Опорный конспект лекций по дисциплине «Биотехнология растений» для студентов специальности 050701 «Биотехнология» очной формы обучения
|
|
Скачать 0.81 Mb.
|
Лекция 6. Криосохранение генофонда. Важным вкладом в селекцию растений стала технология сохранения генофонда в культуре ин витро. Цель создания коллекций и банков клеток растений- обеспечение селекционера нужным для его работы генотипом. В любое время сохраняются редкие и исчезающие виды, сохраняются растения, размножающиеся как вегетативно, так и семенами (это особенно важно для поддержания гетерозисных гибридов, линий с ЦМС), таким образом сохраняются те уникальные генотипы, свойства которых были бы потеряны при половом размножении. Сохраняются также линии клеток и каллусов, синтезирующих ценные продукты вторичного метаболизма. Криосохранение (от греч. «криос»- мороз) буквально означает хранение в замороженном состоянии. На практике это обычно хранение при очень низких температурах: при температуре сухого льда (-79°С), в морозильниках с ультранизкой температурой (-80°С и ниже), в парах (-140°С) или непосредственно в жидком азоте ( -196°С). 8.1. Криосохранение пыльцы и семян Наиболее проста техника криосохранения пыльцы. Для этого подсушенную пыльцу помещают в запечатанные пластмассовые ампулы и переносят в жидкий азот. Криобанк пыльцы делает возможным скрещивание сортов растений, различающихся по времени цветения или же имеющих пыльцу с коротким периодом фертильности. Успехи криоконсервиронания семян в значительной мере зависят от степени их влажности, верхней границей которой является 10-15%. Это связано с тем, что в достаточно сухих семенах вода является связанной, не способной замерзать. Как только при намачивании и набухании семян появляется свободная вода, в них образуется лед при замораживании, который приводит к механическим повреждениям клеток и к их гибели. Установлено, что большинство видов растений имеют семена, которые можно легко высушить до низкой влажности (10-13% и ниже) без существенной потери их всхожести. Такие семена могут быть сохранены в жидком азоте путем прямого погружения после предварительного высушивания в вакууме. Однако существует нижний предел допустимой влажности 4-7%. При высушивании семян ниже 4° наблюдаются повреждения, связанные с аутоокислением липидов в меристематических зонах зародыша. Относительно скорости оттаивания семян после их замораживания в литературе имеются расхождения. Так, для сои некоторые авторы считают более безопасным медленное оттаивание на воздухе при 0°С; другие же получили 80%-ное выживание семян сои при быстром погружении их в жидкий азот с последующим быстрым оттаиванием. Быстрое оттаивание семян с хорошей степенью выживаемости было применено для 13 сортов картофеля после трехлетнего хранения в жидком азоте. В настоящее время при глубинном замораживании семян используют методику японских исследователей Сакан и Ноширо (1975), которые рекомендуют высушивать семена до 8-15%, упаковывая их в пакеты из фольги или ампулы с плотными крышками, которые в дальнейшем погружаются прямо в жидкий азот, и после хранения постепенно размораживать их на воздухе. Однако семена других растений (такие тропические культуры, как кофе, какао, гевея) не могут прорастать, если их влажность снижается ниже 31-12% (в зависимости от вида). Какие-либо рекомендации по их криоконсервированию отсутствуют, однако в этом случае может оказаться полезным предыдущий опыт криоконсервирования. Так, Г.А. Самыгину (1960) удалось сохранить всхожесть ржи и пшеницы на уровне 71 % после замораживания в жидком азоте и даже жидком водороде (-253°С) набухших семян, содержащих 70-80% воды. Успех был достигнут благодаря постепенному еженедельному ступенчатому замораживанию семян путем понижения температуры в холодильных шкафах до -60°С с последующим их погружением в жидкий азот. Оттаивание проводилось в этих же шкафах с периодическим повышением температуры через каждые два дня. Предполагается, что при небольших скоростях охлаждения происходит перераспределение воды внутри семян и лёд образуется в эндосперме, вызывая обезвоженность зародыша и предотвращая тем самым его механические повреждения. Помимо глубинного замораживания семян, возможно их хранение и при небольших пониженных температурах. В настоящее время имеются конкретные рекомендации для хранения семян. Так, например, для семян картофеля оптимальной пониженной температурой хранения является -14°С, для семян сорго -12°С. Однако такое хранение вряд ли целесообразно. Это связано с тем, что биохимические процессы при таких температурах не полностью подавлены; кроме того хранение семян в таких условиях требует дополнительной зашиты от высокой влажности и дополнительных мер предотвращения часто случающихся отказов механических систем охлаждения. 8.2. Криоконсервирование верхушечных, меристем клеток растений Безусловно, хранение семян растений путем глубинного замораживания- наиболее простой и дешевый способ сохранения генетических ресурсов. Но многие растения размножаются только вегетативным путем (черенками, отводками, клубнями). На сегодняшний день для вегетативно размножающихся растений наилучшим способом сохранения их генофонда является криоконсервирование верхушечных меристем побегов. Следует отметить, что данный способ может оказаться единственно пригодным для долгосрочного хранения растений с так называемыми «неподдающимися» семенами, так как обладает большим преимуществом по сравнению с другими объектами, культивируемыми в данных условиях. Это объясняется прежде всего тем, что меристемы после криосохранения сразу развиваются в целое растение, т.е. в данном случае нет необходимости проводить дополнительные процедуры, связанные с регенерацией растений. Клетки меристемных растений всегда однородны по плоидности, и регенерируемые из них растения соответствуют исходному генотипу, этим обеспечивается большая генетическая стабильность. Кроме того, меристемные клетки растений очень мелкие, почти невакуолизированы, а связи с этим они намного легче переносят глубокое замораживание и оттаивание. Подвергая криоконсервированию меристемы, можно не только сохранить данный генотип, но и получить впоследствии путем микроклонального размножения необходимое количество растений. Значительно сложнее стоит проблема криоконсервации клеток растений. Наибольшие трудности здесь связаны с процессом замораживания, так как клетки растении имеют свою специфику. Они обладают большими размерами, сильной вакуолизацией, обилием воды и чрезвычайной шпротой и пластичностью их метаболизма, поскольку находятся в значительно более изменчивых условиях, чем, например, клетки животных. В этой связи выживаемость клеток растений даже в лучших (редких) случаях не превышает 69-70%. В течение многих лет для сохранения исходных культур использовалось постоянное выращивание растений при оптимальных условиях. Но при этом существует риск возникновения сомаклональной изменчивости, загрязнения чужеродным генетическим материалом, случайной утери собственного генетического материала. К тому же для поддержания культуры тканей обычно требуются регулярные пересадки на свежую питательную среду через каждые 2-4 недели, что оказывается довольно трудоемким и дорогостоящим процессом. В настоящее время существуют два основных подхода к хранению культур замедленный рост коллекции и криосохранение. а) Замедленный рост коллекции. Для замедления роста большинства культур необходимы факторы, ограничивающие рост. Наиболее часто используется снижение температуры культивирования. Поместив коллекции в условия низких температур (1-10°С в зависимости от холодостойкости вида растений), период без пересадок можно удлинить до 6-24 месяцев. Рост растений можно задержать добавлением к питательной среде соединений, способных замедлять рост (ретарданты). Они могут оказать осмотическое действие (маннит) или быть веществами гормональной природы (абсцизовая кислота). Еще один способ- изменение состава атмосферного воздуха, с которым соприкасается культура, чаще всего снижение в нем содержания кислорода (гипоксия), например, выращивание в атмосфере, состоящей из смеси азота (90%) и кислорода (10%). Кроме того, задержку роста можно вызвать, снижая атмосферное давление до 0,014 мм ртутного столба или комбинируя пониженное давление и гипоксию. Обычное время хранения культур с ограниченным ростом составляет около года. Снижение скорости роста ниже некоторой точки приводит к гибели культуры. Таким образом, если полностью отказаться от пересаживания культуры, необходимо использовать такой способ хранения, при котором происходит полная остановка метаболизма. б) Криосохранение. Главное преимущество хранения при очень низких температурах состоит в значительном замедлении и даже остановке метаболизма и биологического разрушения. Благодаря этому более совершенному и широко используемому способу сохраняются мутантные, гибридные, трансформированные, способные к морфогенезу клетки: меристемы и кончики побегов, зиготические и соматические зародыши, пыльца, семена, в том числе не выносящие обезвоживания, причем в течение любого срока. Кроме того, хорошо отлаженное криосохранение менее трудоемко, чем поддержание и хранение коллекции. К настоящему времени разработаны условия криосохранення культур клеток примерно 30 видов растений. Успех низкотемпературного криоконсервирования зависит от целого ряда факторов: генетических и морфологических особенностей клеток, состава среды консервирования, вида и концентрации криопротектора, режима охлаждения и условий оттаивания, способности к закаливанию и уровня проницаемости криопротектора. Рассмотрим процессы, происходящие в клетке при охлаждении. Точка замерзания чистой воды 0°С, но ее можно охладить до более низких температур (вплоть до -38°С), при этом льда не образуется. Такая вода называется переохлажденной. Снизить точку замерзания можно добавлением растворяющихся веществ, например хлорида натрия, или криопротекторов (глицерин, диметилсульфоксид, полиэтиленгликоль). При охлаждении водного раствора происходит постепенное образование чистого льда. В результате постепенного удаления из раствора воды (за счет перехода ее в лед) все растворенное вещества концентрируются в оставшемся растворе, вследствие чего заметно снижается его температура замерзания. По мере дальнейшего охлаждения вода из раствора будет продолжать удаляться до тех пор, пока, наконец, не будет достигнута температура плавления, при которой и этот концентрированный раствор твердеет. Как клеточная стенка, так и плазматическая мембрана выступают в качестве барьеров для роста льда. Так как цитоплазма клетки по отношению к внеклеточной среде изначально гипертонична, то лед сначала образуется вне клетки. Внеклеточные растворы становятся концентрированными, и осмотический градиент через мембрану клетки меняет свое направление. В результате клетки начинают терять воду, постепенно обезвоживаясь, а растворы внутри клетки становятся более концентрированными, что является одной из главных причин повреждения клеток в процессе охлаждения (осмотический стресс). Другой причиной является образование внутриклеточного льда. Опасен рост центров кристаллизации в крупные кристаллы (более 0,1 мкм), чьи грани разрушают мембраны. Полностью рост и перестройка кристаллов льда прекращается в чистой воде только при температуре около -140°С. Вот почему длительное уверенное хранение возможно только при низких температурах. Таким образом, повреждении клеток при замораживании и последующем оттаивании зависит, с одной стороны, от образования льда внутри них (механический стресс), а с другой- от их обезвоживания (осмотический стресс). При замораживании происходит образование льда внутри и снаружи клеток. При медленном охлаждении происходит образование внеклеточного льда, что приводит к обезвоживанию и повреждениям клеток до того, как будет достигнута температура замерзания цитоплазмы. Быстрое охлаждение вызывает более раннее замораживание клеток изнутри и меньшее обезвоживание; повреждения клеток вызываются при этом образующимися внутри клеток кристаллами льда. В криосохранении используют метод двуступенчатого охлаждения, который заключается в предварительном замораживании клеток быстрым охлаждением до температуры ниже нуля и кратковременном выдерживании их при этой температуре перед быстрым охлаждением до температуры хранения. Прерывание быстрого охлаждения и выдерживание в течение определенного времени при температуре, выше критической, вызывает сжатие клеток, в результате чего клетки становятся способными пережить охлаждение и оттаивание. Высокие концентрации внеклеточных растворов, создающиеся во время периода предварительного охлаждения, по-видимому, обеспечивают сжатие, достаточное для защиты клеток от повреждения. Оптимальная температура и продолжительность периода предварительного замораживания зависят от типа клеток и связаны с кинетикой движения воды через клеточную мембрану. На этом этапе в среду добавляют криопротекторы- вещества, которые уменьшают повреждения клеток от осмотического и механического стресса при замораживании и оттаивании, изменяют проницаемость клеток и температуру замерзания. Это вызвано снижением количества образовавшегося льда и, следовательно, концентрации других растворенных веществ. Криопротекторами являются либо проникающие в клетки вещества- диметилсульфоксид (ДМСО) и глицерин, либо не проникающие высокомолекулярные- поливинил, пиролидон, декстран, полиэтиленгликоль. Наиболее часто используют ДМСО- или один, или с добавлением сахарозы, глицерина. Большое значение для успеха криосохранения имеет режим замораживания на этапе от 0° до -40°С, который может быть медленным (со скоростью 0,5-1°С в минуту) или сверхбыстрым (от 50° и более чем 1000°С в минуту до непосредственного погружения в жидкий азот объектов размером до 0,5 мм). Хотя для наиболее мелких и устойчивых клеток (например, моркови) допустимы скорости замораживания 1-4°С/мин, для более крупных и вакуолизированных, к которым относится подавляющее большинство культивируемых ин витро клеток растений, рекомендуемая скорость 0,5°С/мин, а для самых больших и клеток апексов еще меньшие скорости. Криоконсервация культур растений во многих случаях начинается с этапа специальной подготовки, хотя существуют культуры, которые достаточно просто брать для замораживания в начале или в середине экспоненциальной фазы роста, когда они обогащены меристемоидными клетками в результате интенсивных делений. Один из способов предварительного культивирования- добавление в среду маннита или сорбита в концентрации 2-6% на период от нескольких суток до 2-3 пассажей. Такой способ уменьшал размер клеток и, что важнее, их вакуолей. При втором способе предкультивирования используют аминокислоты и среди них в первую очередь пролин, чье значение для связывания воды в клетке широко известно. Его концентрацию постепенно поднимали для ряда клеток до 1 М (11,5%) на срок до 4 суток (большой период предкультивирования приводил к дегенеративным изменениям в клетках). Кроме пролина используют низкие концентрации аланина, серина и аспарагина в течение 4-6 суток; наилучшие результаты были получены с аспарагином. В результате в клетках уменьшается количество зерен крахмала и их размеры и увеличивается (примерно в 2 раза) содержание сахаров. Повышается и выживание клеток после оттаивания. Третий способ предварительного культивирования применяли вначале только для апексов побегов- плотных организованных структур без межклетников, размером около 500 мкм. Проникновение во внутренние клетки апексов даже легкопроникающего ДМСО и их образование затруднены. ДМСО добавляли в концентрации от 2,5 до 10% (чаще 5% на срок до 48 часов). Четвертый способ осуществляется в условиях искусственного закаливания к холоду, он применим только к зимующим растениям умеренного климата. Суть закаливания сводится к имитации естественного осеннего процесса подготовки растений к периоду зимнего покоя. При работе с клеточными суспензионными или каллусными культурами обычно их (так же как и растения) или сразу помещают в условия с температурой от 2 до 5°С на срок от 1 до 6 недель, или сначала в течение нескольких суток выдерживают при температуре 8-10°С. Более эффективно закаливание в присутствии сахарозы (до 12-15%). После подготовки перед добавлением криопротекторов клеточные суспензии концентрируют. Поскольку центрифугирование (даже в течение 5 мин. при 100 g) повреждает многие растительные клетки, то применяют осаждение в цилиндре или прямо в колбе, которые устанавливают в сосуд со льдом. Длительность осаждения 15-30 мин в зависимости от размера клеток и их агрегатов. Небольшие агрегаты с мелкими наиболее жизнеспособными и устойчивыми клетками оседают последними. После осаждения надосадочную жидкость отсасывают. Замороженные культуры необходимо хранить при низкой температуре, по крайней мере, при -100°С. На практике для этого удобнее всего использовать жидкий азот (-196°) или его пары (-150°С). При слишком медленном оттаивании клеток в них происходит повторное образование льда, оказывающее повреждающее действие. Поэтому предпочтительнее использовать быстрое оттаивание. Для этого ампулы встряхивают в воде с температурой 40°, иногда 60°С. Но как только начинает исчезать последний кристаллик льда в ампуле, ее переносят в сосуд со льдом. Отмывание от криопротектора применяется только в случае использования веществ, токсичных для данных клеток. Содержимое ампулы разбавляют в 3-4 приема с 15-мипутпыми интервалами большим объемом холодной питательной среды или 3-15%-ной сахарозы. Повышенная концентрация сахарозы полезна для замедления деплазмолиза, если криопротектор вызвал плазмолиз. Затем клетки отстаивают, а надосадочную жидкость заменяют питательной средой, объем которой приблизительно равен исходному объему суспензии.Возобновление роста культур требует 2-3 недель. ^ Предмет генной инженерии- осуществление трансгеноза (переноса генов). Трансгеноз осуществляется в четыре этапа: 1) получение нужного гена; 2) его встраивание в вектор (молекулы ДНК, способные переносить включенные в них чужеродные гены в клетку, где они реплицируются); 3) введение гена в составе вектора в организм; 4) идентификация клеток, которые приобрели желаемый ген. 1. Получение генов Получить нужный ген можно: а) выделением его из ДНК; б) путем химико-ферментативного синтеза; в) воссозданием нл основе информационной РНК с помощью фермента РНК-завн-симон ДНК-иолимеразы (ревертазы). а) Выделение гена из ДНК. Изолированную ДНК разрезают на фрагменты с помощью ферментов- рестрикционных эпдонуклеаз (рестриктаз), которые узнают определенные последовательности нуклеотидов (обычно длиной в 4-6 нуклеотидных пар). К настоящему времени известно более 400 рестриктаз, которые узнают 85 вариантов различных последовательностей. Расщепление может происходить по середине узнаваемого участка, и тогда обе нити ДНК «разрезаются» на одном уровне- образующиеся фрагменты имеют двунитевые (тупые) концы. Другие рестриктазы расщепляют нити ДНК со сдвигом, так что образуется ступенька- одна из нитей ДНК выступает на несколько нуклеотидов. Образуются однонитевые (липкие) концы. Если встречаются два липких фрагмента ДНК., полученных действием одной и той же рестриктазы, то в силу комплементарности концевых последовательностей они легко взаимодействуют и при участии фермента лигазы сшиваются: Однако часто трудно подобрать рестриктазы, позволяющие вырезать из ДНК именно тот участок, который соответствует нужному гену (кроме нужного участка включаются липкие последовательности или, наоборот, отщепляются части нуклеотдной последовательности гена, в результате чего ген становится функционально неполноценным). б) Химико-ферментативный синтез гена. Синтезируются короткие (8-16-звенные) одноцепочечные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды), которые затем сшиваются между собой с помощью фермента лигазы с образованием двухценочечных полинуклеотидов. Для .химико-ферментативного синтеза генов необходима информация о первичной структуре: соответствующего белка. Таким способом уже получены гены соматостатина и инсулина. в) Синтез гена на основе выделенной из клетки информационной РНК. Это наиболее распространенный метод.. Обратная траискриптаза (ревертаза) катализирует синтез нити ДНК, комплементарной иРНК. Полученную одноцепочечпую ДНК, называемую комплементарной ДНК (кДНК), используют в качестве матрицы для синтеза второй нити ДНК с применением ДНК-полимеразы или ревертазы. Таким способом в 1979 г. был получен ген гормона роста человека (соматотропин). 2. Введение гена в вектор Векторы- это кольцевые молекулы ДНК, способные к самостоятельной репликации. Вектор с включенным в него геном образует так называемую рекомбинантную ДНК. Конструирование рекомбинантных ДНК осуществляется ин витро. Кольцевая молекула вектора размыкается рестриктазой. Необходимо, чтобы полученная линейная молекула ДНК содержала липкие концы, такие же, как концы вводимого гена. Комплементарные липкие концы вектора и вводимого гена сшивают ДНК-лигазой, и полученную рекомбинантную ДНК с помощью той же лигазы вновь замыкают с образованием единой кольцевой молекулы. В качестве векторов наибольшее применение в генетическом инженерии нашли бактериальные плазмиды, особенно плазмиды кишечной палочки, а в генной инженерии растений плазмиды бактерий Агробактериум тумефациенс и Агробакгериум ризогенез. Агробактериум тумефациенс содержит так называемые Ti-плазмиды, Т-участок ДНК плазмиды может встраиваться в геном растений (крестоцветные, злаки). Ti-плазмиды содержат три гена (онкогены), два из которых кодируют стадии синтеза ауксина, а третий отвечает за синтез цитокинина. В отличие от роста нормальных клеток, который регулируется поступлением ауксинов и цитокининов, рост клеток, содержащих Т-участок Ti-плазмиды, бесконтролен, что приводит к образованию наростов-опухолей. Плазмиды могут быть «обезоружены» вырезанием у них онкогенов. Вставка в Т-участок гена, кодирующего нужный нам белок, ведет к превращению Ti-плазмид в очень полезный вектор для трансгеноза. Агробактериум ризогенез содержит Ri-плазмиды которые можно использовать аналогичным образом. 3. Перенос гена в клетки организма-реципиента Передача генов, встроенных в плазмиду, осуществляется путем трансформации или конъюгации (если гены встроены в геном вируса путем трансформации). Трансформация- это перенос свободной ДНК в реципиентную клетку, вызывающий изменение признаков клетки. При этом происходит рекомбинация и встраивание однонитевого фрагмента ДНК в хромосому реципиента. Для проведения трансформации растений необходимо получение изолированных протопластов. Совместное культивирование изолированных протопластов с бактериями Агробактериум (или рода Ризобиум) ведет к эффективной трасформации растительных клеток. Максимальное количество трансгенных растений получено путем переноса с помощью Ti-плазмиды. Однако наряду с векторными разрабатываются методы прямого переноса генов в растения. К их числу относятся: микроинъекции ДНК, электропорация, упаковка в липосомы, биологическая баллистика. Для осуществления микроиньекций применяются иглы из электродных трубок с внешним диаметром 2 мкм и внутренним 1,25 мкм. Примерный объем инъекции в каждый протопласт составляет 10-5 мл. Стеклянная микроигла с помощью микроманипулятора вводится в клетку (на 2-5-й день культивирования протопластов) и из нее выдавливается капля буферного раствора, содержащего 9-1 мкг/мкл ДНК. Эффективность трансформации при этом 10-20%. Электропорация- введение ДНК в электрическое поле высокого напряжения, которое обратимо усиливает проницаемость биомембран, благодаря чему молекулы ДНК поглощаются протопластами сразу же или после электрического шока, преимущественно через поры мембран. Для защиты генов, вводимых в протопласты растений, используются липосомы- сферические тельца, оболочка которых состоит из фосфолипидов. Липосомы способны сливаться непосредственно с мембраной клетки или поглощаться ей в результате эндоцитоза. Упаковка в липосомы защищает ДНК от нуклеаз. Новый способ введения генов в растения- биологическая, баллистика (биолистика) состоит в бомбардировке клеток в специальном устройстве при небольшом вакууме вольфрамовыми микрочастицами размером около 4 мкм, покрытыми нуклеиновыми кислотами, которые, попадая в клетки вместе с этими частицами при обстреле, успешно размножаются в них. 4. Идентификация клеток-реципиентов, которые приобрели нужный нам ген После манипуляций по переносу генов, как правило, лишь небольшая часть клеток содержит необходимый ген. Отбор клеток, включивших нужный нам ген, проводят в две стадии. Первая стадия- отбор клеток, несущих соответствующий нектор, послуживший для трансплантации гена. Такой отбор проводится по генетическим маркерам, которыми заранее метят вектор- чаще всего это маркерные гены устойчивости к какому-либо антибиотику, что помогает обнаружить клетки, включившие вектор, при их высеве на среду с этим антибиотиком. Вторая стадия- поиск клеток, несущих не только вектор, но и нужный нам ген. Для этого используют две группы методов. 1. Методы, основанные на непосредственном анализе ДНК клеток-реципиентов: а) определение нуклеотидной последовательности ДНК клеток, предположительно содержащих искомый ген; б) гибридизация выделенной из клеток ДНК со специально меченым зондом, в качестве которого используют или интересующий нас ген или соответствующую ему иРНК. Для этого предварительно изолированную ДНК переводят в одноцепочечное состояние и вводят ее во взаимодействие с одноценочечным же ДНК- или РНК-зондом. Далее определяют присутствие двуцепочечных гибридных молекул ДНК. 2. Методы, основанные на идентификации признака, кодируемого геном: а) непосредственный отбор клеток, синтезирующих белок- продукт работы пересаженного гена, или клеток, образующих соединение, в синтезе которого участвуют ферменты, кодируемые геном; б) использование селективных сред, поддерживающих рост только тех клеток, которые получили ген; в) иммунологическое обнаружение с помощью готовых антител к белку, им закодированному. ^ Методы клеточной селекции Одно из направлений клеточных технологий — это использование их в селекции, которое облегчает и ускоряет традиционный селекционный процесс в создании новых форм и сортов растений. Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro условно можно разделить на две группы. Первая группа — это вспомогательные технологии, которые не подменяют обычную селекцию, а служат ей. К ним можно отнести: оплодотворение in vitro (преодоление прогамной несовместимости), культивирование семяпочек и незрелых гибридных зародышей (преодоление постгамной несовместимости), получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор, криосохранение изолированных клеток, тканей и органов, клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Вторая группа методов ведет к самостоятельному, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений: клеточная селекция с использованием каллусной ткани, соматическая гибридизация (слияние изолированных протопластов и получение неполовых гибридов), применение методов генной инженерии. В отдаленной гибридизации находят применение такие методы культуры изолированных тканей, как оплодотворение in vitro, эмбриокультура (выращивание изолированных зародышей на искусственных питательных средах), клональное микроразмножение ценных гибридов, а также получение гаплоидов in vitro и криосохранение. ^ проводится в том случае, когда невозможно осуществить оплодотворение между выбранными парами в естественных условиях. Это вызвано несколькими причинами: 1) физиологические (несоответствие во времени созревания пыльцы и т. д.); 2) морфологические (короткая пыльцевая трубка или блокирование роста ее на разных этапах развития и т. д.). Оплодотворение in vitro можно осуществить двумя способами: а) культивирование на искусственной агаризованной питательной среде завязи с нанесенной на нее готовой пыльцой; б) завязь вскрывается и на питательную среду переносятся кусочки плаценты с семяпочками, вблизи которых или непосредственно на ткани плаценты культивируется готовая пыльца. Визуально определить, прошло оплодотворение in vitro или нет, можно по быстро увеличивающимся в размерах семяпочкам. Сформировавшийся зародыш, как правило, не переходит в состояние покоя, а сразу прорастает и дает начало гибридному поколению. Плацентарное оплодотворение in vitro позволило преодолеть несовместимость в скрещивании сортов культурного табака N. tabacum с дикими видами N. rosulata и N. debneyi и сделало возможным получение межвидовых гибридов табака в опытах М.Ф. Терновского и др. (1976), Шинкаревой (1986). Постгамная несовместимость при отдаленной гибридизации возникает после оплодотворения. Часто при этом образуются щуплые невсхожие семена. Причиной может быть расхождение во времени развития зародыша и эндосперма. Из-за слабого развития эндосперма зародыш бывает неспособен к нормальному прорастанию. В таких случаях из зрелой щуплой зерновки изолируют зародыш и выращивают его в питательной среде. Выращивание зародышей в искусственной питательной среде называется эмбриокультурой. Среда для выращивания зрелого зародыша может быть простой, без добавок физиологически активных веществ (например, среда Уайта) или любая другая, содержащая минеральные соли и сахарозу. При более отдаленных скрещиваниях нарушения в развитии зародыша могут наблюдаться уже на ранних этапах, что выражается в отсутствии дифференцировки, замедленном росте. В этом случае культура зародыша состоит из двух этапов — эмбрионального роста зародыша, во время которого продолжается его дифференцировка, и прорастания подросшего зародыша. Для первого этапа требуется более сложная по составу среда с повышенным содержанием сахарозы, с добавками различных аминокислот, витаминов и гормонов. Применение эмбриокультуры в селекции приобретает в последнее время большое значение для получения отдаленных гибридов зерновых, злаковых и других сельскохозяйственных культур. Показана возможность увеличения выхода пшенично-ржаных гибридов путем доращивания незрелых зародышей, а также использования эмбриокультуры для преодоления постгамной несовместимости при гибридизации пшеницы с колосняком. Метод эмбриокультуры находит все более широкое применение в межвидовой гибридизации овощных растений. Для лука разработаны приемы выращивания in vitro абортивных зародышей от гибридных семян с разных этапов эмбриогенеза, выращивание зародышей от частично фертильных межвидовых гибридов. Культура изолированных зародышей используется в селекции томатов и других овощных растений. Исследована гормональная регуляция роста и развития зародышей томата in vitro . Обсуждается возможность применения эмбриокультуры для получения отдаленных гибридов подсолнечника, изучаются факторы, контролирующие рост и развитие in vitro зародышей подсолнечника, выделенных в разные сроки после опыления. Культура изолированных зародышей как вспомогательный метод при отдаленной гибридизации применяется не только для преодоления постгамной несовместимости, но также с целью микроразмножения ценных гибридов. В этом случае микроразмножение идет путем каллусогенеза, индукции морфогенеза и получения растений-регенерантов из каллусной ткани. Техника клонирования незрелых зародышей позволяет размножать ценные генотипы растений на ранних стадиях жизненного цикла. Еще одна возможность применения культуры зародышей — использование ее в клеточной селекции. ^ Клетки в культуре in vitro отличаются по морфологии, по биохимическим свойствам, по физиологическому состоянию и генетически. Разнообразие (вариабельность) среди клеточных линий или растений-регенерантов называют сомаклональной вариабельностью. Генетическая природа и механизм возникновения сомаклональной изменчивости пока мало изучены. Однако четко можно выделить зависимость возникновения сомаклональных вариантов, прежде всего, от генетической гетерогенности соматических клеток исходного экспланта, генетической и эпигенетической изменчивости, индуцируемой условиями культивирования in vitro , а также от генотипа и исходного экспланта. Полиморфизм культивируемых клеток можно объяснить видовыми и возрастными особенностями, уровнем плоидности, влиянием состава питательной среды и условий культивирования, отсутствием коррелятивных связей. Последний фактор, ведущий к нарушению жесткой регуляции, существовавшей в целом растении, видимо, является основной причиной спонтанной изменчивости клеток in vitro . Любой фрагмент растения представляет собой мозаику различных тканей, и в зависимости от того, какая ткань даст начало каллусу, возникшие даже из одинаковых эксплантов каллусы будут гетерогенными и отличающимися друг от друга. Одинаковых, в полном смысле, эксплантов в природе быть не может, следовательно, неоднородность исходного материала (видовая, возрастная, физиологическая) предопределяет разнокачественность клеток в культуре. Физиологическая гетерогенность состоит в том. что клетки в популяции находятся в разном физиологическом состоянии, т. е. делятся, растут, стареют, погибают. Такая культура называется асинхронной. Заставить популяцию клеток высших растений проходить фазы клеточного цикла одновременно, т. е. синхронизировать их. почти невозможно. Потому что та часть клеток, которая способна в данный момент к делению, составляет 2—4%. Неблагоприятные условия (низкая температура, исключение важных компонентов питания), задерживающие деление, в какой-то степени способствуют накоплению числа клеток, готовых к делению. Более эффективны некоторые химические вещества, блокирующие определенные стадии подготовки к делению. В лучших случаях синхронизация может быть достигнута у 10—30% клеток, но при последующих делениях популяция опять быстро утрачивает синхронность. Следует подчеркнуть, что физиологическая вариабельность клеток в суспензионной культуре меньше по сравнению с культурой каллусной ткани на агаре, что связано с более однородными условиями питания, аэрации и удаления токсических метаболитов из клеточного окружения в жидкой перемешиваемой среде. Гетерогенность культивируемых клеток обусловлена генетической, эпигенетической и модификационной изменчивостью. Генетические, или мутационные, изменения приводят к изменению генотипа, которое может быть унаследовано. Мутации (изменения количества или структуры ДНК) происходят на генном, хромосомном и геномном уровнях. Генная, или точечная, мутация означает изменение структуры ДНК в одном локусе. Генные мутации приводят к сильным или слабым изменениям морфологических, биохимических и физиологических свойств клетки. Мутации, возникающие в результате изменения макроструктуры хромосом, называются хромосомными мутациями, или хромосомными аберрациями (перестройками). Структурные перестройки хромосом возникают в результате инверсии, делеции, дупликации, транслокации и транспозиции. Геномные мутации связаны с изменением числа хромосом в ядре, т. е. с изменениями в кариотипе. Все виды названных генетических изменений имеют место у клеток in vitro . Наиболее подробно исследована хромосомная изменчивость клеток in vitro. Даже клетки одной и той же ткани, выращиваемые в одном сосуде, могут значительно различаться между собой по хромосомным наборам (диплоидные, полиплоидные, анеуплоидные). Причины генетической изменчивости многообразны: 1) нарушение коррелятивных связей при выделении первичного экспланта из растения, т. е. отсутствие организменного контроля; 2) действие компонентов среды; 3) влияние продуктов метаболизма, накапливающихся в среде; 4) гетерогенность исходного материала и селекция клеток определенного типа. Хромосомная изменчивость является результатом нарушений митоза, называемых эндомитозом и эндоредупликацией. При эндомитозе происходит спирализация хромосом и начинается митоз, но нарушается веретено деления, сохраняется оболочка ядра, хромосомы не расходятся и деспирализуются внутри ядерной оболочки. Это приводит к возрастанию числа.хромосом, увеличению размеров ядра и клеток. Эндоредупликация не сопровождается образованием хромосом и делением ядра, хотя содержание ДНК в ядре тоже увеличивается. К образованию полиплоидных и анеуплоидных клеток также приводят нарушения в митозе, связанные с неправильным распределением хромосом. Клетки различного уровня плоидности различаются по скорости деления и роста, по устойчивости к неблагоприятным воздействиям, начинают конкурировать, и одни из них начинают преобладать. Такой процесс возрастающего доминирования в популяции клеток определенного типа называется клеточной селекцией. Доминирование может быть вызвано преимущественной пролиферацией одних клеток или успешной элиминацией (удалением) других. Такую селекцию правильнее называть автоселекцией, потому что она протекает спонтанно, без специального воздействия какими-либо стрессовыми факторами. В процессе автоселекции формируется наиболее приспособленный к данным условиям кариотип. Вероятно, клетки приспосабливаются к новым условиям существования путем отбора более жизнеспособных полиплоидных клеток. Интересно, что изменение условий выращивания меняет направление отбора. Показано, например, что высокие концентрации 2,4-Д и кинетина увеличивают возможность полиплоидизации. То, что условия выращивания играют важную роль в формировании цитогенетической гетерогенности, хорошо видно из опытов с тканью гаплопаппуса. В лаборатории Р.Г. Бутенко в течение двух лет культивировались меристематические клетки этого растения, пассажи проводились раз в месяц. В итоге исходные диплоидные клетки на 95% приобрели другие уровни плоидности. Шведский исследователь Т. Эриксон, работая с этой же тканью, пересаживал ее на свежую питательную среду через каждые 2 дня. При этом штамм сохранил стабильную диплоидную характеристику. Однако способ выращивания не может полностью гарантировать генетическую стабильность в популяции клеток, так как генетической гетерогенностью может обладать сам исходный материал. У многих растений дифференцированные ткани имеют клетки разной плоидности. Специализированные клетки, например клетки зеленой ассимилирующей паренхимы листа, запасающих тканей мясистых корней, клубней, зачастую являются полиплоидными. Спонтанное или индуцированное каким-либо фактором образование различных вариантных форм растений можно использовать для улучшения уже существующих сортов сельскохозяйственных культур. Как было отмечено, клетки in vitro становятся разнокачественными также благодаря эпигенетическим изменениям, т е. изменениям в программе считки генов или потенции к их активации. Эти изменения генной активности являются наследуемыми. К ненаследуемым изменениям у клеток в культуре относятся модификационные изменения, которые в большинстве носят адаптивный, приспособительный характер. Эти изменения не затрагивают генетических структур клетки, они соответствуют физиологической адаптации, при которой границы изменений не превышают норму реакции, обусловленной генотипом. Гетерогенность клеток in vitro возрастает с увеличением продолжительности их культивирования. Различные типы морфогенеза — соматический эмбриогенез или органогенез—также могут по-разному сказываться на генетических изменениях и, соответственно, на фенотипе растений. Экспериментально установлено, что при соматическом эмбриогенезе время прохождения цикла клетка — растение значительно короче, чем при органогенезе, поэтому степень сходства получаемого материала и исходного родительского генотипа может быть значительно выше. Сомаклональные варианты имеют, несомненно, практическое применение в сельскохозяйственной практике, в силу появления форм, отличающихся от родительских по различным биохимическим, качественным и количественным признакам, а также цитогенетическим характеристикам. Например, получены сомаклоны картофеля сорта Зарево, отличающиеся высокой урожайностью, повышенной устойчивостью к заболеваниям, более высоким содержанием в клубнях протеина и крахмала. Причем наследование важных признаков при размножении клубнями сохранялось в течение трех лет полевых испытаний (В.В. Сидоров и др., 1984, 1985). Для растений табака получены через каллусную культуру сомаклоны, устойчивые к вирусу табачной мозаики. В настоящее время метод культуры тканей начал широко использоваться в селекции не только кормовых и технических культур, но и декоративных и лекарственных растений. Примером тому может служить новый сорт пеларгонии Velvet Rose, полученный через каллусную культуру. Таким образом, полученные положительные результаты свидетельствуют о необходимости более эффективного внедрения различных приемов получения сомаклональных вариантов в практику селекционной работы, и наиболее реальным является применение сомаклональной изменчивости для улучшения или «доработки» уже существующих сортов или линий по отдельным недостающим признакам. Несмотря на то, что существует генетическая нестабильность культур изолированных тканей и клеток растений, она не может обеспечить потребности селекционеров в генетическом разнообразии. В связи с этим для ускорения селекционного процесса в культуре клеток используются химические и физические мутагены. Обработка ткани раувольфии змеиной азотистым ипритом в концентрации 2,5 * 10-3 М привела к повышению уровня аберраций хромосом в первом пассаже до 32%, вызвала сдвиг популяции в сторону увеличения триплоидов. В результате удалось получить штамм с более высокой биосинтетической активностью по сравнению с исходной тканью. Спонтанный и индуцированный мутагенез в культуре клеток, тканей и протопластов позволяет получать растения, представляющие практический интерес для селекционеров. Важное практическое значение имеет создание форм растений, устойчивых к неблагоприятному действию факторов внешней среды, таких как низкие температуры, засоление почв, загрязнение природной среды токсическими веществами, поражение вредителями и возбудителями болезней. Эти факторы могут быть использованы в качестве селективного фона в процессе клеточной селекции. Клетки, сохранившие при этом жизнеспособность, могут быть регенерированы в целые растения. Принципиальной разницы в результатах клеточной селекции при спонтанном и индуцированном мутагенезе нет. Для повышения частоты мутаций в соматических клетках обычно используют такие мутагены, как нитрозогуанидин, нитрозометилмочевина, метилметансульфонат. Реже применяют облучение ультрафиолетом, γ-квантами 60Со и нейтронами. В качестве селективных агентов используют антибиотики, ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот, аналоги пуриновых и пиримидиновых оснований, фито- и патотоксины, агенты, вызывающие солевой и водный стресс, аналоги аминокислот и т.д. Для проведения клеточной селекции используют следующие приемы: — прямая (позитивная) селекция, при которой выживает лишь определенный искомый мутантный тип клеток; — непрямая (негативная) селекция, основанная на избирательной гибели делящихся клеток дикого типа и выживания метаболически неактивных клеток, но требующая дополнительной идентификации у них мутационных изменений; — тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются все клеточные клоны; — визуальная селекция и неселективный отбор, когда вариантная линия может быть идентифицирована среди всей популяции клеток визуально или при использовании биохимических методов (тонкослойная или жидкостная хроматография, радиоиммунный анализ, микроспектрофотометрия и др.). Из перечисленных выше приемов клеточной селекции прямая селекция является наиболее распространенным методом и используется главным образом для выделения растений-регенерантов, устойчивых, например, к гербицидам, антибиотикам, токсинам, тяжелым металлам, солям и другим антиметаболитам. ^ Для проведения работ по клеточной селекции растений в условиях in vitro в качестве объекта исследования могут быть использованы каллусные, суспензионные культуры или изолированные протопласты. Выбор объекта зависит от наличия разработанных технологий применительно к различным видам растений, а также от конечных целей исследования. Каллусная ткань представляет собой легко доступный материал, который наиболее часто используют для клеточной селекции. Как правило, работу проводят на первичной или пересадочной каллусной ткани, которая не утрачивает способности к регенерации на протяжении ряда субкультивирований. Однако при работе с каллусными культурами многие исследователи отмечают существенные недостатки данного объекта: медленный рост ткани, неравноценное для всех клеток действие токсических веществ, которые применяются в качестве селективного фактора, а также потеря регенерационной способности в процессе культивирования каллусных клеток. Несомненно, проводить селекцию целесообразно на уровне одиночных клеток (суспензионная культура, протопласты). Однако для многих видов растений не разработаны эффективные технологии и способы культивирования одиночных клеток. Поэтому, несмотря на перечисленные выше недостатки использования каллусных культур, этот способ селекции остается для некоторых видов растений пока единственным. Получение стабильно устойчивых линий — процесс длительный. Как правило, селекция начинается с получения достаточного количества каллусной массы из изолированных растительных эксплантов, использующейся в дальнейшем для определения концентрации селективного фактора (построение дозовой кривой), при которой наблюдается одновременно рост каллусной ткани, и в то же время часть каллусных колоний погибает. Выбранная концентрация селективного фактора признается оптимальной и используется в дальнейших экспериментах. Так как первично полученные на средах с селективными факторами колонии клеток могли возникнуть вследствие физиологической адаптации или определенного состояния дифференцировки клеток и не быть генетически устойчивыми, то в течение последующих 4—6 субкультивирований на селективной среде проверяется стабильность устойчивости полученных клонов. Затем их переносят на среду без селективного фактора и субкультивируют еще 2—3 пассажа. И только после повторного возвращения в селективные условия отбирают стабильные клоны, из которых пытаются получить растения-регенеранты. Однако работы, проведенные с получением растений, устойчивых к повышенным солям, а также к токсинам, выделенным из грибов—возбудителей болезней, показали, что устойчивость клетки и растения к исследуемому селективному фактору может совпадать и не совпадать. Прямая корреляция между устойчивостью растений и клеток in vitro отмечена лишь для низких температур, устойчивостью к гербицидам, высоким концентрациям алюминия и другим факторам. Большое число работ по культивированию каллуса, с целью получения нового селекционного материала, проведено на пшенице, ячмене, рисе, сорго, а также на картофеле, томатах, люцерне и, крайне редко, на древесных. Уже достигнуты первые положительные результаты по получению растений пшеницы, риса, картофеля, устойчивых к NaCI или Na2S04. Получены клетки, а из них растения моркови, которые синтезируют в 20 раз больше метионина, в 30 раз — триптофана, в 5 раз — лизина путем добавления в питательную среду токсичных аналогов аминокислот. Для картофеля получены растения, устойчивые к кольцевой гнили. Что касается древесных, то для них работы в этом направлении крайне редки и часто имеют поисковый характер. Таким образом, использование каллусной культуры в селекционных целях открывает огромные возможности в создании новых форм растений, несущих ценные признаки, необходимые для человечества. Наряду с перечисленными выше объектами (каллусная, суспензионная культура, изолированные протопласты), в качестве исходного материала для селекции могут быть использованы культуры соматических или андрогенных эмбриоидов, такие органогенные экспланты, как сегменты листьев или различные меристематические и стеблевые части растений, а также культура изолированных зародышей. Например, путем культивирования и селекции in vitro зародышей из семян получены растения ячменя, устойчивые к аналогам аминокислот, с улучшенным содержанием белка. Для картофеля разработан эффективный метод обработки побегов и черенков мутагеном, приводивший к получению химерных мутантов хлорофиллдефектности и антибиотикоустойчивости. При культивировании пыльников яровой пшеницы сорта Саратовская-29 и Московская-35 на питательных средах с повышенным содержанием солей хлорида натрия получены соматические эмбриоиды, а в дальнейшем растения-регенеранты, проявившие повышенную солеустойчивость (Беккужина, 1993). Таким образом, проведение селекции на клеточном уровне позволяет создавать новые формы растений в 2—4 раза быстрее по сравнению с традиционными способами селекции. |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2019
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям