed' области. Нуклеотидная последовательность сайта связывания кодирует TKEQYE гексапептид. Сайт в PTPN12 имеет одну Г:У пару, которая находится на дистанции от 'seed' области. Сайт miR-1279 имеет энергию взаимодействия -24,4 kcal/mol и ΔG/ΔGm равную 86.5%. Человеческий ген PTPN12 имеет 23 ортолога у разных животных. Для верификации сайта мы сравнивали нуклеотидную последовательность сайта с аминокислотной последовательностью (таблица 20). Графики вариабельности, полученные с помощью программе WebLogo, показывают, что нуклеотиды первой и второй позиции кодонов консервативные (рисунок 13). Олигонуклеотид в сайте взаимодействия кодирует TKEQYE гексапептид, который идентичный во всех изученных ортологичных белках. Замены в третьей позиции нуклеотидов не влияют на содержание аминокислот в сайте связывания (рисунок 13). Этот гексапептид расположен от 13 до 18 позиции в консервативной области аминокислотной последовательности изученных тирозин-фосфатаз (таблица 20). Замены в одного или нескольких нуклеотидов в третьей позиции приводит к уменьшению энергии взаимодействия, но не влияет на локализацию сайта. Т
аблица 20 – Нуклеотидные последовательности мРНК гена PTPN12 в сайтах взаимодействия с miR-1279 и аминокислотные последовательности белка PTPN12 в области содержащей пентапептид TKEQYE [348]
Рисунок 13 – Вариабельность нуклеотидной и аминокислотной последовательности сайтов ортологов [348] Сайты связывания в ортологах имеют уровень достоверности от p<0.01 до p<0.0002 (таблица 21). Сайт взаимодействия идентичный у 11 видов от млекопитающих до земноводных, в других видах сайт имеет изменения, но не теряет своей эффективности. Полученные данные свидетельствуют, что сайт связывания существовал на ранних этапах эволюции и не менялся сотни миллионов лет. Таблица 21 – Характеристики взаимодействия hsa-miR-1279 с ортологами гена PTPN12
Таблица 22 - Характеристики взаимодействия hsa-miR-1279 с мРНК гена PTPN12 разных видов животных [348]
Данные таблицы 22 свидетельствуют, что miR-1279 связывается 5'-частью с мРНК гена PTPN12 всех видов животных. Следовательно, вероятность взаимодействия miR-1279 с мРНК ортологичных генов PTPN12 высокая. В таблице 22 приведены характеристики взаимодействия miR-1279 с мРНК ортологичных генов PTPN12 18 видов животных. Соответствующие сайты связывания определены с уровнем достоверности от p<0,0003 до p<0,0002. Вторая miRNA (miR-548m), взаимодействующая с CDS мРНК ортологичных генов PTPN12, имеет сайты связывания менее консервативные, чем сайты связывания для miR-1279. miR-548m связывается с CDS мРНК ортологичных генов PTPN12 в сайтах, кодирующих пентапептид EATDI у девяти видов животных (таблица 23). В олигопептидах гомологичных белков PTPN12 разных видов животных имеются точечные замены одной или двух аминокислот, однако гексапептиды расположены в той же позиции консервативной области белка. Характеристики сайтов связывания miR-548m приведены в таблице 24 и свидетельствуют о меньшей степени взаимодействия miR-548m с CDS мРНК ортологичных генов PTPN12. Таблица 23 - Нуклеотидные последовательности мРНК гена PTPN12 в сайтах взаимодействия с miR-548m и аминокислотные последовательности белка PTPN12 в области содержащей пентапептид EATDI [348]
Величина ΔG/ΔGm изменялась от 42,6% до 80,8% для 19 животных (p<0,96 до p<0,0003). У четырех животных сайт в изученной области не сохранился (Dre, Oan, Xla, Xtr). В девяти геномах сайт имеет высокую консервативность. Следовательно, влияние miR-548m на экспрессию гена PTPN12 слабее, чем miR-1279. Соответственно степень гомологии нуклеотидных последовательностей сайтов связывания в мРНК и степень гомологии пентапептидов ортологичных белков PTPN12 у разных животных меньше (рисунок 13). По данным таблицы 24, miR-548m связывается с мРНК ортологичных генов PTPN12 преимущественно 3'-частью или центральной частью (A. carolinensis, C. jacchus, Galus galus, Meleagris gallopavo, O. niloticus, P. abelii). Эти и приведенные выше данные свидетельствуют о возможности связывания мРНК с любой частью нуклеотидной последовательности miRNA. Полученные данные о свойствах сайтов связывания двух miRNA в белок-кодирующей области мРНК гена PTPN12 свидетельствуют о локализации сайтов в участках мРНК, кодирующих консервативные аминокислотные последовательности тирозин-фосфатазы. Несмотря на дивергенцию, произошедшую сотни миллионов лет назад для некоторых из 24 видов животных, взаимодействие мРНК ортологичных генов PTPN12 с изученными miRNA сохранилось. Этому способствовало расположение сайтов связывания в консервативных участках мРНК, которые определяют сохранение функции тирозин-фосфатазы. Благодаря этому сохранилась возможность регуляции экспрессии гена PTPN12 с помощью miRNA. Таблица 24 - Характеристики взаимодействия hsa-miR-548m с мРНК ортологичных генов PTPN12 разных видов животных [348]
Далее для того, чтобы проверить действие одной микроРНК на несколько генов будут рассмотрены сайты miR-1279 с мРНК генов MSH6 и ZEB1. Сайт связывания в мРНК гена MSH6 имеет однонуклеодный пузырь и четыре Г:У пары. Несмотря на это сайт имеет высокие параметры ΔG/ΔGm (89.4%) и энергию взаимодействия -25,2 kcal/mol. Таблица 25 - Нуклеотидные последовательности мРНК гена MSH6 в сайтах взаимодействия с miR-1279 и аминокислотные последовательности белка MSH6 в области содержащей пентапептид EGSSDE
Таблица 26 - Характеристики взаимодействия hsa-miR-1279 с ортологами гена MSH6
Олигонуклеотид в сайте связывания кодирует гексапептид EGSSDE в белке MSH6. Мы изучили 34 ортолога человеческого гена MSH6. Эффективность miR-1279 сайта сохраняется в 16 ортологах. Олигонуклеотиды сайта и соответственный олигопептид представлены в таблице 25. MSH6 белок 13 млекопитающих и человека имеют идентичных EGSSDE гексапептид и нуклеотидная последовательность сайта также у этих видов является высоко гомологичной. В первой аминокислоте олигопептида есть вариабельность по первому кодону кодирующий глутаминовую кислоту. EGSSDE олигопептид расположен с 13 по 18 позиции консервативного участка белка MSH6 (таблица 25). Вариабельность нуклеотидов и аминокислот представлена на рисунке 13. Все сайты связывания в мРНК гена MSH6 соответствуют одной рамке считывания. Достоверность сайтов связывания составляет от p<0.001 до p<0.00016 (таблица 26). У девяти ортологов сайт имеет полную идентичность (от шимпанзе до морской свинки). мРНК гена MSH6 у 11 животных имеет 3’-доминантный сайт miR-1279 и во всех этих видах высокую гомологию. В мРНК гена Bos Taurus и Loxodonta Africana сайт также имеет 3’-доминантный тип, но слабо взаимодействующий 5’-конец микроРНК (таблица 29). мРНК гена ZEB1 имеет сайт связывания с miR-1279, энергия взаимодействия составляет 90% от максимальной величины, потому что 16 нуклеотидов микроРНК из 17 комплементарны мРНК мишени. Сайт имеет две Г:У пары и однонуклеодный пузырь на обеих нитях. Для проверки доставерности сайта были изучены сайты в мРНК ортологов 16 организмов. 12 из них сохранили сайт miR-1279 и консервативные аминокислоты в сайте связывания (таблица 27). Нуклеотидная последовательность сайта взаимодействия имеет высокую гомологию (Рисунок 13). Таблица 27 - Нуклеотидные последовательности мРНК гена ZEB1 в сайтах взаимодействия с miR-1279 и аминокислотные последовательности белка ZEB1 в
области содержащей пентапептид GEKPYE Третий нуклеотид кодонов кодирующих тирозин и глутаминовую кислоту изменяется у разных организмов. Хотя это событие не влияет на аминокислотную последовательность и все 12 видов имеют в белке гексапептид GEKPYE. Этот олигопептид расположен в консервативной области белка (таблица 27). Характеристики сайтов связывания у ортологичных мРНК представлены в таблице 28. Сайт miR-1279 имеет хорошую консервативность среди млекопитающих и птиц, у земноводных сайт сохранился с меньшей точностью. Если рассматривать вид взаимодействия, то мРНК 9 видов имеет 3’-доминантный тип сайта с miR-1279. мРНК гена ZEB1 у M. musculus, X. laevis, X. tropicalis взаимодействует с 9-11 нуклеотидами с 3’-концом miR-1279, то есть также является 3'-доминантным сайтом (таблица 29). Таблица 28 - Характеристики взаимодействия hsa-miR-1279 с ортологами гена ZEB1
Исследованные сайты генов PTPN12, MSH6, ZEB1 показывает стабильную консервативность сайтов микроРНК среди млекопитающих и позвоночных, что свидетельствует о значимости данных сайтов в регуляции генов мишеней. Таблица 29 - Схемы взаимодействия нуклеотидных последовательностей в сайтах связывания hsa-miR-1279 с мРНК генов MSH6, ZEB1 разных животных
Полученные результаты свидетельствуют, что сайты связывания с высокой комплементарностью, локализованные в кодирующей области мРНК, высоко консервативны среди позвоночных. В результате исследования филогенетической консервативности сайтов связывания микроРНК c мРНК были опубликованы ряд публикаций [348-350]. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям