Леплина ольга Юрьевна Характеристика интерферон-альфа-индуцированных дендритных клеток и их терапевтический потенциал в лечении онкологических и инфекционных заболеваний
|
|
Скачать 0.66 Mb.
|
|
На правах рукописи ЛЕПЛИНА Ольга Юрьевна Характеристика интерферон-альфа-индуцированных дендритных клеток и их терапевтический потенциал в лечении онкологических и инфекционных заболеваний 14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология А В Т О Р Е Ф Е Р А Т диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Новосибирск - 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН ^ доктор медицинских наук, профессор Елена Рэмовна Черных Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Анна Вениаминовна Шурлыгина доктор медицинских наук Константин Валентинович Гайдуль доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН Ирина Соломоновна Фрейдлин ^ Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, г. Москва Защита состоится «_22_»_декабря__2011 г. в__14.00_часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 при НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: (630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14) Автореферат разослан «____»_________________2011г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук О.Т. Кудаева  ^ Актуальность темы. Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антигенпрезентирующими клетками (АПК), играющими центральную роль в поддержании врожденного иммунитета. Благодаря высокой экспрессии MHC антигенов I и II класса, костимуляторных молекул (CD80, CD86) и продукции широкого спектра цитокинов и хемокинов ДК обладают способностью активировать наивные Т-клетки и индуцировать антигенспецифический иммунный ответ [Massard G. et al, 1996; Peters J. et al, 1996]. Наряду со способностью индуцировать активацию иммунокомпететных клеток, ДК могут также ингибировать иммунный ответ. Толерогенные/супрессорные свойства ДК обусловлены различными механизмами, в том числе способностью ДК экспрессировать коингибиторные молекулы и рецепторы (B7-H1, ILT-2, ILT-3, ILT-4, CD209, CD200R и HLA-G), продуцировать иммуносупрессивные цитокины (IL-10, TGF-β), [Reichardt W. et al, 2008; Fedoric B. et al, 2008] и индуцировать генерацию регуляторных Т-клеток (СD4+СD25+Т рег) [Suciu-Foca N. et al, 2005]. Недавние исследования также показали, что ДК могут подавлять пролиферацию и оказывать непосредственный цитотоксический эффект на клетки опухолевых линий [Wesa A. et al, 2008, Chauvin C. et al, 2008]. Противоопухолевая активность ДК опосредуется с участием различных молекул семейства фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α, lymphotoxin-α1β2, FasL, TRAIL), а также перфорина и/или гранзима [Wesa A. et al, 2008; Korthals M. et al, 2007] и имеет, по-видимому, большое значение, поскольку высвобождающиеся опухолевые антигены могут сразу же презентироваться дендритными клетками Т-лимфоцитам, обеспечивая запуск специфического иммунного ответа. Изменения в количественном содержании и функциональной активности ДК выявлены при многих заболеваниях [Duan X.Z. et al, 2005; Pinzon-Charry A. et al, 2005; Yang L. et al, 2004]. При этом снижение стимуляторной активности ДК рассматривается в качестве возможного механизма персистенции вирусной и бактериальной инфекции, а также ускользания опухоли от иммунного надзора [Della Bella S. еt al, 2006; Zhang Z. et al, 2006; Ulsenheimer A. et al, 2005; Chen L. et al, 2007], тогда как нарушение толерогенных свойств ДК при гестации чревато угрозой преждевременного прерывания беременности [Scholz C. et al, 2008; Darmochwal-Kolarz D. et al, 2003]. Способность ДК индуцировать антигенспецифический иммунный ответ и наличие цитотоксической активности сделали эти клетки привлекательными кандидатами для иммунотерапии опухолевых и инфекционных заболеваний. Действительно, исследования на животных [Akbar S.M. et al, 2004] и клинические испытания у человека [Steinman R.M. et al, 2001; Mashino K. et al. 2004, Chen L. et al, 2005] показали, что вакцинация миелоидными ДК, презентирующими вирусные или опухолевые антигены, приводит к индукции специфического иммунного ответа, что сопровождается положительным клиническим эффектом. С другой стороны, толерогенные ДК представляют интерес в плане лечения аутоиммунных заболеваний, патологии беременности и трансплантации органов и тканей [Lim D-S. et al, 2009]. Изучению ДК и их клинической апробации во многом способствовала разработка методов генерации ДК in vitro. При этом выяснилось, что условия культивирования существенно влияют на свойства генерируемых ДК [Hart D.N. et al, 1997; Bender A. et al, 1996]. Традиционно ДК получают путем культивирования прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) в присутствии двух ключевых цитокинов - GM-CSF и IL-4 [Thurner B. et al, 1999]. Генерируемые таким образом незрелые миелоидные дендритные клетки (ИЛ4-ДК) обладают высокой способностью к захвату антигена, но слабой способностью активировать Т-клетки. Дальнейшее культивирование ДК в присутствии TNF-α, IL-1, LPS, CD40-лиганда или коктейля «дозревающих» стимулов ведет к созреванию ДК и повышению их способности стимулировать Т-клеточный ответ [Jonuleit H. et al, 2007]. Однако генерируемые in vitro ИЛ4-ДК обладают низкой миграционной активностью и в условиях дефицита ростовых факторов могут подвергаться обратной трансформации в моноциты. Наряду с традиционным протоколом, Santini с соавт. продемонстрировали, что частично зрелые ДК можно генерировать при замене IL-4 интерфероном-α [Paquette R. et al, 1998; Santini S. et al, 2000; Santini S. et al, 2003; Santini S. et al, 2009; Santini S. et al, 2005]. Интерферон-α индуцированные ДК (ИФН-ДК) генерируются быстрее по времени, обладают высокой поглотительной активностью, сохраняют стабильность в отсутствие цитокинов и превосходят ИЛ4-ДК по миграционной активности, способности стимулировать CD8 Т-лимфоциты. Кроме того, ИФН-ДК индуцируют более сбалансированный иммунный ответ, поскольку наряду с выраженной Th1-стимулирующей способностью обладают умеренной Th2-стимулирующей активностью [Parlato S. et al, 2001; Santini S. et al, 2003; Carbonneil C. et al, 2004]. Учитывая также, что интерфероны способны усиливать цитотоксический потенциал ДК [Lu G. et al, 2002; Chauvin C. et al, 2008; Papewalis C. et al, 2008] и ИФН-ДК по некоторым данным могут обладать более выраженной цитотоксической активностью [Korthals M. et al, 2007], применение этого типа ДК при опухолевых и вирусных заболеваниях представляется весьма перспективным. Однако до сих пор свойства этих клеток (включая спектр и уровень продуцируемых ДК цитокинов, экспрессию поверхностных молекул и способность активировать Th1 и Th2 ответ), особенно активированных ИФН-ДК, охарактеризованы недостаточно. Практически отсутствуют сравнительные данные о цитотоксической и толерогенной активности ИЛ4-ДК и ИФН-ДК. Неисследованным остается также вопрос, насколько эффективно могут генерироваться ИФН-ДК при патологии и отличаются ли ИФН-ДК пациентов по функциональной активности. Наконец, большой интерес представляет клиническая апробация ИФН-ДК в качестве адьювантной клеточной терапии, направленной на активацию специфического иммунного ответа у больных с опухолевыми и инфекционными заболеваниями. В связи с вышеизложенным, была сформулирована цель работы: на основании сравнительной характеристики ИФН-ДК и ИЛ4-ДК, анализе свойств ИФН-ДК при физиологических и патологических состояниях, оценке возможности их регуляции in vitro и клинической апробации у больных с внутримозговыми опухолями и хроническими вирусными инфекциями обосновать возможность использования ИФН-ДК в лечении онкологических и инфекционных заболеваний. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
^ Исследование свойств LPS-активированных интерфероном- ДК в сравнении со стандартно генерируемыми ИЛ4-ДК показало, что популяция ИФН-ДК характеризуется более высоким содержанием клеток, экспрессирующих CD14, СD11c/CD123 и TRAIL, и меньшим количеством CD83+ клеток. При этом ИФН-ДК отличаются более высокой продукцией IFN-γ, IL-2, IL-17, IL-1β, IL-10, IL-5, G-CSF и MCP-1, более активно индуцируют генерацию CD3+IFNγ+ T-клеток и способны активировать CD3+IL4+ Т-клетки. Кроме того, ИФН-ДК проявляют более выраженную цитостатическую активность против TRAIL-чувствительных опухолевых клеток и более высокую цитотоксическую активность в культурах TRAIL-резистентных опухолевых клеток. Сравнение способности ИФН-ДК и ИЛ4-ДК индуцировать регуляторные Т-клетки позволило получить новые данные о толерогенном/супрессорном потенциале анализируемых ДК. В частности, показано, что в отсутствие активации LPS интактные ИФН-ДК индуцируют не только генерацию СD4+FoxP3+, но также СD8+FoxP3+ и СD4+IL-10+- клеток, тогда как после активации LPS, ИФН-ДК теряют способность индуцировать генерацию СD4+FoxP3+- и обладают сходной с ИЛ4-ДК стимулирующей активностью в отношении СD8+FoxP3+ и СD4+IL-10+-клеток. В работе впервые исследована возможность генерации и свойства ИФН-ДК при различных онкологических и инфекционных заболеваниях. Продемонстрировано, что популяция ДК больных с онкопатологией (злокачественные внутримозговые опухоли, злокачественные лимфомы, множественная миелома) и хроническими инфекционными заболеваниями (хронические вирусные гепатиты В и С, туберкулез легких) отличается повышенным содержанием незрелых ДК и ДК промежуточной степени зрелости и уменьшением зрелых ДК; смещением баланса продуцируемых цитокинов в сторону Th2/противовоспалительных цитокинов; снижением аллостимуляторной активности; уменьшением стимулирующей активности в отношении CD3+IFNγ+ T-клеток и/или усилением способности активировать CD3+IL4+ Т-клетки и угнетением цитотоксической противоопухолевой активности (у больных с онкопатологией). Причем выраженность указанных изменений существенно варьирует при различных нозологических формах патологических состояний. Впервые изучены свойства ИФН-ДК, генерируемых у женщин с физиологической и осложненной беременностью. Показано, что ИФН-ДК при физиологической беременности отличаются признаками незрелости, смещением баланса продуцируемых цитокинов в сторону Th2-цитокинов, снижением аллостимуляторной и доминированием Th2-стимуляторной активности и наличием цитотоксической активности против активированных NK-клеток. В то же время ИФН-ДК беременных с надпочечниковой гиперандрогенией (с повышенным уровнем ДГЭАС) обладают более зрелым фенотипом ДК, сохранной аллостимуляторной активностью и способностью активировать Th1-ответ. При этом анализ влияния ДГЭАС на ИФН-ДК in vitro позволил получить новые данные о стимулирующем влиянии ДГЭАС на дифференцировку/созревание ИФН-ДК, продукцию IFN-γ и TNF-α, Th1-стимуляторную активность ДК и ингибирующем эффекте на способность ИФН-ДК индуцировать гибель CD56+CD16+ клеток. Впервые проведена клиническая апробация вакцин на основе ИФН-ДК и показана их безопасность и эффективность в индукции иммунного и клинического ответа у больных злокачественными опухолями головного мозга и хроническими вирусными инфекциями (хронический гепатит В и герпесвирусная инфекция) ^ Сравнение фенотипа клеток в популяциях LPS-активированных ИФН-ДК и ИЛ4-ДК позволило выявить ряд особенностей, которые свидетельствуют о менее зрелом, «промежуточном» фенотипе ИФН-ДК и их более высоком цитотоксическом потенциале, ассоциированном с экспрессией молекулы TRAIL. В свою очередь, выявленные функциональные отличия ИФН-ДК, в частности, их более высокая цитокин-продуцирующая активность и способность к индукции CD3+IFNγ+ Т-клеток при сохранении умеренной Th2-стимуляторной активности, а также более высокая цитостатическая и цитотоксическая активность против опухолевых клеток при сходной способности к индукции регуляторных Т-клеток, указывают на более высокий потенциал ИФН-ДК в индукции/опосредовании иммунного ответа. Выявленные при онкологических и инфекционных заболеваниях фенотипические и функциональные изменения ИФН-ДК свидетельствуют о нарушении дифференцировки/созревания ДК и снижении их способности индуцировать и опосредовать реакции клеточного иммунитета при данных патологических состояниях. При этом взаимосвязь нарушений ИФН-ДК со степенью злокачественности (у больных ЗОГМ) и угнетением антигенспецифического ответа (у больных ТБ) свидетельствует о патогенетической значимости дисфункций ДК при данных патологиях. Исследования свойств ИФН-ДК при физиологической и осложненной надпочечниковой гиперандрогенией беременности показало, что в условиях физиологической гестации ИФН-ДК приобретают толерогенные/супрессорные свойства, которые утрачиваются на фоне повышенного уровня ДГЭАС при надпочечниковой гиперандрогении. При этом способность ДГЭАС индуцировать in vitro созревание ДК и активировать их иммуностимулирующую активность свидетельствует о важной роли гормонов в регуляции ИФН-ДК, и в частности значении ДГЭАС в ослаблении толерогенных/супрессорных свойств ДК. Выявленные отличительные свойства ИФН-ДК обосновывают перспективы их использования в качестве ДК-вакцин для иммунотерапии. При этом установление принципиальной возможности генерации ИФН-ДК у больных с онкологическими и инфекционными заболеваниями, а также возможности коррекции дисфункций ИФН-ДК, в частности, усиление их аллостимуляторной активности и повышение цитотоксической активности in vitro c помощью различных медиаторов/соединений (интерлейкин-2, полиоксидоний, двуцепочечная ДНК человека), является важной составляющей практической значимости работы. Значение работы в прикладном аспекте заключается также в разработке протокола иммунотерапии на основе ИФН-ДК и его клинической апробации у больных со злокачественными опухолями головного мозга и хроническими инфекциями (хроническим вирусным гепатитом В и герпесвирусной инфекцией). При этом полученные результаты о хорошей переносимости и отсутствии побочных эффектов/осложнений при проведении иммунотерапии на основе ИФН-ДК, а также данные об индукции специфического иммунного ответа, который сопровождается улучшением показателей качества жизни/выживаемости у больных со злокачественными внутримозговыми опухолями, прекращением репликации вируса/нормализации биохимической активности (соответственно, в 22 и 55%) при хроническом вирусном гепатите В и увеличением продолжительности безрецидивного периода при хронической герпесвирусной инфекции свидетельствуют о безопасности и терапевтическом потенциале ИФН-ДК-вакцин и обосновывают принципиальную возможность их использования в лечении онкологических и инфекционных (вирусных) заболеваний человека. ^ , выносимые на защиту:
^ Основные результаты работы доложены и обсуждены на конференциях: Всероссийской научно-практической конференции «Многопрофильная больница: проблемы и решения», Ленинск-Кузнецкий, 2003 г, на 14-ой научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины», Новосибирск, 2004 г, на Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины, стволовая клетка, иммунитет. Новосибирск, 2005 г, на 15-й научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной медицины». Новосибирск, 2006 г; на международном конгрессе «International conference Basic Science for Biotechnology and Medicine», Новосибирск 2006 г, на Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» в Красноярске 2005 г, 2006 г; в Томске 2008 г; на 11 Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» - 2007 г; на III Международной конференции "Фундаментальные науки - медицине" Новосибирск 2007 г; на 2nd World Conference on Magic Bullets Celebrating the 100th Anniversary of the Nobel Prize Award to Paul Ehrlich. Nürnberg 2008; на Объединенном иммунологическом форуме – Санкт-Петербург 2008 г, на Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии», Новосибирск 2010г. Публикации По теме диссертации опубликовано 64 печатных работы, в том числе 20 статей в центральной печати, получен 1 патент. ^ Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 9 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Материал изложен на 255 страницах машинописного текста, включающего 49 таблиц, 17 рисунков, 3 схемы. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 300 литературных источника, в том числе 287 иностранных. Работа выполнена в лаборатории клеточной иммунотерапии НИКИ СО РАМН, руководитель – профессор Черных Е.Р. в рамках НИР 032: «Структурно-функциональная характеристика клеток иммунной системы и разработка клеточных биотехнологий иммунодиагностики и иммунотерапии инфекционно-воспалительных, аутоиммунных, аллергических и онкологических заболеваний», НИР 037: «Разработка новых клеточных технологий в лечении онкологических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний человека на основе изучения биологических свойств и молекулярно-генетических механизмов регуляции стволовых и иммунокомпетентных клеток», грантов РФФИ №09-04-00525-а «Гормонально-опосредованная регуляция толерогенной активности дендритных клеток» и №07-04-00967 «Роль дегидроэпиандростерона сульфата в регуляции дифференцировки, созревания и функциональной активности дендритных клеток», гранта ФЦП госконтракт № 14.740.11.0007. - «Разработка технологии создания индивидуальных вакцин на базе инновационных подходов генерации дендритных клеток с использованием интерферона для лечения онкологических и инфекционных (вирусных) заболеваний человека». ^ Характеристика больных, включенных в исследование. Диссертационная работа основана на результатах клинико-иммунологического обследования 145 доноров крови и больных с онкологическими (94) и инфекционными (142) заболеваниями. Группа пациентов с онкологическими заболеваниями включала 68 больных с внутримозговыми опухолями, в том числе 46 больных со злокачественными опухолями головного мозга (ЗОГМ) и 22 - с опухолями низкой степени злокачественности и 26 пациентов со злокачественными лимфомами (ЗЛ), включая 5 пациентов с лимфомой Ходжкина, 7 больных с агрессивными вариантами неходжкинских лимфом и 14 пациентов с множественной миеломой (ММ). В группу с инфекционными заболеваниями вошли 37 пациентов с хроническими вирусными гепатитами В (ХВГВ, n=18) и С (ХВГС, n=19), у 15 из которых диагностировался цирроз печени (ЦП) как исход хронической вирусной инфекции; 90 больных туберкулезом легких (ТБ) и 15 пациентов с герпесвирусной инфекцией. Кроме того, в исследование были включены 60 женщин с физиологической беременностью и 36 беременных с гиперандрогенией надпочечникового генеза (все беременные со сроком гестации до 22 недель). ^ Мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови выделяли стандартным методом и в концентрации 0,1106/лунку культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в полной культуральной среде RPMI-1640 при 37°С в СО2–инкубаторе. Для стимуляции клеток использовали конканавалин А (КонА, Sigma, 15 мкг/мл), рекомбинантный IL-2 (50 ЕД/мл, Ронколейкин, ООО «Биотех», Санкт-Петербург), ППД (очищенный дериват туберкулина, РАО «Биопрепарат», Санкт-Петербург) в концентрации 50 мкг/мл, лизат опухолевых клеток (0,01- 0,1мг/мл ), специфический рекомбинантный антиген HSV1gD (НПО «Диагностические системы», г.Нижний Новгород) 5 мкг/мл, HВs Ag (вакцинальный АГ «Энджерикс В» Смит-Кляйн-Бичем-Биомед, Бельгия) 5 мкг/мл. ^ путем культивирования прилипающей фракции МНК в присутствии GM-CSF (Sigma-Aldrich, 40 нг/мл), INF- (Роферон-А, Roche, Швейцария, 1000 Ед/мл) – ИФН-ДК и в присутствии GM-CSF и IL-4 (Sigma-Aldrich, 40 нг/мл) – ИЛ4-ДК течение 3 и 5 сут, соответственно. На последующие 24 ч в качестве дозревающего стимула вносился LPS (Е.colli 0114:B4, Sigma-Aldrich, 10 мкг/мл). Влияние ДГЭАС (Sigma-Aldrich, кат. № D5297) на фенотип и функциональную активность ДК оценивали, добавляя гормон (10-6М) либо в начале культивирования, либо на стадии дозревания за 24 ч до окончания культивирования. ^ проводили методом проточной цитофлуориметрии, используя меченные фикоэритрином (PE) анти-СD1а, анти-СD123 мАТ (BD PharMingen, США), анти-СD14, анти-CD16 мАТ (Сорбент, Москва), меченные АРС анти-СD11с мАТ (BD PharMingen, США), меченныеFITC анти-CD25, анти-СD83, анти-CD80, анти-CD86 мАТ (BD PharMingen, США) и анти-HLA-DR мАТ (Сорбент, Москва). ^ проводили методом проточной цитофлюориметрии по захвату FITC-декстрана (мол. вес 40 000, Sigma). Аллостимуляторную активность ДК оценивали в реакции смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ). В качестве отвечающих клеток использовались МНК доноров (0,1х106/лунку), стимуляторами служили дендритные клетки в соотношении 10:1 и 100:1. Пролиферативный ответ оценивался на 3-5 сут радиометрически по включению 3H-тимидина (1 мкКю/лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования ^ (IL-1, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12p70, TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, MCP, MIP-1) в цельных культурах ДК оценивали методом проточной цитофлюориметрии на 2-х лучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Rad, США) с использованием коммерческих тест-систем 17Plex (определяемый динамический диапазон 2 – 32000 пкг/мл) В отдельной серии экспериментов концентрацию цитокинов TNF-α, IL-4, IFN-γ, IL-6 («Вектор-Бест», Новосибирск) и IL-10 («Цитокин»; Санкт-Петербург) определяли методом иммуноферментного анализа. ^ в CD3+-популяции лимфоцитов периферической крови проводили методом трехцветной проточной цитометрии (FACSCalibur, Becton Dickinson) с использованием APC-меченных моноклональных анти-CD3-антител, FITC-коньюгированных анти-INF- и PE-меченных анти-IL-4 антител. ^ в различных субпопуляциях NK-клеток проводили с помощью окрашивания клеток Aсtinomycin D, 7-Amino (50 мкг/мл, Calbiochem, Германия) методом проточной цитофлюориметрии. Уровень клеточного цикла оценивали среди CD56+СD16+ клеток в популяции МНК, культивированных в течение 24 ч в отсутствие и присутствии интактных или ДГЭАС-модифицированных ИФН-ДК. ^ в отношении опухолевых клеток оценивали по способности ДК ингибировать пролиферацию клеток опухолевых линий HEp-2 (клетки эпителиальной карциномы гортани человека), Jurkat (T-клеточная лимфома), U-87 (клетки глиобластомы человека). Интенсивность пролиферации оценивали по включению 3Н-тимидина (1 мКю/лунку), вносимого за 18 ч до окончания культивирования. Индекс влияния ДК (ИВДК) рассчитывали как отношение пролиферативного ответа в опыте к контролю, а цитостатическую активность ДК определяли по формуле (1-ИВДК) х 100%. Цитотоксическую активность оценивали по лизису клеток-мишеней дендритными клетками в соотношениях 40:1, 20:1 и 10:1. Процент цитотоксичности рассчитывали по формуле: [1 - (имп/мин в культурах с эффекторными клетками/имп/мин в контрольных культурах в отсутствие эффекторных клеток)] x 100% . ^ оценивали по их способности индуцировать регуляторные Т-клетки в алло-СКЛ при совместном культивировании ДК с аллогенными МНК в соотношении 1:10. Относительное содержание CD4+FoxP3+, CD8+FoxP3+ и CD4+IL-10+ клеток в культурах оценивали на 5 сутки методом проточной цитофлюориметрии ^ с использованием ИФН-ДК были проведены в соответствии с разработанным протоколом, утвержденным Ученым советом Института (протокол №1, апрель 2003г.) и одобренным локальным этическим комитетом. В исследование были включены 32 человека (основная группа) с гистологически верифицированным диагнозом внутримозговых опухолей высокой степени злокачественности, включая 20 пациентов с анапластической астроцитомой (Grade III) и 12 пациентов с глиобластомой (GradeIV), которым оперативное лечение и радиотерапия были дополнены иммунотерапией с использованием ДК. ИТ включала курс адоптивной иммунотерапии и курс вакцинаций дендритными клетками согласно разработанному патенту «Способ комбинированной иммунотерапии злокачественных опухолей головного мозга» (патент на изобретение № 2262941 от 27.10.2005). Антигенный материал (лизат опухолевых клеток) для нагрузки ДК получали из фрагмента аутологичной опухоли больного, в результате 5-кратного замораживания/размораживания суспензии опухолевых клеток, и использовали в концентрации 0,1 мг/мл по белку. Исследование общего состояния включало изучение общемозговой симптоматики и оценку индекса качества жизни. ^ проводились в дизайне открытого проспективного пилотного исследования с контролем «до-после» в соответствии с разработанными протоколами, утвержденными Ученым советом Института (протокол № 6 от 26 сентября 2006 г для ХВГВ и протокол №9 от 11 декабря 2007 для герпесвирусной инфекции) и одобренными локальным этическим комитетом. Группа пациентов составляла 9 больных ХВГВ и 7 женщин с орофациальной локализацией герпетической инфекции. ИТ включала два курса вакцинации дендритными клетками. Первый -4-6 вакцинаций ИФН-ДК, нагруженных HВs Ag (вакцинальный АГ «Энджерикс В» Смит-Кляйн-Бичем-Биомед, Бельгия) или рекомбинантными антигенами вируса герпеса HSV1gD (НПО «Диагностические системы», г.Нижний Новгород) c 2-недельным интервалом. Второй курс - 3-6 вакцинаций с кратностью 1 раз в месяц. Количество ДК на одну вакцинацию – 5-х106. При проведении вакцинаций в качестве адьюванта использовался ронколейкин в дозе 250 000. Ед. Интенсивность антигенспецифического ответа оценивали на 3 сут по пролиферации МНК больных в ответ на стимуляцию Hbs Ag антигеном (5 мг/мл) либо HSV1gD антигеном в отсутствие и присутствии ронколейкина (100 Ед/мл). Неспецифический ответ оценивали по пролиферации МНК в ответ на стимуляцию конканавалином А. ^ in vivo оценивали по выраженности кожной пробы в ответ на введение лизата опухолевых клеток. Реакцию ГЗТ in vitro оценивали в модифицированном тесте миграции лейкоцитов в ответ на аналогичную стимуляцию клеток лейковзвеси. ^ проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы «STATISTICA 6.0». ^ Отправной точкой исследования стало сравнительное исследование фенотипа LPS-активированных ИФН-ДК и ИЛ4-ДК. Поскольку дифференцировка моноцитов в ДК сопровождается закономерной сменой фенотипов, в частности, появлением молекулы СD1а и утратой СD14, а созревание ДК ассоциировано с экспрессией молекул CD83 и СD25 и утратой СD1а, а также усилением экспрессии молекул HLA-DR и CD86, оценка указанных маркеров послужила основой фенотипического анализа (табл.1). Таблица 1 ^
Примечание: относительное содержание (%) различных субпопуляций ДК представлено в виде средних (M±SE.), медианных (Median) и диапазона 25-75% квартильных значений (LQ – UQ). * рt< 0,01 - достоверность различий показателей (t-критерий Стьюдента для связанных выборок) ИФН-ДК были сходны с ИЛ4-ДК по количеству CD86, HLA-DR и CD25-позитивных клеток, однако содержали большее количество CD14 и меньшее - CD83 клеток, т.е. имели менее зрелый - промежуточный фенотип. Значительная доля ИФН-ДК экспрессировала молекулу CD123, что также указывало на меньшую зрелость, поскольку экспрессия данного маркера снижается по мере дифференцировки миелоидных ДК. Промежуточный фенотип ИФН-ДК подтверждался также их достаточно высокой фагоцитарной активностью, в частности, способностью поглощать FITC-меченный декстран, Так 74,96,2% интактных ДК активно поглощали FITC-декстран, но и после активации дозревающим стимулом (LPS) доля клеток с внутриклеточным содержанием FITC-декстрана оставалась высокой (62,08,6%). Исследование поверхностных молекул, способных опосредовать цитотоксическую и/или супрессорную активность ДК (табл. 2), показало, что как интактные, так и LPS-стимулированные ИФН-ДК отличались более высокой экспрессией цитотоксической молекулы TRAIL. Интактные ИФН-ДК содержали большее количество B7-H1–позитивных и меньшее HLA-G –позитивных клеток. Однако после активации LPS экспрессия B7-H1 на ИФН-ДК снижалась, и эти клетки уже не отличались от ИЛ4-ДК по экспрессии толерогенных молекул. Таблица 2 ^
Примечание:относительное содержание (%) интактных и LPS-активированных ДК, экспрессирующих соответствующие маркеры, представлено в виде средних значений (M ± SE), # рU < 0,05 - достоверность различий интактных и LPS-активированных ДК, *рU<0,05 - достоверность различий ИФН-ДК и ИЛ4-ДК (U–критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). Исследование функциональной активности ДК включало оценку продукции цитокинов в культурах ДК, аллостимуляторной и Th1/Th2-стимуляторной активности ДК по их способности индуцировать в СКЛ возрастание количества IFN-γ и IL-4-продуцирующих Т-клеток, а также продукции Th1- и Th2 цитокинов. Культуры ИФН-ДК характеризовались более высоким содержанием IFN-γ, IL-2, IL-1β, TNF-α, IL-17, а также более высоким уровнем IL-10 и IL-5. т.е. ИФН-ДК могли более активно стимулировать Th1 и Th2 ответ (табл. 3). При этом соотношение концентрации TNF-α/IL-10 в супернатантах ИФН-ДК 2-кратно превышало аналогичный показатель в культурах ИЛ4-ДК, свидетельствуя о доминировании провоспалительного потенциала. Наконец, ИФН-ДК отличались более высокой продукцией G-CSF и MCP-1, но более низким уровнем IL-12p70 и IL-7, что могло указывать на более высокую способность рекрутировать моноциты и поддерживать их выживаемость, но меньшую эффективность в поддержании гомеостатической пролиферации. Таблица 3 ^
Примечание: представлены средние (M±SE) и медианные (Median) значения концентрации цитокинов (пг/мл) в супернатантах цельных культур ДК. * рU < 0,05, ** рU < 0,01 - достоверность различий значений между ИФН-ДК и ИЛ4-ДК (U–критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). Сравнение аллостимуляторной активности не выявило различий ИЛ4-ДК и ИФН-ДК (18625±909 и 18922±1743, соответственно, n=14). Вместе с тем ИФН-ДК более активно стимулировали генерацию IFN-γ-продуцирующих Т-клеток, т.е. активировали Th1-клетки и в отличие от ИЛ4-ДК обладали умеренной Th2-стимуляторной активностью (табл. 4). Таблица 4 |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям