«Об улучшении медицинской помощи больным с гнойными хирургическими заболеваниями и усилении мероприятий по борьбе с внутрибольничной инфекцией»
|
|
Скачать 1.06 Mb.
|
|
Приложение № 2 к приказу Минздрава СССР от 2 августа 1978 г. № 720 Инструкция по бактериологическому контролю комплекса санитарно-гигиенических мероприятий в лечебно-профилактических учреждениях (отделениях хирургического профиля, в палатах и отделениях реанимации и интенсивной терапии) 1. Общие положения 1.1. Инструкция по бактериологическому контролю комплекса санитарно-гигиенических мероприятий и контролю стерильности изделий медицинского назначения предназначена для работников бактериологических лабораторий и дезинфекционных станций системы Министерства здравоохранения, осуществляющих бактериологический контроль. 1.2. Бактериологические лаборатории санитарно-эпидемиологических и дезинфекционных станций проводят контроль не реже двух раз в год, бактериологические лаборатории лечебных учреждений контролируют санитарно-гигиенический режим (обсемененность различных объектов и воздуха) один раз в месяц, а контроль стерильности инструментов, перевязочного материала, операционного белья, рук хирургов и кожи операционного поля (выборочно) - 1 раз в неделю. 1.3. Объектами исследования при проведении бактериологического контроля являются: - воздушная среда; - различные объекты внешней среды; - хирургический инструментарий; - шприцы, иглы; - системы переливания крови многократного использования; - зонды, катетеры, бужи, резиновые перчатки и др. изделия из резины и пластикатов; - хирургический шовный материал, подготовленный к использованию; - руки хирургов и кожа операционного поля. 2. Методика микробиологических исследований 2.1.Исследование микробной обсемененности воздушной среды. 2.1.1.Бактериологическое исследование воздушной среды предусматривает: - определение общего содержания микробов в 1 м3 воздуха. - определение содержания зол. стафилококка в 1 м3 воздуха. 2.1.2. Отбор проб воздуха для бактериального исследования проводят в следующих помещениях: - операционных блоках; - перевязочных; - послеоперационных палатах; - отделениях и палатах реанимации и интенсивной терапии и др. помещениях, требующих асептических условий. 2.1.3. Пробы воздуха отбирают аспирационным методом с помощью аппарата Кротова. Скорость протягивания воздуха составляет 25 л в минуту. Количество пропущенного воздуха должно составлять 100 литров для определения общего содержания бактерий и 250 литров для определения наличия зол. стафилококка. Исследование воздуха седиментационным методом допускается в исключительных случаях. 2.1.4. Для определения общего содержания бактерий в 1 м2 воздуха забор проб проводят на 2% питательном агаре. Посевы инкубируют при температуре 37 град. С в течение 24 часов, затем оставляют на 24 часа при комнатной температуре, подсчитывают количество колоний, выросших и производят перерасчет на 1 м3 воздуха. Если на чашках питательного агара выросли колонии плесневых грибов, их подсчитывают и делают пересчет на 1 м3 воздуха. В протоколе количество плесневых грибов указывают отдельно. Примечание: При переносе аппарата Кротова из одного помещения в другое его поверхность обрабатывают дезинфицирующим раствором. Столик, внутренние стыки и крышку прибора с внутренней и внешней стороны протирают спиртом (70 град.) 2.1.5. Для определения наличия зол. стафилококка забор проб проводят на желточно-солевой агар (ЖСА). Чашки помещают в термостат при 37 град. С на 24 часа и выдерживают еще 24 часа при комнатной температуре. Колонии, подозрительные на стафилококк, подлежат обязательной микроскопии и дальнейшей идентификации. С желточно-солевого агара снимают в первую очередь колонии стафилококка, которые образуют радужный венчик вокруг колонии (положительная лецитовителлазная реакция), дальнейшему изучению подвергаются также пигментированные колонии и с отрицательной лецитовителлазной реакцией. Подозрительные колонии пересевают на чашки с кровяным или молочным агаром. Дальнейшее изучение их проводят по схеме. Схема бактериологического исследования на стафилококк. 1. Первый день. Посев на элективные среды (желточно-солевой, молочно-солевой или молочно-желточно-солевой агар). Засеянные среды выдерживают в термостате при 37 град. С в течение 2 суток либо одни сутки в термостате и дополнительно 24 часа на свету при комнатной температуре. 3. Второй - третий день. Просмотр чашек, фиксация в журнале характера и массивности роста. На выше указанных средах стафилококк растет в виде круглых, блестящих, маслянистых, выпуклых, пигментированных колоний. На средах, содержащих желток, зол. стафилококк, выделенный от человека, в 60-70% случаев образует радужный венчик вокруг колонии (положительная лецитовителлазная реакция). Стафилококки животного происхождения дают положительную лецитовителлазную реакцию в 5-10% случаев. Отвивка на скошенный агар для дальнейшего исследования не менее 2-х колоний, подозрительных на стафилококк. Для исследования отвивают прежде всего колонии, дающие положительную лецитовителлазную реакцию. При отсутствии на чашках таких колоний дальнейшему исследованию подвергаются пигментированные колонии, схожие по морфологии со стафилококком. При одновременном наличии на чашках колоний стафилококка, отличающихся по пигменту, следует отвивать не менее двух колоний различного вида. Пробирки с посевом помещают в термостат при 37 град. С на 18-20 часов. 4. Четвертый день. После суточной инкубации у выделенных штаммов проверяют морфологию, тинкториальные свойства (окраска по Граму) и наличие плазмокоагулирующей активности. Следует отметить, что характер роста культуры на скошенном агаре в ряде случаев дает возможность «предвидеть» принадлежность ее к виду золотистого стафилококка или эпидермального стафилококка. Первые, как правило, дают обильный равномерный, сочный рост, вторые - очень скудный и неравномерный рост по ходу посева. Окраску по Граму проводят общепринятым методом. Под микроскопом окрашенные по Граму стафилококки имеют вид фиолетово-синих кокков, располагающихся гроздьями или небольшими кучками («кружево»). Плазмокоагулирующую активность проверяемой в реакции коагуляции плазмы (РКП). С учетом результатов РКП и лецитовителлазной активности в 70-75% случаев, на четвертый день исследования может быть подтверждена принадлежность выделенного штамма к виду зол. стафилококка и выдан соответствующий ответ. На схеме представлены возможные варианты сочетаний результатов определения плазмокоагулирующей и лецитовителлазной активности. Если культура обладает только плазмокоагулирующей или только лецитивителлазной активностью, то для окончательного ответа требуется определение других признаков патогенности (ферментации маннита в аэробных условиях - АФМ или ДНК-азной активности). В этих случаях ответ выдают в зависимости от результатов, полученных при определении названных признаков. В случае необходимости на 4-ый день исследования может быть поставлена реакция определения ДНК-азной активности или анаэробной ферментации маннита. Определение антибиограммы проводят только после выделения чистой культуры по показаниям (выбор способа лечения и т.д.). Выделенные культуры золотистого стафилококка подлежат типированию. 5. Пятый день. Учет результатов фаготипирования, определения чувствительности к антибиотикам, ДНК-азной активности. Окончательная выдача ответа. Критерии оценки микробной обсемененности воздуха в хирургических клиниках
2.2. Исследования микробной обсемененности объектов внешней среды. 2.2.1. Бактериологическое исследование микробной обсемененности предметов внешней среды предусматривает выявление синегнойной палочки, бактерий группы кишечных палочек и аэромонад (строго по показаниям). Забор проб с поверхностей различных объектов осуществляют методом смывов. 2.2.2. Взятие смывов производят стерильным ватным тампоном на палочках, вмонтированных в пробирки, или марлевыми салфетками размером 5х5 см, простерилизованными в бумажных пакетах или в чашках Петри. Для увлажнения тампонов в пробирки с тампонами наливают по 2,0 мл стерильного физиологического раствора. При использовании салфеток стерильный физиологический раствор разливают в стерильные пробирки по 20 мл. Салфетку захватывают стерильным пинцетом, увлажняют физиологическим раствором из пробирки, после протирания исследуемого объекта помещают в ту же пробирку. 2.2.3. При контроле мелких предметов смывы забирают с поверхности всего предмета. При контроле предметов с большой поверхностью смывы проводят в нескольких местах исследуемого предмета площадью примерно в 100 - 200 см2. 2.4. Для выделения стафилококков делают посев непосредственно на чашку Петри с желточно-солевым агаром (см. схему исследования на стафилококк). Кроме того, в качестве среды накопления используют бульон с 6,5% хлористого натрия, бульон с 1% глюкозы, разлитые в пробирки по 0,5 мл, в которые засевают по 0,2-0,3 мл смывной жидкости. Засеянные пробирки инкубируют при 37 град. С в течение 20-24 часов, после чего делают высев на ЖСА (см. схему исследования на стафилококк). 2.2.5. Для выявления бактерий группы кишечных палочек производят посев на среду обогащения, для чего тампон (марлевую салфетку погружают в 10-20% желчный бульон или среду Кесслера. Через сутки инкубирования при 37 град. С делают пересев на среду Эндо. Подозрительные колонии на среде Эндо микроскопируют и пересевают на 2-ую бродильную пробу - среду Гисса с глюкозой. Среду выдерживают 24 часа при 43 град. С. Примечание: При использовании свиной желчи для приготовления желчного бульона концентрация желчи должна быть в 20 раз меньше. 2.2.6.Для выявления синегнойной палочки специальные посевы можно не производить. Обычно колонии синегнойной палочки удается выявить на кровяном агаре или на среде Эндо. Колонии, подозрительные на синегнойную палочку, пересевают на скошенный агар, содержащий 2-5% глицерина или маннита. Колонии синегнойной палочки дают на поверхности скошенного агара обильный рост с зеленоватым оттенком, маслянистой консистенции с характерным медовым запахом. Выделенную культуру окрашивают по Граму, микроскопируют, определяют гемолитические свойства путем высева на чашку с кровяным агаром. Ориентировочный перечень объектов, подлежащих бактериологическому контролю: А. Наркозная комната 1. Инкубационная трубка 2. Маска наркозного аппарата 3. Тройник наркозного аппарата 4. Гофрированная трубка 5. Ларингоскоп 6. Роторасширитель 7. Дыхательный мешок 8. Руки врачей-анестезиологов-реаниматологов, сестер-анестезистов. Б. Предоперационная 1. Тазы для мытья рук хирургов 2. Чистые щетки для мытья рук 3. Фартуки (клеенчатые или полиэтиленовые) В. Операционная 1. Рабочий стол анестезиологов 2. Операционный стол 3. Шланг вакуум-насоса 4. Шланг кислородной подводки 5. Смывы с рук всех участвующих в операции 6. Кожа операционного поля Г. Послеоперационные палаты, отделения и палаты реанимации и интенсивной терапии 1. Кровать, подготовленная для больного 2. Полотенце для рук персонала и смывы с рук 3. Щетка на раковине 4. Шланг кислородной подводки 5. Запасная наркозная аппаратура (набор реанимационной укладки) 6. Шланг вакуумотсоса 7. Внутренняя поверхность холодильника (для хранения лекарств, градусников) 8. Градусники Д. Перевязочные 1. Кушетка для перевязок 2. Полотенце для рук персонала 3. Щетка на раковине 4. Халат медицинских сестер 5. Руки врачей, медицинских сестер 6. Рабочий медицинский стол 7. Внутренняя поверхность холодильника для хранения лекарств 3. Правила отбора проб для контроля стерильности в лечебно-профилактических учреждениях 3.1. Забор проб на стерильность проводит операционная сестра под руководством сотрудника бактериологической лаборатории, в стерильные емкости с соблюдением строжайших правил асептики непосредственно перед проведением операции. 3.2. Для контроля стерильности используют следующие питательные среды: - сахарный бульон Хоттингера (0,5 и 1% глюкозы); - тиогликолевую среду; - бульон Сабуро. Одновременный посев изделий на 3 вышеуказанные среды обязателен. При посеве изделия или его части непосредственно в питательную среду количество среды в пробирке (колбе, флаконе и т.д.) должно быть достаточным для полного погружения изделия или его части. 3.3. Посевы в бульон Хоттингера и тиогликолевую среду выдерживают в термостате при температуре 37 град. С, среду Сабуро - при температуре 20-22 град. С. Посевы инкубируют в термостате в течение 14 суток. 3.4. Описание состава, способа приготовления и правила контроля стерильности: питательных сред изложены в приложении 1. 4. Мероприятия, обеспечивающие асептические условия при посевах 4.1. Требования к помещению для посева на стерильность. 4.1.1.Посев исследуемого материала желательно проводить в настольных боксах с ламинарным потоком воздуха. Эти боксы размещают в отдельных помещениях бактериологической лаборатории. При отсутствии боксов с ламинарным потоком воздуха контроль стерильности проводят в боксированных помещениях (бокс с предбоксником). Общая площадь бокса должна быть не менее 3 м2. 4.1.2. В боксированном помещении стены должны быть окрашены масляной краской и выложены картельной плиткой, не должны иметь выступов, карнизов, трещин; пол в боксе и рабочий стол должны быть покрыты линолеумом, стенки и ножки стола - покрашены масляной краской. 4.1.3. Боксы оборудуют приточно-вытяжной вентиляцией (с преобладанием притока над вытяжкой), в них подается стерильный воздух, проходящий через бактериальные фильтры с материалом Петрянова. 4.1.4. В боксе и предбокснике устанавливают настольные (БОН) и потолочные (ОБП) ультрафиолетовые облучатели из расчета вт. удельной мощности ламп, создающих прямое излучение на 1 м2 помещения. Облучатели размещают на высоте 2-2,5 м от пола. 4.1.5. Для тушения пожара в боксированном помещении должны быть в наличии противопожарные средства, углекислотные огнетушители типа ОУ-2 из расчета один огнетушитель на предбоксник и бокс. 4.2. Подготовка бокса, инструментов и персонала к работе. 4.2.1. Ежедневно до проведения работы помещения бокса и предбоксника подвергают тщательной обработке. Стены, пол, поверхности инвентаря протирают раствором, содержащим 3% перекиси водорода и 0,5% моющего средства (Триас-А, Прогресс, Астра, Лотос). В случае обнаружения в воздухе грибов или споровых форм микроорганизмов, влажную уборку проводят 6% раствором перекиси водорода с 0,5% выше перечисленных моющих средств. Внутреннюю поверхность настольного бокса обрабатывают так же, как и помещение бокса. Через 45-60 минут после обработки в бокс вносят все необходимое для работы материалы и инструменты, кроме образцов продукции. 4.2.2. Перед внесением материалов в настольном боксе включают вентиляцию на время, достаточное для обеспечения полного обмена воздуха в нем. 4.2.3. За 1,5-2 часа до начала работы в боксе и предбокснике на 1,5-1 час включают бактерицидные лампы. 4.2.4. Инструменты, посуду и спецодежду, используемые в работе, предварительно стерилизуют и тканевые изделия обрабатывают при следующем режиме: температура 132 град. С+-2 град. С, время стерилизационной выдержки - 20 мин.; изделия из резины (перчатки и т.д.) - при температуре 120 град. С +2 град. С в течение 45 минут. В процессе работы вспомогательный инструмент - 2-3 раза заменяют новым стерильным комплектом. 4.2.5. Перед входом в бокс работники лаборатории тщательно моют руки теплой водой с мылом и щеткой, вытирают стерильным полотенцем, одевают в предбокснике на ноги бахилы, стерильные халаты, 4-слойные маски, шапочки, стерильные перчатки. 4.2.6. В процессе посева в боксе регулярно проверяют обсемененности воздуха. Для этого на рабочий стол ставят 2 чашки с мясо-пептонным агаром (МПА), открывая их на 15 минут, затем чашки помещают в термостат при температуре 37 град. С на 48 часов. Допускается более трех колоний неспорообразующих сапрофитов. В случае роста на чашках более 3 колоний проведение дальнейших работ в данном боксе запрещается. В боксе дополнительно проводят тщательную обработку 6% раствором перекиси водорода с 0,5% моющего средства. 4.2.7. Контроль стерильности изделий проводят путем погружения в питательные среды. В исключительных случаях, когда необходимо проверить стерильность инструмента больших размеров, пробы забирают методом смыва стерильной марлевой салфеткой размером 5х5 см2, предварительно увлажненной стерильным физиологическим раствором или стерильной водопроводной водой. 4.2.8. Перед посевом исследуемый материал вносят в предбоксник, предварительно снимая наружную мягкую упаковку. В предбокснике пакеты, биксы протирают снаружи с помощью стерильного пинцета (корнцанга) стерильной салфеткой (ватным тампоном), обильно смоченной 6% раствором перекиси водорода, перекладывают на стерильный лоток и оставляют на 30 минут. При поступлении изделий в мягкой упаковке первый слой снимают в предбокснике и изделия во внутренней упаковке сразу переносят в бокс. 4.2.9. Посевы на стерильность проводят бактериолог с помощью лаборанта. 5. Посевы на стерильность хирургического инструмента 5.1. Хирургический инструментарий с помощью стерильного пинцета извлекают из бикса или мягкой упаковки и целиком погружают в пробирки с питательными средами. Как исключение, в отдельных случаях, если все простерилизованные инструменты в одной упаковке крупных размеров (иглодержатели, ранорасширители и т.д.), производят смыв с поверхности инструмента стерильной салфеткой, смоченной в стерильном физиологическом растворе или стерильной водопроводной воде, и погружают салфетку в пробирку с тиогликолевой средой. Аналогичные смывы с других инструментов засевают в пробирки со средой Хоттингера и Сабуро. 5.2.6. Методика посева на стерильность игл и шприцев. Для контроля на стерильность отбирают шприцы малой емкости (1,0 или 2,0 мл) в условиях бактериологического бокса, с соблюдением правил асептики погружают в пробирки с питательными средами отдельно цилиндр, поршень, иглы. При необходимости контроля шприцев большой емкости (10, 20 мл и более) исследование стерильности производят методом смыва, при этом стерильной салфеткой, смоченной в стерильном физиологическом растворе или водопроводной воде, протирают с помощью пинцета внутренние части шприца и погружают салфетку в питательные среды. 5.3. Исследование на стерильность систем переливания крови многоразового использования. От резинового шланга, ближе к игле отрезают ножницами с помощью пинцета небольшие кусочки (1-2 см) и погружают в пробирки с питательными средами, иглу отдельно погружают в питательные среды. 5.4. Посев на стерильность катетеров, резиновых перчаток и др. изделий из резины и пластикатов. Контроль стерильности зондов, катетеров, резиновых перчаток и других изделий из резины производят путем полного погружения мелких изделий в питательные среды, от более крупных с помощью стерильного пинцета стерильными ножницами отрезают небольшие кусочки (1-2 см) и погружают в питательные среды. 5.5. Посев на стерильность хирургического шовного материала. Перед посевом емкость с отобранными образцами шовного материала в предбокснике протирают стерильной марлевой салфеткой, обильно смоченной 6% раствором перекиси водорода, и оставляют на 30 минут. Затем вносят в бокс. 5.5.1. Кетгут. Подготовленный к работе кетгут в операционном блоке хранят в спиртовом растворе йода. Кетгут перед посевом подвергают специальной обработке для нейтрализации и отмывания нейтрализующего раствора. Моток кетгута, приготовленный для исследования, перекладывают стерильным корнцангом или пинцетом в стерильный 10% раствор гипосульфита натрия. Раствор гипосульфита натрия готовят на дистиллированной воде, разливают в пробирки (колбы) по 20-30 мл, стерилизуют текучим паром по 30 минут в продолжение 3 дней. Кетгут выдерживают в растворе гипосульфита в течение 24 часов при комнатной температуре (возможно помутнение раствора за счет выпадения серы), затем перекладывают в пробирки с 20-30 мл стерильной дистиллированной воды, где также выдерживают в течение 24 часов при комнатной температуре. Непосредственно перед посевом моток кетгута извлекают стерильным пинцетом и перекладывают в стерильную чашку Петри, с помощью пинцета и ножниц его разрезают на мелкие кусочки длиной 1-2 см и раздергивают для прорастания микроорганизмов кетгута. Посев производят в 2 пробирки с тиогликолевой средой, 2 пробирки со средой Сабуро и 2 пробирки со средой Хоттингера, помещая в каждую пробирку по 4-5 кусочков исследуемого материала. 5.5.2. Шелк. Подготовленный к работе шелк в операционных хранят в спиртовом растворе, поэтому перед посевом шелк (лавсан) помещают на 24 часа в стерильную дистиллированную воду при комнатной температуре. Перед посевом моток шелка (лавсана) перекладывают в стерильные чашки Петри, разрезают на мелкие кусочки длиной 1-2 см. Посев шелка производят так же, как и кетгута. 5.6. Исследование на стерильность аппаратов экстракорпорального кровообращения. Исследование на стерильность аппарата искусственного кровообращения проводит бактериолог и лаборант лечебно-профилактического учреждения в операционной после асептической уборки аппарата. Контролю подлежат: - смыв из аппарата; - перфузат до перфузии; - кровь после перфузии. Стерильный физиологический раствор в количестве не менее 250 мл прогоняют через аппарат, подготовленный к операции, отбирают 100 мл раствора и засевают на питательные среды. Аналогично производят посев перфузата до перфузии и крови после перфузии. 5.7. Посев на стерильность перевязочного материала. Бинты, ватные шарики, марлевые салфетки, турунды и т.п. отбирают из разных мест бикса стерильным пинцетом. Мелкие изделия целиком погружают в пробирки с питательными средами. От бинтов внутренних частей) и крупных марлевых салфеток с помощью стерильных ножниц отрезают кусочки и погружают в пробирки с питательными средами. На каждый вид перевязочного материала используют по 2 пробирки каждой среды. 5.8. Посев на стерильность хирургического белья. Простерилизованными и фламбированными ножницами (смоченными в спирте и проведенными через пламя горелки) с помощью пинцета от хирургического белья отрезают небольшие кусочки ткани (завязка, внутренние швы и т.п.) и погружают в пробирки (колбы) с питательными средами, по возможности, не касаясь стенок пробирки (колбы). 6. Учет результатов Материал стерилен при отсутствии роста во всех посевах. Материал не стерилен при росте микрофлоры. 7. Бактериологический контроль эффективности обработки кожи операционного поля и рук хирургов Смывы с кожи операционного поля и рук хирургов производят стерильными марлевыми салфетками размером 5х5 см, смоченными 2 в растворе нейтрализатора (если таковой имеется) или в физиологическом растворе. Марлевой салфеткой тщательно протирают ладони, околоногтевые и межпальцевые пространства обеих рук. После забора проб марлевую салфетку помещают в широкогорлые пробирки или колбы с раствором нейтрализатора (воды или физиологического раствора) и стеклянными бусами, встряхивают в течение 10 минут, производят отмыв марлевой салфетки. Отмывную жидкость засевают глубинным способом по 0,5 мл на 2 чашки Петри с мясопептонным агаром, а марлевую салфетку - в 0,5% сахарный бульон. Посевы инкубируют при температуре 37 град. С в течение 48 часов. 8. Учет результатов Кожа и руки стерильны при отсутствии роста микроорганизмов как на твердой, так и на жидкой питательной среде. Приложение 1 Способ приготовления питательных сред, используемых для контроля эффективности стерилизации 1. Тиогликолевая среда 1.1. Состав гидролизат казеина (в пересчете на сухой остаток) - 15 г; дрожжевой экстракт (10% в пересчете на сухой остаток) - 5 г; натрий хлорид - 2,5 г глюкоза - 5 г L-цистеин - 0,75 г тиогликолевая кислота - 0,3 мл раствор резазурина 1:1000 свежеприготовленный - 1 мл агар-агар дальневосточный - 0,75 г вода дистиллированная до 1000 мл рН среды после стерилизации 7,0 - 7,2. 1.2. Приготовление. Смешивают все компоненты среды, кроме глюкозы и тиогликолевой кислоты. Цистеин предварительно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды при постепенном добавлении 10-20% раствора едкого натра до его полного растворения. Смесь подщелачивают 10% раствором едкого натра до рН 8,0 - 8,2, кипятят в котле с паровой рубашкой или на открытом огне при постоянном перемешивании до расплавления агар-агара 5-10 минут. Можно автоклавировать 20 минут при 100 град. С, затем прибавляют горячую воду до первоначального объема, прибавляют глюкозу и тиогликолевую кислоту, фильтруют через полотно, устанавливают рН 7,2 - 7,3. Добавляют раствор резазурина, смешивают и разливают в стерильные пробирки по 20 мл. Стерилизуют 20 минут при 120 град. С. Тиогликолевую среду можно хранить до посева, предохраняя ее от света, при комнатной температуре в течение не более 7 суток со дня приготовления. Примечание: 1. Допускается приготовление среды без раствора резазурина натрия. 2. Допускается применение других сортов агара, но с заранее вытитрованным количеством. 2. Питательный агар с 0,5% глюкозы 2.1. Состав. Панкреатического гидролизата казеина (в пересчете на сухой остаток) - 15 г дрожжевого экстракта (10%) (в пересчете на сухой остаток) - 5 г глюкозы - 5 г натрия хлористого (с учетом содержания в гидролизате) - 5 г агар-агара (в зависимости от плотности агара) - 10-20 г воды дистиллированной - до 1000 мл рН среды после стерилизации 7,2 - 7,4 2.2. Приготовление. Смешивают все компоненты среды, кроме глюкозы, подщелачивают 10-20% раствором NаОН до рН 8,0-8,2 и оставляют на 20-30 минут для набухания агар-агара. Затем его расплавляют в автоклаве текучим паром или в открытом котле с подогреванием в течение 30 минут, отстаивают 20-30 минут, отфильтровывают через ватный фильтр. На полученный после фильтрации объем среды добавляют глюкозу, устанавливают рН 7,3-7,5, разливают в стерильные пробирки по 5 мл. Стерилизуют при 110-112 град. С (0,5 ати) - 30 минут. Химические показания: аминный азот 30-110 хлориды 0,5-0,6% Агар годен для применения в течение 3 месяцев при хранении в холодильнике (4-10 град. С) или 1 месяц при комнатной температуре. 3. Бульон Хоттингера с 0,5% (1,0%) глюкозы 3.1. Состав Мясной перевар по Хоттингеру до разведения аминного азота на 140-160 мг% Натрий хлористый - 0,5% Глюкоза - 0,5% (1,0%) вода дистиллированная - до 1000 мл рН среды 7,2-7,4 3.2. Приготовление Смешивают мясной перевар по Хоттингеру с водой в таком соотношении, чтобы в среде содержалось 140-160 мг% аминного азота, добавляют хлористый натрий. Смесь подщелачивают 10% NаОН до рН 8,08,2, кипятят на открытом огне 10 минут или автоклавируют при 100 град. С 10 минут. Если есть выкипание, доводят объем до первоначального кипяченой или дистиллированной водой. Фильтруют через ватный тампон, прибавляют 0,5% (1,0%) глюкозы, устанавливают рН 7,3-7,5 добавлением 5% НСl. Снова фильтруют через бумажный фильтр или полотно «Бельтент». Разливают в стерильную посуду. Стерилизуют при 110 град. 30 минут. 4. Среда Сабуро 4.1. Состав. Сухой пептон ферментативный 10 г Глюкоза или мальтоза 100 г Вода дистиллированная до 1000 г рН среды после стерилизации 5,5-5,8 4.2. Приготовление В воду добавляют пептон и кипятят 10 минут. Фильтруют через полотно «Бельтент». К полученному объему после фильтрами прибавляют глюкозу или мальтозу. Если рН выше, чем 5,7, то следует подкислить 5% раствором НСl до рН 5,7. Разливают в стерильные пробирки по 10 мл. Стерилизуют при 110 град. С (0,5 кгс/см2 - 30 минут). 5. Контроль стерильности питательных сред Для контроля стерильности питательные среды после изготовления и стерилизации помещают в термостат при температуре 37 град. С на двое суток. Сахарный бульон Хоттингера и среду Сабуро контролируют полностью (всю приготовленную серию пробирок или колб). Тиогликолевую среду выдерживают при повышенной температуре до использования не допускается, поэтому от каждой серии отбирают 1% от общего числа пробирок или колб и выдерживают их в термостате при температуре 37 град. С в течение 2-х суток. Для контроля стерильности эту часть сред не используют. Подготовка посуды Новую посуду для мытья кипятят в слабом растворе (1-2%) соляной кислоты во избежание дальнейшего выщелачивания стекла. Мытье производят ершами с мылом и содой, затем тщательно промывают проточной и ополаскивают дистиллированной водой, что предупреждает выпадение содовых остатков при высушивании. Приготовленную и высушенную посуду завертывают в бумагу и стерилизуют. Приложение № 3 к приказу Минздрава СССР от 2 августа 1978 г. № 720 Инструкция по бактериологическому обследованию на выявление носителей патогенного стафилококка и проведению санации 1. Общие положения 1.1. Инструкция предназначена: Для руководителей: - лечебно-профилактических учреждений, в составе которых имеются отделения хирургического профиля, палаты или отделения реанимации и интенсивной терапии; - для работников санитарно-эпидемиологических станций; - для работников бактериологических лабораторий. 1.2. В последние два десятилетия наблюдается рост внутрибольничных инфекций, одним из возбудителей которых является патогенный стафилококк. 1.3. По принятой классификации семейством Micrococcus включает 3 рода: Micrococcus, Staphylococcus, Planococcus. 1.4. Для медицинской практики наиболее важно дифференцировать стафилококки от микрококков, которые имеют сходную со стафилококком морфологию клеток и нередко выделяются из одних и тех же объектов. 1.5. Род Staphylococcus состоит из трех видов: St. aureus, St. epidermidis, St. saprophyticus. 1.6. В настоящее время четко показано этиологическое значение при гнойно-септических заболеваниях вида St. aureus. Роль вида St. epidermidis значительно меньше и возможна у ослабленных больных, лиц, страдающих диабетом, получающих большие дозы рентгено - и радиотерапии, а также при заболеваниях мочевыводящих путей. 1.7. Распространение стафилококковой инфекции происходит воздушно-капельным и контактными путями. 1.8. Основным источником стафилококковой инфекции в лечебно-профилактических учреждениях является человек/больной или здоровый бактерионоситель) из числа: - больных гнойно-септическими острыми и хроническими процессами, - медицинского и обслуживающего персонала (с локализацией возбудителя на слизистых оболочках носа, зева, на коже и в раневой поверхности). 1.9. Одной из мер профилактики внутрибольничных осложнений является своевременная изоляция больных и выявление носителей патогенного стафилококка с последующей санацией. 2. Организационные мероприятия по выявлению бактерионосителей 2.1. Каждый сотрудник, поступающий на работу в лечебно-профилактическое учреждение, проходит полный медицинский осмотр и включающий обследование отоларингологом и стоматологом. 2.2. Работающий персонал должен быть взят под диспансерное наблюдение для своевременного выявления и излечения кариозных зубов, хронических воспалительных очагов в верхних дыхательных путях и ротовой полости, субтрофических состояний слизистых носа и зева, а также своевременного выявления носительства персоналом St. aureus (1 раз в 6 месяцев - плановое обследование). 2.3. При проведении плановых бактериологических обследований обязательным является исследование слизи из передних отделов носа. Исследование слизи зева может проводиться выборочно. Забор материала проводит старшая сестра лечебно-профилактического учреждения. Результаты плановых бактериологических исследований и обследований ЛОР-специалистом и стоматологом должны четко фиксироваться в индивидуальной карте сотрудника лечебно-профилактического учреждения. 2.4. Приготовление санирующих средств осуществляют аптеки лечебно-профилактических учреждений. 2.5. Перед проведением санации носители проходят обязательную консультацию у специалистов отоларингологов, т.н. в определенной проценте они страдают аллергическими или хроническими заболеваниями верхних дыхательных путей, тонзиллитами и т.д., требующими обязательного специального лечения. 3. Исследование отделяемого верхних дыхательных путей 3.1. Обязательному бактериологическому исследованию подвергают слизь из передних отделов носа; исследование слизи из зева проводят по показаниям, прежде всего при наличии воспалительных процессов в зеве. 3.2. Забор материала из передних отделов носа осуществляют одним стерильным ватным тампоном из обеих половин носа. Сбор материала из зева проводят с поверхности миндалин стерильным ватным тампоном, либо путем смыва. В последнем случае обследуемый полощет горло 5,0 мл стерильного физиологического раствора. Смыв собирают в стерильную колбу (желательно с бусами), закрывают пробкой и встряхивают в течение 10-15 минут до получения однородной суспензии. При этом обязательным условием является взятие материала натощак (не ранее, чем через 2-3 часа после приема пищи). 3.3. Посев исследуемого материала на питательные среды должен проводиться не позже, чем через 2 часа после его забора. 3.4. Для первичного посева предпочтение должно быть отдано желточно-солевому агару (ЖСА) или желточно-молочно-солевой среде. Одновременно параллельный посев на молочно-солевой агар проводить не целесообразно. При целенаправленных исследованиях на стафилококк применение кровяных сред не обязательно. 3.5. Посев проводят тампоном, которым забирали материал. Тампон следует многократно поворачивать, чтобы перенести на питательную среду максимальное количество взятого материала. При посеве смыва из зева на питательную среду наносят 0,1 мл жидкости и растирают по поверхности среды шпателем. 3.6. При исследовании слизи из верхних дыхательных путей предварительное подращивание смывов в солевом или сахарном бульоне проводить не следует. Такое подращивание не позволит иметь истинного представления о массивности обсеменения верхних дыхательных путей, что имеет значение при характеристике источников стафилококковой инфекции. 4. Определение массивности обсеменения верхних дыхательных путей 4.1. Взятый тампоном материал помещают в пробирку с 0,5 мл стерильного физиологического раствора. Тампон ополаскивают в жидкости встряхиванием пробирки в течение 10 минут, затем отжимают о внутренние стенки пробирки и удаляют. Жидкость многократно перемешивают пипеткой. Отдельной пипеткой на чашку с БСА наносят 0,1 мл исследуемого смыва и тщательно растирают шпателем. Чашки оставляют в термостате на 2 суток после чего подсчитывают общее число выросших колоний и отдельно колоний различной морфологии. Особое внимание обращают на колонии, обладающие лецитовителлазной активностью. 4.2. Определение числа снятых на тампон колоний проводится следующим образом: если на чашке с ЖСА после посева 0,1 мл смывной жидкости выросло 15 однородных колоний, а идентификация двух колоний позволила отнести их к St. aureus одного и того же фаготипа, то это дает основание считать все выросшие на чашке колонии, идентичные по морфологии и пигменту, принадлежащими к St.aureus одного фаготипа. Пример расчета: в 0,1 мл содержалось 15 колоний, следовательно, во всем объеме смыва будет 15х10х5=750 колоний или 7,5х102. 4.3. Массивность применения, выражающаяся показателем 102 микробных клеток, снимаемых на тампон, является показателем умеренной обсемененности верхних дыхательных путей. При таком обсеменении выделение возбудителя во внешнюю среду, как правило, не имеет места. 4.4. Обсемененность, выражающаяся показателем 103 и более микробных клеток, снимаемых на тампон, является показателем высокой обсемененности, при которой происходит выделение возбудителя во внешнюю среду, как при различных экспираторных актах, так и при спокойном дыхании. 4.5. В качестве ориентировочного определения массивности обсеменения верхних дыхательных путей можно пользоваться оценкой роста колоний на чашках при прямом посеве в крестах, обозначая: ++++ сливной рост(*) +++ сплошной рост изолированных колоний(*) ++ значительный рост (до 100 колоний) + единичные колонии (10-25) 5. Схема бактериологического исследования на стафилококк 5.1. Первый день. Посев на элективные среды (желточно-солевой, молочно-солевой или молочно-желточно-солевой агар). Засеянные среды выдерживают в термостате при 37 град. С в течение 2 суток, либо одни сутки в термостате и дополнительно 24 часа на свету при комнатной температуре. 5.2. Второй - третий день. Просмотр чашек, фиксация в журнале характера и массивности роста. На вышеуказанных средах стафилококк растет в виде круглых, блестящих, маслянистых, выпуклых, пигментированных колоний. На средах, содержащих желток, St. aureus выделений от человека, в 60-70% случаев образует радужный венчик вокруг колонии (положительная лецитовителлазная реакция). Стафилококки животного происхождения дают положительную лецитовителлазную реакцию в 5-10% случаев. 5.3. Отвивка на скошенный агар для дальнейшего исследован не менее 2-х колоний, подозрительных на стафилококк. Для исследования отвиваются прежде всего колонии, дающие положительную лецитовителлазную реакцию. При отсутствии на чашках таких колоний дальнейшем исследованию подвергают пигментированные колонии, схожие по морфологии со стафилококком. При одновременном наличии на чашках колоний стафилококка, отличающихся по пигменту, следует отвивать не менее двух колоний различного вида; пробирки с посевом помещают в термостат при 37 град. С 18-20 часов. Примечание: (*) - сливной и сплошной рост соответствует, как правило, массивности обсеменения 103 и выше микробных клеток, снимаемых на тампон. 5.4. Четвертый день. После суточной инкубации у выделенных штаммов проверяют морфологию, тинкториальные свойства (окраска по Граму) и наличие плазмокоагулирующей активности. Следует отметить, что характер роста культуры на скошенном агаре в ряде случаев дает возможность «предвидеть» принадлежность ее к виду St. aureus или St. epidermidis. Первые, как правило, дают обильный равномерный, сочный рост, вторые - очень скудный и неравномерный рост по ходу посева. Окраска по Граму проводится общепринятым методом. Под микроскопом окрашенные по Граму стафилококки имеют вид фиолетово-синих кокков, располагающихся гроздьями или небольшими кучками («кружево»). Плазмокоагулирующая активность проверяются в реакции коагуляции плазмы (РКП). 5.5. С учетом результатов РКП и лецитовителлазной активности в 70-75% случаев, на четвертый день исследования может быть подтверждена принадлежность выделенного штамма к виду St. aureus и выдан соответствующий ответ. Возможные варианты сочетаний результатов отделения плазмокоагулирущей и лецитовителлазной активности представлены на схеме 1. 5.6. Если культура обладает плазмокоагулирующей и лецитовителлазной активностью, выдается ответ о выделении St. aureus без проведения дополнительных исследований. Если культура обладает только плазмокоагулирующей или только лецитовителлазной активностью, то для окончательного ответа требуется определение других признаков патогенности (ферментация маннита в анаэробных условиях - АФМ или ДНК-азной активности). В этих случаях ответ выдается в зависимости от результатов, полученных при определении названных признаков. 5.7. Если культура не обладает ни плазмокоагулирующей, ни лецитовителлазной активностью и выделяется из слизи верхних дыхательных путей практически здоровых лиц, то может быть выдан ответ о выделении St. epidermidis без проведения дополнительных исследований. Однако, следует помнить, что в 1-2% случаев речь может идти о выделении культуры St. aureus, лишенной основного видового признака - способности коагулировать плазму. 5.8. Определение антибиограммы проводится только после выделения чистой культуры по показаниям (выбор способа лечения и т.д.). Выделение культуры St. aureus подлежат фаготипированию. В случае необходимости на 4-й день исследования может быть поставлена реакция определения ДНК-азной активности или анаэробной ферментации маннита. 5.9. Пятый день. Учет результатов фаготипирования, определения чувствительности к антибиотикам, ДНК-азной активности. Окончательная выдача ответа. 6. Санация бактерионосителей 6.1. Для санации персонала (ежедневной) необходимо использовать следующие санирующие средства (фурацилин 1:5000, риванол 1:5000, 1% борная кислота, марганцовокислый калий (розово-красный раствор), Люголя (водный или на глицерине), настои листьев эвкалипта, лизоцим, стафилококковый бактериофаг. (Приложение 1) . 6.2. Для санации персонала в период эпидемиологического благополучия необходимо использовать гексахлорофен (1%), трибаск(3%), хлорофиллипт. (Приложение 1). 6.3. Для получения наиболее эффективных результатов санации бактерионосителей следует проводить смену санирующих средств через каждые 7 дней. 6.4. В период эпидемиологического неблагополучия (вспышка ОРЗ, подъем заболеваемости внутрибольничными инфекциями, значительная обсемененность стафилококками предметов окружающей среды и т.п.) в лечебно-профилактических учреждениях следует санировать весь персонал учреждения одномоментно. 6.5. В тех случаях, когда невозможно добиться санацией снижения или полного избавления от носительства стафилококка, необходимо настаивать на правильном ношении маски, закрывающей рот, нос и волосы. При этом необходимо иметь график ношения масок и проводить смену масок каждые три часа. 6.6. При отсутствии положительных результатов при лечении хронических воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей и полости рта медицинских работников переводят на другую работу. Схема видовой идентификации стафилококков
Условные обозначения: РКП - реакция плазмы; ЛВА - лецитовителлазная активность; АСМ - анаэробное сбраживание маннита; ДНК - дезоксирибонуклеазная активность; + положительный результат; - отрицательный результат. Приложение 1 Средства и методы санации
Методики постановки реакций, характеризующих принадлежность выделенного штамма стафилококка к виду золотистого стафилококка I. Определение плазмокоагулирующей активности Для реакции может быть использована свежеприготовленная или сухая цитратная плазма крови кролика. Человеческая плазма менее пригодна для постановки реакции. В ней могут содержаться лекарственные препараты, консерванты, антитела, препятствующие выделению стафилококковой коагулазы. Для приготовления цитратной кроличьей плазмы у кролика берут из сердца 8,0 мл крови и вносят ее в пробирку с 2,0 мл стерильного 5% лимоннокислого натрия (предварительно лимоннокислым натрием смачивают внутренние стенки пробирки). Смесь перемешивают вращением пробирки и ставят в холодильник. После полного осаждения форменных элементов крови, плазма отсасывается в стерильную пробирку и пригодна для постановки реакций в течение 1 - 1,5 недель при условии ее хранения в холодильнике при +4 град. С. При использовании сухой плазмы, годными к употреблению являются только те ампулы, целость которых не нарушена. В каждой ампуле содержится 1 мл высушенной кроличьей плазмы. Перед употреблением ампулу вскрывают и добавляют 1 мл стерильного физиологического раствора для растворения содержимого ампулы. Растворение сухой плазмы происходит медленно и требует осторожного помешивания пастеровской пипеткой. Для реакции применяют плазму в разведении 1:5 в количестве 0,5 мл (на 1 мл плазмы добавляют 4 мл стерильного физиологического раствора). Разведенную плазму разливают в стерильные пробирки (без пробок) по 0,5 мл и в каждую вносят по одной петле 18-20 часовой агаровой культуры стафилококка (или к 0,5 мл плазмы добавляют 0,5 мл 18 часовой бульонной культуры стафилококка). Контроль реакции ставится с заведомо коагулазоположительной и коагулазоотрицательной культурой. Кроме того, для исключения самопроизвольного свертывания плазмы необходимо также ставить контроль незасеянной плазмы. Пробирки помещают в термостат при 37 град. С и проверяют наличие свертывания плазмы через 3 часа, затем пробирки вынимают, оставляют при комнатной температуре на 18-20 часов. Окончательный учет реакции проводится на следующий день. Оставлять реакцию в термостате более 3 часов не рекомендуется, поскольку при длительной инкубации в термостате может наступить разжижение образовавшегося сгустка за счет действия фибринолизина. Реакция считается положительной независимо от степени свертывания плазмы - от небольшого сгустка, взвешенного в плазме, до полного неподвижного сгустка. Реакция в контроле должна бить выражена четко: наличие сгустка с культурой золотистого стафилококка и отсутствие его в 2 других пробирках. РКП может быть поставлена в ускоренной модификации, предложенной Ульянищевой Л.Н. и Кучуриным А.В., которая сводится к следующему: сразу же после отвивки с чашки на скошенный агар колоний подозрительных на стафилококк, в пробирку добавляется 0,5 мл плазмы в разведении 1:5. Плазму следует добавлять стерильно, внося ее по стенке противоположной скошенному агару. Пробирки помещают в термостат при 37 град. С на 18-20 часов, после чего производят учет реакции. Верхняя часть скошенного агара с выросшей культурой может быть использована в дальнейшем для определения других свойств выделенного штамма. Для постановки реакции не рекомендуется использовать свежеприготовленный скошенный агар, который имеет конденсат, дающий дополнительное разведение плазмы. Если культура обладает плазмокоагулирующей активностью, то в пробирке образуется сгусток плазмы. Отсутствие сгустка свидетельствует об отрицательной реакции плазмокоагуляции. К каждому опыту необходимо ставить контроли, как отмечено выше. Опыты, давшие сомнительный результат в контроле, подлежат повторению. Постановка РНП в ускоренной модификации позволяет на сутки раньше получить ответ о принадлежности выделенного штамма к тому или иному виду стафилококка. II. Определение ДНК-азной активности Для постановки реакции используется 2% агар на переваре Хоттингера или приготовленный из сухого питательного агара (рН 8,6). Агар разливают во флаконы по 150,0 мл. По мере надобности агар растапливают, и в него добавляется ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) из расчета 2 мг на 1 мл среды. Во флакон, содержащий 150,0 мл среды, следует добавить 300,0 мг ДНК. Предварительно ДНК растворяют в дистиллированной воде, подщелоченной 1N NaOH. Растворение ДНК в воде без добавления щелочи происходит не полностью. Агар с добавленной ДНК стерилизуют текучим паром в течение 30 минут. Стерильная среда может храниться в холодильнике в течение 1,5-2 месяцев. Перед разливом чашек агар растапливают, добавляют хлористый кальций из расчета 0,8 мг на 1 мл среды.(на 150,0 мл среды следует добавить 1,2 мл продажного стерильного 10% хлористого кальция). На хорошо подсушенную чашку засевают полоской от 10 до 20 культур стафилококка. Чашки помещают в термостат при 37 град. С 18-20 часов, после чего их заливают 5,0-7,0 мл 1N НСl. Учет реакции: проводится после 7-10 минутного контакта кислоты со средой, которая перед учетом реакции сливается. Соляная кислота, реагируя с ДНК, содержащейся в среде, образует непрозрачный белый преципитат. Если исследуемый штамм выделяет в среду ДНК-азу, то последняя деполимеризует ДНК. Вследствие этого при обработке соляной кислотой вокруг таких культур образуется прозрачная зона, содержащая продукты расщепления ДНК, которые не осаждаются соляной кислотой. Хотя ширина прозрачных зон вокруг засеянных колоний может быть различной, чашечный метод определения ДНК-азной активности, является качественным тестом. При оценке реакции на ДНК-азу возможны следующие варианты: 1. Наличие четкой зоны просветления среды - положительная реакция. 2. Полное отсутствие зоны просветления среды - отрицательная реакция. 3. Наличие нечеткой, небольшой зоны просветления среды - сомнительная реакция. В данном случае реакцию необходимо повторить. Определение ДНК-азной активности можно проводить не только у суточных культур, но без предварительного пересева их после 7-10 дневного хранения в холодильнике. В настоящее время показана принципиальная возможность использования для определения ДНК-азной активности не только высокополимерной ДНК, но и натриевой ее соли, получаемой из селезенки рогатого скота, производства Олайнского завода химических реактивов Латвийской ССР. С целью сокращения расхода ДНК, рекомендуется использовать двухслойный метод определения ДНК-азной активности, предложенный А.А. Трояшкиным. Сущность этого метода заключается в том, что ДНК вносится лишь в верхний слой среды, налитый в чашку Петри. Методика постановки реакции: 1. К 100 мг натриевой соли ДНК добавляют 10 мл дистиллированной воды, 0,5 мл 0,2 N раствора NaOН и осторожно встряхивают. Пробирку оставляют при комнатной температуре или в термостате до следующего дня. Для ускорения растворения ДНК пробирку можно поместить в кипящую водяную баню. Готовый раствор ДНК имеет вид и консистенцию нативного яичного белка (рабочий раствор ДНК). 2. В расплавленный 2% агар (рН 7,2-7,4), разлитый в пробирки по 10,0 мл добавляют по 1 мл рабочего раствора ДНК и 0,1 мл продажного стерильного 10% раствора хлористого кальция. Смесь тщательно перемешивают и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. в течение 20 минут, или дробно - три дня подряд по 20 минут в кипящей водяной бане. Агар с ДНК можно хранить 1,5-2 месяца в холодильнике, не допуская высыхания. 3. Чашки с 2% питательным агаром следует хорошо подсушить. Столбик агара с ДНК растапливают в водяной бане и выливают равномерно вторым слоем на агар и ставят на ровную поверхность. После застывания второго слоя чашки снова подсушивают. Посев испытуемых культур, режим термостатирования и учет результатов проводятся, как описано выше. Наличие ДНК-азной активности является простым, удобным и весьма специфическим тестом дифференциации золотистого стафилококка и эпидермального стафилококка. ДНК-азная активность обнаруживается у 97-98% штаммов золотистого стафилококка. III. Определение ферментации маннита в анаэробных условиях Для реакции можно использовать среду, приготовленную из сухого агара с индикатором ВР, содержащую маннит (пропись см. ниже). Среду разливают в пробирки по 4,0 мл и стерилизуют. По мере надобности пробирки со средой регенерируют и добавляют по 2,0 мл стерильного вазелинового масла. Когда среда остынет, уколом (до дна) производят посев испытуемой культуры. Пробирки помещают в термостат при 37 град. С на 5 суток. В случае разложения маннита среда приобретает синий цвет по всему столбику агара. Способность разлагать маннит в аэробных условиях обнаруживается у 94-96% штаммов золотистого стафилококка. IV. Определение лецитовителлазной активности При использовании для первичного посева среды, содержащей желток, специального дополнительного определения лецитовителлазной активности у стафилококка проводить нет необходимости. В случае выделения культуры с других сред в необходимости определения у нее этого признака, следует на чашку с ЖСА посеять испытуемую культуру штрихом или бляшкой. Чашки инкубируют в термостате при 37 град. С в течение 18-20 часов. При положительном результате вокруг колоний стафилококка образуется радужный венчик, что обусловлено выделением фермента лецитивителлазы и разложением лецитина, находящегося в среде. Реакцию следует учитывать в отраженном свете. Лецитовителлазной активностью обладает 60-75% штаммов золотистого стафилококка человеческого происхождения и 5-10% штаммов стафилококка животного происхождения. V. Определение пигментообразования Пигмент колоний стафилококка может варьировать от ярко-золотистого, к желтому, кремовому до белого. Пигментообразование лучше проявляется на свету, при посеве культур на агар, содержащий 10% снятого молока. Следует отметить, что золотистый пигмент образуют не только золотистый стафилококк; колонии некоторых эпидермальных стафилококков и микрококков могут иметь аналогичную окраску. В то же время золотистые стафилококки могут вырастать на агаре в виде белых колоний. VI. Определение гемолитической активности В настоящее время показано, что 60-70% эпидермальных стафилококков на кровяном агаре образуют четкие зоны гемолиза. Поэтому определение гемолитической активности штамма не может служить четким дифференциально-диагностическим тестом для золотистого стафилококка и эпидермального стафилококка. В случае, если имеется необходимость определения альфа-гемолитической активности у выделенных штаммов необходимо использовать 3-5% кровяной агар, содержащий эритроциты кролика, т.к. альфа-гемолизин стафилококка не лизирует эритроциты других животных и слабо лизирует эритроциты человека. Гемолитическая активность стафилококков животного происхождения может быть определена на 3-5% кровяном агаре, содержащем эритроциты барана. Чашки с исследуемыми культурами выдерживают 24 часа в термостате при 37 град. С, и 24 часа в холодильнике при +4 град. С. VII. Определение фаготипа золотистого стафилококка Методика фаготипирования стафилококков подробно изложена в наставлении по применению типовых стафилококковых бактериофагов, прилагаемых к Международному набору, выпускаемому ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР. Фаготипированию должны подвергаться только золотистые стафилококки. При этом следует руководствоваться следующими правилами: золотистые стафилококки выделенные из верхних дыхательных путей у персонала родильных домов, должны подвергаться фаготипированию в обязательном порядке. Золотистые стафилококки, выделенные от больных, подвергаются фаготипированию по эпидемическим показаниям. Для фаготипирования используются Международный набор из 22 умеренных фагов, которые разделены на 4 группы: I группа - фаги 29, 52, 52А, 79, 80. II группа - фаги 3А, 84, 3С, 55, 71. III группа - фаги 6, 85, 42Е, 47, 53, 54, 75, 77, 83А. IV группа - фаги 42Д, Вне групп - фаги 81, 187. При проведении фаготипирования необходимо руководствоваться следующим: 1. Первым этапом фаготипирования является приготовление соответствующих разведений фaга. К каждой ампуле с высушенным фагом добавляют по 1,0 мл щелочного бульона Хоттингера, Мартена, мясопептонного бульона (рН 7,6). Поскольку фаги высушиваются в объеме 0,1 мл, при добавлении 1,0 мл бульона получают разведение 10-3. Если на этикетке ампулы указанное тест-разведение соответствует 10-3 (1:1000), то для получения разведения фага, равного 100ТР, в данную ампулу необходимо добавить 1,0 мл бульона. Полученное разведение фага 1:10 будет соответствовать 100ТР. Если на этикетке ампулы указанное тест-разведение фага соответствует 10-3 (1:1000), то для получения разведения фага, равного 100ТР, в данную ампулу необходимо добавить 1,0 мл бульона, и полученное разведение фага 1:10 развести еще в 10 раз. С этой целью к 0,1 мл разведения 1:10 добавляют 0,9 мл бульона. Полученное разведение соответствует 100ТР. Фаготипирование рекомендуется начинать дозой фага 100ТР. Фаги в разведении 100ТР могут храниться в холодильнике при +4 град. С в течение 1,5-2 месяцев. Для предохранения высыхания пробирку с фагом следует закрывать стерильной резиновой пробкой. При приготовлении разведения фага для ампулы берут отдельную пипетку. После добавления бульона фаг быстро растворяется в ампуле, и его переносят этой же пипеткой в стерильную пробирку. На последней подписывают столбиком порядковый номер фага, его название (тип), конечное разведение и тест-разведение: Например:
Для фаготипирования можно использовать не только 3-4 часовую, но и 18-20 часовую бульонную культуру. 3. Для приготовления среды использовать как 1,2% агар, приготовленный на бульоне Хоттингера, так и сухой питательный агар или агар Д (рН 7,6), с добавлением 0,4% глюкозы. Непосредственно перед разливом чашек в агар добавляют 0,2 мл стерильного продажного 10% раствора хлористого кальция на 100 мл среды. Чашки подсушивают в термостате. 4. На подсушенные среды наносят бульонную культуру и засевают ее газоном, избыток культуры отсасывают пипеткой. Чашки с посевом вновь подсушивают. Поскольку на среду наносится массивный газон культуры, воздушное загрязнение среды не может при этом играть существенной роли. Для удобства работы можно закрывать чашки картонными крышками. 5. Дно подсушенных чашек со средой расчерчивают на 22 квадрата или на поверхности агара агглютинационной пробиркой делают 22 кружка-насечки. В каждый квадрат или кружок оттянутой до капилляра пастеровской пипеткой наносят каплю соответствующего фага всегда в одном и том же порядке. Наносить фаг следует таким образом, чтобы не коснуться пипеткой поверхности среды и избежать тем самым переноса культуры на другую чашку со средой или пробирку с типовым фагом. Набирать в пипетку фаг следует над пламенем горелки. Если количество исследуемых культур невелико, фаг можно наносить не пипеткой, а петлей, каждый раз прожигая ее. Более удобно наносить фаг репликатором. В этом случае на хорошо подсушенную чашку наносят сначала фаг, вновь подсушивают, после чего наносят газоном исследуемую бульонную культуру. Избыток культуры удаляют пипеткой, чашки подсушивают, закрывают крышкой, переворачивают и помещают в термостат. Инкубируют при 37 град. С в течение 18-20 часов, либо 5-6 часов при 37 град. С и до следующего утра при комнатной температуре. 6. При учете результатов фаготипирования отмечают наличие лизиса тем или иным фагом на ++++, +++ и ++ креста. При учете отмечают ++++ - сливной (полный) лизис. +++ - полусливной лизис (незначительный рост культуры в зоне лизиса) ++ - наличие в месте нанесения капли фага свыше 50 колоний фага. + - почти полное отсутствие лизиса. - - полное отсутствие лизиса. Некоторые фаги вызывают как бы утончение роста культуры в месте нанесения фага, т.е. феномен ингибиции (подавление), обозначаемое «О». Ингибиция относится к слабой реакции, но ее наличие должно обязательно отмечаться в рабочем журнале. Штамм считается типируемым, если хотя бы один фаг вызвал сильную реакцию на ++++, +++ или ++ креста. Стафилококковые штаммы чаще лизируются не одним, а несколькими фагами, что дает для каждого штамма характерную фагомозаику. Результаты фаготипирования регистрируются в журнале, с указанием дозы фага, вызвавшей лизис и степени лизиса. Например: 100ТР - ЗС++++/55+++/71++++. В ответе степень лизиса не обозначается, указывается только фагомозаика данного штамма - 3С/55/71. При определении идентичности штаммов следует ориентироваться на следующее: если культуры стафилококков, типированные в один и тот же день, дают фагомозаику не различающуюся или различающуюся на одну сильную реакцию, то их следует считать идентичными. Если культуры стафилококка, типированные в один и тот же день, обнаруживают разницу на 2 и более сильные реакции, штаммы следует признать разными. Однако этот результат является ориентировочным и в каждом отдельном случае при решении вопроса об идентичности выделенных культур следует уточнить место их выделения, характеристику патогенных свойств, отношение к антибиотикам, эпидемическую ситуацию. Следует отметить, что внутри одной группы идентичные штаммы могут иметь различие более, чем в одну сильную реакцию. В настоящее время примерно 30-40% выделенных культур золотистого стафилококка не чувствительны к используемым типовым фагам (так называемые нетипируемые штаммы золотистого стафилококка). Идентичность таких штаммов может быть установлена весьма ориентировочно на основании антибиограммы. VIII. Определение фосфатазной активности В 100 мл растительного и остуженного до 40 питательного агара добавляют 50 мг паранитрофенилфосфата. Смесь разливается стерильно в чашки (по 10-12 мл на чашку). Чашки с застывшим агаром подслушивают и на каждую из них точечным посевом наносятся исследуемые культуры (16-20 культур). Чашки помещают в термостат на 24 часа при 37 град. С. Появление интенсивного желтого окрашивания вокруг посевов регистрируется как положительная реакция. Обязательным является постановка контролей со штаммами стафилококка, заведомо обладающими и не обладающими фосфатазной активностью. Реакция Фогес-Проскауэра (в модификации Баррита). Исследуемую культуру засевают в глюкозо-фосфатный бульон Кларка. После 3 дней роста при 37 град. С 1,0 мл культуры переносят в пробирку и прибавляют 0,6 мл альфа-нафтола (5% раствор в абсолютном спирте) и 0,2 мл КОН (40% раствор) и взбалтывают. В положительном случае через 2-5 минут наступает розовое окрашивание. У штаммов, дающих сильную реакцию, окраска становится интенсивной и через 30 минут - 1 час переходит в малиновую. В отрицательных случаях розового окрашивания не наступает, и раствор принимает цвет меди. (КОН + альфа-нафтол). |
Ваша оценка этого документа будет первой.
Ваша оценка:
Похожие:
База данных защищена авторским правом ©MedZnate 2000-2016
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям
allo, dekanat, ansya, kenam
обратиться к администрации | правообладателям | пользователям