Методические указания по проведению лабораторных занятий
|
|
Скачать 1.1 Mb.
|
|
Министерство сельского хозяйства и продовольствия республики беларусь  Департамент образования, науки и кадров Учреждение образования «Белорусская государственная сельскохозяйственная академия»  Кафедра химии ОРГАНИЧЕСКАЯ И Биологическая химия Методические указания по проведению лабораторных занятий Для студентов зооинженерного факультета специальностей 1-74 03 01 – зоотехния, 1-74 03 03 – промышленное рыбоводство Горки 2003 Одобрено методической комиссией зооинженерного факультета 15.04.2003. Составили профессор А. Р. Цыганов, ст. преподаватель И. В. СУЧКОВА, до- цент И. В. Ковалева. Содержание
УДК 577.1(072) Биологическая химия: Методические указания / Белорусская государственная сельскохозяйственная академия; Сост. А. Р. Ц ы г а н о в, И. В. С у ч к о в а, И. В. К о в а л е в а. Горки, 2003. 72с. Приведены методики определения веществ в биоматериале по основным темам и разделам биохимии, даны краткие пояснения по каждой теме и перечень контрольных вопросов для самопроверки знаний. Для студентов зооинженерного факультета специальностей 1-74 03 01 – зоотехния, 1-74 03 03 – промышленное рыбоводство. Рецензент Г. Ф. Медведев, доктор ветеринарных наук, профессор. Составление. А. Р. Цыганов, И. В. Сучкова, И. В. Ковалева, 2003 учреждение образования «Белорусская государственная сельскохозяйственная академия», 2003 Введение Настоящие методические указания предназначены для выполнения лабораторно-практических работ по биологической химии студентами зооинженерного факультета. Лабораторные работы подобраны в соответствии с учебным планом и программой курса «Органическая и биологическая химия», утвержденной Департаментом образования, науки и кадров от 26 декабря 2000 г. Они охватывают важнейшие разделы статической, динамической и функциональной биохимии. В лабораторные работы включены апробированные, не требующие дорогостоящих реактивов, оборудования и больших затрат времени, методики определения веществ, но при этом широко используемые в лабораторно-клинической практике. Методические указания содержат краткие теоретические пояснения к темам и конкретным опытам. Приводится перечень реактивов, оборудования и изложены особенности приготовления отдельных специальных реактивов. Лабораторные работы по темам содержат несколько опытов, что предполагает возможность выбора. По возможности приведены данные по нормальной и клинической биохимии и пересчеты старых единиц в единицы международной системы (СИ). Все это дает студенту возможность приобрести навыки лабораторных исследований, научиться пользоваться лабораторным оборудованием и реактивами, анализировать полученные данные, делать выводы из результатов биохимических исследований и использовать полученные знания для объяснения характера возникающих в организме животного изменений и контроля полноценности кормления. При выполнении практических работ следует строго соблюдать правила поведения и работы в биохимической лаборатории, что является необходимым условием качественного проведения эксперимента. 1. ВИТАМИНЫ Витамины – это низкомолекулярные органические соединения различной химической природы, способные самостоятельно или в составе ферментов катализировать биохимические реакции. Они не являются энергетическим материалом и организму требуются в ничтожно малых количествах. Отсутствие витаминов в организме приводит к заболеваниям – авитаминозам, избыток витаминов – к гипервитаминозам, недостаток витаминов – к гиповитаминозам. Классифицируют витамины по растворимости на жирорастворимые и водорастворимые. Водорастворимые витамины не растворяются в жирах и многих органических растворителях, но хорошо растворимы в воде. В эту группу входят витамины группы В (В1, В2, В3,В5,В6,В12,Вс и др.), витамины С, Р, Н, U и другие. Водорастворимые витамины отличаются термолабильностью и неустойчивостью к изменению рН среды. В организме почти не накапливаются и должны постоянно поступать с пищей. Способны наиболее полно усваиваться из рационов, сбалансированных по белку. Жвачные животные менее зависимы от поступления витаминов с пищей, что связано с деятельностью микрофлоры ЖКТ. Жирорастворимые витамины не растворяются в воде, но хорошо растворимы в жирах и органических растворителях. К ним относят А, D, Е, К, F, Q и другие. Жирорастворимые витамины отличаются термостабильностью и устойчивостью к изменению рН среды. В организме практически не синтезируются, но могут депонироваться. Полнее усваиваются организмом при наличии жиров в рационе. ^ . Изучить биологическое действие отдельных витаминов и методы исследования витаминов в биологическом материале. Материалы и оборудование. Концентрированная серная кислота; концентрированная соляная кислота; ледяная уксусная кислота, насыщенная сульфатом железа (II); концентрированная азотная кислота; хлорид железа (III), 1% раствор; диэтилдитиокарбомат натрия, 2% спиртовой раствор; NaOH, 4% спиртовой раствор; анилин (к 450 мл прибавляют 30 мл концентрированной серной кислоты, раствор должен иметь светло-желтый цвет); цистеин, 0,25% спиртовой раствор; гидроксид натрия, 10% раствор; сульфаниловая кислота, 1% раствор; нитрит натрия, 5% раствор; Na2CO3, 10% раствор; металлический цинк; сульфат меди, 1% раствор; родонид аммония, 5% раствор; хлорид железа (III), 1% раствор; раствор брома в хлороформе в соотношении 1:60; раствор рыбьего жира в хлороформе в соотношении 1:5; масляный препарат витамина А; концентрат витамина D; сахароза; насыщенный раствор хлорида сурьмы(V); витамин Е, 0,1 % спиртовой раствор; витамин К, 0,05 % спиртовой раствор; викасол, 0,05 % спиртовой раствор; тиамин, 5 % раствор; витамин В2, 0,025 % раствор; никотинамид, 1% раствор; витамин В6, 1 % раствор; насыщенный водный раствор рутина. Желток яйца, тертая морковь. Часовое стекло, штатив и пробирки, капельные пипетки, пипетки на 1 и 5 мл, стеклянная палочка.
Витамин А (антиксерофтальмический, ретинол, витамин роста) в организме участвует в зрительных и ростовых процессах, процессах образования и регенерации эпителиальных тканей. Витамином А богаты корма животного происхождения (молоко, печень, рыбная и мясокостная мука, рыбий жир, яйца). Растения синтезируют провитамин витамина А – каротин (корнеклубнеплоды, сенаж, силос и т. д.). ^ Серная кислота, обладая водоотнимающим свойством, образует с витамином А окрашенный комплекс синего цвета, переходящий затем в фиолетовый и далее в бурый цвет. На часовое стекло наносят 5 капель раствора рыбьего жира в хлороформе (масляного раствора витамина А или желток яйца) и 1-2 капли концентрированной серной кислоты и наблюдают соответствующее окрашивание. ^ В пробирку вносят 3-4 капли раствора рыбьего жира в хлороформе (масляного раствора витамина А в хлороформе), 5-10 капель ледяной уксусной кислоты, насыщенной сульфатом железа (II) и 2-3 капли концентрированной серной кислоты. В присутствии витамина А появляется голубое окрашивание, постепенно переходящее в розово-красное. Каротины дают при этой реакции зеленое окрашивание. Опыт проводят с тертой морковью. Витамин D (кальциферол, антирахитический). Отвечает за обмен кальция и фосфора в организме, способствует транспорту Са и Р через мембраны клеток и при реабсорбции кальция и фософра в почечных канальцах, регулирует обмен кальция в костной ткани. Витамина D много в рыбьем жире, печени, сухих дрожжах, сене. Витамин D синтезируется в коже под действием ультрафиолета из холестерина. ^ На часовое стекло наносят 3 капли рыбьего жира (раствора витамина D в масле) и прибавляют 3-5 капель раствора брома в хлороформе. В присутствии витамина D появляется зеленовато-голубой цвет. Под часовое стекло следует предварительно подложить лист белой бумаги. ^ В пробирку вносят 2 капли масляного раствора витамина D в хлороформе, добавляют 3 капли анилинового реактива и осторожно нагревают до появления красного окрашивания. Пробирку оставляют в штативе остывать. Через несколько минут эмульсия разделяется. Нижний слой, при наличии витамина в исходном материале, окрашен в интенсивно красный цвет. ^ В пробирку вносят 2 мл раствора витамина D в хлороформе, доливают 0,2 мл насыщенного раствора пятихлористой сурьмы (SbCl5) и, при наличии витамина, наблюдают появление желтого окрашивания. Витамин Е (токофеол, антистерильный) является сильным природным антиоксидантом. В организме предохраняет от окисления ненасыщенные жирные кислоты, каротин, витамин А и D. При недостатке витамина наблюдается атрофия семенных канальцев, дегенерация сперматозоидов, неспособность к вынашиванию плода, мышечная дистрофия. Витамина Е много в зародышах семян, в зеленых растениях. ^ В сухую пробирку вносят 5 капель 0,1% спиртового раствора витамина Е и несколько крупинок сахарозы, затем по стенке пробирки приливают 1 мл концентрированной азотной кислоты. Пробирку интенсивно встряхивают и наблюдают окрашивание. В присутствии азотной кислоты токоферол окисляется через промежуточное образование токоферолхинона до орто-, или парохинона, имеющего красное окрашивание. ^ В пробирку вносят 0,5 мл 0,1% спиртового раствора витамина Е и добавляют 0,5 мл 1% раствора хлорида железа (III). Встряхнув содержимое пробирки, наблюдают появление красного окрашивания вследствие образования -токоферилхинона. Витамин К (филлохинон, антигеморрагический). Витамин К участвует в процессах окислительного фосфорилирования и синтеза факторов свертывания крови. Источником витамина К для животных служат растительные корма и кишечная микрофлора, а также искусственно синтезированный аналог витамина К - викасол. ^ В пробирку вносят 2 мл 0,05% спиртового раствора диэтилдитиокарбомата натрия и 2,5 мл 4% спиртового раствора NaOH. При наличии витамина наблюдают появление голубого окрашивания. ^ В пробирку вносят 2 мл 0,05 % спиртового раствора викасола, добавляют 2 капли анилина. Осторожно встряхивают содержимое пробирки и наблюдают красное окрашивание, что обусловлено образованием 1-метил-2-фениламинонафтохи-нона. ^ На часовое стекло наносят 5 капель 0,05% спиртового раствора викасола, 5 капель 0,025% спиртового раствора цистеина и 1 каплю 10% раствора гидроксида натрия. Наблюдают лимонно-желтое окрашивание. По каждому опыту оформляют вывод: Витамин … можно обнаружить реакцией с ……… . При наличии витамина наблюдают появление …………… окрашивания раствора.
Витамин В1 (тиамин, антиневритный) в виде тиаминпирофосфата (ТПФ) входит в состав ферментов декарбоксилаз -кетокислот, участвует в расщеплении и синтезе кетосахаров. Витамина много в дрожжевых препаратах, бобовых растениях. ^ В пробирку наливают 1 мл 1% раствора сульфаниловой кислоты, 1 мл 5% раствора нитрита натрия (в пробирке образуется диазореактив). Затем к диазореактиву приливают 0,5 мл 5% раствора тиамина и 1 мл 10% раствора карбоната натрия. Наблюдают характерное окрашивание. витамин В1 в щелочной среде с диазореактивом образует сложное комплексное соединение оранжевого или красного цвета. Витамин В2 (рибофлавин) в составе флавинадениндинуклеотида (ФАД) является коферментом многих ферментов (флавопротеидов) катализирующих окислительно-восстановительные реакции в обмене белков, жиров и углеводов. При его участии происходит перенос электронов и протонов с окисляемого субстрата на кислород в дыхательной цепи ферментов. Витамина много в отрубях, молочных продуктах, овощах. ^ В пробирку вносят 1 мл 0,025% раствора витамина В2, 0,5 мл концентрированной соляной кислоты и опускают кусочек металлического цинка. Цинк реагирует с соляной кислотой с выделением газообразного водорода. Выделяющийся водород реагирует с окисленной формой В2 желтого цвета, восстанавливая его до промежуточного родофлавина розово-красного цвета (насыщенность цвета зависит от концентрации В2) и далее до бесцветного лейкофлавина. при взбалтывании обесцвеченного раствора лейкосоединение вновь окисляется кислородом воздуха в рибофлавин. Витамин В5 (ниацин, антипеллагрический, никотиновая кислота, РР, никотинамид) в природе существует в двух формах: никотиновой кислоты и амида никотиновой кислоты. В форме амида никотиновой кислоты участвует в окислительно-восстановительных реакциях клеточного обмена. Недостаток витамина вызывает заболевание пеллагрой (шершавая кожа). Витамина много в дрожжевых препаратах, зерновых продуктах. ^ 5. В пробирку вносят 1 мл раствора никотинамида и 1 мл 1% сульфата меди, затем по каплям прибавляют 5% раствор родонида аммония. В присутствии витамина наблюдают зеленое окрашивание. Витамин В6 (пиридоксин, антидерматитный). В организме в форме пиридоксаминфосфата и пиридоксальфосфата участвует в реакциях превращения аминокислот и карбонильных соединений. В6 много в дрожжевых препаратах и отрубях злаковых. ^ В пробирку вносят 1 мл 1% хлорида железа и 1 мл 1% раствора витамина В6. Смесь встряхивают. В присутствии витамина железо образует с ним комплексную соль по типу фенолята железа красного цвета. Витамин Р (рутин, витамин проницаемости, полифенолы) в организме отвечает за нормальное функционирование стенок сосудов, предохраняет адреналин от окисления, обладает антиоксидантным действием по отношению к витамину С и усиливает его антигиалуронатлиазную функцию. Витамина Р много в растительных кормах. ^ В пробирку вносят 1 мл насыщенного водного раствора рутина и прибавляют несколько капель 1% раствора хлорида железа (III). Хлорид железа образует с рутином комплексное соединение по типу фенолята железа зеленого цвета. К раствору рутина можно прилить осторожно по стенке концентрированную серную кислоту. На границе двух жидкостей наблюдают окрашенное в желтый цвет кольцо. ^
^ Витамин С (аскорбиновая кислота, антискорбутный) широко распространена в природе. В организме человека и животных участвует в окислительно-восстановительных реакциях, протекающих с участием транспорта электронов. Витамин С является кофактором гидроксилирования пролина при синтезе коллагена, превращений кортикостероидных гормонов и трансферрина. Обладает антиоксидантным, антимутагенным и антиконцерогенным действием. Предохраняет от окисления адреналин и сульфгидрильные группы белков. Витамина С много в зеленых частях растений, меньше в корнеплодах и практически нет в семенах. Аскорбиновая кислота активно синтезируется большинством животных в печени из глюкозы, а также микрофлорой ЖКТ. При заболеваниях, стрессовых ситуациях, повышенных физических нагрузках организм испытывает недостаток витамина С и его необходимо вводить в рацион. В норме в крови сельскохозяйственных животных содержится 0,2-1,5 мг% аскорбиновой кислоты (или 0,011-0,086 ммоль/л). ^ соляная кислота, 2% раствор; натриевая соль 2,6-дихлорфенолиндофенола, 0,0005 моль/л раствор (М=270, г/экв – 145); 2,6-дихлорфенолиндофенол, 0,125 мМоль/л свежеприготовленный раствор; трихлоруксусная кислота, 10% раствор; дистиллированная вода; соляная кислота, 10% раствор; капуста; картофель; лук; хвоя; силос; сенаж; кровь и т.д. Фарфоровая ступка с пестиком, песок кварцевый, коническая колба, стаканчик, воронка, микробюретка, пипетка, фильтры, весы, центрифуга, центрифужные пробирки. ^ аскорбиновая кислота, окисляясь 2,6-ди-хлорфенолиндофенолом, восстанавливает его до бесцветной формы. Как только все количество витамина С окислится, титруемый раствор приобретает розовую окраску за счет образования недиссоциированных молекул 2,6-дихлорфенолиндофенола. По количеству 2,6-ди-хлорфенолиндофенола, затраченного на титрование, определяют количество аскорбиновой кислоты в исследуемом материале. В щелочной среде 2,6-дихлорфенолиндофенол имеет синюю окраску, в кислой – красную, при восстановлении – обесцвечивается (лейкоформа). ^ Взвешивают 1 г продукта (навеску можно брать в зависимости от содержания витамина С от 0,1 до 3 г). Тщательно расти- рают в ступке с небольшим количеством кварцевого песка. К растертой массе прибавляют 9 мл 0,2% раствора HCl. Количество соляной кислоты зависит от количества взятого продукта. При этом общий объем навески (продукт + HCl) должен составлять 10 мл. Соляную кислоту можно приливать к растираемой массе порциями, оставив часть для смыва ступки. Через пять минут содержимое перемешивают и фильтруют. Отбирают 3 мл фильтрата в коническую колбу и титру-ют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до появления розовой окраски, сохраняющейся в течение 30 с 1 мл 0,0005 моль/л раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола соответствует 0,088 мг аскорбиновой кислоты.  О О    С С С – ОН Сl С = О Cl  О ОC – OH +O= =N– – OH C = O + HO– –N– –ОНH–C Cl H–C Cl HH O–C–H 2,6-дихлорфенол- HO–C–H 2,6-дихлорфенол-индофенол индофенол CH2–OH (окрашенная форма) CH2OH восстановленный L-дигидроаскорби- L- дегидроаскор- (лейкоформа) новая кислота биновая кислота Концентрацию аскорбиновой кислоты определяют по формуле С=  ,где Q – количество аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 мл 0,0005 моль/л раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола (0,088 мг); А – количество 0,0005 моль/л раствора 2,6-дихлорфенолиндофе-нола, пошедшего на титрование, мл; Vo – общее количество экстракта, мл; V1 – объем экстракта, взятый для титрования, мл; а – навеска пищевого продукта, г; 100 – пересчет в %. Для выражения в единицах СИ концентрацию витамина в мг% умножают на коэффициент 56,776 (мкмоль). ^ Концентрация витамина
Для определения витамина С в крови в пробирку отмеряют 2 мл дистиллированной воды, туда же вносят 1 мл свежей крови, смешива- ют и добавляют 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и через 10-15 мин центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15-20 мин. В отдельную пробирку отмеряют 0,1 мл 0,125 ммоль/л раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола и 1-2 капли 10% раствора HCl. Раствор приобретает розовую окраску. Данный раствор оттитровывают центрифугатом крови до обесцвечивания раствора. Определение производят в 2-3 параллельных пробах и для расчета берут среднее арифметическое из результатов титрования. Концентрацию аскорбиновой кислоты в крови определяют по формуле: Х=  ,где Х – концентрация аскорбиновой кислоты в крови в мкмоль/л; 0,125 – количество аскорбиновой кислоты, эквивалентное 1 мл 0,125 ммоль/л раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола; 4 – степень разведения крови при приготовлении центрифугата; 0,1 – количество мл 0,125 ммоль/л раствора 2,6-дихлорфенол-индофенола взятого для определения; 1000 – коэффициент пересчета ммоль/л на мкмоль; n- количество мл фильтрата крови, израсходованное на титрование 0,1 мл 2,6-дихлорфенолиндофенола (при пересчете мкмоль на мг% результат умножают на 0,0176, т. е. 176:(101000). ^ животного содержится …………… мкмоль/л аскорбиновой кислоты.
фотоэлектроколориметрическим методом каротин представляет собой желтый пигмент растений, из которо- го, главным образом в печени животного, образуется витамин А. Имеется несколько каротинов. Из них наиболее биологически активным является -каротин. В слизистой оболочке тонкого отдела кишечника, печени животных под влиянием фермента каротиназы каротин расщепляется на две молекулы витамина А1. Уровень каротина в сыворотке крови сельскохозяйственных животных зависит от его поступления с кормом и является надежным показателем А-витаминной обеспеченности животных. В крови крупного рогатого скота содержится сравнительно много каротина. Так, летом количество каротина у них может достигать 3 мг%, а зимой падать ниже 0,3 мг%. Падение уровня каротина у коров и телят ниже 0,3 мг% расценивается как неблагоприятный фактор, указывающий на значительное снижение запасов витамина А в организме. У свиней, овец, лошадей каротин в пищеварительном тракте быстро превращается в витамин А, поэтому в крови животных он обнаруживается в очень малых концентрациях: 0,01-0,05 мг%. У КРС каротин определяется с 3-месячного возраста. Снижается уровень каротина в крови при нехватке его в кормах, при заболеваниях желудочно-кишечного тракта, гепатитах, различных токсикозах, при недостатке в кормах белков, углеводов, витамина В12, аскорбиновой кислоты. ^ авиационный бензин марки В-70 или петролейный эфир; 96о этиловый спирт; основной стандартный раствор дихромата калия: 360 мг К2Cr2O7 доводят дистиллированной водой до 500 мл; рабочий стандартный раствор дихромата калия: к 5 мл основного стандартного раствора добавляют 5мл дистиллированной воды; фотоэлектрокалориметр, пробирки, пипетки. ^ Основан на осаждении белков сыворотки крови этиловым спиртом. Интенсивность окраски экстракта пропорциональна содержанию каротина. Ход работы. В пробирку отмеряют 1 мл сыворотки крови, 3 мл 96о этилового спирта, тщательно перемешивают, добавляют 6 мл петролейного эфира или бензина, энергично встряхивают не менее 2 мин. И осторожно по стенке пробирки приливают 0,5 мл дистиллированной воды. Дают отстояться до полного разделения органической и водной фаз. Затем осторожно отбирают 4,5-5 мл экстракта каротина и калориметрируют при синем светофильтре в кювете на 10 мм против петролейного эфира или бензина. Одновременно определяют экстракцию стандартного раствора дихромата калия. Содержание каротина рассчитать по формуле х=  , где:х – содержание каротина в пробе, мг%; Еоп. – экстинкция опытной пробы; Ест. – экстинкция стандартного раствора; 0,01248 – количество каротина в мг, соответствующее по окраске 1 мл стандартного раствора дихромата калия; 100 – коэффициент пересчета на мг%. Вывод. Биохимический анализ показал, что в сыворотке крови исследуемого животного содержится …… мг% каротина. Контрольные вопросы 1. Номенклатура и классификация витаминов. 2. Строение, физические и химические свойства витаминов. 3. Биологическая роль витаминов в организме. 4. Патологические изменения, возникающие при недостатке, отсутствии или избытке витаминов в организме животных. Потребность, источники витаминов для животных. 5. Составной частью каких ферментов являются витамины В1, В2,В3, РР, В6? |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям