1 гигиена, токсикология, санитария оценка воздействия наноматериалов на функцию иммунитета методические рекомендации мр 0052-11
|
|
Скачать 0.54 Mb.
|
|
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Главный государственный санитарный врач Российской Федерации Г.Г.ОНИЩЕНКО 29 декабря 2011 года 1.2. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ ОЦЕНКА ВОЗДЕЙСТВИЯ НАНОМАТЕРИАЛОВ НА ФУНКЦИЮ ИММУНИТЕТА МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ МР 1.2.0052-11 1. Авторский коллектив: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт питания РАМН; Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; Учреждение Российской академии наук Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН; Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН. Разработаны в рамках Федеральной целевой программы "Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008 - 2011 годы". 2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 29.12.2011. 3. Введены в действие 29.12.2011. 4. Введены впервые. ^ 1.1. Настоящие Методические рекомендации определяют порядок и методы оценки безопасности искусственных наноматериалов по их воздействию на функцию иммунитета. 1.2. Настоящие Методические рекомендации могут применяться: - при оценке безопасности разрабатываемых новых и уже используемых наноматериалов; - при оценке рисков, связанных с процессами производства, оборота, использования и утилизации наноматериалов; - в процессе проведения экспертизы продукции сельского хозяйства, пищевых продуктов, фармацевтической промышленности, биотехнологического производства, содержащих наночастицы и наноматериалы; - при проведении мероприятий по осуществлению надзора (контроля) в процессе производства, переработки и утилизации искусственных наноматериалов. 1.3. Методические рекомендации разработаны с целью обеспечения единства измерений и представления результатов при оценке воздействия наноматериалов на функцию иммунитета. 1.4. Методические рекомендации предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы научно-исследовательскими организациями гигиенического профиля, медицинскими учебными заведениями и иными организациями и учреждениями, проводящими исследования по оценке безопасности наноматериалов и продукции наноиндустрии. ^ В связи с расширением использования нанотехнологий в различных отраслях промышленности наночастицы и наноматериалы могут содержаться в значимых количествах в объектах окружающей среды (атмосферный воздух, вода, почва), продовольственном сырье и пищевых продуктах. Ввиду этого, оценка риска, связанного с их воздействием на организм, представляет собой важную задачу, решаемую в ходе осуществления санитарно-эпидемиологического надзора. Одним из важнейших этапов оценки риска является характеристика опасности, то есть количественное определение степени воздействия опасного фактора (в данном случае наноматериалов) на наиболее чувствительные органы и системы. В их числе, согласно имеющимся в настоящее время данным, одно из ведущих мест принадлежит иммунной системе. Это связано, во-первых, с тем, что клетки иммунной системы принадлежат к числу наиболее быстро дифференцируемых и обновляемых клеток организма, в них с высокой эффективностью протекают процессы митоза, биосинтеза ДНК и других биополимеров. Ввиду наличия у наночастиц многих типов способности проникать через биологические мембраны в клетки и взаимодействовать с биополимерами, нормальная функция иммунных клеток должна рассматриваться как одна из наиболее чувствительных к повреждающему действию этих факторов. Аналогией повреждающего действия наноматериалов на генетический аппарат клетки и биосинтетические процессы является в данном случае действие ионизирующей радиации, как известно, повреждающей также, в первую очередь, клетки иммунной системы. В рамках Федеральной целевой программы "Развитие инфраструктуры наноиндустрии на 2008 - 2011 гг." был разработан и утвержден в установленном порядке Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека ряд методических документов, включающих порядок и методы тестирования эффектов наночастиц и наноматериалов в биологических системах различного уровня организации (МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов"; МУ 1.2.2634-10 "Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза"; МУ 1.2.2635-10 "Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов"; МУ 1.2.2741-10 "Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных"; МУ 1.2.2745-10 "Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных"; МУ 1.2.2869-11 "Порядок оценки токсического действия наноматериалов на лабораторных животных"; МУ 1.2.2874-11 "Порядок выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных"; МР 1.2.2522-09 "Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека"; МР 1.2.2566-09 "Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo"). Рассматриваемый комплекс методик позволяет проводить оценку безопасности наночастиц и наноматериалов на иерархически организованной системе биологических объектов in vitro и in vivo, включая культуры микроорганизмов, клеточные культуры, гидробионты (беспозвоночные и рыбы), высшие растения, организмы лабораторных животных с использованием комплекса морфологических, биохимических, токсикологических, микробиологических, физиологических и иных методов. Вместе с тем, вопрос об учете в рамках указанной методологии воздействия наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета сохраняет свою актуальность. В настоящих Методических рекомендациях представлены методические подходы к оценке воздействия наночастиц и наноматериалов, в первую очередь, на клеточное звено иммунитета (пролиферация иммунокомпетентных клеток, их функциональные характеристики), а также на гуморальное звено иммунитета, оцениваемое по продукции специфических антител. Изучение перечисленных показателей осуществляется на модели экспериментальных животных, которым вводили наноматериалы, принципиально в двух возможных режимах: а) in vivo, когда количественно оцениваются параметры системы иммунитета непосредственно в организме экспонированных лабораторных животных, и б) ex vivo, когда лабораторные тесты проводятся в строго контролируемых условиях, в культурах клеток, полученных от животных, которым предварительно вводили наноматериалы по определенной схеме. В качестве экспериментальных моделей предлагается использование как предварительно иммунизированных посторонним (по отношению к тестируемым наноматериалам) антигеном, так и не иммунизированных животных. III. Нормативные ссылки 3.1. Федеральный закон от 30 марта 1999 года N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения". 3.2. Федеральный закон от 2 января 2000 года N 29-ФЗ "О качестве и безопасности пищевых продуктов". 3.3. Федеральный закон от 26 июня 2008 года N 102-ФЗ "Об обеспечении единства измерений". 3.4. Федеральный закон от 27 декабря 2002 года N 184-ФЗ "О техническом регулировании". 3.5. Федеральный закон от 10 января 2002 года N 7-ФЗ "Об охране окружающей среды". 3.6. Постановление Правительства Российской Федерации от 30 июня 2004 года N 322 "Об утверждении Положения о Федеральной службе в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека". 3.7. Постановление Правительства Российской Федерации от 21 декабря 2000 года N 987 "О государственном надзоре и контроле в области обеспечения качества и безопасности пищевых продуктов". 3.8. Постановление Правительства Российской Федерации от 21 декабря 2000 года N 988 "О государственной регистрации новых пищевых продуктов, материалов и изделий". 3.9. Постановление Правительства Российской Федерации от 2 февраля 2006 года N 60 "Об утверждении Положения о проведении социально-гигиенического мониторинга". 3.10. Постановление Правительства Российской Федерации от 15 сентября 2005 года N 569 "О Положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации". 3.11. Приказ Министерства здравоохранения СССР от 12 августа 1977 года N 755 "О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных". 3.12. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. N 708н "Об утверждении Правил лабораторной практики". 3.13. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 23 июля 2007 года N 54 "О надзоре за продукцией, полученной с использованием нанотехнологий и содержащей наноматериалы". 3.14. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31 октября 2007 года N 79 "Об утверждении Концепции токсикологических исследований, методологии оценки риска, методов идентификации и количественного определения наноматериалов". 3.15. СП 2.2.2.1327-03 "Гигиенические требования к организации технологических процессов, производственному оборудованию и рабочему инструменту". 3.16. МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов". 3.17. МУ 1.2.2636-10 "Проведение санитарно-эпидемиологической экспертизы продукции, полученной с использованием нанотехнологий и наноматериалов". 3.18. МУ 1.2.2741-10 "Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных". 3.19. МУ 1.2.2745-10 "Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных". 3.20. МУ 1.2.2874-11 "Порядок выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных". 3.21. МУ 1.2.2634-10 "Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза". 3.22. МУ 1.2.2635-10 "Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов". 3.23. МУ 1.2.2869-11 "Порядок оценки токсического действия наноматериалов на лабораторных животных". 3.24. МУК 4.2.2429-08 "Метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах". 3.25. МР 1.2.2522-09 "Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека". 3.26. МР 1.2.2566-09 "Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo". 3.27. МР 1.2.0022-11 "Порядок отбора проб для контроля за наноматериалами". 3.28. МР 1.2.0023-11 "Контроль наноматериалов в пищевой продукции". 3.29. МР 1.2.0024-11 "Контроль наноматериалов, применяемых в химической промышленности". 3.30. МР 1.2.2641-10 "Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, живых организмах и пищевых продуктах". 3.31. ГОСТ 25336-82 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры". 3.32. ГОСТ 26678-85 "Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия". 3.33. ГОСТ Р 51652-2000 "Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия". 3.34. ГОСТ 24104-2001 "Весы лабораторные. Общие технические требования". 3.35. ГОСТ 1770-74 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия". 3.36. ГОСТ 27987-88 "Анализаторы жидкости потенциометрические ГСП. Общие технические условия". 3.37. ГОСТ 24861-91 "Шприцы инъекционные однократного применения". 3.38. ГОСТ 3-88 "Перчатки хирургические резиновые. Технические условия". 3.39. ГОСТ 4328-77 "Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия". 3.40. ГОСТ 4198-75 "Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия". 3.41. ГОСТ 4233-77 "Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия". 3.42. ГОСТ 4172-76 "Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия". 3.43. ГОСТ 25336-82 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры". 3.44. ГОСТ 6709-72 "Вода дистиллированная. Технические условия". 3.45. ГОСТ 2493-75 "Реактивы. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия". 3.46. ГОСТ 4204-77 "Реактивы. Кислота серная. Технические условия". 3.47. ГОСТ 4201-79 "Натрий углекислый кислый. Технические условия". 3.48. ГОСТ 11293-89 "Желатин. Технические условия". 3.49. ГОСТ 908-2004 "Кислота лимонная моногидрат пищевая. Технические условия". 3.50. ГОСТ 22280-76 "Реактивы. Натрий лимоннокислый 5,5-водный. Технические условия". 3.51. ГОСТ 3773-72 "Реактивы. Аммоний хлористый. Технические условия". 3.52. ГОСТ 245-75 "Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия". 3.53. ГОСТ 2263-79 "Натр едкий технический". 3.54. ГОСТ 3118-77 "Реактивы. Кислота соляная. Технические условия". 3.55. ГОСТ 17299-78 "Спирт этиловый технический. Технические условия". 3.56. ГОСТ 7.32-2001 "Отчет о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления". 3.57. ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025-2006 "Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий". ^ 4.1. Целью оценки воздействия наноматериалов искусственного происхождения на функцию иммунитета является: - выявление процессов иммунной защиты организма, являющихся мишенями токсического действия наночастиц и наноматериалов; - установление зависимости доза - эффект, возможных эффектов кумуляции наночастиц в организмах животных по показателям воздействия на функцию иммунитета; - токсиколого-гигиеническая и медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов и продукции, их содержащей; - гигиеническое нормирование содержания наноматериалов в объектах окружающей среды и потребительской продукции; - экспертиза наночастиц и наноматериалов, производимых на территории Российской Федерации или ввозимых на территорию Российской Федерации; - оценка риска для здоровья населения при поступлении наноматериалов в организм с пищей, водой, атмосферным воздухом и иными путями; - разработка мероприятий по охране здоровья населения и окружающей среды от воздействия наночастиц и наноматериалов. 4.2. Оценка воздействия наноматериалов на показатели системы иммунитета проводится в экспериментах in vivo, при путях поступления наночастиц и наноматериалов, максимально приближенных к условиям экспонирования ими через объекты окружающей среды в обстановке реального воздействия, а также в системах ex vivo, включающих тестирование в культуре клеток, полученных от животных, которым вводили наноматериалы. 4.3. Объектами оценки воздействия наноматериалов на систему иммунитета являются состав и численная характеристика популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток, их функциональные характеристики в базальных условиях и при антигенной и неспецифической стимуляции, показатели апоптоза, уровни гуморальных факторов иммунитета (цитокинов, антител). 4.4. Выбор биологического объекта воздействия наночастиц и наноматериалов (вида, линии лабораторных животных), принципы выбора действующих доз, пути, длительность и кратность введения наночастиц и наноматериалов, состав опытных и контрольных групп тестируемых организмов устанавливаются для отдельных тест-систем в соответствии с МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов", МР 1.2.2566-09 "Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo", МУ 1.2.2634-10 "Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза", МУ 1.2.2635-10 "Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов", МУ 1.2.2869-11 "Порядок оценки токсического действия наноматериалов на лабораторных животных". 4.5. При выборе наноматериалов, являющихся объектами оценки токсического действия на иммунную систему, необходимо принимать во внимание: - возможность экспозиции работников нанотехнологических производств, потребителей продукции наноиндустрии и населения в целом наночастицами и наноматериалами на данной территории, в условиях промышленного производства или при потреблении продукции определенного типа; - данные литературы из источников, отвечающих критериям научной полноты и достоверности о наличии у тестируемых наноматериалов и их близких аналогов цитотоксических, генотоксических, мутагенных, иммунотоксических свойств; - степень потенциальной опасности наноматериалов для здоровья человека в соответствии с МР 1.2.2522-09 "Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека". 4.6. Лаборатория (организация), проводящая исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета, должна быть аккредитована на проведение работ в соответствующей области. В лаборатории должны соблюдаться правила надлежащей лабораторной практики в соответствии с Приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 года N 708н "Об утверждении Правил лабораторной практики". 4.7. В организации (лаборатории), проводящей исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета, должна быть разработана программа по обеспечению качества проводимых исследований. Все производственные операции проводятся в соответствии со Стандартными операционными процедурами (СОП), осуществляемыми в целях обеспечения качества, достоверности и воспроизводимости результатов исследования. 4.8. Организации (лаборатории), проводящие исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета, должны быть укомплектованы необходимым оборудованием и средствами измерений, прошедшими поверку (калибровку) в установленном порядке. Эксплуатация оборудования и средств измерений проводится в соответствии с техническим паспортом и инструкцией по применению. Результаты проведения поверки (калибровки) и текущего ремонта оборудования фиксируются в специальном журнале, доступном в любое время сотрудникам, эксплуатирующим оборудование или обеспечивающим его обслуживание. Применяются средства измерений, имеющие сертификат и зарегистрированные в Государственном реестре средств измерений. 4.9. Организации (лаборатории), проводящие исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета, должны иметь помещения для содержания и работы с лабораторными животными (виварии, клиники лабораторных животных), требования к которым изложены в МУ 1.2.2869-11 "Порядок оценки токсического действия наноматериалов на лабораторных животных". 4.10. Организации (лаборатории), проводящие исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета, должны иметь условия для работы с биологическим материалом, включая культуры иммунокомпетентных клеток, чистые боксированные помещения, ламинарные шкафы с горизонтальным потоком воздуха, обеспечивающие длительную экспозицию облучения внутренних поверхностей ультрафиолетовым светом. 4.11. Организации (лаборатории), проводящие исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета, должны иметь оборудование, обеспечивающее безопасность работы с наноматериалами неорганического и биогенного происхождения: ламинарные вытяжные шкафы, перчаточные боксы, снабженные системой вентиляции (НЕРА-фильтры), препятствующие поступлению аэрозоля наноматериалов в воздух производственных помещений и в окружающую среду. 4.12. Документом, подтверждающим результаты проведенных исследований по влиянию наноматериалов на функцию иммунитета, является отчет о проведенном исследовании. Отчет содержит следующие сведения: - название исследования; - адрес организации; - даты начала и завершения исследований; - цель и задачи исследования; - характеристика тестируемых наночастиц и наноматериалов (химический состав, CAS-номер, средний, минимальный и максимальный размер частиц, форма частиц, наличие примесей, состав дисперсионной среды (носителя) в соответствии с МУ 1.2.2636-10 "Проведение санитарно-эпидемиологической экспертизы продукции, полученной с использованием нанотехнологий и наноматериалов"); - применяемая биологическая модель и обоснование ее использования; - перечень исследованных биологических образцов и применяемых стандартных образцов; - вид, линия, пол и возраст используемых лабораторных животных; - состав применяемых рационов, условия содержания животных; - метод введения наночастиц/наноматериалов, применяемые дозы, длительность и кратность введения; - план (дизайн) исследования; - перечень использованных средств измерений и вспомогательного оборудования и режимы их работы; - методы статистической обработки результатов; - результаты исследования, представленные в виде обобщающих таблиц, рисунков с соответствующей статистической обработкой и комментариями к ним; - заключение; выводы; список использованных источников. Оформление отчета о результатах исследования должно соответствовать требованиям ГОСТ 7.32-2001 "Отчет о научно-исследовательской работе. Структура и правила оформления". Отчет о результатах проведенного исследования составляется ответственным исполнителем, утверждается руководителем организации и скрепляется печатью организации. 4.13. Организация (лаборатория), проводящая исследования по влиянию наночастиц и наноматериалов на функцию иммунитета, должна обеспечить конфиденциальность результатов исследований в рамках принятых ею обязательств и в соответствии с законодательством Российской Федерации. ^ 5.1. Модель оценки функции иммунитета у крыс, иммунизированных белковым антигеном 5.1.1. Тестирование проводят на шести группах крыс самцов линии Вистар или линии Спрейг-Доули исходной массой 100 - 120 г (группы N 1 - 6). Численность групп животных составляет не менее 10 особей. Животные всех групп на протяжении всего периода тестирования получают полусинтетический рацион в соответствии с МУ 1.2.2520-09 "Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов". Крыс размещают в клетках из ударопрочной пластмассы группами по 3 - 4 особи; рацион и питьевую воду предоставляют в режиме свободного неограниченного доступа. Примечание: возможно использование при проведении тестирования крыс других линий, а также нелинейных животных. Используемые схемы иммунизации при этом должны быть модифицированы в соответствии с индивидуальными особенностями иммунного реагирования у этих животных. 5.1.2. Тестируемые наночастицы и наноматериалы диспергируют в дистиллированной воде и дополнительно обрабатывают ультразвуком (частота 44 кГц, время и мощность обработки устанавливаются опытным путем) во избежание процессов агрегации. При необходимости степень диспергирования наноматериала проверяют методом электронной микроскопии согласно МР 1.2.2641-10 "Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, живых организмах и пищевых продуктах". Дисперсию наночастиц вводят ежедневно внутрижелудочно (в/ж) через зонд на протяжении 28 дней. 5.1.3. Иммунизацию крыс осуществляют к парентерально вводимому модельному белковому антигену - овальбумину куриного яйца (ОВА). ОВА представляет собой фосфопротеид, состоящий из одной аминокислотной цепи, имеющий молекулярную массу 44 кД. Данный белок высоко иммуногенен для большинства видов млекопитающих. В целях повышения интенсивности иммунного ответа используют адъювант - свежеосажденный гидроксид алюминия. Иммунизацию осуществляют по следующей схеме. На 1-й, 3-й и 5-й день опыта крысам внутрибрюшинно (в/б) вводят дозу 100 мкг ОВА, адсорбированного на 10 мг гидроксида алюминия в 0,2 куб. см физиологического раствора. На 21-й день опыта вводят дополнительно еще 10 мкг ОВА в тех же условиях для индукции вторичного иммунного ответа. 5.1.4. Взятие биологического материала (цельная кровь, сыворотка крови) осуществляют на 29-ый день тестирования в три пробирки, из которых одна обработана для предотвращения свертываемости крови 1,6 мг трикалиевой соли ЭДТА, а другая - 100 куб. мм 1% раствора гепарина путем взятия крови из нижней полой вены под глубокой эфирной анестезией. 5.1.5. План (дизайн) тестирования рекомендуется составлять в соответствии с данными, представленными в таблице 1. Таблица 1 ^ НАНОЧАСТИЦ НА ПОКАЗАТЕЛИ СИСТЕМЫ ИММУНИТЕТА У ИММУНИЗИРОВАННЫХ ОВА КРЫС ┌─────┬────────────────┬─────┬────────────────┬───────────────────────────┐ │N п/п│ Обозначение │Число│ Сенсибилизация │ Внутрижелудочное введение │ │групп│ групп │крыс │ │ препаратов │ ├─────┼────────────────┼─────┼────────────────┼───────────────────────────┤ │1 │Контроль │10 │Не сенсибилизи- │В/ж введение дистиллирован-│ │ │ │ │рованные │ной воды в дозе 10 куб. см │ │ │ │ │ │на кг массы тела с 1-го по │ │ │ │ │ │28-ой дни опыта │ ├─────┼────────────────┼─────┼────────────────┼───────────────────────────┤ │2 │Сенсибилизация │10 │В/б │В/ж введение дистиллирован-│ │ │ │ │сенсибилизация │ной воды 10 куб. см на кг │ │ │ │ │овальбумином на │массы тела с 1-го по 28-ой │ │ │ │ │Al(OH) на 1, 3,│дни опыта │ │ │ │ │ 3 │ │ │ │ │ │5 и 21-ый дни │ │ │ │ │ │опыта │ │ ├─────┼────────────────┼─────┼────────────────┼───────────────────────────┤ │3 │Введение │10 │Не сенсибилизи- │В/ж введение дисперсии │ │ │наночастиц, доза│ │рованные │наночастиц в дистиллирован-│ │ │"А" │ │ │ной воде в дозе "А" с 1-го │ │ │ │ │ │по 28-ой дни опыта │ ├─────┼────────────────┼─────┼────────────────┼───────────────────────────┤ │4 │Введение │10 │Не сенсибилизи- │В/ж введение дисперсии │ │ │наночастиц, доза│ │рованные │наночастиц в дистиллирован-│ │ │"Б" │ │ │ной воде в дозе "Б" с 1-го │ │ │ │ │ │по 28-ой дни опыта │ ├─────┼────────────────┼─────┼────────────────┼───────────────────────────┤ │5 │Сенсибилизация +│10 │В/б │В/ж введение дисперсии │ │ │наночастицы, │ │сенсибилизация │наночастиц в дистиллирован-│ │ │доза "А" │ │овальбумином на │ной воде в дозе "А" с 1-го │ │ │ │ │Al(OH) на 1, 3,│по 28-ой дни опыта │ │ │ │ │ 3 │ │ │ │ │ │5 и 21-ый дни │ │ │ │ │ │опыта │ │ ├─────┼────────────────┼─────┼────────────────┼───────────────────────────┤ │6 │Сенсибилизация +│10 │В/б │В/ж введение дисперсии │ │ │наночастицы, │ │сенсибилизация │наночастиц в дистиллирован-│ │ │доза "Б" │ │овальбумином на │ной воде в дозе "Б" с 1-го │ │ │ │ │Al(OH) на 1, 3,│по 28-ой дни опыта │ │ │ │ │ 3 │ │ │ │ │ │5 и 21-ый дни │ │ │ │ │ │опыта │ │ └─────┴────────────────┴─────┴────────────────┴───────────────────────────┘ Примечание: 1) величину дозы "А" наноматериала устанавливают на основе анализа возможных сценариев пероральной экспозиции наноматериалом человека в условиях контаминации пищевых продуктов и воды отходами деятельности нанотехнологических производств и (или) возможного поступления наноматериала, входящего в состав потребительской продукции с учетом возможной неопределенности и 10-кратного коэффициента запаса, определяемого биологической природой используемой модели (тестирование на грызунах); 2) доза "Б" является 10 - 100-кратно агравированной (увеличенной) в сравнении с дозой "А"; 3) при выборе доз наноматериала следует учитывать данные о его собственных токсических свойствах (LD ) - при наличии таковых. 50 5.1.6. Антиген для сенсибилизации готовят в соответствии со следующей прописью. Готовят следующие растворы. 1) 20 или 2 мг ОВА (5-кратно перекристаллизованный препарат производства "Sigma-Aldrich" (США) или аналогичный) в 1 куб. см стерильного апирогенного физиологического раствора (0,15 М NaCl) по ГФ СССР, Х, 426. 2) 10% по массе алюмокалиевые квасцы х.ч. в дистиллированной воде "для инъекций". 3) 4% по массе (1 М) гидроксид натрия х.ч. в дистиллированной воде "для инъекций". Все растворы фильтруют через мембранные фильтры с размером пор 0,2 мкм для удаления пыли и бактерий. В стерильном стеклянном флаконе смешивают 1 куб. см раствора 1, 1 куб. см раствора 2 и добавляют по каплям 0,6 куб. см раствора 3. Смесь перемешивают и оставляют на 5 минут, после чего переносят в центрифужную пробирку объемом 10 куб. см. Отмывают образовавшийся осадок троекратно объемами по 10 куб. см стерильного апирогенного физиологического раствора; после каждой отмывки осадок седиментируют центрифугированием при ускорении 3000 g в настольной лабораторной центрифуге с охлаждением в течение 5 минут. Окончательно осадок диспергируют в 40 куб. см стерильного апирогенного физиологического раствора. Полученную смесь вводят крысам. Препарат антигена годен к использованию в течение не более 48 часов. Примечание: перед использованием дисперсию антигена необходимо взбалтывать. ^ Интенсивность гуморального иммунного ответа оценивают по концентрации циркулирующих специфических IgG антител с помощью непрямого твердофазного иммуноферментного теста на полистироле. 5.2.1. Оборудование - Фотометр планшетный автоматический "ЭФОС 9305" (производства "ОАО МЗ Сапфир", Россия) с интерференционными светофильтрами на длину волны 492 и 620 нм или иной другой прибор с аналогичными параметрами; - воздушный термостат на температуру +37 °С; - водяная баня на температуру +37 °С; - лабораторный настольный встряхиватель; - устройство для отмывки лунок иммуноферментных - планшет на 8 каналов; - весы аналитические лабораторные электронные с верхним пределом взвешивания 120 г 2-го класса точности +/- 0,1 мг с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104-2001; - весы технические лабораторные электронные с верхним пределом взвешивания 120 г и ценой деления 0,01 г по ГОСТ 24104-2001; - иономер универсальный со стеклянным электродом для измерения pH водных растворов; погрешность измерения +/- 0,05 ед. pH по ГОСТ 27987-88; - секундомер; - пипетка полуавтоматическая 8-канальная регулируемая на объем 20 - 200 куб. мм с наконечниками; - пипетки полуавтоматические 1-канальные на объемы 0 - 20; 20 - 200 и 200 - 1000 куб. мм с наконечниками; - дистиллятор лабораторный; - магнитная мешалка; - колбы мерные наливные на объемы 500, 1000 и 2000 куб. см по ГОСТ 1770-74; - цилиндры мерные на 25, 50, 100 куб. см по ГОСТ 1770-74; - стаканы стеклянные на 500 и 1000 куб. см; - шприц на объем 2 куб. см по ГОСТ 24861-91. 5.2.2. Материалы и реактивы - Овальбумин куриного яйца (ОВА), 5-кратно перекристаллизованный, производства "Sigma-Aldrich" (Германия) или другой с аналогичными параметрами; - кроличьи моноспецифические антитела против IgG крысы, меченные пероксидазой, лиофилизованные, производства НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития России, или аналогичные; - нормальная лошадиная сыворотка (НЛС); - фосфат калия однозамещенный, х.ч., по ГОСТ 4198-75; - фосфат калия двузамещенный трехводный, квалификации х.ч., по ГОСТ 2493-75; - хлорид натрия, х.ч., по ГОСТ 4233-77; - лимонная кислота, х.ч., по ГОСТ 908-2004; - фосфат натрия двузамещенный 12-водный, х.ч., по ГОСТ 4172-76; - кислота серная d = 1,84, квалификации х.ч., по ГОСТ 4204-77; - гидроксид натрия, х.ч., по ГОСТ 4328-77; - натрий двууглекислый безводный, х.ч., по ГОСТ 4201-79; - твин-20 (полиоксиэтиленсорбитан монолаурат) производства "Sigma-Aldrich", Германия, или другой с аналогичными параметрами; - орто-фенилендиамин градации "Analytical grade"; - перекись водорода "медицинская" 33% по ТУ 6-02-570-75; - желатин ("пищевая марка П-11") по ГОСТ 11293-89; - планшеты полистирольные разборные плоскодонные со "средней" степенью связывания. 5.2.3. Приготовление рабочих растворов Буфер для иммобилизации антигенов. Навеску 4 г гидроксида натрия, х.ч., переносят в мерную колбу на 100 куб. см, растворяют и доводят дистиллированной водой до метки. Навеску 8,4 г натрия двууглекислого помещают в стакан на 1000 куб. см, растворяют в 800 - 900 куб. см дистиллированной воды на магнитной мешалке. Добавляют раствор гидроксида натрия при перемешивании под контролем иономера до достижения pH 9,7 +/- 0,1. Смесь количественно переносят в мерную колбу на 1000 куб. см и доводят водой до метки. Фосфатно-солевой буфер (ФСБ). Навеску 68 г калия фосфата однозамещенного переносят в мерную колбу на 500 куб. см, растворяют и доводят дистиллированной водой до метки. Навеску 228 г калия фосфата двузамещенного трехводного переносят в мерную колбу на 1000 куб. см, растворяют и доводят дистиллированной водой до метки. Полученные растворы смешивают под контролем иономера до достижения величины pH = 7,95 +/- 0,05. Навеску 180 г натрия хлорида переносят в мерную колбу на 1000 куб. см, растворяют и доводят дистиллированной водой до метки. В мерную колбу на 2000 куб. см вносят мерным цилиндром 20 куб. см смеси раствора фосфатов и 100 куб. см раствора натрия хлорида и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор Твин-ФСБ. В мерную колбу на 2000 куб. см вносят с помощью шприца 2 куб. см Твин-20 и доводят ФСБ до метки. Раствор НЛС-ФСБ. 100 куб. см ФСБ смешивают с 1 куб. см нормальной лошадиной сыворотки. Блокирующий реагент. 0,2 г желатина смешивают с 20 куб. см ФСБ, оставляют на 16 ч в холодильнике, после чего нагревают при +37 °С на водяной бане до полного растворения. Субстратный буфер. В стакан на 1000 куб. см вносят навески 26,3 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного и 5,6 г лимонной кислоты тригидрата. Растворяют на магнитной мешалке в 800 - 900 куб. см дистиллированной воды, количественно переносят в мерную колбу на 1000 куб. см, доводят до метки и проверяют pH, который должен составлять 6,0 +/- 0,1. Раствор субстрата (готовится непосредственно перед употреблением). Навеску 6,0 +/- 0,1 мг орто-фенилендиамина растворяют при нагревании до 40 - 50 °С в 15 куб. см субстратного буфера и непосредственно перед нанесением на планшету вносят 40 куб. мм 33% перекиси водорода, разведенной 1:1 дистиллированной водой. Останавливающий реагент (фиксатор). В мерную колбу на 1000 куб. см вносят 900 - 950 куб. см дистиллированной воды и отмеряют цилиндром 28 куб. см серной кислоты. Раствор перемешивают, охлаждают до комнатной температуры и доводят дистиллированной водой до метки. 5.2.4. Проведение анализа В лунки полистирольных планшет вносят по 1,0 мкг ОВА в 100 куб. мм 0,1 М Na-бикарбонатного буфера pH 9,7 +/- 0,1 и оставляют на 16 ч в холодильнике. По окончании адсорбции антигена буфер удаляют путем промывки 0,01 М Na-фосфатным буфером pH 7,3 +/- 0,1 с 0,15 М NaCl и 0,1% Твин-20 (Твин-ФСБ). В лунки на 30 мин. вносят по 200 куб. мм 1% раствора желатина в Твин-ФСБ. Отмывку повторяют, после чего вносят в лунки по 100 куб. мм стандартных растворов крысиных антител к ОВА, очищенных методом аффинной хроматографии, или исследуемых сывороток крови крыс в разведении 1:2000. Разведения выполняют в ФСБ с 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА-ФСБ). Планшеты инкубируют 120 мин. при 20 °С со встряхиванием, после чего 5-кратно отмывают Твин-ФСБ и вносят по 100 куб. мм кроличьих антител к IgG крысы, конъюгированных с пероксидазой, в разведении 1:4000 в БСА-ФСБ (примечание: рабочее разведение конъюгированных антител может быть указано на ампуле с сухим препаратом). Инкубацию и отмывку повторяют, после чего проводят реакцию со 100 куб. мм субстрата 0,04% о-фенилендиамина и 0,04% H O в 0,1 М Na-цитрат-фосфатном буфере pH 6,00 +/- 0,05 в течение 15 мин. 2 2 при 37 °С. Реакцию останавливают добавлением 100 куб. мм 1 н H SO . 2 4 Оптическую плотность измеряют при двух длинах волн: основной 492 нм и опорной (620 нм) на автоматическом планшетном фотометре. Концентрации IgG антител в сыворотках крыс определяют по стандартной кривой путем линейной интерполяции в полулогарифмических координатах. 5.2.5. Статистическая обработка результатов Оценку воздействия наночастиц/наноматериалов на показатель ответа антител проводят на основании результатов статистической обработки результатов исследований в соответствии со следующими критериями: а) критерий однородности распределения показателя в шести группах животных, параметрический тест на остаточную дисперсию ANOVA в целях контроля специфичности применяемого теста определения антител; б) факторный анализ с использованием параметрического теста на остаточную дисперсию ANOVA по фактору воздействия наночастиц в группах 2, 5, 6 и парное сравнение животных 2-ой группы с животными 5-ой и 6-ой групп с использованием критериев непараметрической статистики (тесты Манна-Уитни, Колмогорова-Смирнова) в целях выявления эффектов наноматериала, в том числе дозозависимых. При проведении статистической обработки рекомендуется использовать профессиональные пакеты статистических программ. Воздействие наночастиц/наноматериалов на показатели ответа антител считаются выявленным при достоверности различия на уровне значимости Р = 0,05 и менее. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям