Регуляция дифференцировки клеток трансгенными нейротрофическими факторами 03. 00. 25 Гистология, цитология, клеточная биология
|
|
Скачать 0.62 Mb.
|
|
На правах рукописи ПАВЛОВА ГАЛИНА ВАЛЕРИЕВНА Регуляция дифференцировки клеток трансгенными нейротрофическими факторами 03.00.25 – Гистология, цитология, клеточная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Новосибирск2009 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН, в лаборатории нейрогенетики и генетики развития Научные консультанты: член- корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор
академик РАН, доктор биологических наук, профессор Георгиев Георгий Павлович Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Викторов Илья Викторович доктор медицинских наук, профессор Попова Нина Константиновна доктор биологических наук, профессор Гуляева Людмила Федоровна Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН Защита диссертации состоится «___»_________2009 года на утреннем заседании Диссертационного совета Д-003.011.01 при Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, Новосибирск, Россия, пр.ак.Лаврентьева,10, тел/факс: (383) 333-12-78, e-mail: [email protected] С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН. Автореферат разослан « » ____ 2009 года Ученый секретарь Диссертационного совета, Доктор биологических наук Груздев А.Д. ^ Известно, что нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Паркинсона или болезнь Альцгеймера и др., а также ишемический инсульт и ему подобные травматические нарушения мозговых тканей - важнейшие социальные заболевания, одни из существенных причин инвалидности и смертности людей в трудоспособном и пожилом возрасте. Широкое распространение при лечении этих заболеваний приобретают методы клеточной и генной терапии с использованием клеток, с модифицированными генами, обеспечивающими терапевтический эффект. Особенно перспективна возможность использования региональных стволовых клеток самого пациента, индуцированных к развитию в нужном направлении. Однако, так как у интактных региональных стволовых клеток существуют ограничения потенциала дифференцировок, существенное значение имеет разработка способов управления специализацией трансплантируемых клеток и повышения их жизнеспособности, а также способов предотвращения образования рубцовой ткани в местах трансплантации. Главными факторами, определяющими природу и рост афферентных и эфферентных волокон трансплантатов, являются среда, в которой находятся трансплантаты мозга, ростовые способности трансплантата, наличие или отсутствие рубца на границе между трансплантатом и мозгом хозяина. В глиальных септах и в участках глиального рубца густота врастающих в имплантат капилляров существенно ниже таковой в окружающей ткани мозга. Это может привести к его полному отмиранию уже в течение нескольких месяцев после операции, что, в конечном итоге, сводит эффект к нулю. Для достижения лучшей эффективности нейротрансплантации необходима максимальная интеграция трансплантата с мозгом реципиента, что возможно только при отсутствии глио-мезодермальной капсулы (Корочкин, 2000). Для достижения максимального клеточно- и генно-терапевтического эффекта и обеспечения безопасности для пациента необходим поиск генетических регуляторных элементов, способных трансформировать стволовые клетки в нужном для лечения направлении. В случае удачного подбора таких элементов появляется возможность повышения эффективности генной и клеточной терапии. В разрабатываемых конструкциях следует предусмотреть возможность управления экспрессией трансгенов. В состав этих конструкций не должны входить вирусные элементы. Разработка генных конструкций, сдвигающих дифференцировку стволовых и прогениторных клеток в нейральном направлении, и благоприятно влияющих на приживляемость трансплантата, а также исследование функционирования полученных конструкций в трансфицированных клетках в культуре и после трансплантации имеют решающее значение для развития клеточной и генной терапии. Этому и посвящена настоящая работа. ^ Целью настоящей работы является: поиск путей управления дифференцировкой стволовых клеток, использование трансгенных клеток для трансплантаций в мозг млекопитающих, а также улучшения приживляемости трансплантата. Центральным был вопрос исследования с помощью методов молекулярной генетики и клеточной биологии, возможных способов предотвращения формирования рубцовой ткани при нейрохирургических операциях. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1. Получить трансгенные линии дрозофилы, экспрессирующие нейротрофические факторы человека и мыши NGF, BDNF и GDNF и провести молекулярно-генетический анализ полученных линий. 2. Изучить влияние экспрессии чужеродного нейрального гена на трансгенные клетки дрозофилы. 3. Исследовать воздействие полученных трансгенных клеток на клетки или ткани млекопитающих при кокультивации. 4. Провести ксенотрансплантацию и проанализировать влияние трансгенных клеток, экспрессирующих нейротрофические факторы, на приживляемость трансплантата и на образование глиального рубца. 5. Изучить возможность использования промотора гена белка теплового шока дрозофилы hsp70 в клетках млекопитающих в качестве управляющего элемента трансгенов. 6. Получить трансгенные линии НЕК293, экспрессирующие нейротрофические факторы человека и мыши NGF, BDNF и GDNF и провести молекулярно-генетический анализ полученных линий. 7. Провести трансплантацию клеток трансгенной линии НЕК293 в мозг крысы. Проанализировать влияние нейротрофического фактора на образование глиального рубца. ^ 1. Нейроэктодерма трансгенных эмбрионов дрозофилы, продуцирующая нейротрофические факторы, способна стимулировать дифференцировку клеток млекопитающих нейрального происхождения при их совместном культивировании. 2. Смешанная ксенотрансплантация эмбриональных клеток крысы и нервных тканей трансгенных линий дрозофилы с геном gdnf под контролем промотора гена hsp70 дрозофилы стимулирует дифференцировку клеток крысы в нейральном направлении трансплантируемых клеток на границе трансплантат – мозг реципиента. 3. Ксенотрансплантанты с трансгенными, эмбриональными, нервными тканями дрозофилы, экспрессирующими нейротрофические факторы человека, блокируют образование глиального рубца на границе трансплантат – ткани мозга реципиента. 4. Обнаружена позитивная роль белков теплового шока HSP70 в снижении образования глиального рубца при трансплантациях. 5. Обнаружено, что трансдуцированный промотор гена белка теплового шока дрозофилы hsp70 активизируется в клетках млекопитающих при температуре 39оС, при этом появление продукта наблюдается лишь через сутки. 6. Обнаружено, что трансгенные по gdnf клетки человека линии НЕК293, существенно снижают образование рубцовой ткани при их трансплантации в мозг крыс. 7. Обнаружена возможность стимулировать рост отростков у эмбриональных спинальных ганглиев и у поврежденной нервной ткани (фрагмент зачатка спинного мозга эмбриона человека) млекопитающих посредством совместного культивирования его с трансгенным клетками, экспрессирующими gdnf . ^ Несмотря на обилие в мировой литературе экспериментальных данных, показывающих перспективность применения аутологичных стволовых клеток для лечения нейродегенеративных заболеваний мозга, публикации, посвященные практическим вопросам подготовки и клинического применения этих клеток немногочисленны. Данная работа поможет перевести клиническое применение новых клеточных технологий при лечении нейродегенеративных заболеваний на систематическую научную основу. В данной работе предлагается новый подход к лечению нейродегенеративных заболеваний посредством трансплантации клеток носителей нейротрофических факторов. Были разработаны различные способы генноинженерных манипуляций с клетками и трансплантаций полученного материала в мозг. 1. Создана оригинальная модель доставки нейротрофического фактора в поврежденный участок мозга млекопитающих с помощью клеток трансгенных линий дрозофилы. Экспрессия чужеродного гена, проходит лишь в промежутке времени, определенном укороченным жизненным ресурсом клеток дрозофилы в чужеродной ткани млекопитающих. При этом данные клетки –носители не склонны к делению. В результате был разработан метод трансплантации смеси стволовых клеток человека и дифференцированных нервных клеток трансгенных линий дрозофилы, несущих ген фактора роста под контролем промотора гена теплового шока. 2. Обнаружено, что присутствие в ко-трансплантанте нейральных эмбриональных клеток дрозофилы, продуцирующих нейротрофический фактор, противодействует образованию глиального рубца. Данный результат имеет значение для разработки терапевтических методов борьбы с глиозом 3. Предложен новый невирусный промотор для регуляции экспрессии гена введенного в клетки реципиента. Возможность использования невирусных регулируемых структур позволяет включать активность чужеродных генов лишь в определенные необходимые промежутки времени, что важно для безопасности их клинического применения. 4. Для ряда заболеваний необходима постоянная экспрессия определенного гена. Для таких случаев была создана модель на основе родственных человеку трансгенных клеток, способных экспрессировать чужеродный ген постоянно. Использование человеческих клеток обеспечивает длительное их переживание и постоянное продуцирование терапевтического белка. Полученные результаты имеют практическое и теоретическое значение. Появляется возможность повышения эффективности генной и клеточной терапии при лечении многих заболеваний, а также открывается возможность выработки ряда практических рекомендаций по применению стволовых и прогениторных клеток в хирургии и трансплантологии. Предлагаемые подходы к фундаментальным исследованиям стволовых клеток являются оригинальными и основываются на предложении новой техники анализа и управления поведением стволовых клеток. ^ Основные результаты докладывались на различных отечественных и международных конференциях, рабочих совещаниях, семинарах, в том числе на 16th European Drosophila Research Conference. Zurich, 1999, 41th Annual Drosophila Research Conference. Pittsburgh, 2000, 6thEast European Conference of the International Society of Invertebrate Neurobiology, Moscow-Puschino, 2000, Conference on bioinformatics of genome regulation and structure, BGRS, Novosibirsk, 2000, Progress in biotechnology and neurobiology – Integrative medicine, Egypt, Hurtada, 2004г, . ELSO, Nice, 2004, Научные Труды 1-го съезда физиологов СНГ, Сочи-Дагомыс, 2005. Публикации По теме диссертации опубликовано 56 печатных работ. ^ Диссертация изложена на 275 страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалов и методов, результатов и обсуждений, выводов и списка литературы. Библиография включает в себя 284 источника. Работа иллюстрирована 102 рисунками и 6 таблицами. ^ 1. Создание трансгенных линий Drosophila melanogaster гомозиготных по нейральному гену человека. Ранее было показано, что эмбриональные, нервные клетки дрозофилы переживают и дифференцируются после трансплантации в мозг развивающихся амфибий (Корочкин,1991). В связи с этим возникла идея использования ксенотрансплантатов для продукции нейротрофических факторов, способствующих переживанию и развитию трансплантированной нервной ткани. Для исследования были использованы три нейротрофических гена gdnf, bdnf и ngf , физиологическое действие которых на нервную ткань основательно исследовано. Поскольку длительное инъецирование фактора в область повреждения чрезвычайно травматично для ткани мозга, работа была направлена на создание генно-инженерными методами клеток, способных экспрессировать нейротрофический фактор. Трансплантаты, содержащие такие клетки, пригодны для длительного экзогенного выделения фактора в области повреждения мозга. Предложенная нами модель выгодно отличается тем, что промотор гена белка теплового шока дрозофилы hsp70 может автоматически активироваться в условиях температуры тела млекопитающих, обеспечивая тем самым постоянно высокий уровень синтеза продукта, кодируемого геном, «поставленным» в генно-инженерной конструкции под этим промотором. Надлежало выяснить, будут ли активироваться и функционировать нейротрофические гены млекопитающих в клетках и тканях дрозофилы. Для этого были получены три генно-инженерные конструкции на основе вектора CaSper (рис.1,2,3), содержащие соответственно один из исследуемых нейротрофических генов млекопитающих (gdnf, bdnf, ngf). В каждой конструкции нейротрофические гены были поставлены под промотор гена белка теплового шока дрозофилы, благодаря которому активируется транскрипция этих генов при температуре 370С (температура теплового шока насекомых). Данные конструкции были инъецированы в эмбрионы дрозофилы линии Df(1)w67c23(2), которая содержала ген white, обуславливающий фенотип «белые глаза» у взрослых мух. Конструкции же содержали ген mini-white, который позволяет идентифицировать трансформантов в поколении F1.
Рис 1 . А -Схема полученной конструкции на базе вектора pCaSper, содержащей ген gdnf человека под промотором гена белка теплового шока Hsp70. GDNF - ген фактора роста нервов; hsp70 prom. - промотор гена белка теплового шока Hsp70;. mini white - ген, ответственный за красную окраску глаз трансгенных мух. ^ - ген фактора роста нервов. В - Схема полученной конструкции на базе вектора pCaSper, содержащей ген bdnf человека под промотором гена белка теплового шока Hsp70. BDNF - ген фактора роста нервов. Из трансформантов поколения F1 были выведены гомозиготные линии. В результате мы получили три линии: C3- содержащая в гомозиготе ген человека gdnf, G8- содержащая ген ngf мыши и G7- содержащая ген bdnf человека. Каждая из этих линий была скрещена с ранее полученной линией, несущей ген бактериальной галактозидазы lacZ и мутацию Delta, которая вызывает трансформацию вентральной нейроэктодермы в нейральном направлении. Полученные линии C3-1M, G8-1M и G7-1M содержали lacZ и Delta, а также гены млекопитающих gdnf, ngf, bdnf соответственно. Полученные линии были проанализированы молекулярными методами. Методом блот-гибридизации по Саузерну были подтверждены вставки в геном дрозофилы. Контроль экспессии встроенных генов был осуществлен методом блот-гибридизации по Нозерну. В опыте была выявлена индуцированная экспрессия мРНК. Мы не наблюдали экспрессии мРНК нейротрофических факторов млекопитающих без воздействия стрессовой температуры (370 С). Известно, однако, что промотор гена белка теплового шока дрозофилы hsp70 “подтекает” и при более низких температурах и в ряде гибридизаций мы иногда наблюдали слабый сигнал. Аналогичный анализ на экспрессию мРНК был проделан и для конечных линий G7-1M,G8-1M и C3-1M. Перечисленные выше линии были исследованы на предмет активации гена при воздействии хит-шоковой температуры и без данного воздействия. Результаты блот-гибридизации по Нозерну для линий G7-1M,G8-1M и C3-1M показаны на рисунках 4, 5 и 6.
В данном эксперименте не было обнаружено гибридизации с РНК клеток контрольной линии (контролем служила исходная линия, а также трансгенная линия без тепловой обработки). В опыте мы наблюдали индуцированную эскпрессию мРНК при воздействии на эмбрионы шоковой температурой (370С). Для эмбрионов линии G8-1M, содержащей ген ngf, был проведен анализ синтез белка с помощью иммуноблотинга. На эмбрионы воздействовали температурой теплового шока. В результате иммуноблотинга был обнаружен соответствующий белковый продукт (рис. 7).
^ Определение локализации экспрессии мРНК трансфицированных генов gdnf, bdnf и ngf в тканях объекта и ее активности под данным промотором было проведено методом гибридизации in situ на целых эмбрионах. После воздействия теплового шока на эмбрионы трансгенной линии С3-1М была обнаружена транскрипция человеческого gdnf на всех стадиях эмбрионального развития данной линии, как у гетерозигот Dl/+, так и у гомозиготных Dl/Dl особей. На стадии синцитиальной и клеточной бластодермы реакция была умеренно положительной, равномерно распределенной по поверхности эмбриона. По ходу сегментации повышенная экспрессия гена gdnf была отмечена по парасегментам, в результате чего формировался характерный тигровый рисунок окраски. С развитием нейральных элементов областью преимущественной локализации мРНК гена gdnf явилась центральная нервная система эмбрионов. Соответствующие транскрипты были выявлены как в головном, так и в торакальных ганглиях (рис. 8). У исходной линии реакции гибридизации in situ обнаружено не было. а   б  Рис 8. Экспрессия гена gdnf в эмбрионах трансгенных мух D.melanogaster. Whole-mount – гибридизация с использованием в качестве зонда ДНК гена gdnf человека. а,б, Эмбрион линии трансгенных мух в разных положениях. Масштаб 0,1 мм После воздействия теплового шока на эмбрионы линии G8-1M была обнаружена мРНК введенного гена ngf на всех стадиях эмбрионального развития, а также у личинок. Как и в случае с геном gdnf, на стадии синцитиальной и клеточной бластодермы наблюдали умеренную реакцию, равномерно распределенную по всей поверхности эмбриона. По мере сегментации повышенная экспрессия генов наблюдалась в парасегментах, что давало характерный тигровый рисунок. С развитием нейральных элементов у эмбрионов линии G8-1M (ngf) была обнаружена интенсивная окраска в области головного ганглия. При анализе экспрессии bdnf в линии G7-1M (метод гибридизации in situ на целых эмбрионах) окраска наблюдалась практически во всех областях эмбриона (рисунок не представлен). У исходной линии реакции гибридизации in situ с ДНК ngf и bdnf не наблюдалась. ^ Создание линий-носителей нейротрофических факторов для ксенотрансплантации в мозг млекопитающих и кокультивации с эмбриональными клетками поставило следующие вопросы: 1. каким образом будет влиять нейротрофический фактор на сами трансгенные клетки, 2. будут ли клетки выживать в условиях пригодных для клеток млекопитающих при температуре теплового шока и продуцировать трансгенный белок. Для изучения влияния гена ngf человека на фенотип трансгенных клеток была получена культура клеток эмбриона линии G8-1M. В культуре клеток дрозофилы, трансфицированной геном ngf была обнаружена атипичность. Было замечено большое количество игловидных клеток, не встречавшихся в контрольных культурах не содержащих трансген. Наблюдались также сильно распластанные клетки, по форме напоминающие листок полиэтилена, прилипший к поверхности культуральной чашки. В трансгенной культуре не обнаружены наблюдаемые в контрольной культуре сетеподобные образования, которые, по всей видимости, имеют отношение к выработке хитина. Данное отличие говорит о том, в культуре, экспрессирующей нейротрофический фактор млекопитающих, подавляется дифференцировка клеток в иных направлениях, кроме нейрального. Особенности данной культуры, по-видимому, объясняются тем, что даже без теплового воздействия на клетки наблюдается подтекание промотора гена белка теплового шока дрозофилы, вследствие чего наблюдается слабое воздействие нейротрофического фактора на трансгенные клетки. З  начительно более ощутимое воздействие нейротрофического фактора на трансгенные культуральные клетки наблюдали после повышения температуры до уровня теплового шока 370С. Наблюдалось большое количество клеток с длинными отростками (более 50%), похожими на отростки нервных клеток насекомых (рис.9). 
Клетки в модифицированной культуре теряли способность делиться. После обработки температурой теплового шока контрольной культуры клеток дрозофилы появление такого типа клеток не наблюдалось (или около 5%). Также в исследуемой культуре трансгенных клеток были обнаружены характерные округлые клеточные скопления. Тела клеток располагались по краям, в то время как отростки занимали внутреннюю часть скопления. Такая структура напоминает строение нервного ганглия беспозвоночных, Таким образом, температурное воздействие, активирующее ген ngf, не только стимулирует дифференцировку клеток дрозофилы в нейральном направлении, но и провоцирует образование органотипических структур, сходных с эмбриональным головным мозгом дрозофилы (рис 10). При длительном (6 дней) культивировании клеток трансгенной линии дрозофилы при температуре 37оС были обнаружены нервные клетки аномальной величины (5%), в контроле такого размера нервные клетки не наблюдались. ^ ^ Фактор роста нервов является фактором, выделяемым из клеток в межклеточную среду, поэтому клетки, экспрессирующие этот фактор могут оказывать нейротрофное воздействие на окружающие клетки в культуре и, после трансплантации, на клетки тканей реципиента. В экспериментах, проведенных совместно с Кафедрой отоларингологии Каролинского госпиталя (Стокгольм, Швеция) была исследована способность клеток дрозофилы, содержащих трансгены нейротрофических факторов, влиять клетки органотипической культуры нервной ткани млекопитающих in vitro. С этой целью фрагменты нейроэктодермы эмбрионов селектированных нами линий дрозофил, содержащих трансгены нейротрофических факторов, ко-культивировали с эмбриональными спинальными ганглиями крыс (11-й день эмбриогенеза), которые были помечены зеленым белком. В контрольных культурах отростки нервных клеток, выходящие из спинального ганглия, появляются на 3-й день и позднее. При добавлении в культуру нейроэктодермы эмбриона трансгенной линии дрозофилы, содержащей ген человека, наблюдается бурный рост отростков нервных клеток спинального ганглия по направлению к ко-культивируемой ткани дрозофилы (рис.11). Этот процесс начинается уже спустя час после начала ко-культивирования.    Рис.11 Врастание отростков дифференцирующихся нервных клеток эмбриональных спинальных ганглиев крысы в эмбриональную нейроэктодерму линии дрозофил, в геном которой был введен ген gdnf человека. Флюоресцентная микроскопия. Масштаб 0,05 мм Еще более четкая картина была получена при ко-культивировании клеток эмбриональных спинальных ганглиев крысы с клетками линии дрозофилы, содержащей трансген, кодирующий белок BDNF человека. Эффект сказывался так же быстро, как и в предыдущем случае, но можно было отчетливее проследить путь нервных волокон от клеток эмбриональных спинальных ганглиев к нейроэктодерме или к фрагменту трансгенного эмбриона дрозофилы. Несколько менее отчетлив эффект клеток дрозофилы линии, несущей ген, кодирующий фактор роста нервов (NGF). В этом случае дифференцировка эмбриональных нейральных элементов спинального ганглия крысы начинается под влиянием нейроэктодермы дрозофилы так же рано, однако рост отростков нервных клеток не столь интенсивен, как в случае BDNF Поскольку положительный эффект наблюдался во всех случаях, можно было предположить, что он обусловлен неспецифическим эффектом ткани дрозофилы и не связан с явлением трансгеноза. Однако в контрольных экспериментах, когда ткань эмбриональных спинальных ганглиев (меченных красным белком) крысы ко-культивировали с нейроэктодермой «нативных» линий дрозофилы без трансгена, эффекта не наблюдалось. Различия в эффекте клеток, несущих BDNF и NGF, возможно, связаны с тем, что первый стимулирует дифференцировку в первую очередь проприоцептивных нейронов, а второй - ноцицептивных. Нельзя не отметить и то обстоятельство, что опыты по ко-культивированию продемонстрировали выраженное родство нервных тканей даже у столь отдаленных таксонов как насекомые и млекопитающие. Нейробласты дрозофилы мигрировали в эмбриональный спинальный ганглий крысы. На основании изложенных результатов можно сделать вывод, что экспрессия нейротрофического фактора млекопитающих не только влияет на дифференцировку трансгенных клеток дрозофилы, но и меняет свойства других клеток, находящихся в непосредственной близости от них. Известно, что при культивации эмбрионального спинального ганглия крысы, отростки появляются на третьи сутки и имеют звездчатую структуру. При добавлении в среду нейротрофических факторов, отростки образуются значительно быстрее, но также не имеют направленности. В данной работе была опробована новая модель стимуляции образования отростков эмбрионального спинального ганглия в определенном направлении по градиенту концентрации. Данная модель может быть использована для разработки терапевтических методов, стимулирующих направленный рост нервных волокон. В нашей лаборатории был проведен эксперимент, с целью изучить изменение в стимуляции при увеличении расстояния между спинальным ганглием и тканью дрозофилы, экспрессирующей нейротрофический фактор. Было обнаружено, что при увеличении расстояния между исследуемыми объектами уменьшается количество образующихся отростков, однако, стимуляция происходит даже на значительном расстоянии, что видно на рисунке 12.    |
||||||||||||||||||||
1 2 3 4
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям