Осина ирина Геннадьевна высокодозная иммунносупрессивная терапия с аутологичной трансплантацией стволовых кроветворных клеток в лечении аутоиммунных заболеваний (системной красной волчанки, ревматоидного артрита)
|
|
Скачать 0.79 Mb.
|
|
На правах рукописи ОСИНА Ирина Геннадьевна ВЫСОКОДОЗНАЯ ИММУННОСУПРЕССИВНАЯ ТЕРАПИЯ С АУТОЛОГИЧНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИЕЙ СТВОЛОВЫХ КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТОК В ЛЕЧЕНИИ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ (СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКИ, РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА) 14.00.36– Аллергология и иммунология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва – 2007 Работа выполнена в Самарском военно-медицинском институте ^ член - корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Караулов Александр Викторович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор ^ ГНЦ - института иммунологии ФМБА России доктор медицинских наук, профессор Винницкий Леонид Ильич Российский научный центр хирургии РАМН доктор медицинских наук, профессор ^ ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования « Российский государственный медицинский университет Росздрава» Защита состоится«____»_____________ 200 года в часов на заседании диссертационного совета Д. 208.040.08 в ГОУ ВПО Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова Росздрава по адресу: 119881, г.Москва, ул. Трубецкая 8, строение 2. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ММА им. И. М. Сеченова Росздрава по адресу: 117988, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49. Автореферат разослан «_______.» 2007 года. ^ доктор медицинских наук, профессор А. Ю Миронов Список сокращений
^ Актуальность темы. Поиск новых подходов к диагностике и лечению аутоиммунной патологии (СКВ, РА) определяется их распространенностью, тяжестью течения, нередко приводящие к ранней инвалидизации и летальности. Аутоиммунные болезни поражают 5-7% населения земного шара, чаще развивается у женщин чем у мужчин, как правило, в молодом возрасте (Рытикова Н.С., 2000). Распространенность СКВ в европейской популяции – 30 – 40 на 100 000 населения (Насонова В.А., 2000). Частота РА в популяции составляет 1%, у 10% больных наблюдается «злокачественное течение заболевания» (Насонов Е.Л., Балабанова Р.М., 2002). По утверждению ряда авторов H.J. Коlb et al. (1995), W.P. МсGuire et al. (1996) аутоиммунные заболевания (АИЗ) объединяются в одну группу на основании общих особенностей патогенеза, и подходов к лечению, основой которой является иммуносупрессивная терапия. Общим звеном в патогенезе АИЗ являются нарушения в иммунной системе, приводящие к развитию поликлонального иммунного ответа на собственные антигены (в этом ответе участвуют В-, Т- лимфоциты и макрофаги) (Насонов Е.Л., 2001, Назаренко Г.И., Кишкун А.А., 2002). В связи с тем, что все клетки иммунной системы происходят из единой стволовой клетки, имеется концепция о развитии АИЗ вследствие дефектов стволовых кроветворных клеток (СКК) или их ближайших потомков (Шевченко Ю.Л. и соавт., 2004). В последние годы все шире внедряются новые методы лечения, среди которых наиболее сложный - высокодозная иммуносупрессивная терапия с последующей трансплантацией аутологичных стволовых кроветворных клеток (ВИСТ с АТ СКК). В ее проведении используют СКК с целью «репрограммирования» иммунной системы. Вводят большие дозы цитостатиков или проводят общее облучение, что вызывает гипоплазию или аплазию нормального гемопоэза и клеток иммунной системы, с последующим введением собственных СКК, вызывающих восстановление кроветворения и клеток иммунной системы (Brunner M. et al., 2001, Вермель А.Е., 2004). Работами ряда авторов установлено, что ВИСТ c АТ СКК эффективна в отношении клинико-лабораторных проявлений СКВ и РА (McSweeney P., Furst D., 1997, Tyndall A., Gratwohl A., 1997). Это дает основание предположить, что клиническая эффективность ВИСТ с АТ СКК связана с ее воздействием на важные звенья патогенеза болезни, однако целенаправленного изучения иммунологических эффектов ВИСТ с АТ СКК при СКВ и РА до сих пор не проводилось. Существенным пробелом явилось и то, что до настоящего времени не сравнивали эффективность традиционной схемы лечения и применения ВИСТ с АТ СКК у данной категории больных с использованием международных критериев EULAR по оценки эффективности лечения. Все вышеизложенное свидетельствует о необходимости проведения специальных исследований направленных на изучение различных схем лечения и оценки дальнейших исходов у больных с аутоиммунной патологией. ^ - определение роли и места высокодозной иммуноссупрессивной терапии с аутологичной трансплантацией стволовых кроветворных клеток, а также выявление возможных механизмов лечебного действия данного метода при включении в терапию СКВ и РА. ^
^ Впервые проведено комплексное клинико-иммунологическое обследование больных СКВ и РА до и после применения ВИСТ с АТ СКК. На основе системного подхода выполнен многофакторный анализ течения СКВ в зависимости от пола, возраста. Изучено состояние иммунологической реактивности в зависимости от наличия ревматоидного фактора и вида течения при РА. Впервые проведено сравнение и оценка эффективности и исходов традиционных схем лечения СКВ и РА с применением ВИСТ с АТ СКК. Обоснована необходимость применения ВИСТ с АТ СКК при АИЗ. На основании проведенных исследований создана новая программа современного лечения больных СКВ и РА с применением клеточных технологий, с учетом длительности заболевания. Определены предикторы клинико-иммунологического контроля при СКВ и РА, участвующие в формировании аутоиммунной патологии. ^ Полученные результаты исследования позволили: - установить гематологические, биохимические и иммунологические особенности хронического воспаления у больных СКВ в зависимости от пола и возраста; у больных РА - в зависимости от вида течения и клинико-иммунологической характеристики; - определить место ВИСТ с АТ СКК в комплексном лечении больных СКВ и РА, позволяющее достичь позитивных результатов в исходах заболеваний; - создать организационную модель нового лечебного учреждения по применению новых технологий в лечении АИЗ – государственное унитарное предприятие Самарской области «Поволжский банк гемопоэтических клеток», учрежденное губернатором Самарской области, МЗ Самарской области, департаментом по имуществу 14.02.2003 г; - разработать комплексную диагностику, тактику лечения с применением новых технологий, что позволяет улучшить исходы лечения СКВ, РА, увеличить продолжительность ремиссии заболевания, сократить сроки лечения больных в стационаре; - результаты лечения дополнили показания к применению ВИСТ с АТ СКК у больных СКВ в зависимости от длительности заболевания и оценки эффективности лечения по индексу SLEDAI. ^ Предложенные подходы к диагностике и лечению АИЗ (при СКВ и РА – применение клеточных технологий) использованы в работе ревматологического отделения, гематологии и трансплантации костного мозга, хирургии крови, иммунологической и цитологической лабораторий Самарской областной клинической больницы им. М.И. Калинина. Создана организационная модель оказания специализированной помощи больным АИЗ, утвержденная на коллегии Главного Управления здравоохранения Администрации Самарской области 5 июня 2000 г. Впервые в составе поликлиники на базе Самарской областной клинической больницы им. М.И. Калинина организована модель специализированных кабинетов (ревматолог - гематолог - аллерголог - иммунолог) по наблюдению за больными страдающими аутоиммунной патологией (Приказ Управления здравоохранения Администрации г. Самара № 138 от 28.04.95, приказ Министерства здравоохранения и социального развития Самарской области № 443 от 23.08.06). Внедрена программа клинико-иммунологического мониторинга здоровья больных СКВ и РА, после применения ВИСТ с АТ СКК в работу Самарского областного ревматологического центра при Самарской областной клинической больницы им. М.И. Калинина. Изданы учебные пособия: «Основные средства и методы лечения больных с ревматическими заболеваниями», «Диагностические критерии ревматических заболеваний», «Методы диагностики аутоиммунных заболеваний». Выпущена монография «Новые технологии в диагностике и лечении аутоиммунных заболеваний», 2007 г. Результаты проведенного исследования используются в преподавании при подготовке слушателей, интернов и клинических ординаторов на кафедре терапии Самарского военно-медицинского института, госпитальной терапии СамГМУ, на кафедре терапии ИПО при СамГМУ. ^
^ Материалы диссертации доложены на заседаниях Самарского научного областного общества аллергологов-иммунологов, терапевтов, ревматологов ( Самара, 2000), на научных конференциях и съездах в России и за рубежом, в том числе на V съезде иммунологов и аллергологов СНГ в Санкт-Петербурге (2003 г.), 13 и 15 Национальных конгрессах по болезням органов дыхания в Санкт-Петербурге (2003 г.) и в Москве (2005 г.) на научно-практической конференции Приволжского Федерального округа «Дни иммунологии и аллергологии в Самаре» (2003 г.), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клинической и эксперементальной медицины» в Санкт-Петербурге (2004 г.), на IV Всемирном конгрессе по астме и IX Международном конгрессе по клинической патологии в Бангоке (2004 г.), на ежегодной школе молодых ревматологов с конференции «Актуальные вопросы практической и теоритической ревматологии» в Звенигороде (2004 г.), на Международном семинаре «Нелинейное моделирование и управление» в Самаре (2004 г.), на второй Всероссийской научно-практической конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» в Новосибирске (2004 г.), на рабочем совещании «Высокотехнологичные методы лечения в гематологии, онкологии, неврологии и ревматологии. Принципы исследования качества жизни» в Самаре (2004 г.), на X и XI Российском съезде гастроэнтерологов в Москве (2004 г., 2005 г.), на III Всемирном конгрессе по клинической патологии и реабилитации в медицине в Паттайе (2005 г.), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» в Санкт-Петербурге (2005 г.), на 36 Всемирном конгрессе по военной медицине в Санкт-Петербурге (2005 г.), на научно-практической конференции с международным участием «Проблемы клиники, диагностики и терапии гепатитов» в Харькове (Украина, 2005 г.), на Всероссийском кардиологическом клинико-диагностическом форуме к 20-летию ГУНИИК ТНЦ СО РАМН «Тюменский кардиологический центр» в Тюмени (2005 г.), на Российском национальном конгрессе кардиологов в Москве 2005 г.), на конгрессе Ассоциации кардиологов стран СНГ и Ассоциации кардиологов Узбекистана в Ташкенте (2005 г.), на Ежегодных (XXXVI, XXXVII, XXXVIII) итоговых научно-практических конференциях научно-педагогического состава Самарского военно-медицинского института (с 2003-2007 г.г.), на 2-ом международном конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» в Москве (2007 г.). ^ Автор играл ведущую роль в выборе направления исследования, отборе пациентов, в мониторировании показателей иммунной системы и назначении базисной терапии с последующим контролем за эффективностью лечения, при анализе и обобщении полученных результатов. В выполненной работе вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном его участии на всех этапах исследования: от постановки задач до обсуждения результатов для научных публикаций, докладов и выводов. Публикации По материалам диссертации опубликовано 40 печатных работ, из них 13 в журналах, включенных в перечень ВАК, оформлено 3 рационализаторских предложений (авторское свидетельство № 476, 477, 495). ^ Диссертация изложена на 318 страницах машинописного текста, состоит из оглавления, введения, 5 глав, заключения, общих выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 115 таблицами и 42 рисунками. Список литературы включает 283 источника, из них 125 отечественных и 158 зарубежных авторов. ^ Характеристика больных и методы их исследования Для решения задач диссертационного исследования осуществлено обследование 183 пациентов ревматологического и гематологического отделений (рис.1) СОКБ им. Калинина за период с 1999 по 2003 г.г. Первую группу составили 183 пациента, среди них было 143 (78,1%) с СКВ и 40 (21,9%) с РА, получающих традиционную схему лечения. Из данной группы была выделена 2-ая группа пациентов – 10 человек (7 (70%) больных с СКВ и 3 (30%) с РА), которым помимо традиционной терапии была выполнена ВИСТ с АТ СКК. В контрольную группу вошли 46 здоровых доноров в возрасте 35,0±0,6 лет. Характерными признаками обследованных групп явилось преобладание лиц женского пола, молодого (детородного) возраста (21 -30 лет). В обеих группах больных кроме данной возрастной категории преобладали лица среднего (41-50 лет) возраста. Больные с СКВ с традиционной схемой лечения (1 группа) составили 143 человека, среди которых 125 (87,4%) женщин, средний возраст подгруппы составил 37,6±1,2 года, средняя длительность заболевания – 7,2±0,7 лет. У мужчин больных СКВ 1 группы – 18 человек (12,6%), средний возраст составил 31,0±3,3 лет, длительность болезни – 4,7±1,2 года. Таким образом, средний возраст больных СКВ 1 группы составил 36,8±0,99 года, длительность заболевания в среднем – 6,86±0,61 года. Большинство (31,5%) это лица, болеющие до 1 года и 6,3% - это длительно болеющие (более 20 лет). В 1 группе больных РА преобладали женщины - 34 (85,0%), средний возраст в подгруппе составил 36,9±2,10 года, средняя длительность болезни – 6,60±1,40 лет. У мужчин больных РА (1 группа) – 6 человек (15,0%), средний возраст составил 36,50±6,20 года, длительность болезни – 8,80±2,70 года. Таким образом, средний возраст больных РА 1 группы составил 36,90±1,99 года, длительность заболевания в среднем – 6,98±1,28 лет. Лица, болеющие до 1 года составили 12 человек (30,0%) и 2 человека (5,0%) - это длительно болеющие (более 20 лет). Средний возраст пациентов 1 группы 36,80±0,99 года, средняя длительность заболевания – 6,88±0,55 лет. Среди пациентов с СКВ (2 группа) подавляющее большинство составили женщины 5 (71,4%), средний возраст подгруппы - 24,80±3,10 года, длительность заболевания в среднем – 5,10±1,60 лет. У мужчин больных СКВ – 2 человека (28,6%), средний возраст составил 23,50±5,50 года, длительность болезни – 9,00±6,00 года. Таким образом, средний возраст больных СКВ 2 группы составил 24,40±2,50 года, длительность заболевания в среднем – 6,90±1,90 год ^ I этап
II этап
III этап
IV этап
V этап
^ Большинство больных РА 2 группы составили женщины – 2 человека (66,6%), средний возраст в подгруппе - 39,00±11,00 года, средняя длительность заболевания – 5,00±3,00 года. Среди мужчин больных РА 2 группы был 1 пациент (33,4%), возраст составил 25 лет, длительность болезни – 8 лет. Таким образом, средний возраст больных РА во 2 группе составил 34,30±7,90 года, длительность заболевания в среднем – 6,00±2,00года. Средний возраст пациентов 2 группы - 27,60±2,80 года, средняя длительность заболевания – 5,90±1,30 лет. Время от диагностики АИЗ до проведения ВИСТ с АТ СКК составил 5,84±1,93 лет у больных СКВ, при РА этот период равен 6,10±2,10 лет. Период после наблюдения после поведения ВИСТ с АТ СКК у больных СКВ - 49,7 месяцев, у больных с РА - 29 месяцев. В основу клинического обследования СКВ и РА были положены критерии диагностики заболевания, выдвинутые Американской ревматологической ассоциацией (Tan E.N. et al., 1982, Arnett F.C. et al., 1988), а также - критерии оценки активности болезни - Европейские критерии активности СКВ ECLAM (European Consensus Lupus Activity Measurement) и SLEDAI (Systemic Lupus Erythematosus Disease Activity Index) (Bombardier C. et al., 1992); Disease Activity Score (DAS) - для РА (Van Gestel A.M. et al., 1996). Эффективность терапии в баллах оценивалась по данным критериям до и после лечения согласно рекомендациям Европейской лиги по борьбе с ревматическими заболеваниями (EULAR) 2000 г. Для СКВ использовались индексы ECLAM и SLEDAI, для РА – DAS (Насонова В.А., Насонов Е.Л., 2003). Позитивный ответ на лечение заболевания определяли как уменьшение индекса активности СКВ по ECLAM на 3 балла, по SLEDAI на 6 баллов (табл.1). Таблица 1 Ответ на лечение индексов активности СКВ (в баллах)
В работе представлены следующие показатели, характеризующие индекс активности заболевания при РА: 1. Выраженность болей в суставах (ВАШ); 2. Длительность утренней скованности (мин); 3. Число болезненных и припухших суставов; 4. Функциональная активность; 5. Индекс активности болезни - DAS, в который входят 3 показателя: - индекс Ричи, характеризующий болезненность суставов при пальпации по следующей шкале: 0 – нет боли, 1 – пациент говорит, что пальпация болезненна, 2 – пациент морщится, 3 - пациент отдергивает руку или отстраняется от исследователя. Индекс Ричи включает оценку 53 суставов, максимально возможное его значение – 78 баллов; - при определении числа воспаленных (или припухших) суставов (ВС) оценивают 44 сустава: 0 – нет припухлости, 1 – есть припухлость (видимая или пальпируемая), максимальное его значение – 44 балла; - скорость оседания эритроцитов (СОЭ в мм/ч). Вычисляется индекс DAS 3 по следующей формуле: DAS 3 = 0,54 × √индекс Ричи + 0,065 × ВС + 0,33 ln (СОЭ) + 0,224 Значение индекса DAS ≤ 2,4 соответствуют I степени активности, 2,4 – 3,7 – II степени и > 3,7 – III степени. Критерии улучшения (ответ на лечение) представлены в табл. 2 Таблица 2 Критерии улучшения (ответ на лечение) у больных РА
Состояние больных оценивали по клиническим данным (общему состоянию, данным физикального обследования), а также результатам лабораторных и инструментальных методов исследования. Тактика ведения больных СКВ 1 группы включала системный прием ГКС (преднизолон в средней дозе 15-40 мг в сутки применялся у 72 пациентов (50,4%), в поддерживающей дозе 5-10 мг в сутки у 19 (13,3%), свыше 40 мг в сутки у 34 (23,8%) больных). В связи с недостаточной эффективностью терапии при пероральном применении стероидов, быстрым прогрессированием заболевания и выраженным нарастанием висцеральных проявлений у 92 больных СКВ (64,4%) проводилась интенсивная терапия по различным схемам: пульс-терапия ГКС (метипред) в дозе от 600 до 1000 мг, сочетанная терапия двумя препаратами: ГКС и циклофосфан в дозе от 600 до 1000 мг применялась у 26 (18,2%) больных и 3 больным (2,1%) пульс-терапия циклофосфаном в дозе 600 мг. При высокой клинико-иммунологической активности воспаления в комплекс терапевтических мероприятий включались синхронно с проведением интенсивной терапии экстракопоральные методы лечения – плазмаферез в количестве 3 сеанса с интервалом через 1 день. Всего плазмаферез получили 33 (23,1%) больных. Аминохинолиновые производные (делагил или плаквенил в дозе 0,025 по 1 таблетки 1-2 раза в сутки) использовались в лечении пациентов СКВ при неэффективности НПВП у 37 (25,9%). Дополнительные средства не оказывающие иммуносупрессивного действия были представлены дезагрегантами (курантил по 25 мг 3 раза в сутки), антикоагулянтами - введение гепарина в течение 7-10 дней от 10 тыс. ЕД до 20 ты. ЕД покожно под контролем времени свертывания крови и НПВП (диклофенак 100 мг 1-2 раза в сутки). Схема традиционного лечение больных РА 1 группы включала в себя симптом-модифицирующие препараты (НПВП, системный прием ГКС, локальная терапия), болезнь-модифицирующие средства (сульфасалазин, метотрексат, циклофосфан) и интенсивную терапию (пульс-терапия ГКС, пульс-терапия ГКС+циклофосфаном), экстракорпоральные методы лечения (плазмаферез). Всем больным РА с целью уменьшения экссудативных проявлений в суставах и купирования атралгий осуществлялся индивидуальный подбор НПВП в адекватных терапевтических дозах. В основном применялись препараты длительного действия (диклофенак, апонил) 1-2 раза в сутки, а также пироксикам по 10-20 мг/сут. При выраженном суставном синдроме назначались ГКС (преднизолон в дозе 10-15 мг/сут) у 29 пациентов (72,5%), проводилась интенсивная терапия метипредом (до 1000 мг) 12 больным РА и у 2 пациентов схема включала сочетание метипреда с циклофосфаном (до 1000 мг). С целью уменьшения местного воспалительного процесса (синовита) 9 больным РА (22,5%) проводилось внутрисуставное введение дипроспана в дозе 10-40 мг. При не эффективности симптом-модифицирующих препаратов в комплексном лечении больных РА использовались следующие группы болезнь-модифицирующих средств: 37,5% пациентов принимали сульфасалазин от 0,5 до 2,0 г/сут, 10% - метотрексат в дозе 7,5 мг в неделю, в 5% случаев циклофосфан (500-1000 мсут). С целью улучшения микроциркуляции больным РА назначали курантил по 25 мг 3 раза в сутки, а также некоторым пациентом осуществлялось введение раствора пентоксифиллина 5% по 5-10 мл внутривенно на физиологическом растворе хлорида натрия - 0,9% 200 мл. Большинству пациентов на область болезненных суставов назначались электрофорез с димексидом или бишафитом, ультразвук с гидрокортизоном, лазеро- магнитотерапия, сероводородные, родоновые ванны. Схема лечения больных СКВ 2 группы включала системный прием ГКС: преднизолон применялся у 7 пациентов (100%), в средней дозе 15-40 мг в сутки у 5 человек (71,4%), в поддерживающей дозе 5-10 мг в сутки у 2 (28,6%). Интенсивная терапия синхронно с плазмаферезом осуществлялась по различным схемам у 6 больных СКВ (85,7%): пульс-терапия ГКС у 4 (57,1%), сочетанная терапия двумя препаратами: ГКС и циклофосфан применялась у 2 (28,6%) больных и 3 больных (42,8%) пульс-терапия циклофосфаном. Аминохинолиновые производные использовались в лечении пациентов СКВ у 3 (42,8%), дезагреганты у 6 (85,7%), нестероидные противовоспалительные препараты у 4 (57,1%). Терапевтическая стратегия в лечении больных РА 2 группы до применения ВИСТ с АТ СКК включала в себя симптом-модифицирующие препараты: прием НПВП и ГКС от 15-40 мг осуществлялся у всех – 3 больных (100%), болезнь-модифицирующие средства: сульфасалазин у 2 (66,6%), метотрексат, циклофосфан и делагил применялись с одинаковой частотой у 3 пациентов (33,3%), интенсивная терапия ГКС - у 2 пациентов (66,6%). Время от диагностики АИЗ до проведения ВИСТ с АТ СКК составило 5,84±1,93 лет у больны с СКВ, при РА этот период равен 6,1±2,1 лет. Период наблюдения после ВИСТ с АТ СКК у больных с СКВ 49,7 месяцев у больных с РА 29,0 месяцев. Тактика выполнения ВИСТ с АТ СКК включает в себя несколько этапов: I. Удаление CD34+ - позитивных клеток. II. Кондиционирование: а) ВEAM + ALG (кармустин 300 мг/м2 + вепезид 100 мг/м2 + алексан 100 мг/м2 + алкеран 140 мг/м2 + антилимфоцитарный глобулин 10 мг/кг) или б) Флюдара + Алкеран + ALG (флюдара 50 мг/м2 + алкеран 140 мг/м2 + антилимфоцитарный глобулин 10 мг/кг). III. Реинфузия удаленных стволовых клеток (= трансплантация стволовых клеток). IV. Интенсивный уход за больным в течение всего времени аплазии. V. Длительное катемнестическое наблюдение Мобилизация аутологичных стволовых кроветворных клеток производилась нейпогеном («Roche») в дозе 8,7 -10 мг/кг/сут. Получение СКК осуществлялось цитаферезом на аппарате «Haemonetiсs MCS» на 4 и 5 день от начала мобилизации. Криоконсервирование проводилось в программном замораживателе «Cryomed» с использованием в качестве криопротектора диметилсулфоксида в концентрации 7%. Для каждого пациента было заготовлено не менее 12,0·106/кг CD34+ клеток. Предтрансплантационное кондиционирование проводилось по стандартным протоколам: ВЕАМ+антилимфоцитарный глобулин – протокол № 1 и Флюдара+Алкеран+АЛГ – протокол № 2. Протокол № 1 был использован у 8 пациентов (80%), протокол № 2 применен у 2 больных РА. У пациентов 2-ой группы до проведения ВИСТ с АТ СКК дополнительно проводились нижеперечисленные исследования. Определение группы крови по системе АВО- и Rh-фактору призводили с применением стандартных гемагглютинирующих сывороток в реакции агглютинации и с использованием стандартного универсального реагента для определения Rh-фактора. Реакция Вассермана осуществлялась методом ИФА. Микробиологический скрининг включал в себя исследование мазков из крови, зева, носа, прямой кишки, соскоба с языка на грибы рода Саndida. Вирусологическое исследование осуществлялось ИФА методом с определением вируса иммунодефицита человека, маркеров вирусного гепатитов В и С, вируса Herpes simplex, цитомегаловируса. Перед миелотрансплантацией с целью санации ротовой полости и лор –органов осуществлялся осмотр стоматологом и оториноларингологом. Пациентам с первого дня осуществлялась деконтаминация кишечника и противогрибковая профилактика. С целью подавления иммунологической агрессии все трансфузионные среды (эритроциты, тромбоциты, плазма) подвергались облучению в дозе 25 Гр. В работе были использованы современные клинико-функциональные, биохимические, иммунологические, микробиологические, серологические и статистические методы исследования. В ходе исследования, проводившегося перед началом и после применения различных схем лечения, определялись следующие показатели по стандартным методикам: лабораторные методы включали общее клиническое исследование крови с дополнительным подсчетом числа тромбоцитов; объем биохимических исследований включал: определение общего белка и его фракций, серомукоида, сиаловых кислот, общего билирубина и его фракций, креатинина, мочевины и микроэлементов (Na+, К+, Са2+, Cl-). Ревматоидный фактор, С-реактивный белок определяли методом иммуноферментного анализа с использованием наборов реагентов фирмы ORGENTEC (Германия) (Меньшиков В.В., 1997, Долгов В.В., 2003). Иммунологические исследования выполнялись в соответствии с рекомендациями ВОЗ (Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Истамов Х.И., 1995; Новиков Д.К., Сергеев Ю.В., 1999; Ройт А., 2000). Методы исследования клеточных параметров иммунитета включали определение субпопуляций лимфоцитов по уровню экспрессии мембранных антигенов лимфоцитов CD3, CD4, CD8, CD19, CD16, HLA-DR с использованием моноклональных антител (серии ИKО) (Барышников А.Ю.,1990) («БиоМедСпектр», Москва), конъюгированных с флуоресцеина изотионатом (FITC) и фикоэритрином (PE) и лазерного проточного цитофлюориметра FACS Calibur (BECTON DICKINSON, США) (Darzynkiewicz Z., Crissman H.A., 1990). Показатели макрофагального звена исследовали стандартными методиками и включали определение фагоцитоза и фагоцитарного числа с частицами латекса (Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Истамов Х.И., 1995). Идентификация и подсчет абсолютного и относительного содержания гемопоэтических стволовых клеток СD34+ в образцах периферической крови, периферической крови после стимуляции и лейкаферезных образцах осуществлялось методом проточной цитометрии с помощью набора Весtоn Dickinson Immunocytometry РгоСОUNТ™ Ргоgеnitог Сеll Еnumегаtiоn Кit. Уровни сывороточных иммуноглобулинов А-, G-, М- классов определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа, основанного на принципе «сэндвича» с использованием наборов антигенов к соответствующим иммуноглобулинам «IgА (IgG, IgМ) — ИФА — БЕСТ — стрип», Россия. Концентрацию IgA, IgG, IgМ в пробах определяют по колибровочному графику, (согласно инструкции). Содержание циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови определяли в реакции преципитации с 3,5% раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) («Индикатор», Москва) и учетом на спектрофотометре при длине волны 450 нм (Haskova V. et al., 1978). Активность комплемента определяли методом титрования по 50% гемолизу эритроцитов барана и выражали в единицах СН50. Интенсивность гемолиза регистрировали фотометрически при 540 нм. Исследование уровня лизоцима осуществляли нефелометрическим методом с использованием фосфатного буфера и стандартов приготовления из препарата лизоцим (Козлюк А.С., Анисимова Л.А., Шройт И.Т., 1987). Уровень антинуклеарного фактора определяли методом непрямого твердофазного иммуноферментного анализа - ELISA с помощью набора «ANAscreen» (ORGENTEC, Германия) для качественного скрининга антиядерных антител (Feltkamp, T.E.W., 1996, Fritzler, M.J., 1996). Выявление в сыворотке крови аутоантител к отдельным экстрагируемым антигенам ядра клетки (SS-A, SS-B, Sm, Sm/RNP, Scl-70 и Jo-1) осуществляли методом иммуноферментного анализа с использованием набора «ASI ENA PROFILE», производства фирмы Arlington Scientific Inc., США (качественный тест). Антитела к двухцепочечной неденатурированной ДНК определялись методом иммуноферментного анализа тест системой «ВектоДНК — IgG — стрип», Россия (Kavanaugh A.F., Solomon D.H., 2002). |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям