Применение клеточных культур фибробластов в лечении атрофических рубцов кожи (экспериментально-клиническое исследование) 14. 00. 11 кожные и венерические болезни 14. 00. 15 патологическая анатомия
|
|
Скачать 300.57 Kb.
|
|
На правах рукописи Золотовицкая Наталья Николаевна ПРИМЕНЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР ФИБРОБЛАСТОВ В ЛЕЧЕНИИ АТРОФИЧЕСКИХ РУБЦОВ КОЖИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) 14.00.11 - кожные и венерические болезни 14.00.15 - патологическая анатомия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва, 2007 Работа выполнена на базе ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» ^ доктор медицинских наук, профессор Орлов Евгений Владимирович доктор медицинских наук, доцент Колсанов Александр Владимирович ^ доктор медицинских наук, профессор Курдина Мария Игоревна доктор медицинских наук, профессор Туманов Владимир Павлович ^ ГОУ ВПО «Российский Университет Дружбы Народов Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Защита состоится 6 ноября 2007 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета К 208.072.03 при ГОУ ВПО «Российский Государственный Медицинский Университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, 1 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Российский Государственный Медицинский Университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Автореферат разослан 5 октября 2007 года. Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор медицинских наук, профессор И.В. Хамаганова ^ Актуальность темы. Проблема лечения больных с рубцовыми дефектами кожи относится к одному из актуальных разделов медицины (Картамышев А.И., 1953; Серебренников И.М., 1962; Давыдовский И.В., 1969; Мяделец О.Д., 1997; Белоусов А.Е., 1998; Озерская О.С., 2002, Ахтямов С.Н., Бутов Ю.С., 2003). Причины возникновения рубцов разнообразны. Это – физические, механические и химические травмы, воспалительные процессы, кожные заболевания, хирургические вмешательства и другие факторы (Фисенко Г.И. с соавт., 2006). Ответ кожи на эти воздействия является стереотипным и выражается в заживлении дефекта рубцом при ее глубоком повреждении (Кузин М.И., Костюченок Б.М., 1990). Проблема рубцов является актуальной, т.к. их формирование приводит к деформации кожи и нарушению функции органа. При расположении рубцов в области лица отмечаются различного рода нарушения симметрии, мимики и формы (Серебренников И.М., 1962). По данным И.В. Борисевича, К.Н. Малахова (2005), среди обратившихся в косметологическое учреждение за помощью в возрасте до 20 лет, 46,2% имели рубцовые изменения на лице. Молодые люди очень переживают из-за образовавшегося дефекта. Это приводит к снижению социальной адаптации, как в личном, так и в профессиональном плане, изменениям в психоэмоциональной сфере, вплоть до суицида (Шамов С.А., 1982). По клинико-морфологической классификации (Ахтямов С.Н., Бутов Ю.С., 2003) выделяют следующие типы рубцов: атрофические, нормотрофические, гипертрофические и келоидные. Среди пациентов, обратившихся с проблемой лечения рубцов, нормо- и атрофические варианты наблюдаются наиболее часто, в 60,3% случаев (Озерская О.С., 2002). По данным Н.А. Данилина (2002), причиной нормо- и атрофических рубцов являются: последствия угревой болезни (65%), травмы (25%), швы после хирургических операций (7%), последствия инъекций кортикостероидов (3%). В настоящее время предлагается большое количество методов лечения рубцов, не нуждающихся в хирургической коррекции. Для атрофических рубцов – это различные варианты пилингов (Ахтямов С.Н., Бутов Ю.С., 2003; Забненкова О.В., 2005; Glogau R., 1995; Rubin M.K., 1995; Fitzpatrick R.E., 1996), микрокристаллическая дермабразия (Короткий Н.Г. с соавт., 2001; Кадонцева Н., 2005; Tsai R.U. et al, 1995; Koch R.J., 2001), механическая дермабразия (Конченко Л.В., 1993; Коновалова Н.Н., 1999; Фисенко Г., 2003; Оrentreich N., 1995), лазерная дермабразия (Данилин Н.А., Доронин В.А., 2002; Белоусов А.Е., 2005; Lowe N.J. et al., 1995; Alster T.S., 1997; Goldman L., 1998). Все эти виды шлифовок приводят к некоторой сглаженности рубцов, но не решают проблемы полностью. Несмотря на совершенствование методов лечения, результаты полностью не удовлетворяют ни врачей, ни больных. Это требует дальнейшего изучения, разработки и совершенствования методов лечения рубцов кожи. Новые подходы к решению проблемы наметились с развитием биотехнологий получения клеточных культур кератиноцитов и фибробластов (Саркисов Д.С. с соавт., 1995; Туманов В.П., с соавт., 1996; Алексеев А.А., Яшин А.Ю., 1996; Алейник Д.Я. с соавт., 2000; Васильев А.В. с соавт., 2001; Smola H. еt al., 1993; Harris I.R. et al., 1995). Они позволяют влиять на морфологию рубцовой ткани, приближая ее к структуре нормальной дермы. В связи с вышеизложенным, разработка новых методов лечения рубцов кожи является весьма актуальной. ^ Повысить эффективность лечения больных с атрофическими рубцами кожи с использованием культуры дермальных фибробластов. Задачи исследования.
^ Впервые разработана модель формирования атрофических рубцов на коже лабораторных животных. Изучены с помощью гистоморфологических методов, клеточный состав и структурные особенности рубцов данного типа, проведена оценка эффективности и обоснованности трансплантации дермальных фибробластов в рубцовую ткань у экспериментальных животных. Впервые разработан и внедрен в клиническую практику способ лечения больных с атрофическими рубцами кожи с применением культуры аутологичных дермальных фибробластов. ^ Созданная в эксперименте модель атрофического рубца кожного покрова может быть использована при оценке эффективности различных методов местного лечения. Разработанный и внедренный в клиническую практику метод лечения атрофических рубцов кожи с применением культуры дермальных аутофибробластов на 66,7% эффективнее по сравнению с традиционным лечением. Разработанная методика является безопасной, т.к. не были выявлены осложнения на введение клеточной культуры. Достигнутые клинические результаты позволяют повысить качество жизни пациентов. ^
^ Модель создания атрофического рубца кожи внедрена в Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Росздрава». Разработанный способ лечения атрофических рубцов используется в терапии больных с данной патологией в клинике кожных и венерических болезней ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Росздрава», ООО «Институт Красоты» (Самара), ГУЗ Самарский областной кожно-венерологический диспансер. ^ . Основные положения работы доложены на 1-м Международном форуме «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2005), на 2-м Международном форуме «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2006), научно-практической конференции «Медицинская косметология» (Самара, 2006), на Поволжском форуме «Восстановительная медицина, курортология и физиотерапия» (Самара, 2006), на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Москва, 2007). Диссертация апробирована на совместном заседании кафедры дерматовенерологии, кафедры общей хирургии с курсом оперативной хирургии, кафедры патологической анатомии, Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет Росздрава» (июнь 2007). Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в т.ч. 2 статьи в реферируемом журнале ВАК. ^ Диссертация изложена на 188 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2-х глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 408 источников, в том числе 207 отечественных и 201 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 10 таблицами, 48 рисунками. ^ Характеристика объектов, материала и методов исследования Диссертационная работа основана на результатах экспериментально-клинического исследования, направленного на изучение эффективности и безопасности лечения атрофического рубца кожи под воздействием клеточных культур фибробластов. Экспериментальный раздел работы выполнен на базе Центральной научно-исследовательной лаборатории СамГМУ (директор – профессор, д.м.н. Л.Т. Волова) в рамках научной тематики ЦНИЛ: «Регуляция регенераторных процессов в опорных и покровных тканях организма за счет дифференцированного применения аллогенных тканей, культуры клеток, тканевых компонентов, лекарственных и немедикаментозных факторов воздействия». ЦНИЛ СамГМУ имеет лицензию (№ 9901002104 от 09.02.06), позволяющую в соответствии с Российским законодательством проводить работы с культурами нестволовых клеток. Экспериментальные исследования проведены на 57-и белых лабораторных крысах обоего пола весом до 300 г. Все крысы проходили карантин в виварии, где они содержались в индивидуальных клетках, в закрытом, теплом помещении. Пищевой режим обычный. Для оценки влияния культуры аутологичных и аллогенных фибробластов на лечение рубцового дефекта кожи всем 57-и крысам, участвующим в эксперименте были искусственно созданы модели кожных рубцов. Модель рубца получали следующим образом. Животное обезболивали с помощью эфирного наркоза, фиксировали к операционному столу. Шерсть удаляли методом химической депиляции. Операционное поле обрабатывали 70% этиловым спиртом, затем проводили линейное рассечение кожи с подкожно-жировой клетчаткой до фасции длиной 5 см, в области спины. К краям раны (для предотвращения контракции) подшивали прямоугольную рамку из индифферентного синтетического материала, которую удаляли на 7-е сутки после начала эксперимента. У всех крыс рану закрывали стерильными салфетками. Через 28 дней рана заживала с образованием атрофического рубца. Все животные, участвовавшие в эксперименте, были разделены на 3 серии. В первой серии (18 крыс) животными внутрикожным введением трансплантировали культуру аутологичных фибробластов; во второй серии (18 крыс) – в область рубца вводилась культура аллогенных фибробластов; в третьей серии (21 крыса) – рубцы не лечились и служили контролем. Трансплантация клеточной культуры проводилась 3-х кратно с интервалом 2 недели, начиная с 28-х суток после операции. В течение всего срока эксперимента животных ежедневно осматривали, отмечали их общее состояние, активность, характер шерстяного покрова, состояние раны и рубца. Животные выводились из эксперимента на 7-е сутки после 1-й, 2-й, 3-й трансплантаций и через 2, 4, 8 недель после окончания лечения. Во все указанные сроки забирали материал для цитоморфологического исследования (таб.1). Морфологический анализ осуществляли в области рубцового дефекта с прилежащей кожей. Серийные парафиновые срезы толщиной 7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону, орсеином по Унна-Тенцеру для выявления эластических волокн. По всем сериям и срокам эксперимента было изготовлено и изучено – 564 гистологических препаратов. Гистологические срезы изучали, анализировали и фотографировали с помощью системы анализа изображений на базе Pentium 4, состоящей из светового микроскопа Olympus и цифрофой фотокамеры Olympus С 310. Для объективизации морфологической картины работа была дополнена проведением морфометрии гистологических срезов. Измеряли толщину эпидермиса, дермы и гиподермы, считали суммарную плотность волосяных фолликулов в дерме с использованием аналитической системы визуализации «Видео Тест – Морфо» («ВТ – М» - Россия, г. Санкт – Петербург; рег. уд. МЗ РФ № 29/20010702/6102 – 04). Таблица 1 Характеристика серий эксперимента на лабораторных животных и сроки взятия биопсии
Первичную культуру фибробластов получали по общепринятой методике первичных эксплантов (Адамс Р., 1983; Гринберг К.Н. с соавт., 1988; Парамонов Б.А. с соавт., 2000). Весь цифровой материал исследований на лабораторных животных обработан с помощью метода вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента. Значимость отличий средних арифметических опыта и контроля оценивалась при постоянно заданном уровне значимости (р < 0,05). Клинический раздел работы основан на результатах лечения 61 пациента с атрофическими рубцами постакне, проходившим амбулаторное лечение в косметологическом отделении ООО «Институт Красоты» (Самара). В клинической практике определена эффективность интрадермальной трансплантации культуры аутологичных фибробластов по сравнению с традиционным лечением методом химического пилинга на основе 15% трихлоруксусной кислоты, «модифицированной». ^ пациентов в группы сравнения были: атрофические рубцы постакне, наличие информированного добровольного согласия пациента. Критериями исключения пациентов из основной группы являлись: тяжелые хронические заболевания, острые и хронические заболевания кожи, наличие злокачественного новообразования, беременность и лактация, курение и нежелание отказа от него на период лечения. ^ пациентов из основной группы являлись: требование пациента об отказе от исследования на любом его этапе, заключение врача о неблагоприятном влиянии проводимой терапии на пациента, индивидуальная непереносимость. При проведении исследования проводилась оценка безопасности трансплантации культуры аутологичных фибробластов. Оценивался вид реакции на введение клеточной культуры: фармацевтическая (за счет неклеточных компонентов препарата), фармакодинамическая (прямое действие клеток), токсическая воспалительная реакция кожи, острая аллергическая, отсроченная аллергическая. ^ оценивалась как: легкая, умеренная, тяжелая, очень тяжелая. Определялась степень достоверности побочной реакции клеточного материала по следующей градации: прямая степень достоверности, вероятная степень достоверности, возможная степень достоверности, сомнительная степень достоверности, отсутствие связи побочной реакции с введением препарата, серьезная побочная реакция, представляющая угрозу жизни пациента SAE! Для клинико-диагностической оценки эффективности проводимой терапии использовались следующие критерии:
Оценку результатов проводили после окончания лечения, а также 1, 3 и 6 месяцев спустя. ^ и выраженность возможных нежелательных реакций на клеточный материал (побочных эффектов) при лечении оценивалась по бальной шкале: - 0 баллов (побочных действий нет); - 1 балл (побочное действие есть, субъективно не ощущается, регистрируется врачом, не опасно и не требует отмены введения культуры клеток); - 2 балла (побочное действие есть, субъективно ощущается, регистрируется врачом, не опасно и требует отмены введения культуры клеток); - 3 балла (побочное действие есть, субъективно ощущается, регистрируется врачом и требует лечения). При лечении больных применяли культуру аутологичных фибробластов кожи, использование которых одобрено Этическим комитетом на заседании № 34 от 21.09.05 и Ученым советом ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» от 29.10.2004 (протокол №3). Клеточную культуру дермальных аутофибробластов получали по стандартной технологии в лаборатории культур клеток ЦНИЛ СамГМУ. Перед выдачей клеточной культуры проводили контроль контаминации на ВИЧ, сифилис, вирусные гепатиты В и С, микоплазму, цитомегаловирус, герпес методом ПЦР и ИФА. На каждый клеточный материал выдавался паспорт. Для трансплантации использовали культуру 4-10 пассажей в виде суспензии, в физрастворе. В группы сравнения вошел 61 пациент с атрофическими рубцами постакне с локализацией на лице. В основной группе было 30 человек, группу сравнения составил 31 больной, с сопоставимой патологией. Все пациенты имели множественные депрессированные рубцы в виде ямок, диаметром от 1,5 до 5-6 мм. Местами они сливались с образованием рубцового дефекта с фестончатыми краями. По степени зрелости выделяли «молодые» рубцы, со сроком существования от 3 до 12 месяцев и «старые» или «окончательно зрелые», со сроком существования 1 год и более. По степени зрелости рубцы распределились таким образом. В основной группе 16 человек (53,3 %) имели «молодые» рубцы, а 14 человек (46,7%) – «старые» рубцы. В группе сравнения 15 человек (48,4%) имели «молодые» рубцы, а 16 человек (51,6%) – «старые» рубцы (таб. 2). Таблица 2 Распределение пациентов в группах наблюдения
У всех пациентов в обеих группах сравнения рубцы локализовались на лице и являлись эстетически неприемлемыми. Субъективные ощущения в области рубцов и признаки воспалительного процесса на лице отсутствовали. Проанализировав известные на сегодня методы лечения атрофических рубцов кожи, мы выбрали неинвазивный, современный, не дающий серьезных осложнений метод – химический пилинг на основе 15% трихлоруксусной кислоты (ТСА), «модифицированной». По глубине проникновения пилинг был срединным. Пациентам из группы сравнения (31 человек), с целью выравнивания рельефа кожи в области рубцов, проводили местное лечение по предложенному способу. Пилинг проводился 4-х кратно с интервалом в 2 недели, затем через 6 недель курс повторяли. Лечение в данной группе на этом было закончено. Пациентам основной группы (30 человек) с целью улучшения внешнего вида рубцов проводили трансплантацию аутологичных фибробластов в рубцовую зону. В условиях асептики, без предварительной анестезии клеточный препарат вводился в область рубцов интрадермально, инъекционным способом, с помощью шприца. Использовалась папульная техника введения, по методике мезотерапии. Курс лечения состоял из 3-х процедур с интервалом введения 1 месяц. Общее лечение в обеих группах было одинаковым и заключалось в назначении комплекса витаминов и микроэлементов необходимых для синтеза коллагена и нормальной регенерации кожи: К, Mg, Zn, Cu, Se, витамины: А, Е, С. Препараты назначались per os в период всего лечения рубцов. Для объективизации процесса лечения и оценки состояния рубцовой ткани применялся метод двухмерного ультразвукового сканирования кожи. При ультразвуковом дермосканировании кожи в области рубцов постакне отмечалось истончение эпидермиса, в дермальном слое визуализировались гипоэхогенные участки. ^ Результаты экспериментальных исследований При морфологическом исследовании рубцов кожи лабораторных крыс до и после трансплантации дермальных фибробластов были выявлены следующие изменения. Экспериментальный рубец на 28-е сутки имеет линейную форму, широкий, располагается несколько ниже уровня нормальной кожи, розового цвета, не спаян с подлежащими тканями. В этой зоне волосяной покров отсутствует. При исследовании гистологических препаратов мы отметили сглаженность и истончение эпидермиса в зоне экспериментального рубца:19,25 ± 1,30 мкм; при норме 40,83±2,35 мкм (р<0,05). В нем удается четко дифференцировать только базальный и роговой слои. При окраске орсеином наблюдаем нечетко контурирующую базальную мембрану, резкую сглаженность и уплощение сосочков дермы. При окраске пикрофуксином по ван Гизон видно, что коллагеновые волокна дермы тоньше, чем в норме. Они располагаются параллельно базальной мембране в прилежащих к рубцу областях, а в центре рубца как перпендикулярно базальной мембране, так и неупорядоченно, хаотично. Дерма в области рубца отечна, что выражается увеличением ее толщины: 1018,00±98,20 мкм; при норме 604,30±58,43 мкм (р<0,05) и наличием многочисленных полостей между волокнами и в интерстициальном пространстве. В самом рубце кожные дериваты отсутствуют. В сосочковом слое дермы отмечается интенсивная клеточная инфильтрация нейтрофилами, моноцитами и макрофагами. Подкожно-жировая клетчатка истончена и атрофична, ее толщина составляет 102,00±11,23 мкм; при норме – 558,40±42,53 мкм (р<0,05). В середине эксперимента, на 63-и сутки рубец без лечения макроскопически имеет линейную форму, располагается ниже уровня нормальной кожи, достаточно широкий, розового цвета, не спаян с подлежащими тканями. Волосяной покров на самом рубце - отсутствует. Микроскопически сохраняется истончение эпидермиса (23,81±2,01 мкм; р< 0,05), по-прежнему наиболее выражены базальный и роговой слои. Сосочки дермы сглажены. В дерме клеточная инфильтрация, представленная как макрофагами, так и молодыми фибробластами, выражена меньше и в целом толщина дермы снижается и составляет 813,00±81,50 мкм (р<0,05). Отмечается более активное по сравнению с предыдущим сроком формирование кожных придатков – идет образование волосяных луковиц с зачатками волос, но этот процесс представлен в основном на ранних стадиях. Общая плотность волосяных фолликулов снижена и составляет 1,61±0,32%; при норме 3,31±0,31% (р<0,05). Молодые коллагеновые волокна в области послеоперационного рубца неупорядочены, расположены хаотично. Кровеносных сосудов в дерме и гиподерме обычное количество, их просвет не расширен. Подкожно-жировая клетчатка по-прежнему истончена и атрофична (105,70±9,70 мкм; р<0,05). Рубец на 63-и сутки, после введения аутофибробластов (7-е сутки после 3-ей трансплантации). Макроскопически имеет линейную форму, располагается на уровне здоровой кожи, имеет вид тонкой линии, розового цвета, не спаян с подлежащими тканями. Микроскопически на данном сроке лечения отмечается бурная регенерация всех слоев кожи. Характерно восстановление толщины всех слоев эпидермиса и возрастание его общей толщины до нормы 39,15±2,69 мкм. Толщина дермы снижается за счет полного исчезновения явлений посттравматического отёка и составляет 932,60±98,00 мкм (р<0,05). Архитектоника сосочков дермы восстанавливается, они незначительно вдаются в базальную мембрану, благодаря чему её рельеф становится извилистым. В сосочковом слое в зоне рубца определяются очаги повышенной клеточности за счет скопления молодых фибробластов. Во всех слоях дермы видно большое количество новообразованных кожных дериватов на разных стадиях развития – характерен активный рост формирующихся волос к поверхности кожи. Их плотность возрастает до 21,16 ± 1,21% (р< 0,05), что подтверждает мощное стимулирующее влияние имплантированных фибробластов на регенерацию волосяных фолликулов. Молодые коллагеновые волокна имеют несколько неупорядоченное направление в зоне регенерата, и упорядоченное – в окружающих регенерат зонах. Идет активная регенерация мышечных волокон с восстановлением мышечного слоя. В подкожно-жировой клетчатке большое количество активно пролиферирующих фибробластов и молодых коллагеновых волокон. Толщина гиподермы снижена и составляет 251,18±21,69 мкм (р< 0,05). Кровеносных сосудов умеренное количество, их просвет не расширен. Рубец на 63-и сутки, после введения аллофибробластов (7-е сутки после 3-ей трансплантации). Макроскопически имеет линейную форму, располагается ниже уровня здоровой кожи, имеет вид тонкой линии, розового цвета, не спаян с подлежащими тканями. На гистологических микропрепаратах также отмечается активная регенерация всех слоев кожи. Эпидермис имеет меньшую толщину, чем в норме (29,99±2,8 мкм; р<0,05), но количество его слоёв восстанавливается. Рельеф базальной мембраны начинает восстанавливаться за счет формирования дермальных сосочков, но они по-прежнему сглажены по сравнению с нормой. Толщина дермы приближается к интактной и составляет 694,00±66,08 мкм. Общая морфологическая картина схожа с регенерацией леченного рубца того же срока с введением аутофибробластов, но формирующиеся придатки кожи находятся в основном на более ранних сроках развития – в зоне регенерата нет волос, достигших поверхности кожи. Однако плотность волосяных фолликулов также значительно выше нормы и составляет 15,75±1,42% (р<0,05). Регенерация мышечных и коллагеновых волокон идет аналогично лечению с использованием аутофиброластов. Толщина слоя подкожно-жировой клетчатки возрастает, но не достигает нормы (245,00±18,22 мкм; р<0,05). В конце эксперимента, на 102-е сутки рубец без лечения имеет вид широкой линии, лежащей на уровне поверхности кожи, белого цвета, незначительно отличающегося от цвета окружающей нормальной кожи. Отмечается отсутствие волосяного покрова на самом рубце. В эпидермисе четко визуализируются все четыре слоя, но число клеточных рядов в них по-прежнему уменьшено, поэтому общая толщина эпидермиса остается ниже нормы и составляет 30,84±1,47 мкм (р<0,05). Регенерация коллагеновых и мышечных волокон продолжается в виде процессов перестройки направления их хода и пространственной ориентировки. Тем не менее, в зоне рубца по-прежнему многие коллагеновые волокна так и не достигают хода, параллельного поверхности кожи, и располагаются неупорядоченно, хаотично. Общая толщина дермы снижается по сравнению с предыдущими сроками и составляет 787,00±74,80 мкм (р<0,05). Дериваты кожи на данном сроке продолжают свое развитие и созревание – плотность волосяных фолликулов сохраняется ниже нормы и составляет 1,82 ± 0,50 % (р<0,05). Выявляются также единичные случаи волосяных луковиц и желез на ранних стадиях развития, что соответствует уже не репаративной, а текущей физиологической регенерации. Подкожно-жировая клетчатка слабо выражена, ее толщина составляет 201,10±18,05 мкм (р<0,05). Мышечные волокна нормальных размеров и структуры. Отмечается разрастание соединительно-тканных прослоек, в которых встречающиеся в небольшом количестве сосуды имеют нормальный просвет. Рубец на 102-е сутки, после введения аутофибробластов (56-е сутки после 3-ей трансплантации). Рубец имеет вид очень тонкой, едва различимой линии, находящейся на одном уровне и имеющей одинаковый цвет с окружающей интактной кожей. Отмечается полное восстановление волосяного покрова в месте операционного вмешательства. Микроскопическая картина кожи в зоне рубца приближается к норме. В области рубца выражены все слои эпидермиса, его толщина соответствует нормальным значениям и составляет 39,37±3,36 мкм. Толщина дермы по-прежнему превышает норму за счет активно идущих регенераторных процессов и формирования новых клеточных элементов и равна 943,00±97,50 мкм (р<0,05). Сосочки дермы хорошо выражены, вдаются в эпидермис. Базальная мембрана по структуре соответствует интактной. В дерме полностью завершается созревание волосяных фолликулов и сальных желез, волосы выходят на поверхность кожи. Общая плотность волосяных фолликулов по-прежнему превышает норму и составляет 22,85±1,81% (р<0,05), что говорит о сохраняющемся высоком уровне регенераторных процессов. Коллагеновые волокна – зрелые, извитые, нормальной толщины, имеют упорядоченное направление и ход. Кровеносные сосуды имеют размеры и форму, соответствующие интактным, просвет не расширен, их количество идентично здоровой коже. Морфологическая структура подкожно-жировой клетчатки и адипоцитов соответствует норме, но ее толщина снижена и составляет 281,30±25,57 мкм (р<0,05). Характерным является продолжение регенераторных процессов, в которых активная репаративная регенерация сосуществует с не менее активной физиологической, что подтверждается наличием наряду со зрелыми кожными дериватами большого количества молодых, формирующихся придатков кожи. Рубец на 102-е сутки, после введения аллофибробластов (56-е сутки после 3-ей трансплантации). Рубец имеет вид тонкой, но более заметной (чем при введении аутофибробластов) линии, находящейся на одном уровне и имеющей одинаковый цвет с окружающей интактной кожей. Наблюдается полное восстановление волосяного покрова в месте операционного вмешательства. На микропрепаратах динамика морфологических изменений во многом сходна с рубцом после трансплантации культуры аутофибробластов. Результаты лечения путем введения аллофибробластов менее выражены, чем при введении аутофибробластов, но лучше, чем в контрольной серии без лечения. Микроскопически это проявляется восстановлением толщины эпидермиса до нормы - 37,92±3,05 мкм. Толщина дермы выше, чем в норме и составляет – 985,60±68,27 мкм (р<0,05). Общая плотность волосяных фолликулов превышает норму и равна 16,28 ± 0,78 % (р<0,05), что подтверждает сохранение активного новообразования и регенерации волосяных фолликулов с их дальнейшим созреванием и развитием. Коллагеновые волокна – зрелые, извитые, нормальной толщины, имеют упорядоченное направление и ход. Количество кровеносных сосудов, их размеры и форма идентично здоровой коже. Морфологическая структура подкожно-жировой клетчатки и адипоцитов соответствует норме. Толщина гиподермы снижена и составляет 237,87 ± 10,23 мкм (р<0,05). Таким образом, полученные нами результаты показали, что после лечения кожных рубцов путем введения фибробластов: 1. Структура зоны рубца приближается к структуре нормальной кожи за счет активных процессов регенерации. 2. К концу эксперимента в обеих сериях опытов с введением фибробластов отмечается полное восстановление толщины эпидермиса (39,37 ± 3,36 мкм при введении аутофибробластов и 37,92 ± 3,05 мкм при введении аллофибробластов; при норме 40, 83 ± 2,35 мкм), в то время как в рубце без лечения этот показатель остается ниже нормы (30,84 ± 1,47 мкм; р<0,05). 3. В обеих опытных сериях с введением фибробластов на всех сроках наблюдается активное формирование кожных дериватов - волосяных фолликулов и сальных желез с полным восстановлением волосяного покрова. Плотность волосяных фолликулов к 102-м суткам наблюдения составляет: 22,85 ± 1,81% при введении аутофибробластов, 16,28 ± 0,78% при введении аллофибробластов, при норме 3,31 ± 0,31%, в то время как в рубце без лечения этот показатель остается ниже нормы - 1,82 ± 0,50 % (р<0,05). 4. При введении аутофибробластов все регенераторные процессы более выражены, чем при введении аллофибробластов. Это подтверждается более ранним восстановлением нормальных величин толщины эпидермиса (на 63-и сутки по сравнению со 102-ми сутками); большей плотностью (на 29%) волосяных фолликулов к концу эксперимента; более полноценным восстановлением дермы в зоне рубца с формированием сосочкового и сетчатого слоев. Учитывая результаты экспериментального исследования, биоэтические и юридические аспекты, для проведения клинического исследования мы остановились на применении культуры аутологичных фибробластов. ^ В качестве традиционного способа выравнивания рельефа атрофических рубцов кожи мы применили методику срединного пилинга на основе 15% ТСА (трихлоруксусной кислоты), «модифицированной». С этой целью всем пациентам из группы сравнения (31 человек) было проведено 2 курса срединного пилинга на основе 15% ТСА, «модифицированной» с интервалом в 6 недель. В процессе проведения одного курса пилинга (4 процедуры с интервалом в 14 дней) были получены следующие результаты: - отличный результат – 0 пациентов (0%), - хороший результат – 0 пациентов (0%), - удовлетворительный результат - 8 пациентов (25,8%), - неудовлетворительный результат – 23 пациента (74,2%). Затем был проведен еще один курс пилинга. Повторный курс повысил результаты лечения: - отличный результат – 0 пациентов (0%) - хороший результат – 0 пациентов (0%), - удовлетворительный результат - 16 пациентов (51,6%), - неудовлетворительный результат – 15 пациентов (48,4%). Таким образом, у 16 пациентов (51,6%) из группы сравнения, после 2-х курсов пилинга был достигнут удовлетворительный результат. Рубцы приняли более сглаженный вид и несколько уплотнились. В таком виде рубцы стали доступными для косметического камуфляжа. У 48,4% пациентов рубцовые изменения остались без клинической динамики (рис.1).  Рис. 1. Сравнительные результаты эффективности различных вариантов лечения. Пациентам основной группы (30 человек) была введена клеточная культура. В условиях асептики, без предварительной анестезии клеточный препарат вводился интрадермально, инъекционным способом. Использовалась папульная техника введения, по методике мезотерапии. Количество клеток в препарате варьировалось в зависимости от площади рубцовой поверхности, и составляло в среднем от 1 до 10 млн. Объем вводимого препарата составлял от 1 до 5 мл. Курс состоял из 3-х процедур с интервалом введения 1 месяц. Через 6 месяцев после проведенного лечения, в основной группе были отмечены следующие результаты (рис.1): - отличный результат – 12 пациентов (40%), - хороший результат – 8 пациентов (26,7%), - удовлетворительный результат - 10 пациентов (33,3%), - неудовлетворительный результат – 0 пациентов (0%). Таким образом, трансплантация аутофибробластов значительно повысила результаты лечения в основной группе. Количество «отличных» и «хороших» результатов увеличилось с 0% до 40% и 26,7% соответственно, количество неудовлетворительных результатов уменьшилось с 48,4% до 0% (рис. 1). У 16-и пациентов основной группы имеющих «молодые» рубцы, клиническая эффективность проводимой терапии начинала проявляться через 1 месяц после начатого лечения и постепенно нарастала, достигая стойкого клинического эффекта к концу 3-6 месяца. При «отличном» результате это выражалось в выравнивании дна рубцов практически с уровнем здоровой кожи, при «хорошем» - в выравнивании «минус-ткани» на 50% и более. Цвет кожи, ее эластичность, тургор в области лечения рубцов был сопоставим с окружающей здоровой кожей. Этот клинический эффект наблюдался на 90-95 % пролеченной поверхности рубцов. При сравнении результатов лечения у пациентов основной группы с «молодыми» рубцами (16 человек) с группой сравнения результаты оказались еще выше. «Отличный» результат был у 12-и пациентов (75%) этой подгруппы, «хороший» результат – у 4-х пациентов (25%), (рис.2).  Рис. 2. Сравнительные результаты эффективности различных вариантов лечения. У пациентов со «старыми» рубцами (14 человек) положительная динамика развивалась медленно. Первые изменения были заметны лишь через 3 месяца после окончания лечения, достигая клинического эффекта к концу 6 месяца. Это выражалось в уплощении рубцов, в основном за счет эффекта «лифтинга» здоровой кожи. Эффективность проведенного лечения оценивалась через 6 месяцев после окончания лечения, при этом отмечались следующие результаты: - отличный результат – 0 пациентов (0%). - хороший результат – 4 пациента (28,6 %), - удовлетворительный результат - 10 пациентов (71,4%), - неудовлетворительный результат – 0 пациентов (0%). Прослеживалась взаимосвязь между степенью улучшения внешнего вида рубца и сроком его существования. Чем меньше, срок существования рубца («молодой рубец», до 1 года), тем лучше достигались результаты. По результатам ультразвукового дермосканирования после проведения курса трансплантации аутофибробластов толщина дермы и эпидермиса увеличилась по сравнению с исходным состоянием. У пациентов с «молодыми» рубцами отмечено увеличение толщины эпидермиса, усиление плотности дермы и исчезновение гипоэхогенных участков в области рубцов. У пациентов со «старыми» рубцами отмечено усиление плотности дермы в области здоровой кожи, с чем и связан «лифтинговый» эффект и опосредованное разглаживание рубцов. Таким образом, фибробласты восполняя клеточную популяцию дермы способствовали синтезу коллагена, эластина, гликозаминогликанов, новообразованию сосудов и улучшали трофику рубцовой ткани и прилегающих участков кожи. У пациентов группы сравнения (31 человек), результаты лечения после проведения курса пилинга в течение всего срока наблюдения не изменились. Срок наблюдения за пациентами составлял от 1 года до 1,5 лет. В рамках данного исследования мы проводили оценку безопасности использования клеточной культуры и риск возникновения осложнений. Оценку безопасности применения проводили в день первого введения, через 14 суток, 1, 3, 6 и 12 месяцев. Мы не отметили в процессе исследования фармацевтической (за счет неклеточных компонентов препарата), фармакодинамической (прямое действие клеток), токсической воспалительной реакции кожи, острой и отсроченной аллергических реакций. У всех 30 пациентов (100%) на всех сроках наблюдения, не было отмечено появления побочного действия от введения клеточной культуры как местного, так и системного характера (0 баллов). Субъективно пациенты ничего не ощущали, жалоб не предъявляли. Зуд и высыпания отсутствовали. Повышение температуры не отмечалось. Следы от инъекций проходили самостоятельно в течение 1,5-2 часов после трансплантации. Данные наблюдения подтверждают безопасность применения клеточного препарата, содержащего дермальные аутофибробласты человека. Эти сравнительные данные свидетельствуют о том, что предложенный способ лечения атрофических рубцов, позволил значительно (на 66,7%) улучшить результаты терапии по сравнению с традиционным лечением. Максимальный эффект от данного способа лечения мы наблюдали у пациентов с «молодыми» рубцами, при трансплантации культуры аутофибробластов в область «старых» рубцов мы выявили её значительно меньшую эффективность. Выводы
Наиболее эффективно (на 71,4%) проведение интрадермальной трансплантации культуры аутологичных фибробластов у больных с «молодыми» атрофическими рубцами со сроком существования до 1-го года.
Практические рекомендации
^
|
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям