Роль прогениторных клеток костного мозга в ремоделировании левого желудочка при хронической сердечной недостаточности 03. 03. 04 клеточная биология, цитология, гистология
|
|
Скачать 0.54 Mb.
|
|
На правах рукописи ФАТХУДИНОВ Тимур Хайсамудинович РОЛЬ ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА В РЕМОДЕЛИРОВАНИИ ЛЕВОГО ЖЕЛУДОЧКА ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Москва - 2012 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте морфологии человека РАМН Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Гольдштейн Дмитрий Вадимович доктор медицинских наук, профессор, чл. корр. РАМН ^ Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Онищенко Нина Андреевна доктор медицинских наук, профессор Шехтер Анатолий Борисович доктор медицинских наук, профессор^ � Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии СО РАМН Защита диссертации состоится «___» ________________2012 года в ____часов на заседании диссертационного совета (Д 001.004.01) Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института морфологии человека РАМН по адресу: 117418 Москва, ул.Цюрупы, д.3 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института морфологии человека РАМН Автореферат разослан «____»________________ 2012 года Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Михайлова Лилия Петровна ^ Актуальность проблемы Крайне высокая распространенность сердечно-сосудистых заболеваний на сегодняшний день определяет актуальность изучения репаративной регенерации миокарда и методов, направленных на ее стимуляцию. Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) занимает лидирующую позицию в структуре причин смертности населения в развитых странах мира и России [Агеев Ф.Е. и др., 2000, 2004]. Основными причинами развития ХСН являются ишемическая болезнь сердца (ИБС) и дилатационная кардиомиопатия (ДКМП), в последнем случае ХСН отличается быстропрогрессирующим течением и неблагоприятным прогнозом [Шумаков В.И. и др., 2004]. В связи с этим существует необходимость в разработке принципиально новых методов лечения ХСН. Поэтому исследования в этом направлении имеют высокую медицинскую и социальную значимость. Восстановительные процессы в миокарде обеспечиваются не только за счет образования рубца и гипертрофии сохранившихся кардиомиоцитов (КМЦ), но и участия резидентных и внесердечных прогениторных клеток [Bollini S. et al., 2001]. В репарации миокарда участвуют клетки крови, в том числе гемопоэтические и стромальные стволовые клетки, рециркулирующие из костного мозга [Dezawa M. et al., 2008]. По-прежнему остается неясным вопрос: обеспечивают ли эти клетки только реакцию стромы миокарда или все же они дифференцируются в КМЦ. Последнее предположение является основой концепции клеточной терапии миокарда, которая заключается в выделении и экспансии прогениторных клеток костного мозга и введении их в поврежденный миокард с целью замещения погибших КМЦ вновь образующимися [Dohmann H. et al., 2005, Behfar A. et al., 2010]. В работах многих авторов приводятся попытки доказать факт дифференцировки клеток костного мозга в КМЦ с помощью витального мечения и дифференцировочных маркеров [Perin E. et al., 2003, 2004, Ikegami Y. et al., 2010], но всегда остается открытым вопрос реутилизации метки и никогда нельзя исключить возможность слияния (fusion) клеток [Terada N. et al., 2002]. Поэтому сейчас самой распространенной, но убедительно не доказанной, является теория индукционной (паракринной) стимуляции регенерации при трансплантации прогениторных клеток костного мозга, которые, как известно, продуцируют большое количество цитокинов, факторов роста, дифференцировки, регулирующих репаративные процессы [Burchfield J.S. et al., 2008]. Недостаточно изученным является вопрос о влиянии экзогенных стволовых клеток на репарацию миокарда в отдаленные сроки после повреждения, в условиях постинфарктного кардиосклероза. Стоит ли нам ожидать кардиомиогенез после трансплантации клеток на данной стадии заболевания, когда микроокружение в области повреждения значительно отличается от такового в острый период и, вероятно, будет обусловливать иное поведение клеток. Остается открытым вопрос: какие клетки костного мозга вносят больший вклад в репарацию миокарда, какой фенотип прогениторных клеток костного мозга лучше использовать для стимуляции репарации. Несмотря на отсутствие четких представлений о механизмах репарации миокарда при трансплантации прогениторных клеток костного мозга, методы клеточной терапии миокарда активно изучаются в клинике и находятся на заключительных фазах клинических испытаний [Menasche P. et al., 2009]. Однако результаты, полученные в различных клинических исследованиях, неоднозначны и во многом противоречивы, и это обусловлено выбором неэффективных методов верификации результатов, неадекватных суррогатных точек для малых выборок и др. Все вышесказанное свидетельствует об актуальности дальнейших исследований о роли прогениторных клеток костного мозга в репарации миокарда, что необходимо для разработки эффективных методов стимуляции регенерации. ^ – изучить участие трансплантированных интракоронарно различных типов прогениторных клеток костного мозга в репаративной регенерации миокарда при хронической сердечной недостаточности в эксперименте и клиническом исследовании. Задачи:
^ В настоящем исследовании изучена роль различных типов прогениторных клеток костного мозга в репаративной регенерации сердца при постинфарктном кардиосклерозе. С помощью метода витального мечения трансплантированных клеток изучены направления миграции прогениторных клеток костного мозга. Показано, что даже после завершения воспалительных процессов в рубце сердца наблюдается хоминг клеток костного мозга. Количественно охарактеризовано распределение меченых клеток по органам при интракоронарной трансплантации клеток. Кроме сердца, клетки также активно заселяют селезенку, в печени и легких выявлены единичные меченые клетки. Изучены направления дифференцировки трансплантированных клеток костного мозга в условиях экспериментальной модели постинфарктного кардиосклероза. Впервые были получены данные, свидетельствующие о дифференцировке трансплантированных в миокард клеток в фибробласты и миофибробласты. Полученные данные не подтверждают возможность дифференцировки клеток костного мозга в кардиомиоциты, эндотелиальные и гладкомышечные клетки при постинфарктном кардиосклерозе. Трансплантация прогениторных клеток костного в отдаленные сроки после острого инфаркта миокарда, в условиях сформировавшегося кардиосклероза, обеспечивает стимуляцию фиброгенеза, но только в области рубца, и не приводит к экспансии фиброза в перифокальных зонах. Утолщение стенки левого желудочка в области рубца снижает напряжения на неповрежденные участки его стенки, что препятствует патологическому ремоделированию сердца. Проведена сравнительная оценка безопасности и эффективности применения аутогенных нефракционированных мононуклеарных клеток и ауто- и алло-генных мультипотентных стромальных клеток костного мозга для лечения экспериментальной хронической сердечной недостаточности. Трансплантация аутогенных мультипотентных стромальных клеток обеспечивает стимуляцию ангиогенеза и обратного ремоделирования левого желудочка. Аллогенные мультипотентные стромальные клетки значительно уступают аутогенным по своей терапевтической активности, стимулируют ангиогенез и гипертрофию миокарда, не оказывая влияния на ремоделирование левого желудочка. По сравнению с мультипотентными стромальными клетками трансплантация мононуклеарных клеток неэффективна в отношении обратного ремоделирования левого желудочка. Разработан протокол клинического исследования безопасности и эффективности аллогенной клеточной терапии больных хронической сердечной недостаточностью, обусловленной дилатационной кардиомиопатией, с тяжелым течением и неблагоприятным прогнозом. Предложенная тактика клеточной терапии оказалась безопасной в ближайший и отдаленный периоды наблюдения и приводит к снижению уровня мозгового натрий-уретического пептида и улучшению клинического состояния больных. ^ Проведенное доклиническое исследование послужило экспериментальным обоснованием применения клеток костного мозга для лечения хронической сердечной недостаточности в клинической практике. Клиническое исследование продемонстрировало безопасность и эффективность предложенного метода клеточной терапии хронической сердечной недостаточности. В результате чего, было получено разрешение Минздравсоцразвития России на применение предложенного способа для лечения хронической сердечной недостаточности при дилатационной кардиомиопатии (Метод стимуляции репарации миокарда при дилатационной кардиомиопатии, ФС№2010/354 от 21 сентября 2010 г.). Полученные научные данные о хоминге и направлениях дифференцировки клеток костного мозга при трансплантации в сердце при хронической сердечной недостаточности следует учитывать при разработке новых методов клеточной терапии. Полученные данные могут быть использованы в процессе преподавания в вузах медицинского и биологического профиля по специальностям гистология, эмбриология, анатомия и патологическая анатомия. Оригинальный способ интракоронарной трансвентрикулярной трансплантации клеток может быть использован в научно-исследовательских разработках. ^
^ Результаты проведенного исследования используются при чтении лекций и проведении практических занятий на Кафедре гистологии и эмбриологии лечебного факультета ГБОУ ВПО Российского национального исследовательского медицинского университета им. И.Н. Пирогова и Кафедре анатомии и гистологии животных ГБОУ ВПО Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина. ^ Автор планировал и непосредственно участвовал в проведении всех этапов экспериментального исследования, самостоятельно проводил сбор, обработку и анализ полученных данных, самостоятельно сформулировал основные положения диссертации. В клиническом исследовании автор принимал участие в разработке протокола клинического испытания, сборе и анализе данных, полученных при обследовании больных. ^ Результаты исследований и основные положения работы доложены и обсуждены на II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (г. Москва, 2005), конференции «Реабилитационные технологии XXI века» (г. Саратов, 2006), Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (г. Москва, 2006), «Третьем Российском съезде интервенционных кардиоангиологов» (г. Москва, 2008), «Европейском конгрессе по стволовым клеткам» (г. Эдинбург, Великобритания, 2009), Всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (г. Москва, 2009), «Всемирном конгрессе по стволовым клеткам» (г. Сан-Франциско, США, 2010), на 5-ом конгрессе по регенеративной медицине (г. Лейпциг, Германия, 2011), на межлабораторной конференции НИИМЧ РАМН (ноябрь, 2011), Публикации Основные положения диссертации отражены в 22 публикациях, из них – 10 статей в журналах, рекомендуемых ВАК РФ, 3 патента РФ. ^ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, главы собственных исследований и их обсуждения, состоящей из 9 подразделов, заключения, выводов и списка литературы. Объем диссертации составляет 265 страниц машинописного текста и включает 43 таблицы и 6 рисунков. Список литературы включает 348 источника, из которых 25 отечественных и 323 зарубежных. ^ Работа состоит из экспериментального и клинического исследований. Экспериментальное исследование Исследование выполнено в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977г. На проведение эксперимента получено разрешение биоэтической комиссии НИИ морфологии человека РАМН (протокол № 4 от 12.03.2008). Всего в исследовании использовано 146 самцов крыс аутбредного стока Спрейг-Доули массой тела 180–200 г, полученных из питомника Филиал ИБХ РАН (г. Пущино). Всем животным проводили эксфузию костного мозга из бедренных и большеберцовых костей обеих задних конечностей. У всех животных воспроизводили ОИМ с 20-минутной реперфузией. Через 30 суток после моделирования ОИМ всем животным интракоронарным трансвентрикулярным способом вводили трансплантат (Табл. 1): Через 1, 14, 30 и 60 суток после введения клеток оценивали безопасность и эффективность трансплантации с помощью функциональных и морфологических методов исследования. ^ Эксфузию костного мозга выполняли под наркозом (кетамин + ксилазин, внутримышечно, в дозе 90-120 мг/кг + 10 мг/кг) путем пунктирования губчатого вещества бедренной и большеберцовой костей через полость коленного сустава. Таблица 1. Группы исследования
^ Полученную костномозговую взвесь наслаивали на 3 мл раствора фиколла-урографина (плотность 1,077 г/мл) в стерильных 15 мл центрифужных пробирках. Пробирки центрифугировали при 1300 об/мин, 20 мин, 4 ºС. С помощью пипетки отбирали слой супернатанта непосредственно над слоем фиколла (интерфазное кольцо), в котором содержались мононуклеарные клетки и переносили в другую центрифужную пробирку со средой DMEM и снова центрифугировали 10 мин при 1100 об/мин и удаляли супернатант. ^ Культура МСК была выделена и охарактеризована согласно стандартным протоколам Лаборатории стволовых клеток ЗАО «Реметэкс» [Ржанинова А.А. и др., 2003]. При экспансии МСК проводили не более четырех пассажей при низкой посевной плотности. Полученные клетки замораживали в криозащитном растворе, содержащем 10 % высокоочищенный диметилсульфоксид и 90 % аутологичной сыворотки. Криопробирки помещали в программный замораживатель, где они подвергались охлаждению до - 80оС со скоростью 1 о/мин. После этого криопробирки помещали в емкость для хранения (сосуд Дьюара) и хранили в жидкой фазе азота до использования. ^ Полученные МНК или МСК ресуспендировали в 1 мл физиологического раствора. На основании подсчета в камере Горяева полученное количество клеток разводили до концентрации 5 млн. кл./мл физиологического раствора. Жизнеспособность клеток определяли при окраске трипановым синим. В качестве трансплантата в контрольной группе использовали 1 мл физиологического раствора, жизнеспособность клеток в трансплантате составляла не менее 80%. ^ Полученные МНК ресуспендировали в 5 мл 4% раствора формалина на фосфатном буфере (pH=7,4) и инкубировали 30 мин при 4С, после чего клетки отмывали от формалина многократным центрифугированием. ^ Части животных вводили клетки, как живые, так и девитализированные, которые предварительно метили красной флуоресцентной мембранной меткой PKH26 (Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit, Sigma), согласно протоколу производителя. ^ Для моделирования постинфарктного кардиосклероза и хронической ХСН у крыс за 30 суток до трансплантации клеток воспроизводили трансмуральный инфаркт миокарда передней стенки и верхушки левого желудочка (ЛЖ) сердца по Селье [Selye H, 1960] с реперфузией. Животное наркотизировали смесью кетамин/ксилазин, внутримышечно в дозе 90-120 мг/кг + 10 мг/кг. Для обеспечения искусственной вентиляции легких проводили трахеальную интубацию и подсоединяли аппарат искусственной вентиляции легких (UGO BASILE, Rodent Ventilator). Доступ к сердцу осуществляли по стандартной методике и накладывали лигатуру на левую коронарную артерию на 3 мм ниже ушка левого предсердия. При остром инфаркте на ЭКГ наблюдалось куполообразное поднятие сегмента ST, уменьшение зубца R или его замена комплексом QS. Также явным признаком развития окклюзии являлся цианоз передней стенки ЛЖ. После проведения 20 минутной окклюзии послойно ушивали операционную рану. ^ Клеточный трансплантат в опытных группах или физиологический раствор в контрольной вводили однократно через 30 суток после ОИМ в полость ЛЖ через катетер, введенный через наружную сонную артерию катетер, при кратковременном пережатии аорты ниже ее устья и места отхождения правой и левой коронарных артерий. Это обеспечивало во время сердечного выброса попадание трансплантата в коронарные кровеносные сосуды, а не в системный кровоток. Трансплантат вводили в полость ЛЖ в объеме 0,2 мл, после восстановления нормального давления в левом желудочке процедуру повторяли для введения всего объема трансплантата (1 мл, 5 млн. кл./мл). ^ Толерантность животных к физическим нагрузкам была изучена в тесте плавания перед трансплантацией и перед выведением животных из эксперимента. ЭКГ регистрировали с помощью системы мониторирования “HemoDynamics” v.1.1. (ИБК РАН, Россия) при наложении электродов на правую переднюю лапу, грудь и правую заднюю лапу. С помощью программы “AnalyzeHemoDynamics” v.1.1. (ИБК РАН, Россия) рассчитывали параметры сигнала ЭКГ. Артериальное давление и давление в левом желудочке сердца определяли с помощью электроманометрических датчиков DTXTM Plus TNF-R, Becton Dickinson и системы мониторирования “HemoDynamics” v.1.1. (ИБК РАН, Россия). С помощью программы анализа сигналов давления “AnalyzeHemoDynamics” v.1.1. (ИБК РАН, Россия) были рассчитаны среднее артериальное давление, максимальное левожелудочковое давление и индексы контрактильности. Морфологическое исследование Выведение животных из эксперимента проводили в СО2-камере. При вскрытии исследовали полости тела и внутренних органов. Фиксировали органы, указанные в Табл. 2. Таблица 2. Органы, исследованные различными морфологическими методами
Селезенку, печень и легкие животных контрольной и опытных групп проводили стандартным способом: заливали в парафин и делали срезы толщиной 5-7 мкм на 3 разных уровнях, выбранных случайным образом. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Сердца животных заливали в парафин и делали серийные поперечные срезы толщиной 5-7 мкм на 10 уровнях на протяжении от верхушки сердца до предсердий. Препараты окрашивали пикросириусом красным для характеристики рубца и по Маллори для подсчета кровеносных сосудов. При морфометрическом исследовании серийных поперечных срезов сердец проводили измерения и рассчитывали следующие показатели [ Zhan-Qiang Shao, 2006]:
Из органов животных, которым вводили меченные PKH26 клетки, после криофиксации делали криосрезы и проводили анализ миграции клеток в органах с помощью флуоресцентного микроскопа Axioplan 2 (Carl Zeiss), подсчитывая количество меченых клеток в 50 полях зрения в каждой группе. ^ Для иммуногистохимического исследования использовали моноклональные антитела (Abcam) к CD68 (мембранный маркер макрофагов), Ki67 (ядерный маркер пролиферации), Fapα (мембранный маркер реактивных фибробластов), ASMA (α-гладкомышечный актин). В исследовании использовали как крио-, так и парафиновые срезы. Инкубацию с первичными антителами в разведении, рекомендуемом производителем, проводили в течение 24 часов при 4 °C. В качестве системы визуализации использовали биотин-стрептавидин-пероксидазный комплекс (инкубация в течение 20 мин.), ядра докрашивали гематоксилином Караччи. |
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям