Внеклеточная ДНК фактор сигнализации при радиационном эффекте свидетеля 03. 02. 07 Генетика
|
|
Скачать 385.36 Kb.
|
|
На правах рукописи Конькова Марина Сергеевна ВНЕКЛЕТОЧНАЯ ДНК – ФАКТОР СИГНАЛИЗАЦИИ ПРИ РАДИАЦИОННОМ ЭФФЕКТЕ СВИДЕТЕЛЯ 03.02.07 – Генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН
Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП "ГосНИИгенетика") Защита состоится ______________ 2011г. в __ часов на заседании диссертационного совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН по адресу: 115478, город Москва, улица Москворечье, дом 1. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, город Москва, улица Москворечье, дом 1. Автореферат разослан ________________ 2011г. Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.016.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор медицинских наук, профессор Зинченко Р.А. ^ Актуальность темы. Ещё два десятилетия назад эффекты радиации изучались у клеток, непосредственно подвергшихся действию частиц высоких энергий, и сводились к последствиям нерепарированных или неправильно репарированных повреждений ядерной ДНК после взаимодействия её с продуктами радиолиза воды. Эффекты в клетках, которые непосредственно не подверглись облучению, как правило, не рассматривались. Однако в последние годы ушедшего столетия начали появляться сообщения о способности клеток, подвергнутых воздействию ионизирующего излучения в малых дозах, передавать сигнал необлучённым клеткам (клеткам-свидетелям), в результате и в тех, и в других индуцируются одинаковые эффекты (Nagasawa H., Little J.B., 1992). Эффект воздействия облучённых клеток популяции на необлучённые клетки получил название "bystander effect" или "эффект свидетеля" (ЭС) (Lehnert B.E., Goodvin E.H., 1997; Seymour C.B., Mothersill C., 1997). Эффект свидетеля наблюдается преимущественно в интервале малых доз от 1 до 50 сГр (Morgan W.F., Sowa M.B., 2007). Для рентгеновского излучения ЭС тестируется уже при дозе 5 мГр, при этом уровень повреждений ДНК клетки-мишени включает всего пять однонитевых разрывов, 10-15 повреждённых оснований и один двунитевой разрыв ДНК в 20% клеток. Показано, что ЭС может передаваться от облучённых клеток потомству и проявляется в ряду нескольких последующих поколений клеток (Lyng F.M. et al., 2002, Mothersill C. et al., 2002). Механизмы передачи клеткам-свидетелям информации о повреждающем воздействии активно изучаются, однако природа всех факторов сигнального пути до конца не известна. Основное внимание исследователей было сосредоточено на факторах белковой природы (Mothersill C., Seymour C.B., 2001; Nikjoo H., Khvostunov I.K., 2003), прежде всего, на различных цитокинах (Natarajan P.K. et al., 2007). Предполагалось также участие в передаче сигнала в ЭС активных форм кислорода и азота (Azzam E.I. et al., 2002; Matsumoto H. et al., 2007; 2010; Morgan W.F., 2010). В 2007 году сотрудниками лаборатории Молекулярной биологии МГНЦ РАМН было впервые высказано предположение о возможной роли внеклеточной ДНК в реализации эффекта свидетеля (Ермаков А.В. и соавт., 2007). Цель исследования. Цель проведенного исследования – проверка гипотезы: внеклеточная ДНК среды культивирования облучённых клеток (вкДНКR) переносит информацию о радиационном воздействии от облучённых клеток – необлучённым, т.е. выступает в роли фактора сигнализации при реализации эффекта свидетеля. Задачи исследования.
и охарактеризовать её свойства;
радиацией в малых дозах и депротеинизированной вкДНКR;
направленного изменения индуцируемых ею эффектов. Научная новизна. Впервые показано, что вкДНКR выполняет функцию сигнального фактора в реализации эффекта свидетеля, индуцируемого ионизирующим излучением в малых дозах. Определены два условия, которые должны выполняться в клетках для поддержания данной функции вкДНКR: (1) синтез активных форм кислорода и азота и (2) апоптоз повреждённых радиацией клеток. Установлено, что вкДНКR стимулирует в лимфоцитах вторичный окислительный стресс. Впервые показано, что рецепторы "врождённого" иммунитета семейства TLR (TLR9) принимают непосредственное участие в ответе лимфоцитов на воздействие ионизирующего излучения в малых дозах и в реализации эффекта свидетеля. Впервые показана принципиальная возможность моделирования клеточного ответа на действие радиации путем направленного изменения свойств внеклеточной ДНК. Научно-практическая значимость работы. Данные о влиянии свойств вкДНК на клеточный ответ, индуцированный излучением, могут быть использованы при разработке индивидуальных схем радиотерапии. Моделируя содержание GC-богатых последовательностей (GC - ДНК) во вкДНК можно блокировать развитие адаптивного ответа и снизить летальную для клеток опухоли дозу радиации. С другой стороны, анализ индивидуальных свойств вкДНК и их направленное изменение может способствовать повышению радиорезистентности клеток (в перспективе, организма). Положения, выносимые на защиту.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на V и VI международных конференциях "Circulating Nucleic Acids in Plasma/ Serum" (Москва, 2007; Гонконг, 2009); на II Съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007); на Российской научной конференции "Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии" (Санкт-Петербург, 2008); на 37 международной конференции "37th Annual Meeting of the European Radiation Research Society" (Прага, 2009); на международной конференции "Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды" (Сыктывкар, 2009); на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010); на XVI Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 2010); на VI съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2010); на 4 международной школе молодых ученых по молекулярной генетике "Геномика и биология клетки" (Звенигород, 2010); на IV Архангельской международной медицинской научной конференции молодых ученых и студентов (Архангельск, 2011). Диссертационная работа прошла апробацию на семинаре Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического центра РАМН, протокол № 3 от 16.03.2010. Личный вклад автора. Автором подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации, определены задачи исследования и планирование экспериментов. Основная часть исследований выполнена автором лично. Анализ и обобщение полученных результатов, формулировка выводов и написание рукописи выполнены автором самостоятельно. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21 печатная работа. Из них 8 статей опубликованы в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из оглавления, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы состоит из 246 источников, из них 30 отечественных и 216 зарубежных авторов. Работа изложена на 151 листах машинописи. Текст содержит 39 рисунков и 13 таблиц. ^ В исследовании принимали участие 23 здоровых добровольца в возрасте от 19 до 55 лет. Лимфоциты выделяли из периферической крови путем центрифугирования в системе фиколл-верографин, облучали на установке импульсного рентгеновского излучения "АРИНА-2" ("Спектрофлеш", Россия). Облучённые и необлучённые лимфоциты инкубировали в течение 3 ч при 370С (среда содержала 10% эмбриональной телячьей сыворотки). ВкДНК выделяли из среды культивирования стандартным методом экстракции органическими растворителями. Концентрацию фрагментов ДНК определяли флуориметрически на спектрофлуориметре «LS 55» («PerkinElmer», Англия) c использованием красителей Hoechst 33528 или PicoGreen. Для анализа действия вкДНК на интактные клетки в среду культивирования последних добавляли выделенные фрагменты вкДНК в различной концентрации и инкубировали в течение 3 ч при 370С. ^ Акасп.3) в белковых экстрактах клеток определяли с использованием флуоресцирующего субстрата Ac-DEVD-AFC (возб400нм, флу490нм). Активность нормировали на количество клеток. Для этого определяли количество ДНК в образце, из которого получали белковый экстракт. Акасп.3=∆IAFC/1мин.·1мкгДНК, где ∆I – увеличение интенсивности флуоресценции субстрата (в стандартизованных единицах). Нуклеазную активность (НА) в белковых экстрактах определяли с использованием модельного субстрата – комплекса однонитевой ДНК с 30-звенным олигонуклеотидом, содержащим на 5´-конце флуоресцентную группу (FAM), а на 3´-конце тушитель флуоресценции. Для калибровки использовали стандартный раствор ДНКазы-1. НА=∆IFAM /1мин.·1мкгДНК. Активность TNF-α в супертатантах определяли по степени лизиса чувствительных к этому цитокину клеток мышиной фибросаркомы L-929 (Fish H., Gifford J.E., 1989), анализ выполнен к.б.н Е.А.Калашниковой. Концентрацию нитрита в среде определяли колориметрическим стандартным методом Грисса с использованием набора Griess Reagent Kit ("Invitrogen"). В работе использовали ингибиторы: (1) активности каспазы-3 (2 мкМ Biotin-DEVD-FMK ("Sigma)); (2) активных форм кислорода (АФК) (100 мкМ α-токоферол ацетат ("Галено Фарм", Санкт-Петербург)); (3) рецепторов TLR9 (3 мкг/мл олигодезоксирибонуклеотид 2088 (TCC TGG CGG GGA AGT, "Синтол", Москва) или 2 мкг/мл хлорокин ("Boots Company PLC", Англия)). ^ Лимфоциты обрабатывали гипотоническим раствором (0.075М KCl), фиксировали смесью метанол/ледяная уксусная кислота (3:1). Использовали биотинированный зонд на прицентромерный локус 1-й хромосомы (1q12). Гибридизацию осуществляли в термостате "ThermoBrite" ("StatSpin", США). Биотин выявляли конньюгатом авидин-ФИТЦ. Использовали микроскоп Axioplan ("Opton", Германия) и цифровую камеру "RETIGA 2000R" ("IMAGING", Канада). Определение параметров клеток проводили с помощью компьютерной программы анализа изображений ("ИнтерЭВМ", Москва). Для построения распределения параметров использовали данные для 300-500 клеток. ^ фиксированных ядер лимфоцитов проводилась к.б.н. Н.А. Еголиной (лаборатория общей цитогенетики МГНЦ РАМН). Для оценки изменения активности ядрышка определяли число гранул серебра и их суммарную площадь в 150 - 200 интерфазных ядрах. ^ (рибосомный и теломерный повторы человека и сателлит III) в ДНК определяли с помощью метода количественной дот-гибридизации c биотинированными зондами (Вейко Н.Н. и соавт., 2003). ^ методом ПЦР в реальном времени. РНК выделяли с использованием реагента Trizol. Концентрацию выделенной РНК определяли флуориметрически с использованием РНК-связывающегося красителя Quant-iTTM RiboGreen RNA reagent (MoBiTec), возб487 нм, флу524 нм. Обратную транскрипцию проводили с помощью реактивов фирмы “Силекс” по стандартной методике. Для оценки уровня экспрессии TLR9 и MyD88 использовали метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) по принципу TaqMan. В качестве внутреннего стандарта использовали ген GAPDH. ПЦР проводили на приборе Rotor Gene 300 (Corbett, Австр.). Полученные данные обрабатывали методом калибровочного графика и прямым сравнением данных с использованием программы прибора. Ошибка измерения составила ~ 2%. ^ в популяции лимфоцитов определяли методом проточной цитометрии (окраска клеток пропидий йодидом) сотрудники ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА РФ. Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартного пакета программ Statgraphics, Statistica 6.0 и StatPlus. ^ 1. Свойства вкДНК облучённых и интактных лимфоцитов Концентрация вкДНК в среде культивирования лимфоцитов (~0,5·106 клеток/мл среды) 23-х здоровых людей (вкДНКК) через 3 часа культивирования варьировала от 2 до 398 нг/мл среды. Данные о количестве вкДНК целесообразно выражать в процентах от суммарного количества ДНК, которая содержится в клетках и среде культивирования (МвкДНК). Для 22 образцов необлучённых лимфоцитов МвкДНК варьирует от 0.04 до 3.1% (среднее 1.3 ± 1.0%, N = 22). Для образца №23 наблюдалось аномально высокое количество вкДНКК (МвкДНК = 8%). Для лимфоцитов двух доноров (№23 и №5) была определена концентрация вкДНК соответственно 7 раз и 4 раза в течение 2-х лет. Для донора №23 количество вкДНК в среде культивирования оставалось на протяжении этого периода стабильно высоким (5 -10%), для донора №5 – стабильно низким (от 0.1 - 0.3 %). После облучения лимфоцитов концентрация вкДНКR варьировала от 5 до 130 нг/мл среды (N = 23) или от 0.1 до 2.6 % от общего количества ДНК. Сравнение распределений МвкДНКR и МвкДНКК по критерию Манна-Уитни не выявило достоверных различий (p = 0.4; N = 23). Для лимфоцитов 4-х доноров отношение МвкДНКR/МвкДНКК достоверно больше 1 (от 2.5 до 7.1; 4.4 ± 2.2), для 4-х образцов концентрации вкДНКR и вкДНКК примерно одинаковы (p > 0.05). Для ~ 65% образцов детектировано достоверное снижение концентрации вкДНК после облучения (p < 0.05). Отношение МвкДНКR/МвкДНКК для этих образцов варьировало от 0.3 до 0.8 (0.6 ± 0.2; N = 15). Таким образом, облучение по-разному влияет на определяемые количества вкДНКR в среде культивирования лимфоцитов здоровых людей. Содержание повторяющихся последовательностей генома в составе вкДНКR по сравнению с вкДНКK было проанализировано методом сравнительной дот-гибридизации для лимфоцитов двух доноров (№5 и №23). Использовали ДНК-зонды на теломерный, рибосомный повторы и на повтор сателлит III (1q12). Содержание всех трёх повторов во вкДНКR не отличается от такового во вкДНКK (p > 0.1). Таким образом, не происходит существенного изменения состава последовательностей вкДНК после облучения лимфоцитов. ^ К и вкДНКR. На рис. 1 приведена типичная для образцов вкДНК электрофореграмма. ВкДНК представлена фрагментами от 180 до 20000 п.н. Чётко детектируются длинные фрагменты (~20000 п.н.) и фрагменты длиной 180, 360 п.н. и т.д., соответствующие моно- и олигонуклеосомам.
После облучения количество коротких фрагментов увеличивается. "Нуклеосомная лесенка" на электрофореграммах вкДНКК и вкДНКR позволяет предположить, что большая часть вкДНК появляется в среде из апоптотических клеток. ^ определенное методом проточной цитометрии в необлучённых лимфоцитах (МгкК), варьирует от 0.6 до 9.3% всех клеток (3.7 ± 2.5%; N = 23). После облучения (10 сГр) МгкR варьирует от 0.7 до 18.9% от общего количества клеток и возрастает для 22 образцов лимфоцитов (р < 0.05 по критерию Манна-Уитни). Увеличение для большинства образцов после облучения количества гиподиплоидных клеток в среднем в 1.5 раза показывает, что получившие повреждение клетки гибнут при последующем культивировании. Активность каспазы-3 в белковых экстрактах необлучённых лимфоцитов варьирует от 1.5 до 4.9 ед. акт. (3.1 ± 0.9; N = 14). После облучения активность каспазы-3 варьирует от 1.7 до 9.7 ед. акт. (4.4 ± 1.9; N = 14). Сравнение двух распределений по методу Манна – Уитни показало, что при облучении происходит увеличение активности каспазы-3 (р< 0.05). Сопоставление двух параметров: изменение количества гиподиплоидных клеток (МгкR/МгкК) и изменение уровня активности каспазы-3 (Акасп.3R/Акасп.3К) после облучения клеток выявило линейную зависимость (рис. 2). Таким образом, гиподиплоидные клетки – это, прежде всего, апоптотические клетки. Нуклеазная активность в белковых экстрактах необлучённых лимфоцитов НАK варьирует от 1.4 до 5.2 ед. акт. (3.1 ± 1.5; N = 10). После облучения НАR увеличивается (p > 0.05 для каждой пробы) во всех клетках и варьирует от 1.8 до 7.8 ед. акт. (4.0 ± 1.9; N = 10). Показатель НАR/НАK изменяется от 1.1 до 1.5 (среднее 1.3 ± 0.1), что позволяет сделать вывод об увеличении НА в небольшой субпопуляции клеток культуры после облучения. Апоптотические клетки – источник вкДНКR. Апоптоз облучённых лимфоцитов играет значительную роль в появлении в среде фрагментов вкДНКR (Choi J.J. et al., 2005). Блокирование апоптоза ингибитором каспазы-3 (Biotin-DEVD-FMK, 2 мкМ) приводит к снижению в несколько раз концентрации вкДНКR. Для необлучённых клеток количество вкДНКK практически не зависит от присутствия ингибитора (рис. 3).
Таким образом, облучение (10сГр) стимулирует апоптоз в небольшой субпопуляции клеток культуры. Апоптоз сопровождается увеличением НА в клетках и "выщеплением" моно- и олигонуклеосомных фрагментов ДНК из апоптотических клеток. В клеточной популяции увеличивается количество гиподиплоидных клеток, а в среде увеличивается относительное содержание «нуклеосомных» фрагментов. ^ Для анализа ответа лимфоцитов на действие малой дозы радиации и для доказательства участия вкДНК в ЭС изучены четыре эффекта, ранее описанные для облучённых клеток. Кроме того, в качестве аналога радиации, который вызывает окислительный стресс без прямого повреждения ДНК (Lubrich A. et al., 2010), была использована перекись водорода в концентрации 10 мкМ. 1) Перемещение локусов гомологичных хромосом. Известно, что начальная стадия клеточного ответа на действие рентгеновского излучения в малых дозах сопровождается транспозицией центромерных локусов гомологичных хромосом из примембранных областей ядра во внутреннюю и их сближением (Спитковский Д.М. и соавт., 2000; 2003; Abdel-Halim H.I. et al., 2004). Перемещение участков хроматина в ядре многие авторы связывают с регуляцией генной экспрессии в ответ на стресс (Tanabe H. еt al., 2002; Zimber A. еt al., 2004; Grattarola M. et al., 2006; Strasаk L. et al., 2009). Для регистрации перемещения хроматина использовали маркерный локус 1q12, поскольку ранее было показано, что данный локус в норме располагается примембранно, но при различных повреждающих воздействиях перемещается внутрь ядра (Leger I. еt al., 1994; Rupa D.S. et al., 1997; Barki-Celli L. et al., 2005). Использование данного эффекта позволяет количественно проанализировать ранний ответ всей популяции клеток на действие облучения. Положение локусов 1q12 в ядрах G0-лимфоцитов человека были определены с помощью метода FISH (см. рис. 4).  Рис. 4. Препарат ядер лимфоцитов после FISH с зондом на участок 1q12, общий вид (А). Иллюстрация определяемых параметров: радиус-вектора меток (r1 и r2) и радиуса клеточного ядра (Б). Основной параметр – значение нормированного к радиусу ядра радиус-вектора метки (r). Результат представляли в виде гистограмм кумулятивного частотного распределения сигнала (для 300-500 ядер) по значению r (рис. 5). Большая часть ядер интактных лимфоцитов и лимфоцитов, инкубированных в присутствии среды культивирования интактных клеток или в присутствии вкДНКК, характеризуется максимальными значениями r. Подобный профиль распределения изменяется при воздействии ионизирующего излучения (10 сГр), среды культивирования облучённых лимфоцитов, 10 мкМ Н2О2, вкДНКR или вкДНК клеток, обработанных Н2О2 (вкДНКОХ): уменьшается количество ядер с примембранной локализацией зонда (0.8 < r ≤ 1) и увеличивается число ядер с r < 0.8. Помимо гистограмм распределения, эффект более наглядно может быть охарактеризован табличной величиной (Fr), отражающей частоту встречаемости значений r от 0.8 до 1 в процентах (рис. 6).  Рис. 5. (А) Кумулятивное частотное распределение гибридизационного сигнала локуса 1q12 по нормированному радиус-вектору r (0 – центр ядра), полученное для контрольных G0-лимфоцитов (К), подвергнутых воздействию рентгеновского излучения в дозе 10 сГр (R) и Н2О2 в концентрации 10 мкМ (Н2О2). Распределения r для (R) и (Н2О2) отличаются от (К): D = 0.58; α << 10-5, D = 0.55; α << 10-5 соответственно. (Б) Распределения r для клеток, обработанных вкДНКК, вкДНКR, вкДНКОХ (50 нг/мл, 3 часа). Распределения r для (вкДНКR) и (вкДНКОХ) отличаются от вкДНКК (D = 0.42; α << 10-5) и (D = 0.44; α << 10-5) соответственно. Использован тест Колмогорова-Смирнова.  Рис. 6. Изменение значений Fr после воздействия на лимфоциты рентгеновского излучения в дозе 10 сГр (R), Н2О2 (10 мкМ), среды культивирования облучённых и интактных клеток, а также фрагментов вкДНК из среды интактных (вкДНКК), облучённых (вкДНКR) и обработанных Н2О2 (вкДНКОХ) клеток (12 – 130 нг/мл, 3 часа). n – число независимых экспериментов. В контрольных лимфоцитах Fr составляет ~ 60. После облучения или воздействия Н2О2 Fr уменьшается до 10-20 %. При культивировании интактных лимфоцитов в среде облучённых клеток Fr уменьшается до 12-13%, величина эффекта не зависит от количества инкубированных клеток (0.5 - 1.0 · 106, 105 и 104 клеток/мл) которые продуцировали в среду факторы стресс-сигнализации после облучения. Среда интактных клеток не влияет на величину Fr. Таким образом, мы показали, что рассматриваемая клеточная реакция передается необлучённым клеткам по механизму ЭС, благодаря факторам, присутствующим в среде культивирования облучённых клеток. Добавление к интактным клеткам фрагментов вкДНКR и вкДНКОХ вызывает те же эффекты, что и среда культивирования облучённых клеток, а также прямое действие радиации и Н2О2, величина данного эффекта практически не зависит от концентрации вкДНКR и вкДНКОХ в интерваде 12 - 130 нг/мл. В то же время в присутствии вкДНКК в среде культивирования интактных клеток, описываемые эффекты не наблюдаются. Эти эффекты также отсутствуют, если вкДНКR, обработать ДНКазой-1 ("исчерпывающий" гидролиз). ^ Ранний ответ лимфоцитов человека на действие радиации в малой дозе (Вейко Н.Н. и соавт., 2004) и других стимулирующих факторов сопровождается увеличением транскрипции рибосомных генов, что отражается в увеличении площади окрашиваемого серебром материала ядрышка, где локализованы рибосомные гены (Léger I. et al., 1994; Derenzini М., Trerè D., 2001). Данный вариант регистрации увеличения активности рибосомных генов позволяет проанализировать поклеточно ответ всей популяции лимфоцитов. После воздействия рентгеновского излучения на лимфоциты в 2-3 раза увеличивается средняя суммарная площадь окрашиваемых серебром ядрышек и их число (рис. 7). Причем величина средней суммарной площади (SAg) более адекватно отражает увеличение активности ядрышка.  Рис. 7. Анализ активации рибосомных генов в G0-лимфоцитах человека. (а) Общий вид окрашенного AgNO3 препарата фиксированных ядер лимфоцитов. Примеры анализа ядер с одним (б) и несколькими ядрышками (в, г). На рис. 8 для сравнения представлены значения SAg для ядер лимфоцитов, подвергшихся "прямому" воздействию ионизирующего излучения или Н2О2, культуральной среды интактных и облучённых клеток, а также вкДНК среды культивирования. В клетках-свидетелях при инкубации в среде облучённых лимфоцитов (независимо от концентрации в ней облучённых клеток-мишеней) в 1.5- 1.7 раза по сравнению с контролем увеличивается SAg, аналогичные изменения происходят при добавлении вкДНКR и вкДНКОХ.  Рис. 8. Изменение SAg в G0-лимфоцитах человека после воздействия радиации в малой дозе (10 cГр), 10 мкМ Н2О2, среды культивирования облучённых (0.5 - 1.0 · 106, 105 и 104 клеток/мл) и интактных клеток, а также фрагментов вкДНКК, вкДНКR и вкДНКОХ (12 – 130 нг/мл, 3 часа). n – число независимых экспериментов. (3, 4) Изменение активности TNF-α и концентрации нитрита. В связи с тем, что некоторые исследователи предполагают, что цитокин TNF-α (Morgan W.F., 2003; Natarajan M. et al., 2007; Luce A., 2009) и молекула окиси азота (NO) (Azzam E.I. et al., 2002; Matsumoto H. et al., 2007; 2010; Morgan W.F., 2010) являются сигнальными факторами в ЭС, было проанализировано изменение активности TNF-α и концентрации метаболита NO – нитрита после воздействия рентгеновского излучения и вкДНК. При прямом действии радиации, как и при добавлении вкДНКR, происходит значительное увеличение концентрации цитокина TNF-α. Ионизирующее излучение и фрагменты вкДНК также стимулируют увеличение концентрации нитрита в среде культивирования (рис. 9).  Рис. 9. Относительные изменения активности TNF-α и концентрации нитритов в среде культивирования после воздействия на лимфоциты радиации в малой дозе (10 сГр) и фрагментов вкДНК из среды интактных (вкДНКК) и облучённых клеток (вкДНКR). n – число независимых экспериментов. Таким образом, вкДНК, выделенная из среды культивирования облучённых клеток, вызывает те же изменения в интактных лимфоцитах, что и ионизирующее излучение: (1) перемещение участков гетерохроматина первой хромосомы из примембранных областей ядра во внутреннюю; (2) активацию транскрипции рибосомных генов; (3) увеличение активности цитокина TNF-α; (4) увеличение концентрации метаболита окиси азота. ВкДНКR можно рассматривать как фактор сигнализации в ЭС, который переносит информацию о повреждающем воздействии от облучённых лимфоцитов – необлучённым. ^ Основной источник вкДНКR - апоптотические клетки (Choi J.J. et al., 2005; Ермаков А.В. и соавт., 2007б). Блокирование апоптоза облучённых клеток сопровождается снижением концентрации вкДНКR (см. п. 2). Чтобы показать, что свойство вкДНКR быть фактором сигнализации в ЭС зависит от её происхождения из апоптотических облучённых клеток, было исследовано влияние блокирования апоптоза на это свойство. Введение ингибитора (Biotin-DEVD-FMK, 2 мкМ) в среду за 30 мин. до облучения снижает в клетках активность каспазы-3 в 3 раза. Ингибирование апоптоза облучённых лимфоцитов приводит к полной блокировке раннего ответа клеток на действие облучения: локусы 1q12 не изменяют своего положения в ядре (рис. 10), и не происходит увеличения площади SАg ядрышка (рис. 11).  Рис. 10. А – кумулятивное частотное распределение гибридизационного сигнала локуса 1q12 по нормированному радиус-вектору r полученное для контрольных G0-лимфоцитов (К) и подвергнутых воздействию рентгеновского излучения в дозе 10 сГр (R) в отсутствии и присутствии ингибитора каспазы-3. Распределения (К) и (R) достоверно различаются (D = 0.47; α <<10-5). Б - изменение значений Fr после воздействия на лимфоциты радиации, вкДНКК, вкДНКR (12 нг/мл, 3 часа), а также вкДНК из среды культивирования лимфоцитов, в которых ингибирован апоптоз.  Рис. 11. Изменение SAg после воздействия на лимфоциты радиации, вкДНКК, вкДНКR (12 нг/мл, 3 часа), а также вкДНК из среды культивирования лимфоцитов, в которых ингибирован апоптоз. Если из среды, в которой культивировались облучённые лимфоциты с ингибитором апоптоза, выделить фрагменты вкДНКR и добавить их к интактным клеткам, то они не будут обладать стимулирующей активностью: локусы 1q12 не меняют своего положения, и не происходит активации ядрышка (рис. 10-11). Также было показано, что процесс апоптоза важен не только для ответа клеток на действие радиации, но и для развития ЭС в присутствии вкДНКR. Если к клеткам, в которых заблокирован апоптоз, добавить вкДНКR, то, как и при "прямом" действии радиации, не происходит изменения положения локусов 1q12 и увеличения SАg (табл. 1). Таблица 1. Изменение положения локуса 1q12 и величины SRAg в ядрах лимфоцитов, культивируемых в присутствии вкДНКК, вкДНКR и Biotin-DEVD-FMK
(*) α << 10-5; (**) р < 0.001 (t-тест)  Рис. 12. Изменение активности TNF-α и концентрации нитрита в среде культивирования, после воздействия на лимфоциты вкДНКК, вкДНКR, а также при добавлении вкДНКR к лимфоцитам, в которых заблокирован апоптоз ингибитором Biotin-DEVD-FMK. (*) p < 0.05 (U-тест). Блокирование апоптоза при действии вкДНКR на лимфоциты сопровождается также блокированием другого эффекта - синтеза дополнительных количеств NO, который наблюдается в отсутствии ингибитора апоптоза. Активность цитокина TNF-α при таких условиях (вкДНКR + ингибитор) по-прежнему возрастает (рис. 12) по сравнению с контролем. Таким образом, апоптоз облучённых клеток является важной составляющей в реализации эффекта свидетеля и в появлении у вкДНК способности быть фактором сигнализации в ЭС. ^ Ионизирующая радиация может оказывать прямое воздействие на ДНК, вызывая одно- и двунитевые разрывы при непосредственном попадании частицы в её макромолекулу, и непрямое, опосредуемое активными формами кислорода и азота (АФКиА), возникающими в процессе ионизации (Leach J.K. et al., 2001; Morgan W.F., Hartmann A., 2002; Slupphaug G., 2003; Lubrich A. et al., 2010). Чтобы понять значение синтеза АФКиА в раннем ответе клеток на радиацию, было исследовано сравнительное действие на лимфоциты радиации в малых дозах и Н2О2 в малых концентрациях (см. рис. 5 и 6). Дополнительно была исследована реакция лимфоцитов на перечисленные выше воздействия в присутствии ингибитора АФКиА – α-токоферола (Меньщикова Е.Б. и соавт. 2006).
 Рис. 14. Отсутствие достоверных изменений значений Fr и SАg после воздействия на лимфоциты радиации, Н2О2, вкДНКК, вкДНКR, вкДНКОХ (12 нг/мл, 3 часа) в присутствии α-токоферола (100 мкМ). n – число независимых экспериментов. После воздействия и радиации и 10 мкМ Н2О2 уменьшается количество ядер с примембранным расположением локусов и возрастает суммарная площадь SAg в ядре. Такие же изменения происходят при добавлении в среду интактных клеток вкДНКR и вкДНКОХ (см. рис. 5, 6, 8). Блокирование АФКиА α-токоферолом полностью подавляет обе клеточные реакции как в случае прямых повреждений, так и при действии вкДНКR или вкДНКОХ (рис. 13, 14). Таким образом, синтез АФКиА – одна из главных составляющих ответа лимфоцитов и на "прямое" действие радиации и в реализации ЭС, опосредуемом вкДНКR. ^ R Возникает вопрос, каким образом фрагменты вкДНКR (вкДНКОХ) влияют на клетки-свидетели? Для развития в клетках-свидетелях аналогичных с облучёнными лимфоцитами эффектов необходим контакт реципиентов с факторами сигнализации. Можно предположить, что в передаче сигнала при ЭС участвуют известные клеточные рецепторы TLR9, которые могут взаимодействовать с некоторыми из фрагментов вкДНКR. (Hemmi H. et al., 2000; Ahmad-Nejad P. et al., 2002; Latz E. et al., 2004; Tobias P., Curtiss L.K., 2005; Krieg A.M., 2008; Hennessy E.I. et al., 2010; Barber G.N., 2011). Образование комплекса "ДНК-TLR9" инициирует клеточный сигнальный путь, связанный с активацией фактора транскрипции NF-κB посредством участия адаптерной молекулы MyD88, что сопровождается, в том числе, и синтезом АФКиА. Чтобы проверить предположение об участии TLR9 в развитии ответа клеток на облучение, проведены два эксперимента. В первом опыте измерялись относительные количества мРНК TLR9 и MyD88. Во втором опыте TLR9 блокировали двумя типами ингибиторов: хлорокином (изменяет pH в эндосомах, где и реализуется взаимодействие ДНК с TLR9) и олигонуклеотидом-супрессором 2088 (конкурент за связывание лигандов с TLR9, (Duramad O. et al., 2005)). Для оценки изменения количества мРНК TLR9 и MyD88 с помощью обратной транскриптазы из клеточной РНК была получена кДНК. Количество кДНК определяли методом количественной ПЦР (вариант TaqMan), внутренний стандарт – ген GAPDH, рис. 15. Ионизирующая радиация в малой дозе стимулирует в лимфоцитах экспрессию генов TLR9 и MyD88 в 3-4 раза. В присутствии Н2О2 также увеличивается количество мРНК этих генов в 1.5 - 4 раза в зависимости от концентрации агента (рис.15, А). Аналогичное действие на экспрессию генов TLR9 и MyD88 в лимфоцитах оказывает вкДНКR (12 нг/мл), рис.15, Б. Для сравнения использовался классический лиганд для TLR9 - ДНК E.coli. (Hemmi H. et al., 2000). Во всех перечисленных случаях наблюдается достоверное увеличение в несколько раз количества мРНК TLR9 и MyD88. При блокировании TLR9 олигонуклеотидом 2088 (3 мкг/мл) или хлорокином (2 мкг/мл) в лимфоцитах-свидетелях не происходит изменений примембранной локализации локусов 1q12 после добавления фрагментов вкДНКR (табл. 2). Однако активация ядрышка имеет место: после внесения в инкубационную среду вкДНКR, средняя площадь окрашенных серебром участков в ядрах возрастает в 2.3 и 2.7 раза при использовании соответственно хлорокина или олигонуклеотида. Добавление в культуральную среду необлучённых лимфоцитов олигонуклеотида или хлорокина не приводит к транспозиции локусов хромосом или активации ядрышка.  Рис. 15. Изменение количества мРНК TLR9 и MyD88 при действии на лимфоциты радиации, Н2О2 (А), а также при воздействии разных образцов ДНК (Б). Значения нормированы на величину в контроле. Время инкубации - 3часа. Все варианты достоверно отличаются от контроля (К и вкДНКК), p < 0.05. n – число независимых экспериментов. ^ SAg при культивировании лимфоцитов с вкДНК в присутствии ингибиторов TLR9
(*) α << 10-6; (**) р < 0.001 (t-тест) При блокировке рецепторов TLR9 не происходит увеличения активности TNF-α и увеличения концентрации нитрита в присутствии вкДНКR по сравнению с контролем (рис. 16). Очевидно, в реализации стимулирующего действия вкДНКR на синтез TNF-α и окиси азота лимфоцитами-свидетелями задействован клеточный сигнальный путь, связанный с рецепторами TLR9.  Рис. 16. Влияние ингибирования TLR9 хлорокином (2 мкМ) и олигонуклеотидом 2088 (3 мкг/мл) на способность вкДНКR стимулировать увеличение активности TNF-α и концентрации нитритов в среде культивирования (вкДНКR, 50 нг/мл, 3 часа). (*) - обозначены варианты, которые достоверно отличаются от контроля (p < 0.05) (U-тест). n = 3. Таким образом, в ответе клеток на действие радиации и вкДНКR (ЭС) участвуют известные ДНК-узнающие рецепторы TLR9. Поскольку некоторые из реакций (активация ядрышка) не блокируются ингибиторами TLR9 в облучённых лимфоцитах и лимфоцитах-свидетелях, то можно предположить наличие дополнительных ДНК - узнающих рецепторов иной природы. ^ Для ответа на вопрос о возможности моделирования клеточного ответа на воздействие радиации путём изменения состава последовательностей вкДНК, была проведена серия опытов, в которых на лимфоциты одновременно действовали ионизирующим излучением (10 сГр) и модельными фрагментами CpG-ДНК. В качестве источника CpG-ДНК использовали линеаризованную плазмиду, содержащую фрагмент ТОрДНК (участок от -515 до 5321 нуклеотидов в соответствии с HSU 13369, "GeneBank") и встроенную в вектор pBR322. Препарат вводили в конечной концентрации 50 нг/мл. После облучения клеток и последующего их культивирования в среде, содержащей CpG-ДНК, профиль распределения r приближается к таковому для неэкспонированных лимфоцитов (рис.17, А). Также не происходит увеличения площади серебрящегося материала (рис.17, Б).  Рис. 17. Изменение положения прицентромерного гетерохроматина локусов 1q12 и площади SAg в ядрах G0-лимфоцитов человека после облучения (10 сГр) или совместного воздействия радиации и рибосомного повтора (10 сГр + ТОрДНК). Распределения значений r для (10 сГр) и (10 сГр + ТОрДНК) статистически отличаются от (К): D = 0.61; α << 10--5 и D = 0.51; α << 10--4 соответственно; (*) p < 0.05 (U-тест), n=3. Совместное действие радиации и рибосомного повтора значительно снижает экспрессию TLR9 и MyD88 (рис. 18, А). После совместного действия радиации и рибосомного повтора на лимфоциты уровень активности TNF-α значительно возрос по сравнению с контрольным (рис. 18, Б).  Рис. 18. А - изменение количества мРНК TLR9 и MyD88 при действии рентгеновского излучения (10 сГр) или совместного действия радиации и рибосомного повтора (10 сГр + ТОрДНК). Значения нормированы на величину в контроле. Все варианты достоверно отличаются от контроля, p < 0.05, n=3. Б – изменение активности TNF-α в инкубационной среде при аналогичных условиях. (*) - (p < 0.05) (U-тест), n = 3. Таким образом, ответ лимфоцитов на действие ионизирующего излучения можно значительно изменить, изменив состав вкДНК в среде облученных клеток, например, путем введения последовательностей, содержащих CрG- повторы. 8. Заключение В ходе проведённой работы были проанализированы эффекты, сопровождающие ранний (3 часа) клеточный ответ на повреждающее воздействие, которые сравнивались с клеточными реакциями на действие депротеинизированных образцов внеклеточной ДНК, выделенной из среды культивирования клеток. Анализ этих результатов позволил предложить схему развития раннего ответа всей клеточной популяции на действие ионизирующего излучения в малой дозе (рис. 19). Интактные лимфоциты, выделенные из периферической крови человека, исходно содержат поврежденные/апоптотические клетки. Культивирование этих клеток приводит к потере части хроматина. Фрагменты хроматина из таких клеток переходят в среду культивирования и образуют пул вкДНКK (рис. 19, клетка №4). Через 3 часа от начала культивирования количество гиподиплоидных клеток составляет в среднем 3% от числа клеток всей популяции, количество вкДНКK в среде – около 1% от суммарного количества ДНК клеток. Частицы высоких энергий при облучении проходят через определённое количество клеток популяции (зависящее от дозы излучения) и вызывают первичные эффекты – повреждение биомолекул, в том числе индукцию одно- и двунитевых разрывов ДНК, и окислительный стресс (ОС). В экспонированных клетках активируются системы репарации. Повреждения, связанные с двунитевыми разрывами и окислительной модификацией ДНК, будут удалены, при этом есть вероятность, что в геноме такой клетки возникнут мутации (рис. 19, клетка №1). При невозможности репарации серьезных повреждений клетка гибнет по механизму апоптоза (рис. 19, клетка №3), и в среде появляются фрагменты вкДНКR. Основное отличие этих фрагментов от вкДНКК – это повреждение ДНК. Химическая природа повреждений ДНК в условиях окислительного стресса, вызванного радиацией или другим индуктором ОС (например, перекисью водорода), очень хорошо изучена (Dizdaroglu М., 1992; Breen A.P., Murphy J.A., 1995; De Bont R., van Larebeke N., 2004; Radulescu I. et al., 2004; Shi S. et al., 2007; Falk M. et al., 2008). Основная модификация – это образование 8-оксогуанозина и, в меньшем количестве, тимидингликоля. Кроме того, образуются внутри- и межмолекулярные сшивки, одно- и двунитевые разрывы. Очевидно, именно благодаря окислительной модификации, вкДНКR (а также вкДНКОХ из среды клеток, обработанных перекисью) приобретает особые, по сравнению с вкДНКК, свойства – она становится фактором стресс-сигнализации в клеточной культуре.  Рис. 19. Гипотетическая схема развития раннего ответа лимфоцитов на ионизирующее излучение в малых дозах. Чтобы в популяции лимфоцитов наблюдались эффекты, связанные с облучением, необходимо обязательное соблюдение двух условий: (1) присутствие в клетке активных форм кислорода и азота (т.е. возможность окислительной модификации клеточной ДНК) и (2) протекание процесса апоптоза повреждённых клеток (т.е. переход ДНК апоптотической клетки в среду культивирования). Блокирование хотя бы одного из процессов – увеличение количества АФКиА (α-токоферолом) или апоптоза (ингибитором каспазы-3) приводит к тому, что вся клеточная популяция перестает отвечать развитием реакций раннего ответа на действие радиации. Таким образом, с точки зрения рассматриваемых в представленной работе клеточных реакций (перемещение локусов хромосом, активация ядрышка, увеличение активности в среде TNF-α и количества NO), "ранний ответ" лимфоцитов на облучение обязательно включает в себя эффект свидетеля, опосредуемый фрагментами "окисленной" вкДНК. Показано, что способность вкДНКR стимулировать в интактных клетках эффекты, сходные с действием радиации, не является результатом существенного изменения её состава по сравнению с вкДНКК. Не обнаружено изменения содержания трёх повторов генома во вкДНКК и вкДНКR по сравнению с геномной ДНК, выделенной из клеток. Фрагменты вкДНКR "выщепляются" эндонуклеазами из хроматина апоптотических клеток в среду культивирования, где взаимодействуют с ДНК- узнающими рецепторами интактных клеток (рис. 19, III). В литературе рассматривают несколько вариантов взаимодействия вкДНК с клеткой (Vlassov V.V. et al., 2007). Наиболее изучено взаимодействие вкДНК с рецепторами хорошо охарактеризованного семейства TLR (TLR9). Оказалось, что три исследованных эффекта (перемещение локусов хромосом, увеличение активности в среде TNF-α и количества NO) зависят от активности этих рецепторов. Введение в клетки двух известных ингибиторов TLR9 (хлорокин и олигоdN 2088) приводит к блокированию перечисленных эффектов. Стимуляцию сигнального пути, связанного с активацией TLR9 при действии радиации (опосредованном вкДНКR), дополнительно подтверждают данные об увеличении экспрессии на уровне транскрипции двух основных участников ответа: белка TLR9 и белка-адаптора этого сигнального пути (MyD88). Но один эффект – активация транскрипции рибосомных генов – не зависит от присутствия ингибиторов TLR9. Таким образом, можно предположить, что имеются альтернативные пути воздействия вкДНКR на интактные лимфоциты. Существование других типов рецепторов, опознающих фрагменты ДНК, было уже показано в ряде недавних работ других авторов (Wang L. et al., 2008; Barber G.N., 2011). Достаточно трудно, при имеющихся неполных наших и литературных данных, ответить на вопрос о причинах появления у окисленной ДНК (вкДНКR и вкДНКОХ) свойства выступать в роли лиганда TLR9. Этот вопрос требует дальнейшего исследования. Возможно, что TLR9 активируются не в результате связывания с лигандом, а в результате стимуляции другого клеточного каскада, звеном которого является путь, связанный с TLR9. Более вероятным, однако, кажется следующее объяснение. Окислительная модификация ДНК может приводить к нарушению баланса последовательностей лигандов и последовательностей ингибиторов TLR9 в составе геномной ДНК. Известно, что окисление гуанозина до 8-оксогуанозина идет преимущественно в составе последовательностей Gn (Murata M., Kawanishi S., 2002; Oikawa S. et al., 2002), но именно эти повторы являются эффективными ингибиторами связывания лигандов с TLR9 (Peter M. et al., 2008). В интактной ДНК в среднем, по очень заниженным подсчетам, на 1 последовательность-лиганд приходится 10-15 последовательностей-ингибиторов (Костюк С.В. и соавт., 2010). Реально это соотношение для геномной ДНК млекопитающих ещё выше, поскольку лигандом для TLR9 является только неметилированная CpG - содержащая последовательность, которой немного в ДНК вследствие высокого уровня её метилирования. Если ингибиторы Gn будут преимущественно модифицированы окислением и не смогут связаться с TLR9, чтобы их заблокировать, то способность ДНК к взаимодействию с TLR9 должна возрасти. Эта очень интересная гипотеза будет проверена в ближайшее время. Взаимодействие TLR9 с лигандами запускает в клетке каскад событий, сопровождающийся синтезом АФКиА. Стимуляция рецепторов TLR9 сопровождается образованием радикала О2•- (Henneke P. et al., 2002), выделением NO• и АФК (Adachi Y. et al., 2006), в том числе пероксинитрита (Jozsef L. et al., 2006). Образующиеся малоактивные О2•-, NO• или Н2О2 в результате последовательных ферментативных процессов с участием металлосодержащих комплексов могут давать начало высокореакционным соединениям: •OH, гипогалогенным кислотам и 1О2, NO• и NO2• (Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006). На возможное участие в ЭС реакции Фентона указывают также в работе (Matsumoto H. et al., 2007). Таким образом, взаимодействие белков-рецепторов TLR9 с фактором стресс-сигнализации в составе вкДНКR сопровождается вторичным ОС в клетках-свидетелях, в отличие от первичного ОС, вызванного прямым действием радиации. Очевидно, что вторичный ОС индуцирует в небольшом числе клеток те же события, что и первичный ОС – окислительную модификацию ДНК и гибель клеток с высоким уровнем повреждений продуктами ОС. Уровень гибели клеток при вторичном ОС будет ниже, чем при первичном действии радиации, т.к. повреждение клеток не осложняется наличием двунитевых разрывов. По-видимому, в результате активации в клетках антиокислительных систем со временем ответ на однократное действие радиации будет уменьшаться, поскольку будет снижаться уровень окислительной модификации ДНК и количество апоптотических клеток, которые являются донорами активных фрагментов вкДНК. Данные, полученные в предыдущих исследованиях, показывают, что наблюдаемые эффекты детектируются спустя 1-6 часов после облучения, а через 24 часа уменьшаются (Спитковский Д.М., 2005). Важно отметить, что способность вкДНКR индуцировать в клетках-свидетелях наблюдаемые эффекты не зависит от концентрации вкДНКR (в проверенном диапазоне от 12 нг/мл до 130 нг/мл), но зависит от синтеза АФКиА и апоптоза. Это подтверждает предположения о "третичном" окислительном стрессе и апоптозе, который посредством вкДНКОХ "поддерживает" сигнал от первичного (радиация) и вторичного (вкДНКR) воздействия. Таким образом, в ходе данного исследования показано, что внеклеточная ДНК, донором которой служат погибшие вследствие первичного повреждающего воздействия апоптотические клетки, действительно является растворимым фактором стресс-сигнализации в реализации эффекта свидетеля, вызванного действием ионизирующей радиации в малой дозе. Описанная схема развития раннего ответа на ионизирующее излучение в популяции лимфоцитов была подтверждена для других типов культивируемых клеток человека в работах, проведенных в лаборатории молекулярной биологии МГНЦ РАМН. Эта схема справедлива для эндотелиальных клеток культуры HUVEC (Ermakov A.V. et al., 2011) и для мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани (Ermakov A.V. et al., 2011а; Ермаков А.В. и соавт., 2010). Очевидно, предложенная схема может объяснить не только действие радиации на популяцию лимфоцитов, но и некоторые другие эффекты, связанные с индукцией окислительного стресса в клеточных культурах и в организме. Например, недавно было показано, что вкДНК больных острым инфарктом миокарда (который всегда сопровождается высоким уровнем ОС) оказывает сильное биологическое действие на культивируемые клетки (нейроны крысы (Efremova L.V. et al., 2010)) и клетки HUVEC (Алексеева А.Ю. и соавт., 2010). ВкДНКОХ из апоптотических (вследствие ОС) клеток может выступать в организме в роли агента, непрерывно поддерживающего ОС. Это особенно актуально при патологии, сопровождающейся высоким уровнем ОС, а также при старении. В рамках настоящей работы показано, что изменение свойств вкДНК (например, добавление последовательностей ингибиторов или лигандов TLR9) может существенно изменить эффекты, индуцируемые ионизирующей радиацией. ВЫВОДЫ
^
^ АФКиА – активные формы кислорода и азота; вкДНК – внеклеточная ДНК; вкДНКК – фрагменты вкДНК, выделенные из среды необлучённых клеток; вкДНКR – фрагменты вкДНК, выделенные из среды облучённых клеток; НА – нуклеазная активность; ОС – окислительный стресс; ТОрДНК – транскрибируемая область рибосомного повтора; ЭС – эффект свидетеля; FISH – флуоресцентная гибридизация in situ; MyD88 – миелоидный фактор дифференцировки; TLR9 – "toll-like" receptor 9; TNF-α – фактор некроза опухоли.  |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
плохо
1
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям