Молекулярные механизмы апоптоза при окислительном стрессе 14. 00. 16 патологическая физиология 03. 00. 25 гистология, цитология, клеточная биология
|
|
Скачать 0.59 Mb.
|
1 2
На правах рукописиЧасовских Наталия Юрьевна МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АПОПТОЗА ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ 14.00.16 – патологическая физиология 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степенидоктора медицинских наукТомск – 2009 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Ведущая организация: ГУ НИИ физиологии СО РАМН Защита состоится «_____» _________ 2009 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, Томск, пр. Ленина, 3) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН Автореферат разослан «_____» ___________ 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Амосова Е.Н.  ^ Актуальность исследования. На современном этапе развития зарубежной и отечественной медико-биологической науки накоплен большой объем знаний о механизмах повреждения и адаптации клеточных систем при патологических процессах разного генеза. В центре внимания исследователей находятся ключевые механизмы регуляции апоптоза, который представляет собой активную форму клеточной гибели и является физиологическим механизмом устранения избыточных и/или функционально аномальных клеток. Известно, что развитие различных болезней (злокачественные новообразования, сердечно-сосудистые, нейродегенеративные, острые и хронические воспалительные процессы, сахарный диабет и др.) связано с нарушениями механизмов реализации апоптоза, приводящими к его излишнему активированию или ингибированию [Bredesen D.E., 2000; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006]. Наряду с этим важным звеном патогенеза данных заболеваний является дисбаланс окислительного метаболизма [Зенков Н.К. и соавт., 2001]. Развитие окислительного стресса при ряде патологий обусловлено резкой интенсификацией процессов свободно-радикального окисления и/или снижением резерва антиоксидантной защиты, что приводит к значительному накоплению активных форм кислорода (АФК) [Скулачев В.П., 1996]. Последние вызывают окислительную модификацию белковых и липидных молекул, повреждение ДНК, нарушение структуры мембран и др. [Дубинина Е.Е., 2001; Zhu H. et al., 2001; Mathers J. et al., 2004]. Вместе с тем известно, что АФК являются внутриклеточными мессенджерами, участвующими в регуляции различных клеточных процессов, в частности - апоптоза [Safa O., 2001; Sorescu D., 2001; Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007]. Влияние АФК на про- и антиапоптотические мишени и механизмы осуществляется непосредственно или через внутриклеточные редокс-зависимые сигнал-передающие системы [Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006]. При этом в клетке может происходить одновременная активация нескольких молекулярных путей, взаимодействующих между собой [Wajant H., 2002; Schultz D.R., Harrington W.G., 2003]. Индуцирующие апоптоз сигналы стимулируют множество киназ, включая митоген-активируемые протеинкиназы JNK и р38. Последние воздействуют на белки-мишени, связанные с функционированием факторов транскрипции и регуляцией программированной клеточной гибели: р53, NF-κB, АР-1 и др. [Gallo K.A., Johnson G.L., 2002; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006]. Под контролем редокс-чувствительных транскрипционных факторов находится синтез белков семейства Bcl-2, являющихся ключевыми регуляторами апоптоза. В частности, р53 активирует экспрессию Bid, PUMA и Noxa [Oda E. et al., 2001; Sax J.K. et al., 2002], NF-κB управляет генами, кодирующими белки Bcl-XL, IAP, A1, отвечающие за угнетение процесса апоптоза [Kucharczak J. et al., 2003]. Вместе с тем ряд исследований свидетельствуют о проявлениях редокс-чувствительными элементами сигнальной трансдукции как про-, так и антиапоптотической активности [Perkins N.D., 2004; Harada C., Nakamura K., 2006], зависящей от особенностей индуцирующих сигналов, комбинации возможных путей их передачи и типа клеток. Данное обстоятельство затрудняет возможность идентификации механизмов развития заболеваний, сопровождающихся развитием окислительного стресса и сопряженных с дизрегуляцией летальной программы клеток. Необходимость разработки и внедрения селективных технологий управления апоптозом ставит перед фундаментальной наукой задачу идентификации редокс-чувствительных молекулярных мишеней и обосновывает целесообразность проведения комплексного исследования фундаментальных механизмов нарушения программированной гибели клеток в условиях окислительного стресса. ^ установить редокс-чувствительные молекулярные механизмы апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови в условиях окислительного стресса. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:
^ Впервые с помощью современных молекулярно-биологических методов проведено исследование редокс-чувствительных молекулярных механизмов реализации программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении. Впервые при культивировании in vitro мононуклеарных лейкоцитов крови с 1 мМ Н2О2 показано, что нарастание продукции активных форм кислорода в клетках сопровождается увеличением содержания апоптотически измененных мононуклеарных лейкоцитов, опосредованным активацией митохондриального и повышенной готовностью клеток к TNFα-рецепторному пути инициации апоптоза. Установлено, что в условиях дисбаланса окислительного метаболизма усиливается фосфорилирование редокс-чувствительных JNK и p38 МАР-киназ, являющихся важным элементом системы сигнальной трансдукции апоптогенных сигналов. Впервые в эксперименте с использованием селективных ингибиторов МАР-киназ показано, что JNK влияет на продукцию IL-8, но не участвует (также как р38) в регуляции синтеза IL-10 в условиях дисбаланса окислительного метаболизма. Факторы транскрипции NF-κB и p53 через механизмы фосфорилирования МАР-киназами и/или непосредственного действия АФК влияют на экспрессию генов, кодирующих белки-регуляторы апоптоза (увеличение экспрессии проапоптотического протеина Вах и антиапоптотичекого Bcl-XL). Получены приоритетные данные об изменении содержания про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2 в мононуклеарных клетках крови при экспериментальном окислительном стрессе. Изменение соотношения ключевых белков-регуляторов апоптоза семейства Bcl-2 сопряжено с последовательной активацией редокс-чувствительных элементов сигнальной трансдукции (МАР-киназ и факторов транскрипции). Установлены однотипные молекулярные механизмы дизрегуляции программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови при экспериментальном окислительном стрессе, индуцированном 1 мМ перекисью водорода, и остром воспалительном процессе. Выявлено, что редокс-чувствительные элементы внутриклеточных сигналпередающих систем являются мишенями для терапевтической коррекции нарушений апоптотической программы клеток. ^ Результаты проведенного исследования расширяют существующие представления о фундаментальных механизмах дизрегуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов в условиях окислительного стресса. Установлена роль редокс-чувствительных МАР-киназ p38, JNK и факторов транскрипции р53, NF-kB в изменении баланса про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2. Полученные знания носят фундаментальный характер и могут служить основой для разработки молекулярной технологии воздействия на оксидант-опосредованную модуляцию активности ключевых регуляторов апоптоза. Идентифицированные в ходе исследования редокс-чувствительные молекулярные мишени могут быть использованы в разработке подходов селективного управления апоптозом клеток при патологических процессах, патогенез которых сопряжен с развитием окислительного стресса, а также с нарушением реализации летальной программы клеток. ^ 1. Усиление программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови в условиях окислительного стресса сопряжено с активацией митохондрий-опосредованного и повышенной готовностью клеток к TNFα-рецепторному пути инициации апоптоза. 2. В реализацию летальной программы мононуклеарных лейкоцитов при окислительном стрессе вовлечены редокс-чувствительные элементы внутриклеточной сигнальной трансдукции (МАР-киназы р38 и JNK, факторы транскрипции NF-kB и р53). 3. В изменении баланса ключевых белков-регуляторов апоптоза в мононуклеарных лейкоцитах при окислительном стрессе участвуют факторы транскрипции NF-kB и р53, контролирующие экспрессию соответствующих генов. 4. Дизрегуляция апоптоза представляет собой один из компонентов патогенетических изменений при воспалении, сопровождающемся дисбалансом окислительного метаболизма. ^ . Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на Российском медицинском форуме с международным участием «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006), 5-й научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2006), III Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2007), научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения» (Санкт-Петербург, 2007). Исследования поддержаны Советом по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ в рамках проекта «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы» (НШ-4153.2006.7), РФФИ - «Молекулярные механизмы управления программированной гибелью клеток с использованием регуляторных молекул» (№ 07-04-12150), «Разработка технологии селективного управления внутриклеточными редокс-зависимыми сигнальными системами» (№ 09-04-99026), а также выполнены в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы» (государственные контракты № 02.442.11.7276 от 20.02.2006, № 02.445.11.7419 от 09.06.2006), ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (государственные контракты № 02.512.12.0013 от 01.08.2008, № 02.512.11.2285 от 10.03.2009). Основные результаты диссертационного исследования включены в лекционный курс по патологической физиологии («Патофизиология клетки», «Типовые патологические процессы», «Роль апоптоза клетки в патологии») для студентов лечебного и педиатрического факультетов ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ, из них 8 – в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, одна монография в соавторстве. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 219 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 471 источник, из них - 122 отечественных и 349 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 46 рисунками. ^ Регуляцию апоптоза при окислительном стрессе мы рассматривали с позиции существования типовых неспецифических механизмов изменения летальной программы клеток. Для того чтобы понять особенности влияния окислительного стресса на реализацию апоптоза, проводимое нами исследование (в соответствии с поставленными целью и задачами) было разделено на два последовательных этапа. На первом этапе исследования предстояло выяснить, приводит ли дисбаланс окислительного метаболизма к нарушению реализации летальной программы клеток. Для этого проводили оценку выраженности апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови в условиях оксилительного стресса, состояния ключевых путей инициации программированной гибели клеток (рецепторный, митохондрий-опосредованный, ядерный). На втором этапе исследования предполагалось проверить гипотезу о вовлечении редокс-чувствительных элементов сигнальной трансдукции в механизмы нарушения летальной программы клеток при окислительном стрессе. Для определения роли митоген-активированных протеинкиназ р38 и JNK в регуляции апоптоза клеток при окислительном стрессе использовали селективные ингибиторы МАР-киназ (ML3403 и SP600125), определяли наличие общих и фосфорилированных форм МАР-киназ, транскрипционных факторов р53 и NF-kB, фосфорилированного р53. Для определения участия протеинов семейства Bcl-2 в регуляции апоптоза измеряли внутриклеточное содержание про- (Вах, Bad) и антиапоптотических (Вcl-2, Bcl-XL) представителей данного семейства белков (табл. 1). Затем оценивали экспрессию генов белков-регуляторов апоптоза, находящихся под транскрипционным контролем р53 и NF-kB. Для верификации молекулярных мишеней, ответственных за редокс-зависимую модуляцию апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови, проводилось манипулирование in vitro мононуклеарными лейкоцитами крови, полученными у здоровых доноров и больных острыми воспалительными заболеваниями. В исследование были включены 46 здоровых доноров в возрасте от 18 до 50 лет (мужчины - 20, женщины – 26) и 49 больных (25 мужчин и 24 женщины в возрасте от 18 до 50 лет, средний возраст – 32±3 лет) с острыми воспалительными заболеваниями (внебольничная пневмония, острый аппендицит). Критериями исключения из программы исследования для здоровых доноров и больных острыми воспалительными заболеваниями являлись: возраст моложе 18 и старше 50 лет; период обострения хронических воспалительных заболеваний; аутоиммунные, наследственные и психические болезни, злокачественные новообразования, алкогольная и наркотическая зависимости; отсутствие информированного согласия. Пациенты были обследованы при госпитализации в терапевтическое и хирургическое отделения ММЛПУ Городская больница №1 (главный врач - С.М. Кирютенко), госпитальные клиники ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (главный врач – Заслуженный врач РФ, канд. мед. наук В.М. Шевелев), клиники Военно-медицинского института МОРФ (зав. кафедрой терапии и усовершенствования врачей – канд. мед. наук, доцент Т.С. Агеева). Материалом для исследования служила венозная кровь, взятая утром натощак из локтевой вены в количестве 10 мл и стабилизированная гепарином (25 Ед/мл). Исследование проводилось на базе Межкафедральной научно-образовательной лаборатории молекулярной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (руководители – д-р мед. наук, проф. Н.В. Рязанцева, акад. РАМН В.В. Новицкий), лаборатории фармакогеномики НИИ химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск) (зав. лабораторией – канд. мед. наук М.Л. Филипенко). Мононуклеарные лейкоциты выделяли из крови путем центрифугирования на слое фиколла (“Pharmacia” Швеция) плотностью 1,077 и инкубировали в течение 18 ч при температуре 37ºС в полной питательной среде. Для определения роли митоген-активированных протеинкиназ р38 и JNK в регуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при окислительном стрессе использовали селективные ингибиторы МАР-киназ (ML3403 и SP600125 («Biosource», США) соответственно). Для индукции окислительного стресса в клеточные культуры добавляли перекись водорода в различных концентрациях (10 мкм, 50 мкм, 100 мкм, 500 мкм и 1 мМ). Методом проточной лазерной цитофлуориметрии с использованием цитометра Epics XL («Beckman Coulter», Франция) оценивали уровень внутриклеточной продукции АФК, количество апоптотически измененных клеток, содержание мононуклеарных лейкоцитов со сниженным трансмембранным митохондриальным потенциалом и число TNFR1-презентирующих клеток. Оценку реализации апоптоза мононуклеарных лейкоцитов проводили с использованием ФИТЦ- меченного аннексина V («ANNEXIN V FITC» («Beckman Coulter», Франция)), обладающего сродством к мембранно-связанному фосфатидилсерину [Van Engeland M., 1998]. Для подтверждения наличия в Таблица 1 Распределение здоровых доноров и пациентов с острыми воспалительными заболеваниями, в соответствии с проведенными методами исследования
^
исследуемой культуре клеток с апоптотическими изменениями применяли TUNEL-метод («Webstain», США). Количество клеток со сниженным уровнем потенциала митохондриальных мембран (∆ψ) регистрировали с использованием набора реагентов «MitoScreen» («BD Pharmigen», США). Уровень активных форм кислорода в клетках оценивали с помощью красителя с заблокированной флуоресценцией – дихлорфлюоресцеина диацетата («Sigma», США). Содержание мононуклеарных лейкоцитов, презентирующих на своей поверхности мембранную форму рецептора к фактору некроза опухоли-α 1-го типа (TNF-RI), определяли с помощью стандартных моноклональных антител к TNF-RI, меченных ФИТЦ («Immunotech», Франция). Продукцию мононуклеарными лейкоцитами TNFα оценивали с помощью иммуноферментного анализа по инструкции, предлагаемой фирмой-производителем тест-систем («Протеиновый контур», Россия). В супернатантах интактных, перекись-стимулированных и культивированных с ингибиторами МАР-киназ культур мононуклеарных лейкоцитов определяли содержание IL-8 и IL-10, используя метод иммуноферментного анализа в соответствии с инструкцией к набору («Biosurce», USA) на микропланшетном фотометре Multiscan EX («ThermoLabSistems», Финляндия). Концентрации TNFα, IL-8 и IL-10 вычисляли по калибровочной кривой. Для определения содержания активных и неактивных форм МАР-киназ р38, JNK, транскрипционных факторов (NF-kB, p53 и фосфо-формы р53) и белков-регуляторов апоптоза (Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bad) был использован метод вестерн-блоттинга. Клеточные экстракты получали путем лизиса клеток. Белки разделяли по молекулярной массе под действием электрического поля в течение 60 мин при напряжении 120 В. Для последующего исследования белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Bio-Rad», США). Перенос белков осуществлялся электрофоретически в течение 90 мин при силе тока 60 мА. Нитроцеллюлозные блоты инкубировали с первичными антителами к активным и общим формам МАР-киназ (JNK 1 и 2, р38, фосфо JNK 1 и 2, фосфо р38), факторам транскрипции (р53 («Biosource», США), NF-kB («Biosource», США)), к фосфо-форме р53 («Biosource», США) и белкам-регуляторам (Bax («Biosource», США), Bcl-XL («Sigma», США), Bad («Biosource», США), Bcl-2 («Biosource», США)) в разведении 1:200. В качестве стандарта и внутреннего контроля использовали белок глицеро-3-фосфат-дегидрогеназу («Chemicon», США). Для количественного определения экспрессии РНК генов bcl-2, bax, bcl-XL и bad использовали метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Выделение РНК из мононуклеаров крови осуществляли с применением гуанидин изотиоционата с последующей фенол-хлороформной экстракцией [Chomczynski P., Sacchi N., 1987]. Оценку качества выделенного препарата РНК проводили по итогам электрофоретического разделения. Возможные примеси геномной ДНК удаляли при помощи переосаждения в 2,5 М LiCl. Следующим шагом синтезировали ДНК на матрице РНК при участии обратной транскриптазы. Полученный фрагмент ДНК амплифицировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени с использованием SYBR Green I («Мolecular Probe», США) на амплификаторе IQ5 («Bio-Rad», США). Амплификацию проводили с использованием режима, предполагающего предварительную денатурацию образцов (95°С, 2 мин) с последующими сорока циклами, включающими денатурацию (95°С, 15 сек) и отжиг (60°С, 45 сек). Праймеры, позволяющие специфично амплифицировать фрагменты кДНК генов bcl-2, bcl-XL, bax и bad, были предоставлены лабораторией фармакогеномики НИИ химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск). Для определения относительного количества кДНК в образце использовали критерий ddCt. При оценке полученных данных использовали методы статистического описания и проверки статистических гипотез [Лакин Г.Ф., 1980]. Для каждой выборки вычисляли средневыборочные характеристики: среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение, ошибка среднего или медиана, первый и третий квартили. Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. При соответствии нормальному закону распределения признака в исследуемых выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием t-критерия Стъюдента. В случае отсутствия согласия данных с нормальным распределением для оценки различий между зависимыми выборками применяли непараметрический критерий Вилкоксона. Для оценки достоверности различий независимых выборок использовали ранговый критерий Манна-Уитни. Наличие связи между изученными показателями проводили с использованием корреляционного анализа по методу Спирмена. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05 [Лакин Г.Ф., 1980; Гланц С., 1999]. ^ МОНОНУКЛЕАРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ В УСЛОВИЯХ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА Интенсификация окислительных реакций при различных патологических состояниях может оказывать влияние на процессы реализации апоптоза (как в сторону активации, так и в сторону ингибирования), выступая в качестве дополнительного патогенетического механизма развития сердечно-сосудистых, онкологических заболеваний, воспалительных и нейродегенеративных процессов. Особый интерес исследователей в этом плане привлекает роль изменений редокс-статуса клетки в модуляции ее программированной гибели [Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007]. Вместе с тем особенности функционирования отдельных систем передачи апоптогенных сигналов (вне- и внутриклеточных) в условиях изменения окислительного метаболизма требуют детального изучения. При выборе методологии исследования мы руководствовались следующими позициями. С одной стороны, известно, что окислительный стресс выступает в качестве одного из важнейших патогенетических факторов развития различных заболеваний (воспалительные процессы любого генеза, злокачественные новообразования, сердечно-сосудистая и бронхо-легочная патологии, неврологические и психические заболевания, интоксикации разного генеза и др.). При этом механизмы генерации АФК носят типовой универсальный характер [Дубинина Е.Е., 2001]. В качестве примера патологического процесса, сопровождающегося дисбалансом окислительного метаболизма, нами был выбран острый воспалительный процесс у больных внебольничной пневмонией и острым аппендицитом. С другой стороны, изучение роли какого-либо определенного молекулярного механизма требует создания экспериментальной модели, существенным плюсом которой является возможность анализа изолированной цепи событий, приводящих к патологическим изменениям [Веденов А.А., 1988]. В связи с этим в программу исследования был включен экспериментальный блок, основанный на моделировании окислительного стресса in vitro с использованием Н2О2. Добавление в культуральную среду Н2О2 в различных конечных концентрациях является одним из наиболее распространенных способов моделирования окислительного стресса in vitro [Abe J. et al., 1997; Griendling K.K. et al., 2000; Chen K., Vita J.A. et al., 2001; Ding B., 2007]. Задачей экспериментального раздела исследования явилась оценка уровня внутриклеточной продукции АФК и количества апоптотически измененных мононуклеарных лейкоцитов при различных концентрациях перекиси водорода. При этом оптимальной для моделирования окислительного стресса in vitro считалась концентрация Н2О2, при которой внутриклеточный уровень АФК, превышая контрольные значения и вызывая интенсификацию процессов апоптоза, не приводил к возрастанию числа некротизированных клеток в культуре. Оценка содержания АФК в клетках при добавлении в культуральную среду перекиси водорода в диапазоне концентраций от 10 до 500 мкМ не выявила значимых отклонений исследуемого показателя от аналогичного параметра в контроле (р>0,05) (рис. 1). Полученные нами данные свидетельствуют о сохранении баланса между анти- и прооксидантными системами мононуклеарных лейкоцитов при воздействии указанных концентраций перекиси водорода. Известно, что устойчивость клеток к воздействию Н2О2 обеспечивается глутатионпероксидазной и каталазной ферментативными системами [Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006]. Добавление перекиси водорода в конечной концентрации 1 мМ в культуру мононуклеарных лейкоцитов приводило к повышению внутриклеточной продукции АФК в 2,5 раза (р<0,05) (рис. 1), что свидетельствует о нарушении баланса между про- и антиоксидантными системами клетки и может служить признаком дисбаланса окислительного метаболизма. Помимо окислительного стресса, носящего как адаптивный, так и дезадаптивный характер, апоптоз является одним из фундаменальных механизмов регуляции клеточного гомеостаза. В связи с этим чрезвычайно интересна взаимозависимость и участие АФК в регуляции клеточного саморазрушения [Зенков Н.К. и соавт., 2001].  Рис.1. Уровень активных форм кислорода, содержание апоптотических клеток и клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий в общей популяции мононуклеарных лейкоцитов периферической крови в условиях культивирования in vitro с различными концентрациями перекиси водорода и у больных острыми воспалительными заболеваниями Примечание: 1 - интактная культура мононуклеарных лейкоцитов; 2 - инкубирование клеток с 10 мкМ Н2О2; 3 - инкубирование клеток с 50 мкМ Н2О2; 4 - инкубирование клеток с 100 мкМ Н2О2; 5 - инкубирование клеток с 500 мкМ Н2О2; 6 - инкубирование клеток с 1 мМ Н2О2; 7 - мононуклеарные лейкоциты крови, полученные у больных внебольничной пневмонией; 8 - мононуклеарные лейкоциты крови, полученные у больных острым аппендицитом Показано, что ранним признаком апоптогенных изменений может служить изменение локализации фосфатидилсерина, а точнее - его перемещение с внутренней стороны клеточной мембраны на внешнюю. Исходя из факта присутствия фосфотидилсерина на поверхности мембраны апоптозных клеток, их регистрация может осуществляться с помощью соединения, обладающего сродством к нему, - ФИТЦ-меченного аннексина V [Van Engeland M. et al., 1998]. Именно такой методологический подход был использован в нашем исследовании. Добавление в культуральную среду малых концентраций перекиси водорода (10-500 мкМ) не вызывало достоверных изменений количества апоптотически измененных клеток (р>0,05) (рис. 1). Выраженная индукция летальной программы была обнаружена в культуре мононуклеарных клеток, подверженной воздействию 1 мМ перекиси водорода. Выявленные при экспериментальном окислительном стрессе изменения подтверждают факт участия АФК в индукции и передаче апоптотического сигнала. Культивирование мононуклеарных лейкоцитов, полученных у здоровых доноров, с Н2О2 в концентрации, превышающей 1 мМ, приводило к возрастанию в культуре числа некротизированных клеток, определяемых при окраске трепановым синим. Данное обстоятельство заставило нас исключить дальнейшее исследование влияния перекиси водорода в концентрации выше 1 мМ на процесс апоптоза. Как известно, реализация апоптогенной программы представляет собой три последовательных стадии: инициации, эффекторная и деградации [Thornberry N.A., Lazebnik Y., 1998; Kroemer G., Reed J., 2000]. Исследование различных путей инициации апоптоза способствует более глубокому пониманию механизмов его регуляции при окислительном стрессе, поэтому в ходе настоящего исследования оценивались основные варианты запуска программированной гибели клеток: митохондриальный, рецепторный (TNFα-опосредованный) и ядерный (р53-опосредованный). В настоящее время накоплено большое количество данных, подтверждающих взаимосвязь между генерацией АФК, функцией митохондрий и реализацией апоптоза [Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007]. Показано, что митохондрии могут выступать в качестве мишеней регуляторных молекул при передаче апоптогенного сигнала, а также в роли источника АФК, являющихся сигнальными молекулами данных каскадов [Green D.R., Reed J.C., 1998; Zhu H., Bunn H.F., 2001]. Митохондриальный путь инициации программы апоптоза включает изменения электронного транспорта и клеточного редокс-баланса, потерю митохондриального трансмембранного потенциала, взаимодействие про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2, выход апоптогенных факторов (цитохром с, AIF, Smac/DIABLO) [Liu X. et al., 1996; Antonsson B., 2001; Du C. et al., 2000; Wu G. еt al., 2000; Joza N. еt al., 2001; Li L.Y. et al., 2001; Cory S. еt al., 2002]. Последнее возможно только при повышении проницаемости ее наружной мембраны. В связи с этим нами в качестве показателя, характеризующего вовлеченность митохондриального пути в реализацию апопотоза при окислительном стрессе, оценивалась целостность митохондриальных мембран по показателю трансмембранного потенциала. Он является электрохимическим градиентом протонов, создаваемым цепью переноса электронов на внутренней мембране митохондрий. Рассеивание ∆ψ может происходить за счет открытия неселективных пор пермеабилизационного перехода между наружной и внутренней мембранами митохондрий [Susin S.A. et al., 1998]. Проведенное нами исследование показало, что добавление в культуральную среду Н2О2 в диапазоне концентраций от 10 до 500 мкМ не вызывало изменений уровня митохондриального трансмембранного потенциала мононуклеарных лейкоцитов (р>0,05), число аннексин-положительных клеток также не изменялось (рис. 1). В соответствии с гипотезой J.J. Lemasters et al. [1998], уменьшение ∆ψ в результате повышения проницаемости наружной митохондриальной мембраны является критическим фактором для развития апоптоза. Оказалось, что число клеток со сниженным трансмембранным потенциалом после воздействия 1 мМ перекиси водорода превышало аналогичные значения в контроле в 6,8 раза (р<0,05) (рис. 1), свидетельствуя об активации программированной гибели клеток по митохондриальному пути в условиях окислительного стресса. Предположение об индукции апоптоза по митохондриальному пути в условиях окислительного стресса подтверждалось наличием положительной корреляции между увеличением числа апоптотически измененных клеток и возрастанием количества мононуклеарных лейкоцитов со сниженным ∆ψ при окислительном стрессе in vitro (r=0,78, p<0,05). Полученые результаты позволяют сделать вывод о том, что в условиях усиленной внутриклеточной продукции АФК передача сигнала апоптоза сопряжена с дисфункцией митохондрий, выражающейся в повышении проницаемости их мембран и снижении ∆ψ. Другой важнейший путь запуска программы апоптоза, реализуемый в условиях окислительного стресса, - рецепторный [Самуилов В.Д. и соавт., 2000]. Его наиболее распространенный вариант - индукция летальной программы клеток с помощью суперсемейства TNF-рецепторов [Ярилин А.А., 2001]. Данное семейство включает Fas (C95, APO-1), TNF-R1, DR3/WS1-1, DR4/TRAIL-R1, DR5/TRAIL-R2 и DR6, «домены смерти» которых находятся в цитоплазматическом участке и обеспечивают активацию каспазного каскада [Garg A.K., Aggarwal B.B., 2002]. Проведенная нами оценка содержания клеток, несущих на своей поверхности TNFR1 выявила увеличение (в 4,7 раза) количества TNFR1-презентирующих клеток в случае воздействия на культуру мононуклеарных лейкоцитов in vitro 1 мМ перекиси водорода (p<0,05) (рис. 2). Полученные данные свидетельствуют о повышенной готовности клеток к запуску апоптотической программы по рецепторному пути в условиях окислительного стресса. А В
 Рис.2. Содержание TNFR1–презентирующих клеток (А) и уровень TNFα в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови (В) при экспериментальном окислительном стрессе и у больных острыми воспалительными заболеваниями Поскольку запуск TNF-опосредованного апоптоза обусловливается взаимодействием данного цитокина с соответствующим лигандом, для нас представляло интерес исследование продукции клетками TNFα, запускающего внутриклеточный каскад активации каспаз. Основными продуцентами TNFα являются моноциты и макрофаги, а также лимфоциты, естественные киллеры и гранулоциты крови [Фрейдлин И.С., 2001]. Оценка содержания TNFα в супернатантах культуры мононуклеарных лейкоцитов у здоровых доноров продемонстрировала, что добавление в культуральную среду перекиси водорода в концентрации 1 мМ не приводило к выраженному увеличению продукции TNFα клетками (p>0,05). Выявленное отсутствие изменений продукции TNFα в условиях окислительного стресса может свидетельствовать о нарушении вовлеченности редокс-сигнальных систем в наработку данного цитокина. Вместе с тем полученные результаты свидетельствуют о повышенной готовности клеток к реализации рецептор-опосредованного пути запуска апоптоза в условиях окислительного стресса in vitro. Известно, что одной из мишеней АФК в клетке являются нуклеиновые кислоты. Возникающие при этом повреждения ДНК, обусловливающие активацию гена р53, могут приводить к запуску ядерного пути апоптоза [Чумаков П.М., 2000]. Данные, свидетельствующие о вовлеченности р53 в редокс-зависимые пути инициации апоптоза в мононуклеарных лейкоцитах, представлены в следующих главах. Активация либо ингибирование программированной гибели клеток, как ведущего механизма ограничения пролиферации клеточных популяций, может лежать в основе развития ряда патологических состояний. С другой стороны, в качестве ведущего патогенетического фактора для большого числа заболеваний выступает окислительный стресс - универсальный механизм повреждения клеток, при котором механизмы генерации АФК являются однотипными. Отличительные особенности образования внутриклеточных АФК можно выявить только на начальных стадиях развития болезни [Дубинина Е.Е., 2001]. Острое воспаление является одним из примеров патологических процессов, характеризующихся как дисбалансом окислительного метаболизма, так и нарушениями реализации апоптоза. При воспалении усиление процессов свободно-радикального окисления сопровождается увеличением наработки АФК, играющих важную роль в регуляции редокс-чувствительных сигнальных систем клетки, экспрессии воспалительных медиаторов, программ выживания или гибели клетки. Излишняя активация апоптотической гибели клеток может приводить к истощению защитных сил организма, в то время как ее ингибирование - к хронизации воспалительного процесса. Основные эффекторные молекулы воспалительной реакции - АФК, обеспечивая микробицидное, фугицидное и цитотоксическое действие, могут изменять жизнедеятельность всех клеток организма. В связи с этим в проведенном нами исследовании влияние дисбаланса окислительного метаболизма на программированную гибель мононуклеарных лейкоцитов оценивали на модели острого воспаления (внебольничная пневмония и острый аппендицит). Анализ уровня АФК в мононуклеарных лейкоцитах, полученных у пациентов с острым воспалением, показал увеличение значений указанного параметра по сравнению с таковым в клетках у здоровых доноров в 2,1 раза (р<0,05) (рис. 1). Известно, что воспалительный процесс в тканях сопровождается значительной продукцией АФК, и прежде всего наиболее стабильной их формы - перекиси водорода [Крыжановский Г.Н., 2002]. Образованная при «дыхательном взрыве» перекись водорода может проникать в рядом расположенные клетки, вызывая в них увеличение продукции АФК за счет разобщения окислительного фосфорилирования. Распространяясь таким образом на значительные расстояния в отсутствие прямых межклеточных контактов, Н2О2 приводит к изменениям структуры и функции клеток крови, в частности, к зарегистрированному нами повышению продукции АФК мононуклеарными лейкоцитами крови, полученными у больных острыми воспалительными заболеваниями. В результате исследования количества апоптотически измененных мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из крови у пациентов с внебольничной пневмонией и острым аппендицитом, было продемонстрировано повышение данного показателя в 7,3 и 7,7 раза, соответственно, по сравнению с нормой (p<0,05) (рис. 1). Влияние окислительного стресса на развитие апоптоза мононуклеарных лейкоцитов подтверждалось наличием положительной корреляции между повышением уровня АФК и возрастанием количества аннексин-положительных мононуклеарных лейкоцитов при экспериментальном окислительном стрессе (r=0,84, p<0,05) и острых воспалительных заболеваниях (r=0,71, p<0,05). Полученные данные свидетельствуют о том, что увеличение внутриклеточной продукции АФК является одним из ведущих факторов интенсификации апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при воспалении. Помимо окислительного стресса, апоптоз, как это показано выше, также относится к типовым универсальным механизмам дизрегуляции клеточного гомеостаза, лежащим в основе развития большого числа распространенных заболеваний, в том числе воспалительных процессов. Оценка выраженности апоптоза в культуре мононуклеарных лейкоцитов, выделенных из крови у пациентов с внебольничной пневмонией, показала увеличение данного показателя до 9,98(8,79-11,33)% по сравнению с контролем (p<0,05) (рис. 1). Количество апоптотически измененных мононуклеарных лейкоцитов, полученных у больных острым аппендицитом (10,46(9,83-10,94)%), также достоверно превышало их содержание в норме (p<0,05). Отсутствие различий показателей апоптотической активности мононуклеарных лейкоцитов у больных острым аппендицитом, определенных с использованием лазерной проточной цитофлуориметрии и TUNEL-метода (р>0,05), подтверждает адекватность примененного нами аннексинового теста для характеристики реализации летальной программы клеток. Относительное содержание апоптотических клеток в культурах мононуклеарных лейкоцитов у больных острым воспалением (внебольничная пневмония и острый аппендицит) оказалось достоверно ниже их количества при окислительном стрессе in vitro (р<0,05) (рис.1). Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что острый воспалительный процесс характеризуется нарушением редокс-гомеостаза и сопровождается активацией процессов апоптотической гибели мононуклерных лейкоцитов крови. Оценка количества мононуклеарных лейкоцитов со сниженным ∆ψ показала, что данная величина при остром воспалении в 5,6 раза превышала аналогичный параметр в контроле (р<0,05) и не отличалась от таковой в случае экспериментального окислительного стресса (р>0,05) (рис. 1). Таким образом, нарушения баланса окислительного метаболизма мононуклеарных лейкоцитов, как в случае индукции окислительного стресса перекисью водорода, так и в случае острого воспаления (внебольничная пневмония и острый аппендицит) сопровождаются возрастанием числа клеток со сниженным трансмембранным потенциалом митохондрий. Численность TNFR1-экспрессирующих клеток, выделенных из крови у больных острыми воспалительными заболеваниями, превышала в 4,5 раза соответствующие параметры в интактной культуре (p<0,05). По полученным данным, индуцируемый добавлением в культуральную среду перекиси водорода окислительный стресс и острый воспалительный процесс сопровождаются повышением готовности клеток к реализации TNF-опосредованного программированного механизма летальной программы клеток. Подтверждением этому служат результаты проведенной нами оценки продукции TNFα мононуклеарными лейкоцитами крови при остром воспалении. Анализ уровня продукции TNF-α показал, что величина этого показателя повышалась по сравнению с контролем в культурах мононуклеарных лейкоцитов крови, полученных у больных острым воспалением (p<0,05) и достоверно превышала таковую при окислительном стрессе in vitro (p<0,05). В целом, проанализировав данные, характеризующие особенности реализации апоптоза при окислительном стрессе, полученные на первом этапе настоящего исследования, можно утверждать, что возрастание уровня АФК в мононуклеарных лейкоцитах крови сопряжено с активацией митохондриального и ядерного вариантов запуска апоптотической гибели, а также с повышенной готовностью инициации рецепторного пути (рис. 1). Следующий этап нашего исследования был посвящен изучению молекулярных редокс-чувствительных механизмов данного явления, позволяющему идентифицировать молекулярные мишени для коррекции нарушений апоптоза при окислительном стрессе. В настоящее время выявлено большое число сигнальных путей, регулируемых АФК. Среди них в наибольшей степени изучены механизмы, основанные на фосфорилировании и дефосфорилировании белков специфическими киназами и фосфатазами [Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007]. В частности, универсальными трансмиттерами сигналов от множества трансмембранных рецепторов к внутриклеточным компартментам являются МАР-киназы. К числу последних относятся митоген-активируемые протеинкиназы JNK и р38, фосфорилирующие ответственные за реализацию летальной программы клеток белки-мишени, среди которых важное место занимают факторы транскрипции NF-kB и р53 (Gallo K.A., Johnson G. L., 2002). Активируемые киназами NF-kB и р53, в свою очередь, контролируют синтез ключевых белков-регуляторов апоптоза. Выбор про- или антиапоптогенной функции данными элементами сигнальной трансдукции зависит от особенностей инициирующих сигналов, комбинации возможных путей их передачи и типов клеток. ^ Различные воздействия на клетку - цитокины, гормоны, факторы роста и др. – обусловливают активацию определенных элементов системы сигнальной трансдукции [Гусев Н.Б., 2000]. Ее важнейшими звеньями являются протеинкиназы, активирующие друг друга по каскадному принципу. Особая роль в реализации клеточного ответа принадлежит редокс-чувствительным МАР (Mitogen-activated protein) киназам (МАРК). Данные киназы представлены тремя семействами: р38 (протеинкиназа 38 кДа), JNK/SAPK (c-Jun N-terminal kinase/Stress activated protein kinase) и ERK (Extracellular signal-regulated kinase). Последние ответственны за выживание и пролиферацию клеток, в то время как активация киназ семейств р38 и JNK/SAPK связана с инициацией апоптоза [Xia Z., Dickens M. et al., 1995; Потехина Е.С., Надеждина Е.С. 2002; Gallo K.A., Johnson G.L., 2002; Владимирская Е.Б., 2004]. JNK и p38 протеинкиназы фосфорилируют проапоптотические белки-мишени, связанные с регуляцией программированной клеточной гибели и функционированием соответствующих факторов транскрипции [Влаопулос С., Зумпурлис В.С., 2004]. Вместе с тем, ряд исследований свидетельствуют о наличии антиапоптотической активности JNK и p38 [Zechner D. et al., 1998; Craig R. et al., 2000; Hoover H.E. et al., 2000; Andrekа P. et al., 2001], зависящей от природы индуцирующего сигнала, сопутствующих условий стимуляции и типов клеток. В связи с этим возникает необходимость более подробного изучения роли стресс-активируемых протеинкиназ JNK и p38 в реализации летальной программы клеток при окислительном стрессе. Активация JNK играет ведущую роль в запуске летальной программы клеток в ответ на стресс (воздействие воспалительных цитокинов IL-1 и TNF-α, свободных радикалов и др.) [Srivastava R.K., 1999]. Наиболее подвержен стрессовым воздействиям (в частности, при повреждении белков) механизм активации JNK, связанный с ингибированием JNK-инактивирующих фосфатаз [Влаопулос С., Зумпурлис В.С., 2004]. Вместе с тем JNK может оказывать и антиапоптогенное действие: выявлена активация процессов NO-индуцированного апоптоза за счет экспрессии доминант-негативной JNK1 либо доминант-негативной МКК4 [Andrekа P. et al., 2001]. Показано предотвращение апоптоза кардиомиоцитов (в условиях ишемии) ингибированием JNK1 [Hreniuk D. et al., 2001]. JNK может индуцировать апоптоз путем фосфорилирования и активации фактора транскрипции р53 по Thr8 [Влаопулос С., Зумпурлис В.С., 2004]. Известно, что редокс-чувствительная киназа JNK играет важную роль в митохондриальном пути реализации апоптоза [Tournier C. et al., 2000; Aoki H. et al., 2002; Baines C.P., Molkentin J.D., 2002]. Установлено, что JNK-киназа может проникать в митохондрии, где фосфорилирует и активирует проапоптотические белки Bax и Bad, а также инактивирует антиапоптотические белки семейства Bcl-2 [Fan M. et al., 2000; Tournier C. et al., 2000; Chawla-Sarkar M. et al., 2003; Harada C., Nakamura K., 2006]. Так, H. Aoki et al. [2002] показали, что активированные JNK и МКК4, локализованные в митохондриях, индуцируют высвобождение цитохрома с и усиливают апоптоз кардиомиоцитов. В литературе имеются сведения о том, что JNK, независимо от каспазы-8, непосредственно активирует расщепление Bid, облегчая таким образом реализацию митохондриального пути клеточной смерти [Deng J. et al., 2003]. Наконец, JNK киназа прямо фосфорилирует два дополнительных про-апоптотических белка Bim и Bmf, облегчая тем самым их транслокацию в митохондрии [Lei K., Davis R.J., 2003]. Роль р38 в реализации программированной гибели также неоднозначна. Установлено, что трансфекция МКК6 - элемента р38 киназного каскада - вызывает фосфорилирование шаперона -В-кристаллина, усиливая антиапоптотический эффект [Zechner D. et al., 1998; Craig R. et al., 2000; Hoover H.E. et al., 2000]. По данным C. Communal et al. [2000], ингибирование р38 приводит к увеличению апоптотической активности кардиомиоцитов. Вместе с тем результаты большого числа исследований свидетельствует о вовлеченности р38 в индукцию летальной программы клеток. Ингибирование р38 блокирует апоптоз кардиомиоцитов, индуцированный ишемией, в культуре и in vivo [Zhu W. et al., 1999; Kang Y.J. et al., 2000; Sharov V.G. et al., 2003]. Активация р38 способствует экспрессии и митохондриальной трансдукции одного из важнейших апоптогенных белков - Вах, опосредуя свое влияние через фосфорилирование р53 [Kim S.J. et al., 2002; Mayr M. et al., 2002]. Таким образом, стресс-активируемые киназы, с одной стороны, являются неотъемлемым элементом системы регуляции летальной программы, а с другой, - играют ключевую роль в процессах пролиферации и дифференцировки клеток. Однако условия и факторы, способствующие проявлению апоптогенной функции МАР киназ (в том числе окислительный стресс), требуют детального изучения. Для выяснения роли JNK, р38 в регуляции программы апоптоза при окислительном стрессе в нашей лаборатории было проведено двухэтапное исследование. На начальном этапе применялся широко распространенный подход к изучению функций МАР-киназ, основанный на оценке результатов эксперимента при их избирательном блокировании. В нашем исследовании регистрировалась активность процесса апоптоза в культурах клеток, инкубируемых с селективными ингибиторами JNK и р38 (SP600125 и ML3403, соответственно) в присутствии 100 мкМ либо 1 мМ Н2О2 (рис. 3). Полученные данные свидетельствуют о том, что добавление ингибитора JNK (так же как и ингибитора р38) в культуру мононуклеарных лейкоцитов крови препятствовало увеличению числа аннексин-положительных клеток при окислительном стрессе in vitro и снижало их содержание у пациентов с острым воспалением.  ^ in vitro с ингибиторами МАР-киназ Примечание: а - контроль; б - окислительный стресс in vitro; в - культивирование с 1 мМ Н2О2 и ингибитором ML3403; г - культивирование с 1 мМ Н2О2 и ингибитором SP600125; д - культивирование клеток, полученных у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями; е - культивирование клеток, полученных у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями, в условиях in vitro c ML3403; ж - культивирование клеток, полученных у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями, в условиях in vitro c SP600125 Таким образом, результаты проведенного исследования продемонстрировали, что ингибирование МАР-киназ р38 и JNK препятствует реализации программированной клеточной гибели мононуклеарных лейкоцитов в условиях дисбаланса окислительного метаболизма. Полученные данные могут служить доказательством того, что в условиях окислительного стресса мононуклеарных лейкоцитов МАР-киназы JNK и р38 выступают в качестве проапоптогенных регуляторных молекул. Это предположение согласуется с приводящимися в литературе сведениями о защитной роли ингибиторов р38 и JNK в случае сердечной дисфункции и апоптоза кардиомиоцитов, индуцированного ишемией [Meldrum D.R. et al., 1998; Barancik M. et al., 2000; Schneider S. et al., 2001]. Так, апоптоз кардиомиоцитов, индуцированный ишемией и доксорубицином в культуре, снижался при ингибировании р38 МАРК [Zhu W. et al., 1999; Kang Y.J. et al., 2000; Sharov V.G. et al., 2003]. V.L.Gabai et al. [2000] показали, что ингибирование JNK в Н9с2 миоцитах блокировало апоптоз, вызванный окислительным стрессом. При обсуждении результатов, полученных в экспериментах с ингибиторами МАР-киназ, возникают следующие вопросы: каковы молекулярные механизмы проапоптогенного эффекта МАР-киназ в условиях изменения редокс-статуса клетки; сопряжена ли данная функция JNK и р38 с увеличением содержания в мононуклеарных лейкоцитах их активных (фосфорилированных) форм, которые могут оказывать воздействие на другие мишени - элементы сигнальной системы (факторы транскрипции, белки-регуляторы апоптоза); чем может быть обусловлено это увеличение – изменением общего содержания киназ при окислительном стрессе за счет увеличения их экспрессии, либо только активацией процесса фосфорилирования? Результаты проведенной методом вестерн-блоттинга оценки содержания в мононуклеарных лейкоцитах общих и фосфорилированных форм JNK и р38 показали, что при окислительном стрессе, индуцированном добавлением 1мМ Н2О2 в культуру клеток, полученных у здоровых доноров, общее содержание JNK (JNK1 и JNK2) и р38 не изменялось по сравнению с контролем. Аналогичные результаты были получены и в клинике острого воспаления – общий уровень JNK и р38 в мононуклеарных лейкоцитах в этом случае соответствовал норме. Вместе с тем содержание фосфорилированных форм МАР-киназ (р-JNK и р-р38) увеличивалось по отношению к контролю при инкубации мононуклеарных лейкоцитов, полученных у здоровых доноров, с 1мМ Н2О2, и в клетках крови у пациентов с острыми воспалительными заболеваниями (рис. 4, 5). Полученные данные свидетельствуют о том, что при окислительном стрессе увеличение уровня р-JNK и р-р38 обусловлено АФК-зависимой активацией процесса фосфорилирования и не связано с изменением активности экспрессии данных ферментов в клетке. АФК могут влиять на активность JNK и р38 посредством различных реакций [Brumell J.H., 1996; Турпанов К.Т., 2002; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006]. В частности, АФК активируют белки MAPK Kinase Kinase (в частности, белок ASK1- Apoptosis signal-regulating kinase 1, активирующий как JNK, так и р38), которые запускают сигнальный каскад [Tobiume K. et al., 2001; Matsuzawa A., Ichijo H., 2005]. JNK удерживается в неактивной форме глутатион-S-трансферазой класса Pi (GSTPi). Под действием Н2О2 происходит диссоциация этого комплекса и активация киназы JNK [Mathers J. et al., 2004; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006]. Гидроксиноненаль - конечный продукт перекисного окисления липидов - образует аддукт с JNK, вызывая ее активацию [Дубинина Е.Е., 2001]. АФК инактивируют фосфатазы, отщепляющие фосфатные группы от специфических ферментов, вызывая тем самым их инактивацию [Klein J.A, Ackerman S.L., 2003; Влаопулос С., Зумпурлис В.С., 2004]. Повышенный уровень АФК часто коррелирует с активацией фосфорилирования JNK и р38 [Baines C.P. et al., 2005; Gautam D.K. et al., 2005; Teraishi F. et al., 2005; Cho S.D. et al., 2006], что подтверждается результатами настоящего исследования.  клетки, инкубированные in vitro c 1 мМ Н2О2 ^ (содержание белка р38 в интактной культуре здоровых доноров принято за 100%) При окислительном стрессе МАР-киназы опосредованно влияют на реализацию программы апоптоза, участвуя в регуляции продукции ряда цитокинов. В указанном аспекте нами было рассмотрено влияние JNK и р38 на продукцию IL-8 и IL-10 мононуклеарными лейкоцитами при экспериментальном окислительном стрессе и остром воспалении. С одной стороны, продукция IL-8, обусловленная NF-κB-зависимой индукцией промотора гена IL-8, может служить косвенным признаком активации данного транскрипционного фактора, предположительно участвующего в апоптозе; IL-10 интересовал нас в силу своего антиапоптогенного действия. С другой стороны, данные цитокины обладают про- и антивоспалительным эффектами (IL-8 и IL-10 соответственно), что еще более обосновывает целесообразность оценки их продукции в случае острого воспаления.  in vitro c 1 мМ Н2О2 ^ (содержание JNK1/2 в интактной культуре у здоровых доноров принято за 100%) Как свидетельствует проведенное исследование, содержание провоспалительного цитокина IL-8 в супернатантах исследованных культур мононуклеаров превышает контрольные значения в случае окислительного стресса in vitro и при остром воспалении. Редокс-чувствительная киназа JNK (в отличие от р38) влияет на продукцию IL-8, что подтверждается экспериментом с использованием селективного ингибитора SP600125; ингибитор р38 МАРК ML3403 не обладает таким эффектом (рис. 6). Представленные результаты вполне согласуются с данными литературы, в соответствии с которыми ингибитор JNK SP600125 блокирует экспрессию мРНК IL-8 и уменьшает продукцию данного цитокина различными клетками (эндотелиоциты, альвеолоциты А549, бронхиальные эпителиоциты человека) [Li L.F. et al., 2003; Saatian B. et al., 2006]. Для экспрессии воспалительных медиаторов — цитокинов, металлопротеиназ и адгезивных молекул - необходима активация JNK в присутствии АФК [Kathleen A., Johnson G. L., 2002; Влаопулос С., Зумпурлис В.С., 2004]. Регуляция IL-8 МАР-киназами отличается в зависимости от природы стимулов [Shapiro L., Dinarello C.A., 1995; Li L.F. et al., 2003; Kim M.S. et al., 2005; Harimaya A. et al., 2007] и типа клетки [Hashimoto S. et al., 1999; Li J. et al., 2002; Oudin S., Pugin J., 2002; Li L.F. et al., 2003; Aydin M. et al., 2007]. Окислительный стресс, вызванный экзогенной Н2О2, индуцирует синтез IL-8 в эпителиальных и эндотелиальных клетках [Lakshminarayanan V. et al., 1997; Shimada T. et al., 1999]. Этот факт подтверждают и результаты проведенного нами эксперимента. После культивирования мононуклеарных лейкоцитов крови, полученной у здоровых доноров, с 1 мМ Н2О2 определялось, как было показано выше, повышенное содержание IL-8 в супернатантах клеток (рис. 6).  Рис. 6. Содержание IL-8 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов при ингибировании МАР-киназ р38 и JNK в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении Примечание: а - контроль; б - окислительный стресс in vitro; в - культивирование клеток с 1 мМ Н2О2 и ингибитором JNK SP600125; г – культивирование клеток с 1 мМ Н2О2 и ингибитором р38 ML3403; д - интактная культура клеток у больных острым аппендицитом; е - интактная культура клеток у больных внебольничной пневмонией; ж - инкубирование клеток у больных острыми воспалительными заболеваниями с ингибитором JNK SP600125; з - инкубирование клеток у больных острыми воспалительными заболеваниями с ингибитором р38 ML3403 Роль р38 МАР-киназы в регуляции синтеза IL-8 неоднозначна. Так, по данным ряда авторов, ингибитор р38 МАРК (SB 203580) значительно снижает продукцию данного цитокина, опосредуя свое действие через NF-kB [Kim M.S. et al., 2005; Saatian B. et al., 2006; Harimaya A. et al., 2007]. Напротив, L.F. Li et al. (2003) показали, что ингибирование р38 МАРК не вызывает снижение экспрессии и секреции IL-8, предположив, что регуляция данных процессов осуществляется через активацию АР-1, NF-kB, зависящую от JNK и NIK (NF-kB-inducing kinase). Еще одним важным цитокином, продуцируемым мононуклеарными лейкоцитами крови при острых воспалительных заболеваниях, сопровождающихся окислительным стрессом, является интерлейкин-10. Известно, что IL-10 способен подавлять апоптоз [Go N.F. et al., 1990]. Имеются многочисленные сведения о способности этого цитокина ингибировать апоптоз В-лимфоцитов, активированных Т-клеток [Pawelec G. et al., 1996; Cohen S.B. et al., 1997; Рубцова И.Е. и соавт., 2004]. Результаты проведенного нами исследования свидетельствуют об отсутствии изменений содержания IL-10 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов как в случае окислительного стресса in vitro так и при острых воспалительных заболеваниях. Для выяснения роли р38 и JNK МАР-киназ в регуляции синтеза IL-10 в условиях окислительного стресса мы использовали их селективные ингибиторы (ML3403 и SP600125, соответственно). В результате настоящего исследования было показано, что в условиях дисбаланса окислительного метаболизма ни р38, ни JNK не влияют на продукцию IL-10 мононуклеарами. Отсутствие изменений синтеза IL-10 в условиях окислительного стресса и при ингибировании МАР-киназ наводит на мысль об отсутствии участия обозначенных редокс-сигнальных систем в продукции данного цитокина. Полученные результаты свидетельствуют о том, что роль киназ JNK и р38 в регуляции апоптоза и продукции клетками IL-8 и IL-10 в условиях острого воспаления весьма неоднозначна. Факт возрастания продукции IL-8 может свидетельствовать об активации в условиях воспалительного процесса JNK транскрипционных факторов (в частности, NF-kB). Последний в ряде случаев может выполнять как про-, так и антиапоптогенную функцию. Отсутствие возрастания продукции антиапоптотического цитокина IL-10 может являться одним из условий для активации летальной программы клеток. Кроме того, в рассмотренных условиях имеет место отчетливый дисбаланс между продукцией про- и антивоспалительных цитокинов (IL-8 и IL-10, соответственно) в пользу первых. В целом, рассмотренные в данной главе результаты исследования свидетельствуют об участии МАР-киназ JNK и р38 в реализации программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови при окислительном стрессе в условиях in vitro и в клинике острого воспаления. Регуляторное влияние данных МАР-киназ может быть опосредовано другими редокс-чувствительными элементами внутриклеточных систем сигнальной трансдукции, в частности транскрипционными факторами. Среди последних важнейшую роль в инициации/блокировании летальной программы клеток играют р53 и NF-kB, влияющие на баланс про- и антиапоптогенных белков-регуляторов. |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
1 2
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям