Иммунометаболическое и гепатопротекторное действие гликозаминогликанов, гликозидаз и витаминов при кровопотере 14. 00. 25 фармакология, клиническая фармакология
|
|
Скачать 0.72 Mb.
|
|
На правах рукописи Рыбников Владимир Николаевич ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКОЕ И ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ, ГЛИКОЗИДАЗ И ВИТАМИНОВ ПРИ КРОВОПОТЕРЕ 14.00.25 – фармакология, клиническая фармакология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Курск – 2009 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». ^ доктор медицинских наук, профессор Лазарев Алексей Иванович доктор медицинских наук, профессор Бровкина Инна Леонидовна ^ доктор медицинских наук, профессор Муляр Александр Георгиевич доктор медицинских наук, профессор Утешев Даниил Борисович доктор медицинских наук, профессор Кинзирский Александр Сергеевич ^ ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ» Защита состоится «___» ___________ 2009 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.039.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (305041, г. Курск, ул. К.Маркса, 3). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава. Автореферат разослан «_____» _________________ 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета Пашин Е.Н. ^ Различные формы нарушения гомеостаза характеризуются иммуносупрессией, основными причинами развития которой является усиление генерации активных метаболитов кислорода, снижение антиокислительного потенциала тканей, повышение интенсивности процессов перекисного окисления липидов мембран, снижение энергообеспечения клеток, нарушение структуры и функции иммуноцитов (Прокопенко Л.Г. и др., 1999; Новицкий В.В. и др., 2003). Наряду с принципиально общими механизмами развития метаболической иммуносупрессии при состояниях, характеризующихся выраженным стрессорным компонентом (алиментарные нагрузки, голодание, охлаждение, физические нагрузки), имеют место характерные для них особенности, обусловленные природой индуцирующего агента и первичным звеном его воздействия на клетки и организм в целом (Прокопенко Л.Г., Бровкина И.Л., 2003). Общность направленности и в значительной степени выраженность иммунометаболических сдвигов, наблюдающиеся при различных формах стресса и патологии, сочетается с неодинаковой эффективностью корригирующего действия различных фармакологических средств. Потеря значительного количества крови, как правило, сочетается с травматизацией тканей, а иногда с действием наркотизирующих веществ. Такая форма стресса является одной из наиболее частых в условиях чрезвычайных ситуациий, а также хирургической и акушерско-гинекологической практики. Иммунометаболические сдвиги, возникающие после острых кровопотерь, изучены недостаточно. Известно, что умеренная острая кровопотеря приводит к снижению антиоксидантного потенциала гепатоцитов, усилению перекисного окисления и нарушению энергетического обмена в клетках, повышению проницаемости клеточных мембран гепатоцитов (Матвеев С.Б. и др., 1991,1999). Кровопотеря сопровождается увеличением числа ретикулоцитов и снижением количества зрелых эритроцитов в периферической крови, изменением деформируемости этих клеток, снижением числа тромбоцитов, повышением их адгезивных и агрегативных свойств (Соловьев С.В., 1989). Эритроциты и тромбоциты оказывают существенное влияние на функциональную активность иммуноцитов (Прокопенко Л.Г., Сипливая Л.Е, 1992). Значительные кровопотери, имеющие место при травмах и хирургических вмешательствах, сопровождаются нарушением иммунологических функций (Прокопенко Л.Г. и др., 1993), механизм которого изучен недостаточно, а соответственно этому мало разработаны способы иммунореабилитации после острых кровопотерь. Многие фитопрепараты обладают иммуномодулирующими свойствами, обусловленными наличием в них каротиноидов, сапонинов, флавоноидов и, особенно, полисахаридных комплексов (Хаитов P.M. и др., 1995; Du J.-Y. et al., 1996). Гликозаминогликаны различного видового происхождения корригируют развитие различных форм иммунного ответа при токсических поражениях печени, интенсивных физических нагрузках, алиментарных нарушениях гомеостаза, остром тепловом и холодовом стрессах (Конопля Е.Н., 1997; Ермакова А.Е., 1995; Прокопенко Л.Г. и др. 1999; Байбурин Ф.Я. и др., 2000). В составе природных фитопрепаратов содержатся ГАГ, которые могут взаимодействовать с другими соединениями, обладающими иммуномодулирующими свойствами. В то же время, механизмы взаимодействия ГАГ с жиро- и водорастворимыми витаминами мало изучены, что представляет большой научный и практический интерес. Цель – выявление иммунометаболических и гепатопротекторных эритроцитзависимых эффектов взаимодействия гликозаминогликанов, гликозидаз, протеаз и витаминов при острой кровопотере. Задачи. 1. Изучение иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозаминогликанов растительного происхождения и жирорастворимых витаминов при кровопотере. 2. Выявление иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозаминогликанов растительного происхождения и водорастворимых витаминов после кровопотери. 3. Установление иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозаминогликанов животного происхождения и витаминов при кровопотере. 4. Изучение иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозидаз и витаминов после кровопотери. 5. Изучение иммунометаболических эффектов взаимодействия витаминов и продуктов фрагментации гликозаминогликанов при кровопотере. 6. Выяснение роли эритроцитов в реализации иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозаминогликанов, гликозидаз и витаминов после кровопотери. 7. Выявление гепатопротекторных эффектов взаимодействия гликозаминогликанов, гликозидаз и витаминов после кровопотери. 8. Изучение иммунометаболических эффектов совместного введения протеолитических ферментов и витаминов после кровопотери. ^ Острая кровопотеря вызывает развитие иммуносупрессии, в реализации которой принимают участие эритроциты. Гликозаминогликаны растительного происхождения (ГАГ-Р, ГАГ-Т, ГАГ-А) как иммунокорректоры при кровопотере более эффективны, чем гликозаминогликаны животного происхождения («Остенил», «Дона», АНК). Иммунометаболические эффекты гликозаминогликанов различного видового происхождения и гликозидаз («Лидазы» и «Лизоцима») при кровопотере усиливаются жиро- («Ретинола ацетат», «Токоферола ацетат», «Викасол», «Менадион») и водорастворимыми витаминами («Пиридоксина гидрохлорид», «Фолиевая кислота», «Цианкобаламин»). Наиболее эффективно при этом совместное применение гликозаминогликанов и гликозидаз с витаминами А, К, В6, и В12. В реализации иммунотропного действия совместного применения гликозидаз с витаминами А и К важную роль играют тяжелые эритроциты. Высокой иммунометаболической активностью обладает строма эритроцитов, включающая менадион и обработанная лизоцимом. Гликозаминогликаны или лизоцим, введенные с витаминами А или К, вызывают выраженный гепатопротекторный эффект. Иммунометаболические эффекты гликовитаминных взаимодействий опосредуются соединениями, выделяющимися различными популяциями спленоцитов. Протеазы по отдельности и в сочетании с жиро- или водорастворимыми витаминами в норме или после кровопотере оказывают разнонаправленные иммунометаболические эффекты. Папаин не влияет, а лизоцим или террилитин по отдельности, в большей степени в сочетании с витаминами, повышают ФМА нейтрофилов и иммунную реактивность крыс после кровопотери. Строма эритроцитов крыс, полученная после кровопотери реагирует на кобаламин повышением имуномодулирующей активности, индуцируемой лизоцимом и террилитином ^ Экспериментально обоснована перспектива изучения иммуномодулирующего, гепатопротекторного действия лизоцима в сочетании с витаминами А, К, В6 или B12 при острых кровопотерях в хирургической, травматологической и акушерско-гинекологической практике. Показана возможность получения высокоэффективных иммунокорректоров, гепатопротекторов на основе стромы эритроцитов, экстракорпорально взаимодействующих с менадионом и лизоцимом. Показана взаимосвязь фармакологических эффектов действия витаминов и гликолитических ферментов при кровопотере. Установлены стимулирующие эффекты террилитина и лизоцима, как по отдельности, так и в сочетании с витаминами на функциональную активность нейтрофилов и иммунологическую реактивность крыс после кровопотери. Обнаружены иммуномодулирующие свойства стромы эритроцитов, индуцированной лизоцимом или террилитином, полученной после кровопотери и обработанной кобаламином. Материалы диссертации включены в рабочие программы ряда кафедр Курского, Саратовского, Самарского и Российского государственных медицинских университетов, Нижегородской государственной медицинской академии, медицинских факультетов Белгородского и Орловского государственных университетов. ^ 1. Различие иммунометаболической активности гликозаминогликанов растительного и животного происхождения. 2. Эффективность иммунометаболического взаимодействия гликозаминогликанов и витаминов. 3. Особенности иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозидаз и витаминов. 4. Интегрирующая роль эритроцитов в реализации иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозидаз и витаминов. 5. Гепатопротекторные эффекты взаимодействия гликозаминогликанов, гликозидаз и витаминов. 6. Сочетанное применение террилитина или лизоцима с ретинола ацетатом или менадионом вызывает более выраженный иммуномодулирующий эффект, чем раздельное введение препаратов. ^ Основные положения диссертации представлены на конференциях Курского государственного медицинского университета: конференциях, посвященных 65 и 66-летию КГМУ «Актуальные проблемы медицинской науки и фармации» (Курск, 2000, 2001), IV съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2000), VII и X Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2000, 2003), Международной научно-практической конференции «Современные технологии фитонутрициологии в акушерстве, гинекологии и педиатрии» (Москва, 2003), V Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2007), на совместном заседании кафедр фармакологии, фармацевтической и токсикологической химии с курсом аналитической химии, биохимии, спортивной медицины и медицинской реабилитации, акушерства и гинекологии, акушерства и гинекологии ФПО, микробиологии и патофизиологии Курского государственного медицинского университета (2008). Публикации. По материалам диссертации в центральной и местной печати опубликовано 32 работы, в том числе в 10, рекомендуемых ВАК РФ, и 3 монографиях. В работах содержится весь объем информации, касающейся темы диссертации. ^ Диссертация изложена на 211 страницах машинописного текста, иллюстрирована 64 таблицами и 16 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (4 главы), описания методов исследования, изложения собственных результатов (11 глав), заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 280 отечественных и 111 иностранных источников. ^ Материалы и методы исследования. Исследования проведены на крысах Вистар массой 200-220 г. В опытах использовали животных, прошедших карантинный режим вивария Курского государственного медицинского университета и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом режиме. Для получения статистически достоверных результатов группы формировали из 8-10 животных. В контрольные и опытные группы входили животные одного возраста, полученные из питомника одновременно. Разброс в группах по исходной массе не превышал 10%. Все исследования проводили в одно и то же время суток с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986). Животных выводили из опыта декапитацией под эфирным наркозом. Для исследования от опытных животных получали сыворотку крови, эритроциты и нейтрофилы периферической крови, ткань селезенки, подколенные лимфатические узлы. Кровопотерю моделировали следующим образом: после предварительного обильного питья под общим обезболиванием выполняли венесекцию участка бедренной вены одной из задних лапок крысы, затем канюлировали мобилизованную вену и вводили 1000 МЕ гепарина, после чего из кровотока удаляли 21 мл/кг крови, что приблизительно соответствует 3,5-4 мл или кровопотере. Объем циркулирующеей жидкости восполняли аналогичным кровопотере объемом 0,15 М раствора хлорида натрия (Sapirstein L.A., 1960). Использованные фармакологические препараты и активные субстанции, производитель, способы, дозировки и кратность их введения представлены в табл. 1. Таблица 1. ^
Способ введения препаратов соответствовал рекомендациям, приведенным в пособии по фармакотерапии М.Д. Машковского «Лекарственные средства» и аннотациях по их использованию препаратов. Таблица 2. ^
О выраженности ГИО судили по количеству АОК и РОК в селезенке. Индукцию иммунного ответа проводили эритроцитами барана (Кэбот Е., Мейер М., 1968). Антиген вводили внутрибрюшинно в дозе 108 клеток на 1 кг массы тела. Число АОК к ЭБ устанавливали методом прямого, локального гемолиза в агаре (Мальберг К., Зигль Э., 1987). Количество иммунных РОК определяли по Х. Зауэр (1987). Для определения выраженности ГЗТ сенсибилизирующую дозу ЭБ (106) вводили внутрибрюшинно, спустя 4 суток в подушечку правой лапки вводили разрешающую дозу ЭБ (108), а в подушечку левой лапки вводили 0,15 М хлорид натрия. О выраженности ГЗТ судили по величинам разницы массы регионарных и контралатеральных лимфатических узлов спустя 24 ч. после введения разрешающей дозы (Федосеева В.Н. и др., 1993) (табл. 2). Функционально-метаболическую активность нейтрофилов оценивали по их способности поглощать инертные частицы латекса размером 1,5-2 мкм. Рассчитывали: фагоцитарный показатель, фагоцитарное число, индекс активности фагоцитоза (Медведев А.Н., Чаленко В.В., 1991). Кислородзависимую активность полиморфноядерных лейкоцитов оценивали по показателям НСТ-тестов спонтанного и стимулированного зимозаном и по общему резерву нейтрофилов – разнице между спонтанным и стимулированным тестами (Щербаков В.И., 1989) (табл. 2). Спленоциты получали из ткани селезенки, которую извлекали в асептических условиях и измельчали ножницами в чашках Петри. Полученную тканевую массу разбавляли средой 199, гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера-Уэлса и центрифугировали 10-15 минут при 200 g. Суспензию фильтровали через капроновые сетки и дважды отмывали средой 199 в течение 10 минут при 200 g. Эритроциты удаляли гемолитическим шоком (Бурмейстер Ю., 1979). Клетки селезенки фракционировали по способности прилипать к стеклу при различной температуре (Родионов С.В. и др., 1985). Прилипающие и не прилипающие клетки инкубировали в среде 199 (107 клеток на 1 мл среды), содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотики (пенициллин и стрептомицин), в течение 4-6 часов в ламинарном боксе при периодическом обновлении газовой среды (95% кислорода и 5% двуокиси углерода) и готовили пул супернатантов прилипающих и не прилипающих к стеклу клеток селезенки, содержащих равные объемы супернатантов 5-6 животных. Белки супернатантов прилипающих и неприлипающих клеток селезенки после диализа и концентрирования фракционировали на сефадексе G-150. Получали три фракции белков: фракция I содержала белки с молекулярной массой более 150 кД, фракция II – белки с молекулярной массой 50-60 кД и фракция III – белки с молекулярной массой менее 15 кД. Концентрацию белков во фракциях устанавливали по Бредфорд. Активность фракций оценивали путем внесения их в среду инкубации ПЯЛ. Выделение эритроцитов проводили следующим образом. Кровь отстаивали дважды в 10 мМ Na-фосфатном буфере (рН = 7,4), содержащем 0,9% хлорида натрия и 2% декстрана Т-500 в течение 30 мин при 37°С. Затем кровь центрифугировали (3000 об/мин, в течение 10 мин при 4°С). Слой эритроцитов удаляли аспирацией. Эритроцитарную массу подвергали дополнительной очистке на хроматографической колонке, содержащей HBS-целлюлозу в 10 мМ Na-фосфатном буфере, содержащем 0,9% хлорида натрия. После очистки эритроциты осаждали центрифугированием (3000 об/мин в течение 10 мин при 4°С) (Beutler, 1985). Эритроциты фракционировали в градиенте плотности яичного альбумина (Кобзев Т.В. и др., 1978). Для приготовления градиента носителя навеску сухого яичного альбумина растворяли в буферном растворе (рН = 7,8). Готовили ряд пробирок, содержащих 1 мл раствора яичного альбумина: 1 пробирка - конц. 28% (d = 1,079 г/см3), 2 пробирка - конц. 30% (d = 1,091 г/см3), 3 пробирка - конц. 40% (d = 1,105 г/см3), 4 пробирка - 43% ( d = 1,117 г/см3). Взвесь эритроцитов (5 х 109 клеток в 0,5 мл среды 199) наносили на раствор альбумина в первую пробирку и центрифугировали при 1400 g в течение 10 мин. Верхняя зона представляла собой легкие эритроциты (плотность ниже 1,079 г/см3). Нижнюю зону переносили во 2 пробирку и центрифугировали, верхнюю зону клеток отбрасывали, а нижнюю переносили в третью пробирку. После центрифугирования отделяли эритроциты верхней зоны, имеющие плотность 1,091-1,105 г/см3 (промежуточная по плотности фракция), а клетки нижней зоны вносили в 4 пробирку. После центрифугирования отделяли нижнюю зону клеток. Это фракция тяжелых эритроцитов с плотностью, превышающей 1,117. Полученные фракции эритроцитов тщательно отмывали от альбумина 0,15 М хлоридом натрия и использовали для введения аллогенным животным. Спленоциты культивировали с аллогенными эритроцитами или их фракциями в соотношении клеток 1:2 (5 х 107 лимфоцитов и 108 эритроцитов на 3 мл среды) в среде 199 (5 х 107 клеток на 3 мл среды), содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотики (пенициллин, стрептомицин), в течение 4 часов в ламинарном боксе при периодическом обновлении газовой среды (95% кислорода и 5% углекислого газа). По истечении срока инкубации клетки осаждали центрифугированием при 400 g в течение 15 минут и готовили пул надосадочных жидкостей, содержащих равные объемы жидкостей 5-6 животных. Пул жидкости диализовали в течение 12-15 часов против 50 кратного объема 0,05 М трис-буфера (рН=8,0), приготовленного на 0,15 М хлориде натрия. После диализа его концентрировали полиэтиленгликолем (ММ 40 кД) и повторно диализовали против трис-НС1-буфера). Очищенную от низкомолекулярных веществ и сконцентрированную надосадочную жидкость осаждали от образовавшегося при концентрировании осадка центрифугированием при 800 g в течение 20 минут. Концентрацию белка в надосадочных жидкостях и их фракциях определяли по Бредфорду, используя краситель Кумаси G-250 (Шишкин С.С., 1982). Активность надосадочных жидкостей и их фракций определяли путем добавления их к взвеси мононуклеаров в объеме, содержавшем 100 мкг белка, и последующего определения показателей ФМА мононуклеаров. Выделение стабильного метаболита оксида натрия лейкоцитами определяли спектрофотометрически с использованием реактива Грисса (Голиков П.П. и др., 2003). Активность НАДФН-оксидазы нейтрофилов определяли по Л.В. Никитиной и др. (2001), содержание фруктозо-2,6-дифосфата (ФДФ) в лимфоцитах – по Б.Ф. Коровкину и др. (1999). В строме эритроцитов определяли суммарную активность Na+, K+-АТФазы и Mg2+-АТФазы (Рыжикова Г.Ф., Вишняков С.И., 2005). Активность последней устанавливали в присутствии дабалена, ингибирующего Na+, K+-АТФазу. В тромбоцитах определяли содержание МДА (Негреску Е.В., 1992) (табл. 2). Иммуносупрессорный потенциал крови оценивали по концентрации в сыворотке ЛНП (Кобл В.Г., Камышников B.C., 1976), ДК и МДА (Стальная И.Д., 1977; Стальная И.Д. и Гаришвили Т.Г., 1977), ГАГ (Мудрашов Б.Ф. и др., 1986), активности антипротеолитических белков - АЛЛ и АМГ (Нартикова В.Ф., Пасхина Г.С., 1979). Иммуностимулирующую активность сыворотки оценивали по концентрации АНК (Колб В.Г. и Камышников B.C., 1976), активности протеолитических ферментов (Покровский А.А., 1969) и лизоцима (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1974) (табл. 2). В эритроцитах определяли содержание макроэргических соединений (БФГ и АТФ) (Виноградова И.Л. и др., 1980) и активность антиоксидантных ферментов (СОД и ГР) (Макаренко Е.В., 1988) (табл. 2). ГАГ выделяли из соцветий лекарственных растений Polygonaceae (ГАГ-Р), Tiliaceae (ГАГ-Т) и Astraceae (ГАГ-А) по способу Ласковой И.Л. и др. (а.с. №1603714). Способ включает экстракцию 5% раствором серного эфира в этаноле и очищение горячей (95 ºС) водой, деминерализацию путем переосаждения этанолом и диализом, дополнительную деминерализацию ионитами, очистку от белковых примесей, обработкой смесью хлороформа и этилового спирта и щелочного омыления гетерополисахаридного комплекса. Количественный и качественный состав выделенных полисахаридов изучен и описан ранее. Полученные соединения являются глюкуроногликанами, в состав которых входят D-галактуроновая кислота (60-80%), галактоза (15-19%), глюкоза (6-12%), арабиноза (4-8%) и рамноза (5-10%) (Яковлев А.И. и др., 1985, 1988). Получение эритроцитов, обработанных ГАГ-P и менадионом. Эритроциты здоровых крыс и животных, потерявших 2% крови, инкубировали в растворах, 1 мл которых содержал 1, 2 или 3 мг ГАГ-Р или 1, 2 или 3 мг менадиона. К 1 мл раствора добавляли 107 эритроцитов и инкубировали 30 минут при 37 ºС. Для включения менадиона в строму эритроцитов использовали метод гипоосмотического гемолиза (Генинг Т.П. и др., 1988; Жумадилов Ж.Ш., Макаренкова Р.В., 1990) Эритроциты крыс, выделенные из 3 мл крови дважды отмывали изотоническим раствором натрия хлорида путем центрифугирования при 500 g в течении 5 мин при 4°С. К осадку эритроцитов добавляли семикратный объем охлажденной до 0°С дистиллированной воды и центрифугировали при 1500 g в течении 25 мин. К полученной строме приливали пятикратный объем менадиона, растворенного в охлажденной до 5°С дистиллированной воде. Концентрация препарата в инкубационной среде составляла 1, 2 или 3 мг/мл. Взвесь инкубировали в течение 20 мин при 4°С, затем добавляли 1/10 объема 10% хлорида натрия для восстановления целостности стромы и инкубировали в течении 30 мин при 37°С. После включения менадиона в стромальные сферы, последние дважды отмывали изотоничеким раствором натрия хлорида, затем осаждали при 1500 g в течении 10 мин. Включение ГАГ в строму эритроцитов осуществляли методом гипоосмотического гемолиза (см. выше). О включении ГАГ в строму судили по увеличению в среде гексуроновых кислот после полного гемолиза стромальных сфер (Прохорова М.И., 1982). СЭОГ и СЭОМ вводили внутрибрюшинно 5-кратно с 12-часовым интервалом по 108 частиц на 1 кг массы тела. Одновременно с первой инъекцией СЭОГ или СЭОМ животных иммунизировали ЭБ. Контролем служили крысы, которым вводили строму эритроцитов, не обработанную препаратами. Статистическая обработка материала. Вычисляли средние арифметические величины определявшихся показателей и их стандартные ошибки. Существенность различий средних величин оценивали по критериям Стьюдента (Лакин Т.Ф., 1980), Вилкоксона, Манна-Уитни (Гублер Е.В., Генкин А.А., 1973). |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям