Изучение тканеспецифической экспрессии сплайс-вариантов мрнк il-4 и il-6 у мыши и человека 14. 03. 09 Клиническая иммунология, аллергология
|
|
Скачать 274.43 Kb.
|
На правах рукописиЯценко Ольга ПетровнаИЗУЧЕНИЕ ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССИИ СПЛАЙС-ВАРИАНТОВ мРНК IL-4 И IL-6 У МЫШИ И ЧЕЛОВЕКА 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Новосибирск, 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН. Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор ^ Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Кожевников Владимир Сергеевич доктор медицинских наук, профессор ^ Ведущее учреждение: ФГУП «Гос. НИИ ОЧБ» ФМБА России, 197110 , Санкт-Петербург, ул. Пудожская, д. 7, Тел.: 8 (812) 235-12-25, тел./факс: 8 (812) 230-49-48 Защита диссертации состоится « » 2011 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 в НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН (630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14) Автореферат разослан 28 cентября 2011 г. Ученый секретарьдиссертационного совета, доктор медицинских наук Колесникова Ольга Петровна ^ Актуальность проблемы. Общее количество генов, обнаруженное в геноме человека, в процессе выполнения проектов по секвенированию всего генома по разным подсчётам не превышает 30-40 тысяч, в то же время база экспрессирующихся последовательностей человека на порядок больше. Причины этого многообразия кроются в посттранскрипционных событиях. Одним из наиболее значимых посттранскрипционных событий является альтернативный сплайсинг пре-мРНК, который, благодаря комбинированию порядка и количества экзонов, позволяет продуцировать различные зрелые транскрипты от одного единственного гена без изменения его геномной организации. Белки, образующиеся вследствие трансляции альтернативно сплайсированных мРНК, могут выполнять как сходные, так и различные функции. Было продемонстрировано, что альтернативный сплайсинг вовлечен в процессинг пре-мРНК генов IL-1β, IL-1α, IL-1Ra, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-15, M-CSF, G-CSF, TGF-α, c-kit, LIF, SCF, FasL, онкостатина М, IL-2R, IL-4R, IL-5R IL-6R IL-9R GM-CSF эритропоэтина, некоторых хемокинов (VCAM) и т.д., приводя к образованию тканеспецифических изоформ различной локализации (мембрансвязанных, секреторных, внутриклеточных) и функции [Сенников С.В. и др., 2001]. В этом отношении представляют интерес два иммунорегуляторных медиатора IL-4 и IL-6, имеющие важное значение для регуляции многих клеточных процессов, в том числе гемопоэза и иммунопоэза на разных этапах онтогенетического развития [Chomarat P., 1997; Paul W.E., 1991; Banchereau J., 1991; D'Andrea A, 1995; Ryan D.H., 1994], и для этих медиаторов показано, что их экспрессия происходит с участием альтернативного сплайсинга [Alms W.J., 1996; Kestler D., 1995; Bihl M., 2002]. Ген IL-4 у человека экспрессируется в виде двух форм мРНК: полноразмерной формы, содержащей все 4 экзона и альтернативно сплайсированной, не содержащей 2-го экзона, названной IL-42 [Alms W.J., 1996; Glare E.M., 1999; Seah G.T., 2001]. Образование изоформ мРНК IL-4 у взрослого человека имеет тканеспецифический характер: обычно мРНК IL-42 обнаруживается в мононуклеарных клетках (МНК) периферической крови человека в минорных количествах [Alms W.J., 1996], однако в ряде случаев в МНК периферической крови [Alms W.J., 1996; Atamas S.P., 1996], а также в клетках тимуса и бронхо-альвеолярного лаважа [Atamas S.P., 1996], клеточных линиях B95/8 и HL60 [Klein S.C., 1996] обнаруживается преобладание мРНК IL-42 над полноразмерной формой. Рекомбинантный человеческий белок IL-4δ2 (rhIL-42) способен связываться с рецептором IL-4 и ингибировать действие rhIL-4 на иммунокомпетентные клетки [Arinobu Y., 1999; Atamas S.P., 1996]. Для гена IL-6 показано существование у человека пяти сплайс-вариантов мРНК IL-6: hIL-6 мРНК, hIL-6alt мРНК, hIL-6∆2 мРНК, hIL-6∆2,4 мРНК и hIL-6∆4 мРНК [Bihl M.,2002; Kestler D.,1995]. Данных об их экспрессии мало, а сведения по биологической активности противоречивы. Остаётся невыясненным имеет ли сплайсинг мРНК генов IL-4 и IL-6 особенности в различных тканях на разных этапах онтогенеза и как их экспрессия может меняться под действием других регуляторных молекул. Систематизированные данные по тканеспецифической экспрессии сплайс-вариантов мРНК могут прояснить физиологическую роль альтернативных вариантов этих цитокинов. При отсутствии антител способных специфически связывать изоформы или метода анализа мРНК in situ для оценки уровней экспрессии широко применяется метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Учитывая трудности получения образцов тканей от человека, представляется возможным в ряде экспериментов исследовать особенности экспрессии генов на животных. Оптимальной моделью для исследований в иммунологии является мышь, которая имеет значительное сходство с человеком в геномной организации иммунной системы. Использование мышиной модели допустимо для изучения спектра сплайс-вариантов мРНК, так как имеющиеся в литературе данные о механизмах сплайсинга, говорят о том, что он происходит однотипно у человека и мыши в случае некоторых мРНК интерлейкинов [Thanaraj T.A., 2003; Sorek R., 2003]. Изучение тканеспецифического распределения различных сплайс-вариантов мРНК цитокинов в онтогенезе может во многом поменять наши взгляды на регуляцию иммунных и дифференцировочных процессов. В связи с вышеизложенным актуальным представляется изучение роли альтернативного сплайсинга в экспрессии генов IL-4 и IL-6 как ключевых цитокинов в регуляции иммунных процессов. ^ поиск новых сплайс-вариантов мРНК IL-4 и IL-6 и изучение особенностей их экспрессии в разных тканях и на разных этапах онтогенеза у мыши и человека. ^
^ Впервые продемонстрировано наличие специфических мРНК IL-4δ2, IL-6δ3 и IL-6δ5 в клетках мыши и выполнено систематизированное исследование экспрессии сплайс-вариантов мРНК IL-4 и IL-6 в различных тканях мыши. Установлено, что кинетика экспрессии сплайс-вариантов IL-4 при митогенной стимуляции аналогична в клетках мыши и человека. Впервые продемонстрирована экспрессия мРНК IL-4аlt3 и мРНК IL-6δ2δ4 в мононуклерных клетках человека. Доказан тканеспецифический характер экспрессии мРНК IL-4 и IL-6 в фетальных тканях человека. ^ В работе продемонстрировано, что экспрессия генов IL-4 и IL-6 в клетках человека и мышей происходит с участием альтернативного сплайсинга. При этом у мышей альтерантивно сплайсированные варианты мРНК этих генов экспрессируются как минорные варианты, а у человека наблюдается тканеспецифическая экспрессия сплайс-вариантов, которая имеет качественные и количественные различия. Полученные результаты расширяют представления об экспрессии генов цитокинов клетками различных органов и тканей, позволяют глубже понять взаимосвязи внутри цитокиновой сети и их взаиморегуляцию. В частности в период фетального развития человека экспрессия альтернативных сплайс-вариантов мРНК IL-4 и IL-6 может быть доминантной, что отражает особенности тканеспецифической регуляции гистогенеза. Представленные в работе факты экспрессии генов цитокинов в виде нескольких форм существенно дополняют представления о структуре и функционировании цитокиновой сети. Эти данные позволяют иначе взглянуть на организацию цитокин-опосредованных взаимодействий, поскольку механизм альтернативного сплайсинга также активно используется генами рецепторов IL-4 и IL-6. Из полученных данных можно сделать предположение о возможности непосредственного участия изоформ цитокинов в иммунорегуляции. Выяснение спектра экспрессии генов цитокинов в различных тканях также может быть полезным для определения роли изоформ в норме и патологии. ^ 1.Экспрессия генов IL-4 и IL-6 в клетках человека и мышей происходит с участием альтернативного сплайсинга, причем характер экспрессирующих последовательностей имеет как качественные, так и количественные различия. 2. Экспрессия мРНК IL-4 и IL-6 в клетках человека имеет тканеспецифический характер. ^ Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1) Международной научно-практической школе-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет» (Новосибирск, 2002г.), 2) 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2003г.), 3) 7-ом Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003г.), 4) 8-ом всероссийского научном форуме с международным участием имени В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004г.), 5) Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетичекие основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010г.), 6) Семинаре экспериментального отдела НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН (Новосибирск, 2011г.). Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в том числе 4 статьи в журналах рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ. ^ Результаты, представленные в данной работе, получены лично автором на базе лаборатории молекулярной иммунологии НИИКИ СО РАМН и группы фармакогеномики ИХБФМ СО РАН. ^ Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения и выводов. Библиографический указатель включает 147 источников, из них 137 зарубежных, 10 - отечественных. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 3 таблицами. ^ Материалом для исследований данной работы стали образцы тканей мышей (СBAC57BL/6J)F1, (DBA/2JC57BL/6J)F1 и человека (кровь условно-здоровых доноров, фетальные ткани). Животные. В работе использовались интактные животные, полученные из НИЛ ЭБМ Томского Научного Центра СО РАМН и лаборатории экспериментальных животных (моделей) ГУ НИИ КИ СО РАМН, а также особи иммунизированные эритроцитами барана и самки в I, II и III триместрах беременности. Иммунизацию эритроцитами барана проводили внутрибрюшинно в дозе 4х109, 2х108 или 4х105 в 0.5мл RPMI-1640, селезёнку забирали через 24 часа. Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации, эмбрионов - ингаляцией эфира. Выделенные от мышей селезенки и костный мозг гомогенизировали шприцем, ресуспендировали в среде RPMI-1640, подсчитывали количество клеток и оценивали их жизнеспособность. МНК выделяли на градиенте фиколла-урографина плотностью 1,082. Выделенные клетки использовали для культивирования или помещали в лизирующий раствор (1х106 кл.) и хранили при -200С до использования. Для изучения тканеспецифической экспрессии на холоду были взяты следующие ткани мыши: печень, тимус, ткань легкого, лимфатические узлы, плейеровы бляшки, стенка кишечника, ткань мышцы, плацента и эмбриональные ткани: печень эмбриона на 11 и 15 сутки и мозг эмбриона после 14 суток гестации. Выделенную от каждой мыши ткань замораживали в жидком азоте и хранили при -700С до использования. Культивирование спленоцитов и МНК костного мозга мыши in vitro. Клетки в количестве 5х106 культивировали в чашках Петри в среде RPMI-1640, дополненной 2 мМ L-глутамином, 5%-ной инактивированной фетальной телячьей сывороткой, 50 мкМ β-2-меркаптоэтанолом и гентамицином (80 мкг/мл), в течение 48 ч в СО2-инкубаторе при 37оС. Растворы митогенов добавляли в культуральную среду однократно вначале культивирования в следующих концентрациях: Конканавалин А (КонА) из расчета 10 мкг/ 1 млн. клеток, ЛПС E.сoli 055:B5 - 30 мкг/ 1 млн. клеток. Ткани человека. Образцы фетальных тканей человека были получены из абортивного материала при прерывании беременности по социальным показаниям в сроке 20-24 недели. Фетальные ткани исследовали на отсутствие основных инфекций (герпес 2 типа, гепатиты В и С, цитомегаловирус, ВИЧ, реакция на Hbs-Ag и RW). Исследования с фетальными тканями одобрены Локальным этическим комитетом и проводились при наличии информированного согласия женщин. У всех доноров периферической крови было получено информированное согласие на процедуру забора биологического материала и разъяснены цели исследования. Выделение и культивирование МНК периферической крови проводили стандартными методами [Boyum A., 1968; Силков А.Н., 2007]. Растворы цитокинов и КонА добавляли в культуральную среду однократно вначале культивирования в следующих концентрациях: КонА из расчета 10 мкг/ 1 млн. клеток, rhIL-2 – 10 нг/мл, rhIL-4 – 5 нг/мл, rhIL-IL-4δ2 – 100 нг/мл, rhIFNγ – 3 нг/мл, rhIL-18 - 40 нг/мл, rhIL-10 15 нг/мл, эритропоэтин – 5U/мл. В качестве контроля использовали культуры МНК без цитокинов с КонА и без него. Жизнеспособность клеток не изменялась в процессе культивирования и составляла не менее 98% по окраске трипановым синим. Выделение суммарной клеточной РНК и получение кДНК. Суммарную РНК выделяли по методу Chomozynski P. и Sacchi N. [Chomozynski P., 1987]. Качество суммарной РНК оценивали электрофорезом в 1,5% агарозном геле, количество определяли спектрофотометрически по поглощению при 260 нм. РНК хранили при -70oC до момента использования. кДНК получали из 1 мкг суммарной РНК в реакции обратной транскрипции (ОТ) с использованием 5 мкМ d(рT)18 праймера и 100 ед. акт. MoMLV РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ИХБФМ СО РАН) в 20 мкл буфера, содержащего 20 мM Tris-HCl, pH 8,3, 2мM MnCl2, 5 мM дитиотреитол, 100 мM KCl, 400 мкM dNTP. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР проводили в объеме 20 мкл реакционной смеси с 1 ед.акт. Taq- полимеразы (ИХБФМ СО РАН). Амплификационная смесь содержала 2 мкл (~50 нг) кДНК в качестве матрицы, 200 мкM раствор dNTP, в стандартном буфере, содержащем 67 мМ трис-HCI (рН 8.9), 16 мМ сульфат аммония, 1,5 мМ МgС12, 0,05% Tween-20, 20 пкМ каждого праймера для амплификации. Условия ПЦР: денатурация 95C – 3 мин; затем 40 циклов по 7сек при 95C, 7 сек при 62C и 12 сек при72C. Заключительный цикл элонгации – 3 мин при 72C. Для усиления чувствительности и специфичности выполнялась «вложенная» ПЦР с продуктом первого раунда ПЦР в качестве матрицы. Дезоксирибоолигонуклеотидные праймеры были синтезированы в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и имели последовательности, представленные в таблице 1. Дизайн праймеров был проведен с помощью программы «PrimerPremier» на основе нуклеотидных последовательностей, опубликованных в базе данных GeneBANK. Конкурентную ПЦР выполняли как описано ранее [Auboeuf D., 1997]. Конкурентные стандартные ДНК для определения количества кДНК IL-4 и IL-42 были получены амплификацией геномной ДНК фага Т7 с праймерами, специфичными для исследуемых кДНК, с использованием низкой температуры отжига на первых циклах. Продукты реакции амплификации (10 мкл) подвергали разделению электрофорезом в 6% полиакриламидном геле или в 1,5%-м агарозном геле. Гель окрашивали бромистым этидием (0,5мг/мл) и визуализировали ДНК под УФ-светом. Изображение фиксировали с помощью CD-камеры Watec AD-901 (Watec Co., LTD, Япония). Количество ДНК высчитывали по плотности полос с помощью программы ScionImage [http://www.scioncorp.com]. Строили график линейной регрессии, откладывая по оси ординат логарифм отношений количества конкурентной ДНК к исследуемой кДНК, а по оси абсцисс логарифм начальных концентраций конкурентной ДНК, в которых она добавлялась в ПЦР. Определяли точку эквивалентности, в которой логарифм отношений количества конкурентной ДНК к кДНК был равен 0, и изначальное количество исследуемой кДНК соответствовало начальному количеству конкурентной ДНК. По результатам трех повторных измерений для каждой кДНК высчитывали среднее значение, а также стандартную ошибку среднего. Исследование уровня экспрессии мРНК ИЛ-4 и ИЛ-4δ2 в ткани тимуса, печени и селезёнки 24-недельных фетусов проводили методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (РТ-ПЦР) на приборе ICyclerIQ (Bio-Rad Laboratories, США) с применением интеркалирующего флуоресцентного агента SYBR Green I. Амплификацию всей серии образцов проводили одновременно, по две точки на каждый образец кДНК, анализ проводили два раза. Нормировку количества кДНК, взятой в анализ проводили, измеряя количество кДНК рибосомного белка S26 человека. Секвенирование. Продукты амплификации элюировали из геля как описано ранее [Маниатис Т., 1984]. Секвенирование проводили по методу Сэнгера с использованием набора BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Amersham) в соответствии с рекомендациями фирмы производителя. Электрофоретическое разделение продуктов секвенирования проводили на автоматическом ДНК секвенаторе ABI310. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей проводили с использованием пакета программ VectorNTI (Informatics). Таблица 1 ^
Гидролиз эндонуклеазами рестрикции. Гидролиз ДНК проводили в 1х буфере, соответствующем выбранной эндонуклеазе рестрикции, согласно рекомендаций производителя ферментов. Результат оценивали после электрофоретического разделения продуктов рестрикции в 6% ПААГ. результаты И ОБСУЖДЕНИЕ Первой задачей данного исследования был поиск в клетках мыши мРНК IL-4δ2 - аналогичной варианту, обнаруженному у человека и других видов животных. Система олигонуклеотидных праймеров была разработана таким образом, что позволяла селективно детектировать полноразмерный вариант мРНК IL-4 и альтернативно сплайсированный IL-42. Для поиска мРНК IL-42 мыши были использованы суммарные кДНК из спленоцитов и МНК костного мозга, культивированных in vitro с КонА, ЛПС и без митогенов. Фрагменты соответствующие мРНК IL-42 мыши (нуклеотидная структура определена прямым секвенированием по методу Сэнгера) присутствовали в образцах клеток селезенки и костного мозга, стимулированных КонА и не были выявлены ни в одном из образцов кДНК из культур клеток без митогенов или при стимуляции ЛПС. Присутствие минорных количеств мРНК IL-42 в интактных клетках костного мозга и селезенки обнаруживалось только при проведении «вложенной» двухстадийной ПЦР, которая характеризуется более высокой чувствительностью.
Рис. 1.^ При изучении кинетики экспрессии мРНК IL-4 и мРНК IL-4δ2 в культурах спленоцитов мыши, показано, что при стимуляции КонА в них происходила индукция экспрессии как мРНК IL-4, так и мРНК IL-4δ2. Максимальный уровень мРНК IL-4δ2 наблюдался через 3 часа после добавления КонА с последующим резким падением уровня экспрессии. Незначительный уровень мРНК IL-4δ2 продолжал определяться в клетках вплоть до 48 часов культивирования. Пик индукции мРНК IL-4 наблюдался через 6 часов после начала стимуляции, и далее уровень мРНК постепенно снижался (рис.1). С помощью конкурентной количественной ПЦР показано, что на пике индукции (6 часов) уровень мРНК полноразмерной формы был в 14 раз выше, чем уровень мРНК IL-4δ2. Эти результаты согласуются с опубликованными в литературе работами, где также наблюдали повышение уровня экспрессии обеих изоформ интерлейкина-4 (полноразмерного варианта – в большей степени) и через несколько часов возвращение к базовому уровню. Следующим этапом работы стало изучение тканеспецифического распределения сплайс-вариантов мРНК интерлейкина-4 у мышей. Были исследованы ткани мыши: печень, тимус, легкое, лимфатические узлы, плейеровы бляшки, стенка кишечника, мышца, плацента и эмбриональные ткани: печень эмбриона на 11 и 15 сутки и мозг эмбриона после 14 суток гестации. Матричная РНК полноразмерного варианта IL-4 детектировалась в большинстве образцов (печени, лимфатических узлов, плейеровых бляшек, стенки кишечника, мышцы, плаценты и фетальной печени) при одностадийной ОТ-ПЦР. Матричная РНК IL-4δ2 не определялась в нативных тканях методом одностадийной ПЦР и была обнаружена только более чувствительным методом «вложенной» двухстадиной ПЦР. На этом основании было заключено, что сплайс-вариант мРНК IL-4δ2 у мыши в обследованных образцах тканей является минорной формой, по отношению к доминантной полноразмерной форме мРНК IL-4. Для изучения особенностей экспрессии гена IL-6 мыши использовали те же образцы кДНК, что и в экспериментах по изучению экспрессии гена IL-4. Для увеличения специфичности и чувствительности метода использовали двухстадийную («вложенную») ПЦР.
Рис. 2. ^ Примечание: A – кДНК из клеток селезенки, мыши через 24 часа после иммунизации эритроцитами барана в дозе 4х109; B - кДНК из клеток печени интактной мыши; С - кДНК из клеток плаценты мыши во II триместре беременности; D - кДНК из клеток плаценты мыши в III триместре беременности. Стрелками отмечены фрагменты: 1 - 640 п.о. (mIL-6), 2 - 582 п.о. (mIL-6∆5), 3 - 526 п.о. (mIL-6∆3). Из представленной на рис. 2 электрофореграммы видно, что помимо основного фрагмента ДНК размером 640 п.о., соответствующего полноразмерной форме мРНК mIL-6, в образцах присутствуют дополнительные фрагменты меньшей величины, соответствующие альтернативным сплайс-вариантам мРНК интерлейкина-6. Секвенирование полученных нуклеотидных последовательностей показало, что фрагмент 2 содержит делецию участка экзона 5 размером 58 п.о., а фрагмент 3 – делецию экзона 3, размером 114 п.о. Соответствующие сплайс-варианты были обозначены как mIL-6∆5 и mIL-6∆3. Матричную РНК mIL-6∆3 и мРНК mIL-6∆5 детектировали в селезенке мыши через 24 часа после иммунизации эритроцитами барана в дозе 4х109 и в плаценте во II и III триместрах. Кроме того, мРНК mIL-6∆5 обнаружена в печени интактной мыши. Описанная выше серия экспериментов продемонстрировала, что cплайсинг матричных РНК IL-4 и IL-6 у человека и мыши происходит видоспецифично. Поэтому дальнейшие исследования особенностей экспрессии сплайс-вариантов матричных РНК IL-4 и IL-6 выполнялись на тканях человека, в том числе фетальных. Для исследования спектра сплайс-вариантов мРНК интерлейкина-4 в фетальных тканях человека использовали подход, позволяющий амплифицировать последовательности всех возможных сплайс-вариантов. Результаты представлены в таблице 2. Таблица 2 ^
Примечание: Приведены результаты исследования 2-4 образцов каждой ткани. «+» - ПЦР-продукт присутствовал во всех образцах, «-» - отсутствие специфического ПЦР-продукта, «+\-» - ПЦР-продукт присутствовал не во всех исследованных образцах. В фетальных тканях, имеющих непосредственное отношение к гемопоэзу и иммунопоэзу (тимус, печень, селезёнка) была предпринята попытка количественно охарактеризовать уровень матричных РНК IL-4 и IL-4δ2. Измерения проводили методом ОТ-ПЦР с флуоресцентной детекцией результатов в «реальном времени». Результаты представлены на рис. 3. Показано, что экспрессия полноразмерного варианта в тимусе в среднем на 1-2 порядка выше, чем в печени и селезёнке. Это согласуется с данными Klein S.C. с совт. и Atamas S.P., которые наблюдали слабую экспрессию мРНК IL-4 в клетках тимуса [Klein S.C. et all., 1996; Atamas S.P., 1996].
Примечание: Данные приведены в относительных единицах как среднее + стандартное отклонение для четырех образцов печени, селезенки и тимуса. Количественный анализ мРНК IL-4δ2 показал, что в печени его в среднем в 2-5 раз больше, чем в селезёнке или тимусе. В то же время в тимусе у эмбрионов мРНК IL-4δ2 даже чуть больше, чем в селезёнке (рис.3). Т акже было исследовано влияние некоторых цитокинов в культуре in vitro МНК периферической крови здоровых людей на спектр экспрессируемых ими мРНК IL-4, поскольку известно, что продукция цитокинов и их изоформ в культуре клеток может меняться под воздействием цитокинов и ростовых факторов [Chomarat P., 1997; D'Andrea A., 1995; Hart P.H., 1989; Силков А.Н., 2005; Douay L., 1994]. В культуре клеток использовалась панель рекомбинантных цитокинов человека, включающая IL-2, IL-4, IL-4δ2, IL-10, IL-18, IFNγ и эритропоэтин. Выделенные от условно здоровых доноров МНК периферической крови культивировались в течение 6 часов в присутствии и в отсутствии цитокинов и КонА. Констатировано присутствие в культурах клеток мРНК IL-4 и мРНК IL-4δ2. В МНК некоторых доноров, культивированных в присутствии rhIL-18 был обнаружен дополнительный фрагмент ДНК меньшего размера, соответствующий мРНК IL-4alt3, что было определено методом ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) - анализа и прямого секвенирования. В экспериментах по изучению спектра экспрессируемых мРНК IL-6 у мыши были обнаружены два новых сплайс-варианта: IL-6∆3 и IL-6∆5. Поскольку в литературе приводятся противоречивые сведения о спектре сплайс-вариантов IL-6 у человека, была сконструирована система праймеров, позволяющая выявить все возможные сплайс-варианты мРНК интерлейкина-6 у человека. На рисунке 4 представлена электрофореграмма продуктов ПЦР, где в качестве матрицы использовали кДНК из МНК периферической крови свежевыделенных от условно здоровых доноров, а также МНК периферической крови, культивированных в течение 48 часов спонтанно, в присутствии КонА или в присутствии rhIL-18. Все образцы содержат фрагмент ожидаемой длины (711 п.о.), соответствующий мРНК IL-6. Кроме того, во всех дорожках присутствует фрагмент меньшей длины (520 п.о.).  Рис. 4. Электрофореграмма в 6% ПААГ продуктов ПЦР с праймерами 6hum1/6hum2 на матрицах кДНК из нативных и культивированных МНК периферической крови. Примечание: 1-4 - донор 1, 5-8 – донор 2. М - маркёр молекулярного веса pGK3/HaeIII (видны полосы 734, 525, 503, 404). 1 и 5 - нативные МНК, 2 и 6 - МНК после культивации, 3 и 7 - МНК культивированные с добавлением КонА (10 мкг/мл), 4 и 8 - МНК культивированные с добавлением IL-18 (40 нг/мл). Методом ПДРФ - анализа было установлено, что он соответствует мРНК IL-6δ2, в которой отсутствует второй экзон. В образцах из свежевыделенных МНК периферической крови присутствует дополнительный фрагмент (373 п.о.), соответствующий мРНК IL-6δ2δ4, что также было определено методом ПДРФ. В процессе культивирования МНК периферической крови человека происходит изменение спектра экспрессируемых сплайс-вариантов матричных РНК IL -6: изоформа мРНК IL-6δ2δ4 (373 п.о.) исчезает. Таким образом, в МНК периферической крови человека присутствуют мРНК IL-6, мРНК IL-6δ2 и мРНК IL-6δ2δ4. Присутствие мРНК IL-6δ2δ4 в МНК периферической крови человека показано впервые. Далее были исследованы фетальные ткани человека на предмет присутствия в них сплайс-вариантов мРНК IL -6. В тканях фетусов был обнаружен тот же спектр матричных РНК интерлейкина-6, что и в предварительных эксперимнтах с митоген-стимулированными МНК периферической крови человека (табл. 3). При этом в ткани поджелудочной железы и мозга обнаруживался только полноразмерный вариант, мРНК IL-6; в яичнике, печени и коже - только альтернативные варианты: мРНК IL-6δ2 и мРНК IL-6δ2,4. В тканях щитовидной железы, надпочечника, легких, селезенки, тимуса, миокарда, яичка и почки выявлялись мРНК IL-6 и мРНК IL-6δ2, причём интенсивность сигнала была приблизительно одинаковая для обоих сплайс-вариантов. Таблица 3 ^ человека
Примечание: Приведены результаты исследования 2-4 образцов каждой ткани. «+» - ПЦР-продукт присутствовал во всех образцах, «-» - отсутствие специфического ПЦР-продукта, «+\-» - ПЦР-продукт присутствовал не во всех исследованных образцах. Выводы
^
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям